Krooninen sairaus

tiivistelmä

CD44 ja CD147 liittyvät syövän etäpesäkkeitä ja etenemiseen. Meidän tarkoitukseen oli tutkia vaikutukset alas-säätely CD44 tai CD147 on metastaattinen kyky eturauhassyövän (CAP) solut, dosetakseliannosta (DTX) reagointikykyä ja mahdollisia mekanismeja

in vitro

ja

in vivo

. CD44 ja CD147 olivat tippuu alas (KD) PC-3M-luc CaP solut käyttämällä lyhyitä hiusneula-RNA (shRNA). Expression of CD44, CD147, MRP2 (multi-drug resistance protein-2) ja MCT4 (monokarboksylaatti tranporter-4) arvioitiin käyttäen immunofluoresenssilla ja Western blotting. DTX annos-vaste ja proliferaatio mitattiin MTT: n ja pesäkekokeissa, vastaavasti. Invasiivisen potentiaali arvioitiin käyttäen Matrigel kammion määritystä. Signaalitransduktiota proteiinit PI3K /Akt ja MAPK /Erk reitit arvioitiin Western-blottauksella.

in vivo

ihonalainen (s.c.) ksenograftimallia perustettiin arvioimaan CaP tumorigenecity, imusolmukemetastaaseja ja DTX vastaus. Tuloksemme osoittivat, että KD CD44 tai CD147 laski MCT4 ja MRP2 ilmaisun vähensi CaP lisääntymistä ja invasiivisia potentiaali ja tehostettu DTX herkkyys; ja KD CD44 tai CD147 alassäädetty p-Akt ja p-Erk, pääsignaalin modulaattoreiden liittyvien solujen kasvua ja selviytymistä.

In vivo

, CD44 tai CD147-KD PC-3M-luc ksenografteissa näytetä tukahdutti kasvaimen kasvua lisääntynyt DTX vastata vertailuryhmän ksenograftit. Sekä CD44 ja CD147 parantaa metastaattisen kapasiteetti ja chemoresistance CaP soluja, mahdollisesti välittävät aktivoituminen PI3K ja MAPK polkuja. Valikoiva kohdentaminen CD44 /CD147 yksin tai yhdistettynä DTX voi rajoittaa CaP etäpesäke ja lisätä kemosensitiivisyys, lupaus tulevaisuuden CaP hoitoon.

Citation: Hao J, Madigan MC, Khatri A, Virta CA, Hung TT, Beretov J, et al. (2012)

In vitro

ja

In vivo

Eturauhassyöpä etäpesäke ja Chemoresistance voidaan moduloida ilmentäminen joko CD44 tai CD147. PLoS ONE 7 (8): e40716. doi: 10,1371 /journal.pone.0040716

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 helmikuu 2012; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 03 elokuu 2012

Copyright: © Hao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Health Medical Research Council (NH MRC) (YL), St George Medical Research Foundation (YL), Urology Research Fund (PJC) ja St George Hospital Trust Fund (PHG). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (CAP) on yleisimmin diagnosoitu ja toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään miehillä Yhdysvalloissa [1]. Vaikka aluksi reagoi androgeenien puute hoitoa (ADT), useimmat potilaat kärsivät syövän uusiutumiseen 12 kuukauden kuluttua, ja Cap tässä vaiheessa ei ole enää parannettavissa [2]. Eteneminen korkki edennyt pitkälle on ominaista levittämistä pahanlaatuisten syöpäsolujen ja pieni soluklusterien kautta lymphatics ja verisuonia. Vaikka useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset raportoidaan CaP etenemisen, solun mekanismeja eteneminen lokalisoitu korkki etäpesäkkeitä jäävät määrittämättä.

Kemoterapia on perinteisesti käytetty lievittää oireita kehittynyt korkki. Kaksi viimeaikaista doketakseli (DTX) -pohjaisen kliiniset tutkimukset ovat ensimmäistä kertaa esitetty mahdolliset hyödyt kemoterapiaa pidentää elinaikaa ja elämän laatua CaP potilaiden [3], [4]. DTX on tällä hetkellä tehokkain kemoterapeuttinen lääke metastaattisen CaP [3] – [6]. Kuitenkin lääkeaineille luonne CaP edelleen haastaa tehokkuutta tällaisten hoitomuotojen. On selvää, monilääkeaineresistenssin ja etäpesäkkeitä pysyvät pääsyistä hoidon epäonnistumisen ja kuolleisuuden korkki potilailla. Näin ollen on erittäin arvokkaita liittyvien mekanismien ja reitit CaP etäpesäkkeiden ja lääkeresistenssi, tunnistaa hyödyllinen terapeuttinen tavoitteena parantaa nykyisten hoitomuotojen.

CD44 on monitoiminen proteiini liittyi solun tarttumiseen, muuttoliike, lääkeresistenssin , signaalin siirto, muuttoliike ja apoptoosin [7], [8]. CD44-geeni sisältää 20 eksonia vaihtoehtoisesti liitettyjä antaa monia isoformeja tai vaihtoehtojen (CD44v), joista jotkut muodostavat muuttumattoman ekstrasellulaarisen domeenin standardin CD44 (CD44s). CD44 on ensisijainen reseptori hyaluronaanin (HA), joka on merkittävä osa soluväliaineen (ECM) ja kriittinen solujen signalointi ja solu-ECM vuorovaikutuksia syöpä. CD44-HA sitoutuminen stimuloi myöhemmät vaikutukset solun tukirangan proteiineihin osallistuvat kasvaimen solujen vaeltamiseen sekä stimuloiva monilääkeresistenssiin protein1 (

MDR1

) ilmaisun ja lääkeresistensseihin [9]. CD44s on läsnä kalvon useimpien selkärankaisten soluihin [7]. Ilmaisu Tiettyjen CD44 variantteja on raportoitu tiiviisti syövän etenemiseen, ja tämä vaihtelee kasvaintyyppi tutkittu [10]. Kiehtova tutkimukset ovat sekaantuneet HA /CD44 vuorovaikutus epiteelin mesenkymaaliset-siirtymä (EMT), ”stemness” ja syöpä [11], [12]. Vuorovaikutusta HA: n ja CD44 on osoitettu laukaisevan väyliä, jotka liittyvät kasvaimen kasvua ja selviytymistä [13], [14]. Kuitenkin rooli CD44s ja CD44v Cap kehitykseen ja etenemiseen on erilainen, sillä tutkimukset osoittavat sekä kasvain estäviä (CD44s) ja kasvaimen edistäminen (CD44v) vaikutukset [15] – [17]. Osallistuminen CD44 ja sen variantit Cap etenemisen ja etäpesäkkeiden optio lisätutkimuksia.

CD147 (soluväliaineen metalloproteinaasi induktori proteiini-EMMPRIN) on monitoiminen glykoproteiini, joka voi muuttaa kasvain mikroympäristölle aktivoimalla tiiniproteinaasit asiakkuutta angiogeenisten tekijöiden molemmissa kasvain ja strooman solujen ja säännellä kasvua ja selviytymistä kiinnittymisestä riippumattoman kasvainsoluja (micrometastases) sekä monilääkeresistenttisyyden [18]. Transcriptome analyysi ja vertaileva genominen hybridisaatio yksittäisten kasvainsolujen eristetty luuytimestä potilailla, joilla on CaP osoitti, että CD147 on yleisimmin ilmaistuna proteiini primaarikasvaimista ja mikrometastaasien [19]. Lisäksi lisääntynyt CD147 ilmentyminen liittyy lisääntyneitä riskejä lukien prostataspesifisen antigeenin (PSA) vika, etäpesäke, ja vähentää yleistä eloonjäämistä ihmisen CaP [20]. Olemme äskettäin osoittivat, että korkeita CD147 ilmentyminen korreloi CaP etenemistä ja liittyy ilmentymisen MMP (metalloproteinaasien) kasvaimen sekä stroomasolut [21]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CD147 voisi olla hyödyllinen terapeuttinen kohde CaP terapiassa. Kuitenkin rooli CD147 Cap etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssi jää epäselväksi.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme arveltu, että (1) CD44 ja CD147 ilmentyminen korreloi metastaattisen kapasiteetti ja chemoresistance CaP ja voivat tehdä yhteistyötä vaikuttaa CaP etenemiseen ja (2) alas-säätely CD44 tai CD147 ilmentyminen voi olla terapeuttista potentiaalia rajoittavia CaP etäpesäkkeitä ja parantamalla CaP kemoterapeuttisen herkkyys. Osoitamme seuraavissa jaksoissa että CD44 ja CD147 antavat ominaisuudet merkittävä YMP etäpesäke ja chemoresistance

in vitro

ja

in vivo

, ja ne ovat käyttökelpoisia terapeuttisia kohteita tulevan YMP terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

Vasta saatiin eri lähteistä. Yksityiskohtaiset tiedot ja edellytykset kaikille vasta-aineiden lueteltu taulukossa 1.

Solun viiva ja soluviljelmissä

androgen-ei reagoi PC-3M-luc-C6 (PC- 3M-luc) CaP solulinja saatiin Xenogen Corp, USA. Kaikki kudosviljelmässä reagenssit toimitti Invitrogen Australia Pty Ltd (Melbourne, VIC, Australia), ellei toisin mainita. PC-3M-luc-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% (tilavuus /tilavuus) lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 50 U /ml penisilliiniä ja 50 U /ml streptomysiiniä. PC-3M-luc-scr (sekoitetun shRNA kontrolli), PC-3M-luc-CD44-pudotus (KD), PC-3M-luc-CD147-KD-soluja kasvatettiin samassa väliaineessa, johon oli lisätty lisäksi 1 ug /ml puromysiiniä seulontaan. Kaikkia solulinjoja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Short hiusneula-RNA (shRNA) transfektion CD44 /CD147

PC-3M-luc solut shRNA välittämää KD CD44 (t ja v) /CD147 tai salattu sekvenssiohjauksen off-tavoite vaikutukset (PC-3M-luc-scr) tuotettiin käyttäen aiemmin julkaistu menetelmä, jossa muutos [22]. Viisi MISSION® lentiviruksen transduktiopartikkeleilla koodaa shRNAs vastaan ​​CD44 tai CD147 ja MISSION® kuin kohde-shRNA ohjaus transduktiopartikkeleilla käytettiin (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia) (taulukko S1). Lyhyesti, 2 x 10

4 PC-3M-luc-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä ja transdusoitiin kaikki viisi klooneja lentiviruksesta hiukkasia tai saman verran kuin kohde- shRNA ohjaus transduktiopartikkeleilla seuraten valmistajan protokollaa (infektiokerroin = 2, virus- muutinlait- yksikköä /solu). Transdusoiduissa kloonit valittiin puromysiiniä sisältävien solujen viljelyalustaan ​​(0,5 ug /ml) (Invitrogen Australia Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australia), lisätä ja lopulta siirretään 25 cm

2 soluviljelmässä pulloihin ja ylläpidettiin alustassa joka sisälsi 1,0 ug /ml puromysiiniä ja seuraavissa kokeissa.

Immunofluoresenssianalyysi konfokaalimikroskopialla analyysi PC-3M-luc ja PC-3M-luc-KD solulinjat

immunofluoresenssi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin lasipeitinlevyjä kiinteä, huuhdeltiin ja inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden yön yli (o /n) 4 ° C: hiiren anti-humaani-CD44 monoklonaalinen vasta-aine (MAb) (1:200 laimennus), CD147 polyklonaalinen vasta-aine (PAB ) (1:100 laimennus), MRP2 MAb (laimennos 1:50), kanin anti-humaani MCT1 Pab (1:200 laimennus) tai MCT4 Pab (1:400 laimennus). Huuhtelun jälkeen TBS, soluja inkuboitiin 45 minuuttia Alexa Fluor-488 vuohen anti-hiiri tai Alexa Fluor-488 vuohen anti-kani-IgG: tä (1:1000 laimennokset) huoneenlämpötilassa (RT). Propidiumjodidia (PI) (0,2 mg /l) käytettiin värjäämään ytimet. Negatiiviset kontrollit käsiteltiin identtisesti mutta inkuboitiin joko hiiren tai kanin isotyyppikontrollia. Immunofluoresenssi visualisoitiin käyttäen FV300 /FV500 Olympus laserskannaus konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani).

Western blotting -analyysi

Proteiinin ilmentymistasot määritettiin Western blotting-analyysi, kuten on kuvattu [24] . Lyhyesti, kokosolulysaateille erotettiin NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris geelielektroforeesi ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi kalvo. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiin kohtiin 5% rasvaton maito, kaivoa inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden sopivina pitoisuuksina (taulukko 1), jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääriset vasta-aineet (vuohen anti-hiiri tai vuohen anti- kani sopiva isäntä lajin ensisijainen aine) (1:5000 laimennus). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia (ECL) substraatti (Pierce Chemical Co., Rockford, USA), ja kuvattiin käyttäen ImageQuant LAS4000 järjestelmän (GE Health Care, USA). Vahvista yhtäläinen lastauksen proteiinilysaattien, kalvot riisuttu (Palauta Western Blot kuoriminen Buffer, Pierce) ja uudelleen probed hiirellä anti

β

tubuliinia MAb (1:10000 laimennus), sitten käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. Kuvat käsiteltiin Adobe Photoshop.

Co-immunosaostuksella (IP) määritys

Solulysaatti sisältää 200 ug kokosolulysaateista PC-3M-luc-soluja, inkuboitiin 2 ug anti- CD44 tai anti-CD147-vasta-aineita (Ab: t) tai normaali seerumin (Ig-ohjattu) o /N 4 ° C: ssa. Immuuni- komplekseja eristettiin saostamalla käyttämällä proteiini A /G Plus-agaroosia (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) 8 h 4 ° C: ssa. Helmet pestiin 4 kertaa 1000

g

ja suspendoitiin 20

μ

L NuPAGE LDS-näytepuskuria (Invitrogen Australia Pty Ltd, Australia) ja sitten kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan . Sitten uutteet immunoblotattiin CD44 ja CD147 primaarisilla vasta-aineilla, jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja havaittiin käyttämällä ECL substraattia. Kuva-analyysi on kuten edellä on kuvattu (Western blotting).

MTT-määritystä varten DTX vasteen

MTT-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (0,001-1000 nM) DTX laimennettuna 100% etanolia, ja ajoneuvon ohjaus. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 0,5 mg /ml MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia]. 4 tunnin kuluttua supernatantit poistettiin ja tuloksena MTT formatsaaniksi liuotetaan DMSO: hon ja mitataan spektrofotometrisesti 562 nm: ssä BIO-TEK mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Tulokset edustavat OD suhde DTX-testi- ja käsiteltyjä soluja. Kasvun inhibitio käyrä on luotu käyttäen GraphPad Prism 4-ohjelma (GraphPad, San Diego, CA, USA). Absoluuttinen IC

50-arvot laskettiin käyttäen risteyksessä 50% normalisoitu lääkevaste ja kasvun estäminen käyrät kustakin solulinjasta, löytää x-akselin arvot IC

50 DTX konsentraatio (nM).

Colony muodostavat määrityksissä

PC-3M-luc ja PC-3M-luc-KD-soluja käytettiin pesäkkeitä muodostavien määrityksiä kuten aiemmin on kuvattu vähäisin muutoksin [25]. Lyhyesti, 1500 solua /malja ympättiin 10 cm: n maljoille 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja sitten sitä käsiteltiin kiinteän annoksen DTX 3,5 nM lopullinen konsentraatio (1/2 annos alimman IC

50 alkaen MTT-määritystä neljän CaP solulinjoissa) tai sama tilavuus ajoneuvon hallinnan (100% etanolia). 3 päivän kuluttua hoidon, DTX sisältävä elatusaine korvattiin tuoreella väliaineella ja kaikki viljelmiä inkuboitiin vielä 7 päivää, kunnes pesäkkeet olivat tarpeeksi suuria selvästi havaittavissa. Pesäkkeet, määritellään ryhmiä 50 solua, pisteytettiin manuaalisesti tuella Olympus INT-2 käänteismikroskooppi (Tokio, Japani). Keskimäärin pesäkkeistä piirretty (keskiarvo ± SD, n = 3).

Matrigel invaasiomääritys

invasiivinen kyky CaP solulinjoissa määritettiin käyttäen kaupallista matrigeeliä ja hallita transwell kammiot (BD Bioscience , NSW, Australia). Lyhyesti, 2 x 10

4 PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD CaP solujen 500 ui seerumittomassa keskipitkän lisättiin kuhunkin transwell lisätä ja 750 ui täydellistä väliainetta lisättiin ulomman hyvin tarjota kemoattraktantti ja kuivumisen estämiseksi. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 24 tunnin ajan ja sitten värjättiin Diff-Quik -värjäyspakkausta (Allegiance Healthcare Corp, McGraw Park, Illinois, USA). Irtoväriä pestiin pois vesijohtovedellä ja määrä värjättyä soluja, tunkeutuu läpi matrigeeliä tai kontrolli insertit laskettiin viidessä HPF (HPF) valomikroskoopilla (Leica mikroskooppi, Nussloch, Saksa). Invasiivinen potentiaali laskettiin seuraavasti:% Invasion = [(Mean solut tunkeutuvat läpi matrigeeliä lisätä kalvo) /(keskiarvo liikkuvien solujen kautta ohjaus insertin kalvo)] x 100%. Soluinvaasiota hinnat piirrettiin, jossa keskiarvo ja SD (n = 3).

ihonalainen (sc) -ksenografti eläinmallissa

Mies, ikä 6-8 viikkoa Balb /c nude-hiiriin (Animal Resources Centre, Länsi-Australia) pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa tiloissa hyväksymiä University of New South Wales (UNSW) Animal Care ja eettisen komitean (ACEC) ja käsittelyt suoritettiin laminaaristi kaapit. ACEC erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen (hyväksyntä ID on 10 /121A). Hiiriä pidettiin vähintään 1 viikko ennen kokeellista manipulaatiota. Kaikki hiiret pysyivät terveinä ja aktiivisina kokeen aikana. Kuten aiemmin on kuvattu [26], viljeltiin PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD tai PC-3M-luc-CD147-KD CaP soluja (1,5 x 10

6 /injektio) 100 ui DPBS istutettiin ihonalaisesti oikeaan taka kylkeen alueelle hiiriä (n = 10 hiirtä /per ryhmä). Syövän etenemistä dokumentoitiin viikoittain mittauksia satulat, ja kasvainten tilavuudet laskettiin seuraavasti: pituus x leveys x korkeus x 0,52 (millimetreinä) [27] jopa 8 viikkoa. Kun uhri, ensisijainen kasvaimia ja paikallisten alueellisten imusolmukkeet poistettiin histologista tutkimusta.

DTX vaste korkki s.c. eläinmallissa

Todettuaan s.c. mallit korkki solulinjojen, jolloin kasvaimen keskimääräinen koko oli 30 ± 10 cm

3 kunkin alaryhmän (n = 10 /alaryhmä), 5 hiirtä (n = 5) käsiteltiin 25 mg /kg DTX jatkuvasti 3 viikon ip injektio, ja 5 hiiret (n = 5) sai vehikkeliä ohjaus (suolaliuos). Kasvaimen kasvu laskettiin mittauksista käyttäen jarrusatulat julkaisemassa [27].

Hiiri kudosten ja histologia

Kaikki kudokset joko formaliinilla tai jäädytettiin. Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H positiiviset solut näyttivät ruskea. Kontrollilevyt käsiteltiin samalla tavalla, ja käyttämällä isotyypin Abs tai jättämällä pois primaarinen vasta-aine negatiivisena kontrollina.

CD44 ja CD31 immunovärjäys jääleikkeillä suoritettiin, kuten aiemmin on julkaistu (28). Leikkeitä inkuboitiin hiiren anti-ihmis-CD44 (1:200 laimennus) tai rotan anti-hiiri-CD31 MAb (1:100 laimennus) O /N 4 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin kaniinin anti-hiiri /rotta biotinyloitua lgG: tä (1:200 laimennos) 45 minuuttia RT: ssä, ja sitten konjugoitua streptavidiinia /HRP (1:200 laimennos) vielä 30 minuuttia. Osiot kehitettiin käyttämällä DAB liuosta (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Negatiivisia kontrolleja leikkeet värjättiin isotyypin MAb tai jättämällä ensisijaisen vasta-aineilla.

TUNEL määritys apoptoottisten solujen

in vivo

Apoptoosi arvioitiin -tuumoriksenografti kudoksiin käyttämällä TUNEL-menetelmää ja TdT-fragEL in situ apoptoottisen detektioreagenssipakkaus (Calbiochem, San Diego, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Spesifisyys TUNEL reaktiivisuus vahvistettiin sopivilla negatiivinen (TdT jätetty pois merkinnöistä mix) ja positiivisia (käsitelty HL-60 liukuu yrityksen toimittamat) valvontaa. Objektilasit tutkittiin käyttämällä Leica valomikroskoopilla (Nussloch, Saksa).

Arvio immunovärjäyty-

Värjäys voimakkuus (0-3) arvioitiin valomikroskoopilla (Leica, Saksa) ja x40 tavoite . Kriteerit arvioinnissa käytetään olivat aiemmin raportoidun [29], jossa: 0 (negatiivinen, 25%); 1+ (heikko, 25-50%); 2+ (kohtalainen, 50-70%); 3+ (vahva, 75%) tuumorisolujen värjätään. Arviointi kudosvärjäyksellä tehtiin itsenäisesti kolme kokenutta tarkkailijaa (JH, JB ja YL). Kaikki näytteet pisteytettiin sokea ja keskimäärin laadut otettiin.

Tilastollinen

Kaikki numeeriset tiedot ilmaistiin keskiarvona saatujen arvojen ja keskihajonta (SD) laskettiin. Tiedot eri ryhmiin verrattiin käyttäen kaksisuuntainen opiskelijan t-testiä. Kaikki

P

arvot olivat 2-puolinen. Tilastollinen analyysi immunovärjäyty- intensiteetin eläinten -ksenografteissa kuvatussa tuoreessa julkaisussa [28]. Yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Dunnettin post hoc suoritettiin määrittämään merkitystä erot kasvukäyrät vuonna s.c. malli kasvaimen tilavuuden muutoksiin.

P

0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki numeeriset tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 4,00 paketti (GraphPad, San Diego CA).

Tulokset

Expression of CD44, CD147, MCT4 ja MRP2 in CD44 tai CD147-KD ja ohjaus solulinjat

PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr CaP solulinjat osoittivat vahvan positiivisen värjäytymistä CD44, CD147, MCT4 ja MRP2 (Fig. 1A). Seuraavat CD44 kaataa, väheneminen CD44-ilmentyminen myös liittyy samanaikainen vähentäminen ekspressiotasoja CD147, MCT4 ja MRP2 (Fig. 1A). Samoin, kun kaatamalla CD147, tasot CD147 ilmen- vähentää ja samanaikaisesti vähennettyä ilmentymisen CD44, MCT4 ja MRP2 nähtiin myös (Fig. 1A). Mitään havaittavaa värjäytymistä nähtiin soluissa inkuboitiin isotyyppikontrolleja (tuloksia ei ole esitetty). Immunofluoresenssikokeisiin värjäytyminen tuloksia eri CaP solulinjoissa on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. immunofluoresenssimenetelmällä tulokset ilmentymisen CD44, CD147, MCT4 ja MRP2 Cap solulinjat varmistettiin lisäksi Western blottauksella (kuvio. 1 B). PC-3M-luc solulysaateista myös immunosaostettiin joko anti-CD44-vasta-aine, anti-CD147-vasta-aineen tai normaali seerumi (Ig), ja immunoblotattiin CD44 ja CD147 Abs (Fig. 1 C). Sekä CD44 (90 kDa) ja CD147 (~ 50 kDa) vyöhykkeet havaittiin anti-CD44 ja anti-CD147-vasta-aineen IP lysaatit vastaavasti, mutta ei Ig saostetaan lysaatti.

edustaja konfokaali kuvia CD44, CD147 , MCT4 ja MRP2 (vihreä) immunofluoresenssi jälkeen kaatamalla CD44 tai CD147 (A). Tumat värjättiin PI: llä (punainen). Suurennus: kaikki kuvat × 400. Tyypillisen western blot on esitetty vahvistaa immunofluoresenssivärjäyksen (B). β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. scr: salattu shRNA ohjaus. PC-3M-luc solulysaateista immunosaostettiin anti-CD44, anti-CD147-vasta-aineen, ja normaali seerumi (Ig), jota seuraa immunoblottaus joko CD44 tai CD147-vasta-aineita (C). IB: immunoblottaus; IP: immunosaostus.

Knock alas CD44 tai CD147 herkistää yksikerroksisen CaP solujen DTX hoito

in vitro

KD (PC-3M-luc -KD-CD44 ja PC-3M-luc-KD-CD147) ja ohjaus (PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr) CaP solulinjat eri tasoilla CD44 ja CD147 ilmentyminen vastasi eri DTX hoitoon. IC

50-arvot (annos, saamiseksi 50%: n solukuoleman) korreloi voimakkaasti tasot CD44 ja CD147 ilmentymistä (Fig. 2A). Näin ollen PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr kontrollisoluja (korkea CD44 ja CD147) olivat vähiten herkkä (IC

50: 118 ja 104 nM, vastaavasti), kun taas PC-3M-luc -CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD soluja (alhainen CD44 ja CD147) olivat erittäin herkkiä DTX hoitoon (IC

50: 7 ja 19 nM, vastaavasti). Merkittäviä eroja (

P

0,05) IC

50 välillä havaittiin PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD soluja ja PC-3M-luc /PC-3M-luc-scr soluissa.

PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD CaP soluja käsiteltiin DTX (0.001-1000 nM) osoittivat muuttuja vastausta. Herkkyys CD44 /CD147-KD solujen eri pitoisuuksilla DTX verrattuna kontrolleihin oli ilmeisesti lisääntyi MTT-määrityksellä (A) (

P

0,01). Neljä CaP solulinjoja istutettiin 10 cm: n maljoilla ja käsiteltiin kiinteän DTX-annoksen (3,5 nM), 3 d. Käsittelyn jälkeen soluja viljeltiin kasvatusväliaineessa 7 d. Tulokset on esitetty, koska muodostuneiden pesäkkeiden määrästä. Tyypillisiä kuvia näytetään pesäkekasvun Cap solulinjoissa käsitelty VC tai DTX (B). Tyypilliset tulokset DTX herkkyyden pesäkkeet CaP solulinjoja on esitetty (C): ”▴” tarkoittaa, ettei merkittävää eroa keskimäärin pesäkkeiden välillä DTX käsiteltyjen solujen ja VC-käsitellyissä soluissa PC-3M-luc /PC-3M- luc-scr solulinjoissa (

P

≥0.05); ”○” tarkoittaa merkittävää eroa keskimäärin pesäkkeiden välillä DTX käsiteltyjen solujen ja VC käsiteltyjen solujen PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD solulinjoissa (

P

0,05); ”Δ” tarkoittaa merkittävää eroa keskimäärin pesäkkeiden välillä DTX käsiteltyjen solujen PC-3M-luc-CD44-KD /PC-3M-luc-CD147-KD solulinjojen ja VC käsiteltyjen solujen PC-3M-luc /PC -3M-luc-scr solulinjoissa (

P

0,05). Matrigel invaasiomääritys käytettiin tutkittaessa muutosta hyökkäyksen mahdollisuudet PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr ja PC-3M-luc-CD44 /CD147-KD soluissa. Invasiivinen potentiaali oli merkittävästi vähentynyt 25% ja 50% PC-3M-luc-CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD vastaavasti verrattuna 69% ja 64% PC-3M-luc ja PC-3M -luc-scr, vastaavasti (

P

0,01) (D). Edustavia valomikroskoopilla kuvia Cap soluinvaasiota (E). Neljä signaalin siirtoon molekyylejä (p-Akt, t-Akt, p-Erk ja t-Erk) arvioitiin tutkia suhdetta CD44, CD147 ja solujen signalointireittejä. Tasot p-Akt ja p-Erk vähenivät KD solulinjoissa verrattuna villin tyypin ja scr valvontaa. Edustavia tuloksia on esitetty (F). Kaikki tulokset olivat kolmen erillisen kokeen (keskiarvo ± SD, n = 3). DTX: doketakseli; KD: kaataa; p-Akt: fosforyloitu-Akt; p-Erk: fosforyloitu-Erk; scr: sekoitetun shRNA valvonta; t-Akt: yhteensä-Akt; t-Erk: yhteensä-Erk; VC: auton ohjaus; * Tarkoittaa 0,01

P

0,05; ** Osoittaa 0,001

P

0,01; *** Osoittaa

P

0,001.

Knock alas CD44 tai CD147 vähentää klonogeeniset kyky ja herkistää CaP pesäkkeet DTX hoitoon

Sen tutkimiseksi, KD of CD44 ja CD147 vaikuttaa kyky muodostaa klooneja joko yksin tai yhdistettynä DTX hoitoa, arvioimme KD ja ohjaus CaP viljelmässä. Pesäkkeiden määrä väheni huomattavasti joko ajoneuvon hallintaan tai DTX hoito PC-3M-luc-CD44 tai CD147-KD soluissa verrattuna PC-3M-luc tai PC-3M-luc-scr soluissa, kun taas ei ollut merkittävää ero (

P

≥0.05) välillä pesäkkeiden lukumäärä tuotettu PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr-soluja. Merkittäviä eroja (

P

0,05) keskimääräinen lukumäärä pesäkkeiden havaittiin 1) väliin DTX käsiteltyjen solujen ja VC käsiteltyjen solujen PC-3M-luc-CD44-KD /CD147-KD solulinjoissa; 2) väliin DTX käsitelty PC-3M-luc-CD44-KD /CD147-KD soluja ja VC käsitelty PC-3M-luc /PC-3M-luc-scr soluissa. Kuvat ovat on esitetty kuvassa. 2B. DTX vaste PC-3M-luc-CD44 tai CD147-KD solulinjoissa oli suurempi kuin PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr solulinjoissa (Fig. 2C). Kyky muodostaa klooneja (keskiarvo DTX-käsitelty pesäkettä /keskimääräinen ajoneuvon hallinnan käsiteltyjen pesäkkeiden%) oli 89%, 84%, 56% ja 74% PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc- CD44-KD, ja PC-3M-luc-CD147-KD solulinjoissa, vastaavasti.

Knock alas CD44 tai CD147 vähentää CaP soluinvaasiota

Kun kaatamalla CD44 tai CD147, soluinvaasiota väheni merkittävästi sekä PC-3M-luc-CD44-KD (

P

0,001) ja PC-3M-luc-CD147-KD solut (

P

0,01) verrattuna PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr ohjaus soluja (Fig. 2D). Suhteellisen suurempi vähennys invaasio kyky löydettiin PC-3M-luc-CD44-KD soluissa kuin PC-3M-luc-CD147-KD-soluissa (kuvio. 2D). Prosenttiosuus hyökkäys PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc-CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD-soluissa oli 70%, 62%, 22%, ja 47 %: lla (Fig. 2D). Edustaja kuvia kunkin solulinjan on esitetty kuviossa. 2E.

PI3K /Akt ja MAPK /Erk signaalinvälitysreittien liittyvät ilmaus CD44 ja CD147 Cap soluissa

Kun kaatamalla CD44 tai CD147, huomasimme, että ilmaus p- Akt ja p-Erk molemmat vaimentua PC-3M-luc-CD44 tai CD147-KD solujen verrattuna PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr ohjaus soluja, joissa on enemmän merkittävä väheneminen PC-3M-luc- CD44-KD-solut; ei ollut ilmeisiä muutoksia t-Akt ja t-Erk ilmentymistä kaikissa CaP solulinjoissa (kuvio. 2F).

Knock alas CD44 tai CD147 vaikuttaa tuumorigeenisyyteen, imusolmukemetastaaseja ja DTX herkkyys s.c. ksenograftimallissa

Kuten on esitetty tuumorin kasvun kuvaajat on esitetty. 3A, verrattuna scr ohjaus, viikoittain mittaukset CD44 ja CD147 KD ksenografteissa, käsitellään joko ajoneuvon ohjaus (VC) tai DTX (25 mg /kg), oli merkittävästi vähentynyt kasvaimen kasvu sekä VC (

P

0,05) ja DTX-käsiteltyjen ryhmien (

P

0,05) (vasemmalla ja keskellä paneelit). Ei ollut merkittäviä eroja kasvaimen kasvu PC-3M-luc villityypin ja PC-3M-luc-scr vierassiirrännäiset joko VC tai DTX testiryhmään (

P

0,05). VC-käsitelty ksenografteissa, hieman voimakkaampaa tuumorin kasvu oli CD44 KD ksenografteissa verrattuna CD147 KD ksenografteja, vaikka mitään selvää eroa välillä havaittiin kasvua CD44 KD ja CD147 KD kasvaimet (

P

0,05). DTX-käsitellyn ksenografteissa, kasvaimen ksenografteissa neljän CaP solulinjoissa oli pienempi kasvainten verrattuna vastaaviin VC-käsitelty ksenografteissa kaikissa aikapisteissä (

P

0,05). Hieman kasvainregressio nähdään DTX saaneilla CD44-KD ksenografteissa mutta mitään merkittävää eroa ei havaittu välillä CD44-KD ja CD147-KD kasvukäyrät (

P

0,05). Lisäksi vertasimme suhde kasvaintilavuudet välillä DTX ja VC käsiteltiin ksenograftit (DTX /VC) (Fig. 3A, oikea paneeli). Suhde CD44-KD ja CD147-KD kasvainten (DTX /VC) väheni nopeammin kun DTX tai VC hoitoa, mikä viittaa siihen, että KD joko CD44 tai CD147 voi aiheuttaa tukahduttaminen kasvaimen kehitystä verrattuna scr ja villin tyypin ksenografteissa.

Kasvaimen kasvukäyrät PC-3M-luc, PC-3M-luc-scr, PC-3M-luc -CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD ksenografteissa esitetään joko VC (juoni vasemmalla) tai DTX hoitojen (tontin keskellä). Suhde DTX käsiteltyjen versus VC kasvaimen tilavuuteen (DTX /VC) piirrettiin alusta hoidon loppuun kokeessa (käyrässä esitetään oikealla) (A). Lopussa kokeiden kasvaimen paino PC-3M-CD44-KD ja PC-3M-luc-CD147-KD ryhmää hiiriä oli ilmeisesti pienennetty PC-3M-luc ja PC-3M-luc-scr ryhmä hiiriä VC ja DTX hoitoja (

P

0,05) (B). Kuvat ovat kasvaimen kokoa ja imusolmukemetastaaseja eri ryhmistä ja hoitoja on esitetty (C). DTX: doketakseli; KD: kaataa; scr: sekoitetun shRNA valvonta; VC: auton ohjaus. * Tarkoittaa 0,01