Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpiä maailman. Genomi laajuinen seulonta transcriptome säätelyhäiriötä syövän ja normaalin kudoksen antaisi käsityksen molekyyliperustan CRC aloittamista ja etenemistä. Verrattuna sirutekniikalla, jota yleisesti käytetään tunnistamaan transkription muutoksia, äskettäin kehitetty RNA-seq tekniikka on kyky havaita muita epänormaaleja asetusten syövän transcriptome, kuten vaihtoehtoisen silmukoinnin, uusia historiatiedot tai geenin fuusio. Tässä tutkimuksessa, suoritimme suuren suoritustehon transcriptome sekvensointi ~ 50 × lähetyksenä CRC, viereisen ei-kasvain ja kaukana normaalista kudoksesta. Tulokset paljastivat syöpä-spesifinen, differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja ero vaihtoehtoisen silmukoinnin, mikä viittaa siihen, että solunulkoinen matriisi ja metaboliset reitit aktivoituvat ja geenit, jotka liittyvät solun homeostaasin tukahdutetaan CRC. Lisäksi yksi kasvaimeen rajoitettu geenin fuusio, PRTEN-NOTCH2, havaittiin myös kokeellisesti vahvistettu. Tämä tutkimus paljastaa joitakin yhteisiä piirteitä kasvaimen invaasion ja tarjoaa kattavan selvityksen CRC transcriptome, mikä antaa paremman käsityksen monimutkaisuus sääntelymuutosten aikana kasvaimen kehittymisen.

Citation: Wu Y, Wang X, Wu F, Huang R, Xue F, Liang G, et al. (2012) transcriptome profilointi Cancer, vieressä Non-kasvain ja Distant Normal kudokset siitä peräsuolen syövän Patient Deep Sequencing. PLoS ONE 7 (8): e41001. doi: 10,1371 /journal.pone.0041001

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 13 joulukuu 2011; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 08 elokuu 2012

Copyright: © Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Medical Innovaatiohankkeiden Fujianin maakunnassa (2012-CXB-6). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpiä yli miljoona uutta tapausta maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Metastaattinen CRC on yleensä parantumaton; seurauksena, CRC on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien [1], [2]. CRC syntyy adenomatoottisten polyyppien ja kehittyy paikallisesti invasiivisia ja myöhemmin metastaattinen. Eteneminen CRC on monivaiheinen prosessi ja voidaan jakaa neljään vaiheeseen (Dukes pysähdyspaikan järjestelmä), joka perustuu määrin kasvaimen invaasion [3], [4]. Aiemmissa tutkimuksissa useita molekyylitason mekanismeja, kuten perimän epävakaisuuden [5], [6], [7], DNA: n menettämisen korjaavien geenien [8], [9] ja poikkeava epigeneettiset muutokset [10], [11] (ks tarkastelu in [12]), osoitettiin edistää CRC. Lisäksi puolueeton lähestymistapa korkean seulontaan ilmaisun muutosten välillä CRC ja normaalin kudoksen paljasti useita ja ennustavia biomarkkerit [13], [14], [15]. Kuitenkin kattava käsitys etenemistä CRC ja asianmukaisen ennusteen edelleen haastava tehtävä johtuen geneettisen heterogeenisyyden CRC ja koko genomin muutoksia löytyi tämä syöpä [12], [16].

Prior tutkimuksia perimän muutoksia ovat paljastaneet, että somaattisia muutoksia, kuten pistemutaatiot, DNA uudelleenjärjestelyjä ja kopioluvun vaihtelut (tarkistetaan [12]), voi johtaa mutaatioiden että ajaa kehitystä CRC. Seurauksena muutosten syövän genomin, järjestämällä uudelleen transcriptome johtaa epänormaalia solujen käyttäytymistä ja siten suoraan vaikuttaa syövän etenemiseen [17], [18]. Opiskelu syöpä transcriptome ansiosta voimme täyttää kuilu kuljettajan mutaatioiden ja syöpäsolujen käyttäytymistä, mutta myös auttaa meitä tunnistamaan muita ehdokas syöpään liittyvien mutaatioiden ja molekyyliperustan geenisäätelystä [17]. Viimeaikainen kehitys massiivisesti rinnakkaisen sekvensoinnin (RNA-seq) tarjoaa tehokkaan lähestymistavan profiloida transcriptome tehokkaammin ja Tarkempaa [19]. Etuna RNA-kohdat on, että tämä tekniikka tekee toteutettavissa tutkimuksen syövän transcriptome monimutkaisuus, mukaan lukien vaihtoehtoisen silmukoinnin, isomuodon käyttö, geenifuusiot ja uusia kopioita (tarkistetaan [20], [21]). Huolimatta esiintyvyys käyttäen RNA-seq selvitystä eri syövän transcriptomes [22], [23], [24], [25], syvä merkinnästä CRC geeniekspressioprofilointi ei ole tehty.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin perusteellisesti käsinkirjoittaa transcriptomes CRC kudoksen vieressä ei-kasvainkudoksessa ja kaukana normaalista kudoksesta yhdestä potilaan RNA-seq. Ensin löysimme useita syöpää erityisiä säädeltyyn geenejä ja vaihtoehtoisen silmukoinnin. Toiseksi seuraava Gene ontologia (GO) ja polun analyysi säädeltyyn geenien ja isomuodot tunnistimme mahdollisena polku ja toiminnallisen luokan geenejä, jotka ovat merkityksellisiä CRC etenemisen, jota ei ole raportoitu aikaisemmin. Kolmanneksi, havaitsimme uuden geenin fuusio tapauksessa erityisesti CRC kudosten ja varmistetaan kokeellisesti fuusio tuotteen. Lopuksi vahvistamaan sekvensointialustamme tuloksia, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) käytettiin vahvistamaan geeniekspression ero CRC ja normaalia kudosta.

Tulokset

karakterisointi sekvensointi ja kartoitus

kolme näytettä – CRC kudos (vaihe III), viereisen ei-kasvainkudoksessa ja etäinen normaalia kudosta – kerättiin 57-vuotiaan naispotilas. Kliinis tietoa potilaan on esitetty kuviossa. S1. Kaikki kolme näytettä altistettiin massiivisesti rinnakkaisia ​​pariksi-end-cDNA-sekvensoinnin avulla. Kaikkiaan saimme 36500000, 33100000 ja 29900000 lukea parit CRC, viereisen ei-kasvain ja etäinen normaalia kudosta, vastaavasti. Käytimme Tophat yhdenmukaistaa lukee sen UCSC (University of California Santa) viite ihmisen genomin Hg19. Yksilöllisesti Tasattu lukee kolmesta näytteestä vaihteli 20800000-25900000 paria. Osuus lukee että kartoitettu Ensembl viittaus geenit vaihteli 75%: sta 86% kolmesta näytteestä. Keskimääräinen kattavuus sekvensointialustamme syvyys oli noin 50 kertaa ihmisen transcriptome (noin 113 Millon bp, joka perustuu kokonaispituus yksilöllisesti selityksin eksonin alueelle Ensembl tietokanta). Lisäksi vain ~ 1% lukee kartoitettiin ja rRNA, mikä osoittaa, että kirjastot ovat rakennettuja ja uskollisesti edustavat ilmaus RNA ployA hännät. Yksityiskohdat kartoituksen tulokset on lueteltu taulukossa 1.

Analyysi erilaisesti ilmaisi geenien

mittaamiseksi geenien ilmentyminen ja tunnistaa ilmentyvät eri geenit (DEGS) joukossa näytteitä käytimme menetelmä Cuffdiff [26] arvioida geenien ilmentymistä ja tunnistaa merkittävästi väärin säädellystä geenejä. Normalisoidut ekspressiotaso kunkin geenin mitattiin Fragments Per kiloemästä eksonin miljoonasosaa fragmentteja kartoitettu (FPKM). Vaatimalla, että FPKM oli suurempi kuin yksi, havaitsimme 14854-15168 ilmaistuna geenejä jokaisen näytteen, joka sisälsi suurimman osan selityksin ihmisen viite geenejä (katso taulukko S1 lisätietoja). Olemme edelleen analysoineet korrelaatio geenien ilmentymisen joukossa näytteitä. Maailmanlaajuinen profiilit geeniekspression yleensä korreloi voimakkaasti Pearsonin korrelaatiokerroin, jotka vaihtelevat 0,90-0,94 (Fig. 1A). Lisäksi klusterointi analyysi osoittaa, että CRC transcriptome on erotettava viereisen ei-kasvainkudoksessa ja kaukana normaalista kudoksesta (Fig. 1 B).

V: Sirontakuvaajan maailmanlaajuisen ilmaisun näytteiden välillä; Pearsonin korrelaatiokerroin on esitetty; B: Hierarkkinen klusterointi erilaisesti ilmaisi geenien (DEGS) joukossa näytteitä; C: Venn kaavio havainnollistaa päällekkäisen DEGS näytteiden välillä; D: Volcano tontteja kaikkien geenien jokaisessa vertailussa. Punainen ja siniset pisteet osoittavat, että ylä- ja alassäädetty DEGS oli merkitsevä q arvoihin alle 0,01.

Olemme havainneet 1660, 1528 ja 941 merkittäviä DEGS välillä CRC ja viereiseen kudokseen, CRC ja normaalin kudoksen ja viereisen ja normaalin kudoksen, vastaavasti (täydellinen luettelot DEGS on esitetty taulukossa S1). Päällekkäisyyttä DEGS: n joukossa kolme näytettä on esitetty Venn-kaavio on esitetty. 1C. On huomionarvoista, että CRC kerää enemmän säädeltyyn geenit (1660 geenien CRC vs. vieressä, 1528 geenien CRC vs. normaali) kuin kahden muun kudoksia, jotka ovat 1,5-kertaisesti runsaammin kuin löytyy muista kudoksista (941 geenien normaalia vs . vieressä), osoittaa syövän erityisiä kyseeseen CRC transcriptome, kuten on esitetty ”tulivuoren plot” geenin ilmentymisen profiilien (Fig. 1 D). Verrattaessa suuntaan DEGS määrä ylä- ja alas-geenien välillä havaittiin CRC ja toiset kaksi näytettä oli lähes sama. Sitä vastoin lisääntyi hieman alas geenien havaittiin viereisen ei-kasvainkudoksessa verrattuna viereiseen syövän ja normaalin kudoksen. MA-juoni geeniekspressioprofiilien (Fig. S2) osoittaa, että merkittävä määrä säädeltyyn geenien ei painotettu voimakkaasti ilmentyvien geenien.

Aiemmissa tutkimuksissa useita keskeisiä geenejä merkityksellisiä CRC on tunnistettu. Sen määrittämiseksi, ovatko tulokset olivat kanssa raportoituihin, me järjestelmällisesti verrattuna muutokset spesifisten CRC liittyvien geenien kanssa mainittuja muissa tutkimuksissa. Huomasimme, että 15-prostaglandiini dehydrogenaasi (15-PGDH), nopeutta rajoittava entsyymi, joka katalysoi hajoamista prostaglandiini [27], on merkittävästi säädellä vähentävästi CRC syövän kudoksissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Aktivointi COX-2 ja menetys 15-PGDH ovat yhteisiä onkogeenisiä tapahtumia, jotka havaittiin -80% CRC tapauksista [28]. Lisäksi löysimme toisen kasvaimia estävä,

TGFBR2

[29], joka oli alassäädetty sekä CRC ja syöpää viereisten kudosten. Koska inaktivointi TGFBR2 koordinoidaan siirtymistä adenooma ja karsinooma, asteittainen inaktivaatio TGFBR2 syövän läheisen ja tuumorikudoksia odotetaan. Olemme myös havainneet muiden geenien, jotka on väärin säädellystä CRC, mukaan lukien APC [30], MYH [31], CD133, IDH1 ja MINT2 [10]. Sen sijaan, useita tunnettuja kuljettajan tekijöitä, jotka ovat usein mutatoitunut CRC, mukaan lukien MINT3 [32], [33], MSH2 [34] ja MSH6 [9], ei osoittanut muutosta ilmentyminen tässä tutkimuksessa, mikä viittaa siihen, että geneettinen heterogeenisyys CRC tai mutatoitunut tuote olla haitallista, vaikka ilmentymistaso ei vaikuta.

Functional rikastamiseen analyysi erilaisesti ilmaisi geenien

ymmärtää paremmin funktio DEGS teimme rikastuminen analyysi Gene ontologia että säädeltyyn geenejä. Tunnistamaan syövän erityinen toiminnallinen luokkia, ensin suoritetaan rinnakkain rikastamiseen testit merkittävästi ylös- ja alas geenien havaitsemia pair-wised vertailuja CRC, viereisen ei-kasvain ja normaali kudos käyttämällä online työkaluilla DAVID [35 ]. GO luokat, joita on huomattavasti rikastettu säädeltyyn geenien vertailu CRC vs. syövän vieressä ei-kasvainkudoksessa ja CRC vs. normaali kudos, mutta ei vieressä ei-kasvain vs. normaali kudos, valittiin. Kaikkiaan ylä- ja alas geenien CRC oli luokiteltu 47 syöpää erityisiä toiminnallisia luokkia (Fig. 2). Mielenkiintoista, vaikka tunnistimme yhtä paljon ylä- ja alas geenien in CRC, havaitsimme ylimäärä merkittäviä GO luokat CRC up-geenien, mikä viittaa siihen, että säätely ylöspäin syöpää erityisiä geenejä on toiminnallisesti tärkeämpää syöpä etenemistä. Esimerkiksi merkittävä GO termejä jopa geenien, jotka sisältävät ”solujen vaeltamiseen”, ”soluliikkuvuus” ja ”soluväliaineen sitova”, on merkitystä syövän invaasio [15], [36], [37]. Lisäksi geenit liittyvät aineenvaihdunnan muutoksia, mukaan lukien ”kollageeni aineenvaihduntaa”, ”monisoluisista organismin makromolekyylin aineenvaihduntaa” ja ”monisoluisten eliöiden catabolic prosessi”, heijastavat muuttaminen kasvain aineenvaihdunta [38], [39] ja myös yli- edustettuina CRC. Päinvastoin, geenejä, jotka säädellä vähentävästi CRC ovat rikastuneet useita toiminnallisia liittyvissä prosesseissa homeostaasiin.

Olemme vain Valitsimme GO luokkia rikastettu syöpään liittyvien säädeltyyn geenit mutta ei rikastuttaa säädeltyyn geenejä, jotka tunnistettiin kun vertaamalla normaalia kudosta, jonka vieressä ei-kasvainkudoksessa. Syöpä-erityinen säädeltyyn geenejä luokiteltiin merkittävästi ylös- tai alaspäin geenien syöpäkudoksessa. Taso merkitys on merkitty eri väreillä. ”S1”, ”s2” ja ”s3” indikaattorit tarkoittavat ”syöpä”, ”viereisen ei-kasvain” ja ”etäinen normaali” kudoksiin, vastaavasti.

informatiivisempi analyysi toiminnallisen annotation voidaan saavutetaan tutkimalla rikastuminen differentiaalisesti ilmentyvien geenien tietyssä reitin. Käytimme DAVID [35] analysoidaan, mitkä Kegg koulutusjakson rikastettiin CRC-erityisiä väärin säädellystä geenejä. Polut rikastettu DEGS on lueteltu taulukossa 2. soluväliaineen (ECM) reseptorivuorovaikutuksessa koulutusjakso on yleisesti vaikutti kaikissa pareittain vertailuissa ja tällainen geeni sääntelyn muutoksia ECM koulutusjakson olivat paljon vakavampia CRC kudoksessa. Lisäksi fokaalisen adheesion polku on rikastettu DEGS tunnistaa CRC-kudoksesta.

kokeellisesti vahvistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistaa RNA-seq ekspressiotasot valittujen geenien validoitu kussakin näytteestä kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR (qRT-PCR). Valitsimme viisi kandidaattigeenit (COL1A1, COL3A1, FN1, SPP1, ja ITGB5) ECM: stä polku (mukaan geenin ilmentymisen tasoa ja käännä muutoksen välillä CRC ja normaalin kudoksen), jotka ilmentyvät differentiaalisesti mukaan Cuffdiff (taulukko S2). Käytimme GAPDH kuin endogeeninen kontrolli näissä reaktioissa. QRT-PCR Tulokset vahvistivat, että kaikki nämä kandidaattigeenien osoitti lähes identtinen muutoksia geenien ilmentymisen, jotka havaitaan kautta RNA-seq tekniikkaa, kuten on esitetty kuviossa. 3.

qRT-PCR suoritettiin viisi geeniä, jotka on tunnistettu ero ilmentyvien geenien välillä CRC ja kahden muun kudoksiin. Ilmentymisen taso kunkin geenin normalisoitiin tasoon normaalissa kudoksessa. ”S1”, ”s2” ja ”s3” indikaattorit tarkoittavat ”syöpä”, ”viereisen ei-kasvain” ja ”etäinen normaali” kudoksiin, vastaavasti.

tutkia näiden geenien olivat aina ylös -regulated että paksusuolen syövän, suoritimme qRT-PCR testata ilmentyminen muuttuu viiden geenien välillä pariksi syövän ja normaalin kudoksen kymmenen potilasta lisää. Tuloksena on yksi pariksi näytteitä yhdestä potilaasta jätettiin pois johtuen suuresta vaihtelusta teknillisten rinnakkaista. Tulos jäi potilaista osoitti, että lukuun ottamatta ITGB5, muut kolme geeniä COL1A1, FN1and SPP1were säädellään ylöspäin kuusi syöpänäytteissä, ja COL3A1 oli säädelty neljässä syöpänäytteissä (taulukko S3), mikä viittaa siihen, ECM-reitin geenit ovat yleensä säädellään ylöspäin peräsuolen syöpä. Lisäksi, syöpä näytteet viidestä potilaasta voidaan ryhmitelty yhteen ilmaisun mukaisesti määriä näitä viisi geeniä (Fig. S3).

Analyysi vaihtoehtoisen silmukoinnin ja ero käyttö isoformien

Yksi geenilokukseen voi ilmaista useita isomuotoja vaihtoehtoisen silmukoinnin (AS). Otteen moninaisuus johtaa muovi transkription verkkoja syöpä, jotka ovat tärkeitä tuottaa epätavallisia ominaisuuksia syöpäsolujen [40], [41]. Lukuisista molekyylitason mekanismeja, jotka voivat tuottaa AS isoformeja, eksonin ohittaminen katkaista toiminnallinen verkkotunnus on yleisin tapa tuottaa proteiinia tuotteita vaihtoehtoisia toimintoja nisäkkäillä [41]. Meillä on siis suoritettu genomin laajuinen seulonta tunnistaa syöpää rajoitettu eksonin ohittaminen tapahtumia käyttämällä ohjelmistoa MISO (seos isoformien) [42]. Kaikkiaan havaitsimme 14072, 14537 ja 13865 eksonin ohita tapahtumia CRC, viereisen ei-kasvainkudoksessa ja normaali kudos, tässä järjestyksessä. Me seuraavaksi verrattiin ero eksonin ohitus (DES) tapahtumia (taulukko S4) joukossa näytteitä, kuten on esitetty kuviossa. 4A. Huomasimme, että: i) vain pieni osa DES tapahtumien jaettiin kolmiosaisissa verrattuna, mikä viittaa siihen, että huomattava osa geeneistä ovat alle syöpää sääntely vaihtoehtoisen silmukoinnin; ja ii) määrä DESS normaalin ja vieruskudos on pienempi kuin määrä DES tapahtumien välillä CRC ja viereiseen kudokseen tai CRC ja normaali kudos, joka osoittaa tehostettu käyttämällä ohjaavaa isomuotojen syövässä. Koska ES tapahtumat ovat todennäköisesti muuttuvat proteiinin toiminnan vaikuttamalla toiminnallinen toimialallaan määrä DES tapahtumia CRC kudos on suunnilleen kaksinkertainen verrattuna ei-syöpä kudosta, mikä osoittaa, että liitos polku voidaan merkittävästi aktivoida CRC tuottamaan erilaisia ​​toimivia tuotteita. Olemme tarkastetaan ilmentyminen viipalointi, jotka on johdettu NCBI ja SpliceAid 2 (https://www.introni.it/spliceaid.html), ja havaitsi, että neljä liitos tekijöistä, mukaan lukien RBFOX1, SPRK1, MBNL1 ja SRRM2, olivat merkittävästi väärin säädellystä välillä syöpäkudoksessa ja ei-syöpäkudoksessa (taulukko S1), mikä viittaa siihen, että poikkeava silmukoinnin aktiivisuus syöpäkudoksessa voi liittyä kanssa häiriöstä silmukoinnin tekijöistä.

(DES) tapahtumien joukossa näytteitä. V: Venn kaavio lukumäärästä DES tapahtumia; B: Päällekkäisyys välinen ilmentyvät eri geenien ja geenien DES tapahtumia.

Vaikka DEGS on jo osoitettu olevan merkittäviä CRC, olisi mielenkiintoista selvittää verran päällekkäisyyttä DEGS ja geenejä DES tapahtumia. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, vain kolme geeniä (3/752, ~0.4%) oli samanaikaisesti muutokset vaikuttavat transkription säätelyyn ja transkription jälkeisen sääntelyn (eli vaihtoehtoinen silmukointi).

Tunnistaa erittäin luotettava syöpään liittyvien geenien kanssa DES tapahtumia, me suodatettiin DES tapahtumien sarja vaiheita (Materiaali ja menetelmät), kaikki DES tapahtumista (taulukko S4), ja saatu 20 luotettava DES tapahtumia 14 syöpään liittyvien geenien (taulukko 3). Kuusi geeniä, mukaan lukien ADD3, CTNND1, EPB41L3, F3, MUC4 ja PDGFA, osoitti syöpään kudosspesifisiä DES tapahtumia. Kuten on esitetty kuviossa. 5. suhde risteys-lukee numero eksonin sisällyttämistä vs. eksoni syrjäytyminen oli ilmeisesti pienempi syöpäkudoksessa kuin kahdessa muussa kudoksiin. Lukuoperaatioista kartoitettava muut viisi geenejä kuvassa. S4-S8 vastaavasti.

RNA-Seq lukee olivat kartoitus UCSC viite genomin (hg19) of ADD3. CRC kudos raidoista näkyy punaisena, viereisessä ei-kasvain vihreänä ja normaalia kudosta sinisellä. Laskurit lukee ulottuu risteyksessä eksonit on esitetty.

erilaisesta silmukoitumisesta ADD3 on havaittu, että ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [43], ja hiiren rinta- kasvaimen [44 ]. Mielenkiintoista, ADD3 osoitti kasetti eksonin osallisuuden näissä kahdessa tutkimuksessa, mutta se osoitti kasetti eksonin syrjäytymisen samassa paikassa tutkimuksessamme. Eräässä toisessa tutkimuksessa ihmisen alkion kantasolujen (hESCs), kasetti eksonin ulkopuolelle on myös todettu hESCs suhteessa johdetun sydämen progenitorit [45]. Jopa edellisessä keuhkosyöpä tutkimuksessa oli myös heterogeeninen näyttöä vaihtoehtoisen silmukoinnin malleja ADD3 (neljä 18 keuhko-syöpäpotilaat osoitti kasetin eksoni poissulkemista varten ADD3) [43]. Siksi lisätutkimukset ADD3 pitäisi tehdä ymmärtää suhdetta sen vaihtoehtoisen silmukoinnin syöpään.

Bioinformatics ennustaminen geenin fuusio tapahtumista

Käytimme kaksi algoritmeja, purkaa ja Tophat-Fusion, jotta havaita geeni fuusio perustuu parin päät lukee eri näytteissä. Vaikka eri tulokset saatiin aikaan laukaisemiseksi ja Tophat-Fusion (taulukko S5), fuusio tapahtuma välillä PTGFRN ja NOTCH2 oli ainoa syöpää erityisiä fuusio tapahtuma tunnistetaan molemmat algoritmit. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, PTGFRN ja NOTCH2 erotetaan kromosomissa 1 3 miljoonaa bps, ja villityypin muodot transkriptoidaan vastakkaisiin suuntiin. Meidän syöpänäytteessä, olemme havainneet, että ensimmäisen intronin PTGFRN on fuusioitu 3 ’liitoskohtaan 17. eksonin NOTCH2 kimeerisen PTGFRN-NOTCH2 transkriptin. On syytä huomata, että osittainen introni alue PTGFRN on läsnä kypsä mRNA koska tämä fuusio tapahtumaan (Fig. 6B). Meillä on siis erikseen suunniteltu alukeparin, joka koordinoi ensimmäisen intronin PTGFRN ja eksonin alueelle NOTCH2 vahvistaa tätä fuusio normaalia, viereisen ei-kasvain ja syöpäkudoksessa RT-PCR: llä. Tulokset osoittivat, että tämä fuusio tapahtuma on syöpä-rajoitettu (Fig. 6C), joka on sopusoinnussa johtopäätöksiä meidän RNA-seq analyysi. Lisäksi olemme tutkineet PTGFRN-NOTCH2 geenin fuusio lisäksi kymmenen näytettä RT-PCR: llä, mutta yksikään niistä osoitti geenin fuusio, mikä viittaa siihen, että PTGFRN-NOTCH2 voi olla harvinainen geenin fuusio kolorektaalisyövässä.

V: välinen kromosomigeeni- fuusio käsittää PTGFRN (näkyy keltainen) ja NOTCH2 (näkyy vihreänä) loci; etäisyys näiden kahden loci on noin kolme Mbp. Fuusio tapahtumia havaittiin pari loppuun lukee joka kesti fuusio alueella ja lukee ylittäneiden fuusio alueella; B: vertaaminen lukee kartoituksen tulokset fuusio transkriptien joukossa kolme näytettä. Rakenne fuusiogeenin on alareunassa. Lukuoperaatioista laskee ”normaali”, ”viereisen ei-kasvain” ja ”syöpä” kudos on merkitty nimellä ”vihreä”, ”sininen” ja ”punainen” baaria, vastaavasti. C: RT-PCR: llä sekvensointi tulokset fuusio transkriptin kolmen näytteen. PCR-aluke on merkitty paneeli A. D: ennustaminen ORF ja sen toiminto PTGFRN-NOTCH2 by bioinformatiikan, aloituskodoni käytti aloituskloonia NOTCH2 ja lopetuskodonin (punainen ”*”), joka sijaitsee fuusio sekvenssin PTGFRN. Fuusiopeptidin sisälsi verkkotunnuksia (ennusti CD-Search NCBI) sen alue NOTCH2, kuten EGF-domeenia, mutta joitakin keskeisiä verkkotunnuksia proteiinissa NOTCH2, kuten NOTCH domain ja ankyriinitoistot, puuttuivat.

Käyttämällä osa-spesifisiä käänteisen transkription ja PCR, olemme huomanneet, että fuusio-geeni transkriptoidaan promoottorista ja NOTCH2. Olemme ennustettu ORF fuusiogeenin käyttämällä aloituskodonin NOTCH2 (Fig. 6D). Tämä ennustettu proteiini vastaa 934aa peptidisekvenssi ensimmäisen 917aa peräisin NOTCH2 (nämä sekvenssit lueteltu Täydentävä S1). Me selityksin proteiinisekvenssin käyttäen CD-Hakutyökalut NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi, tietokanta: CDD), ja havaitsi joitakin EGF verkkotunnuksia peptidin alueita NOTCH2. Kuitenkin joitakin keskeisiä verkkotunnuksia NOTCH2, kuten NOTCH domain ja ankyriinitoistot, menetettiin fuusioproteiinin (Fig. 6D). Siksi me päätellä, että geeni fuusio PTGFRN-NOTCH2 tässä tutkimuksessa näytti olevan enemmän kuin menettämisestä toiminnon mutaatioita, yhdenmukaiset äskettäin kuvattu myelooisen leukemian [46], pään ja kaulan okasolusyöpä [47], [ ,,,0],48]. Kuitenkin yleinen ilmentyminen villin tyypin PTGFRN, NOTCH2 ja sen tavoitteet (PTCRA, HES1, HES5) ovat vähemmän vaikutusta syövän (taulukko S6), mikä osoittaa, että 1) PTGFRN-NOTCH2 fuusio voisi tapahtua osajoukko syöpäsolujen tai 2) että fuusio on heterotsygoottinen syöpäkudoksen ja fuusio alleeli saattaa ekspressoituu erittäin alemmalla tasolla. Lisätutkimukset ovat tarpeen ymmärtää erityisen mekanismia fuusio tapahtuman ja sen toiminnallinen seuraus.

Keskustelu

Käyttäen RNA-seq tekniikka, me profiloitu koko transcriptomes CRC, viereisen ei-kasvain ja normaali kudos erittäin perusteellisesti. Kaikkiaan noin 50-70 miljoonaa lukee kertyi per näyte, jonka avulla voimme mitata geeniekspressiota runsauden laajalla [49]. Määrä ilmentyvien geenien (FPKM 0) havaittu tutkimuksessamme on noin 67% koko UCSC viittaus geenien näytettä kohti, eli suurin osa transcriptome.

Vaihtoehtoinen geenin ilmentymisen säätelyyn voidaan saavuttaa transkription ja transkription jälkeisen sääntelyn. Ensimmäinen luokka häiriöstä CRC transkriptiotasolla on hyvin tutkittu käyttäen sirutekniikalla [14], [15], [50]. Määrällisesti toisen luokan sääntelyn muutos pysyy haasteellisena vaikka keksintö eksonin array [51]. RNA-seq teknologia mahdollistaa samanaikaisen tutkimuksen näiden kahden eri mekanismeja [19], [26], [52], [53]. Tutkimuksessamme selvitimme transkription dysregulation analysoimalla degs. Sitten käytimme pari-end cDNA sekvensoinnin tehokkaammin tunnistaa vaihtoehtoisen silmukoinnin. Lisäksi käytettäisiinkin MISO algoritmi, pystyimme mittaamaan suhteellista ilmentymistason eri isomuotojen tuottaman eksoni-ohita tapahtumia, jotka ovat kvantitatiivisia mittauksia vaihtoehtoisen silmukoinnin. Mielenkiintoista, geenit, joita nämä kaksi eri sääntelymekanismeja ovat pitkälti riippumattomia (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, monipuoliset ohjelmoida syövän transcriptome.

Paikallinen invaasiota ja etäpesäkkeiden syöpä on pidetty monivaiheinen prosesseja koostuu sääntely muuttuvan solunsisäisten virtapiirejä ja monimutkainen vuorovaikutus syöpäsolujen ja niiden mikroympäristön [36], [54], [55]. Aikana ja metastaasit, usein remodeling soluväliaineen mahdollistaa syöpäsolujen levittää primaarikasvaimista ja tunkeutua normaalia kudosta. Tutkimuksessamme olemme huomanneet, että monet geenit liittyvät soluväliaineen (ECM) reseptorin vuorovaikutuksia ovat erittäin väärin säädellystä on syöpää rajoitetusti. ECM muodostuu useita erilaisia ​​makromolekyylejä, mukaan lukien kollageeni-tyypin proteiineja, laminiinit, tenaskiini ja muiden adheesiomolekyylien [55]. Kaikki kollageenin tyypin geenejä, mukaan lukien tyypin I-IX kollageenin, ovat säädelty 10- 1000-kertaiseksi syöpäkudoksessa (taulukko S7). Vaikka on jonkin verran vastaavuutta välillä havaintojemme ja aikaisemmat tutkimukset ylössäätöä kollageenin mRNA kolorektaalisyövässä kudoksessa [56], läpitunkeva induktio kollageenin mRNA: iden on ainutlaatuinen tutkimuksemme. Nämä havainnot viittaavat siihen, että uudelleenohjelmointi on kollageeni perheen verkosta paksusuolensyöpä kehitys voi olla paljon monimutkaisempi kuin aikaisemmin on luultu. Lisäksi meillä on myös huomattava, että jäsenet matriisin metalloproteinaasi (MMP) -perheen, jotka hajoavat ECM rakenteita [55], [57], myös indusoituu merkittävästi syövän kudoksissa, yhdenmukaisia ​​aiemman raportin [58]. Kansi muutos ilmentymisen MMP vaihteli 10-kertaiseksi (MMP-1, MMP3 ja MMP14) ja 554-kertainen (MMP7). Samaan aikaan, muut solu-solu-adheesio-sukua olevien molekyylien, kuten laminiinit (LAMA4, LAMA5, LAMB1, LAMB2 ja LAMC2) ja integriinit (ITGA5, ITGA5, ITGB5, ITGA11 ja ITGBL1), ovat koholla syöpäkudoksissa. Olemme myös havainneet ylös-säätely verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF), mikä viittaa siihen, että ”angiogeneesi kytkin” on aktivoitu syöpäkudoksessa. Yhdessä globaalin säätely ylöspäin ECM reitin ja angiogeenisen kasvutekijän osoittaa, että CRC eteneminen johtaa massiivinen ECM remodeling ja laajentamiseen uuden aluksen verkkoja. Lisäksi aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että geenien ECM-reitin tehostetussa epigeneettisellä muutos [59] ja voi siten olla uusia prognostisia biomarkkerit; näin, meidän tutkimus antaa tarkemman käsityksen käyttäen ilmaisua muutoksia ECM koulutusjakson jäsenten ehdokkaaksi biomarkkereita.

Gene fuusio, joka johtuu usein genomisesta poikkeavuus, on osoitettu olevan keskeinen mekanismi kimeerisen ”onkogeenien” jotka käynnistävät kasvaimien syntyyn tai myötävaikuttaa taudin etenemiseen (tarkistetaan [60]). Käyttäen RNA-seq tekniikka, ilmennetty geeni fuusio transkripti, joka on todennäköisesti tuottaa toimiva tuote voidaan havaita [23], [61]. Koska yhteinen geeni fuusio on harvinaista CRC [5], yksilöidään tapauskohtaisesti geeni fuusio voi auttaa ymmärtämään monimutkaisuutta molekyyliperustan CRC kehitystä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme syöpää rajoitettu geeni fuusio välillä PTGFRN ja NOTCH2 CRC. Lisäksi geenifuusioita immunoglobuliinin lambda muuttujat ja IGLL5 havaittiin suodatuksen tulos Tophat-Fusion (taulukko S5), joka voisi edustaa immuuni uudelleenjärjestelyjä kasvaimeen liittyvien B-solujen. Aiemmat tutkimukset ehdotti, että seurauksena geenin fuusio voi olla i) muutos geenin ilmentymisen [62]; tai ii) sukupolven katkaistun tai kimeerinen proteiini, jolla on eri tehtävä [63]. Koska PTGFRN-NOTCH2 transkripti sisältää vain pieni osa PTGFRN ja ilmentymistä PTGFRN ja NOTCH2 ei säädellä vähentävästi CRC, me selvää, että alkuperäiset toiminnot nämä kaksi geeniä eivät vaikuta fuusio tapahtuman, ja siksi voitto tehtävä tämän -fuusiorakenteen on erityisen kiinnostava myöhempää tutkimusta. Ottaen huomioon, että suurin osa fuusiogeenin koostuu NOTCH2, tehtävä tämä fuusio tuotteen voisi olla sukua että NOTCH2. NOTCH2 on homologi Notch1 ja on merkitystä erilaisissa kehitys- prosesseja ohjaamalla solun kohtalon päätöksiä. NOTCH2 ilmentyminen on osoitettu olevan prognostinen ennustajan ja liittyy kasvaimen erilaistumiseen asema CRC [64], [65]. Lisäksi voitto toiminta katkaistu NOTCH2 kanssa nonsensemutaatiota aiheuttaa autosomaalinen hallitseva luuston häiriö [66]. Siksi NOTCH2 voi olla tärkeä rooli CRC kehitys sekä PTGFRN-NOTCH2 geeni fuusio voisi esitellä hallitseva kielteiset vaikutukset normaaliin kehitykseen ohjelman.

Materiaalit ja menetelmät

Sample tietoa

kirjallinen suostumus potilailta saatiin, ja tämä sarja tutkimuksia tarkasteli ja hyväksynyt institutionaalisten eettisten toimikuntien Fujian Hospital (Fuzhou, Kiina). Kolme näytettä käytetään RNA-Seq, kuten kaukainen normaali paksusuolen limakalvon vieressä paksusuolen limakalvon ja syöpä, kerättiin yhden kiinalaisen potilas oli diagnosoitu vaiheen III paksusuolen adenokarsinooma. Etäisyys vierekkäisten ei-kasvain ja syöpä kudos raja on noin 1cm, kun taas kaukaisen normaalia kudosta ja syöpä kudos on noin 10 cm. Kuva. S1 tarjoaa micrograph syöpä käytetyn näytteen tutkimuksessamme. Kymmenen pariksi normaali ja syövän käytettyjen näytteiden ylimääräisen saatiin kymmenen potilasta, joilla on vaiheen III paksusuolen adenokarsinooma.

Kirjasto valmisteen

Kokonais-RNA uutettiin normaaleista, viereisen ei-kasvain ja syöpä paksusuolen kudoksiin