Krooninen sairaus

tiivistelmä

Head and Neck Okasolusyöpä (HNSCC) on viidenneksi yleisin syöpä, vuosittain vaikuttaa yli puoli miljoonaa ihmistä maailmassa. Tällä hetkellä ei ole olemassa hyväksyttyjä biomarkkereita kliinisen havaitsemisen ja valvonnan HNSCC. Tässä työssä kattava genominlaajuisia analyysi epigeneettiset muutokset ensisijainen HNSCC kasvainten käytettiin yhdessä syöpää erityisiä harha tilastojen määritellä uusia biomarkkereiden geenejä, jotka eri tavoin metyloitavaa HNSCC. 37 tunnistettu biomarkkereiden ehdokkaat top-pisteytys harha geenien kanssa näkyvä ero metylaatio kasvaimissa, mutta jolla ei ole signaalia normaaleissa kudoksissa. Nämä otaksuttu ehdokkaita validoitu riippumaton HNSCC kohortteja meidän laitoksen ja TCGA (Cancer Genome Atlas). Käyttämällä top ehdokkaat,

ZNF14

,

ZNF160

, ja

ZNF420

, määritystä kehitettiin havaitsemiseksi HNSCC syövän ensisijainen kudos- ja sylkinäytteiden 100%: n spesifisyys, kun verrattuna normaaliin kontrollinäytteestä. Koska korkea havaitsemisen spesifisyyden analyysin ZnF DNA: n metylaation yhdessä muiden DNA: n metylaatio biomarkkerit voivat olla hyödyllisiä kliinisessä puitteet HNSCC havaitsemista ja seurantaa, erityisesti korkean riskin potilailla. Useita muita ehdokkaita tunnistettu tätä työtä voidaan tutkia tarkemmin kohti tulevaa kehitystä usean geenin paneeli biomarkkereita valvonnan ja havaitsemiseen HNSCC.

Citation: Gaykalova DA, Vatapalli R, Wei Y, Tsai HL, Wang H, Zhang C, et ai. (2015) Outlier Analyysi asetus määrittää Zinc Finger Gene Family DNA Metylointi kasvaimissa ja Sylki pään ja kaulan syöpäpotilaiden. PLoS ONE 10 (11): e0142148. doi: 10,1371 /journal.pone.0142148

Editor: Kwok-Wai Lo, Kiinan University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 10 helmikuu 2015; Hyväksytty: 18 lokakuu 2015; Julkaistu: 06 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Gaykalova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Affymetrix Expression Data käytettävissä GEO33205 ja Illumina metylointi Data in GEO33202.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus ja National Institute of Health Challenge Grant (RC1DE020324); National Institute of Dental ja kallon ja kasvojen tutkimus ja National Cancer Institute avustus (P50 DE 019032 pään ja kaulan alueen syövän SPORE) ja JAC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Head and Neck Okasolusyöpä (HNSCC) vaikuttaa arviolta 60000 yksilöitä Yhdysvalloissa ja 600000 yksilöiden maailmassa vuosittain [1, 2]. HNSCC yleisesti aiheutuu tupakasta ja alkoholista altistuminen, sekä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) [1]. Huolimatta edistysaskeleet ymmärrystä HNSCC biologian, noin puolet potilaista, joilla HNSCC periksi tauti viiden vuoden kuluessa diagnoosista [2-4].

Nyt on laajalti havaittu, että koko genomin hypometylaatio, mukana -geenin promoottorin hypermetylaatio, on yleinen piirre kiinteiden kasvainten [5, 6]. Promoottori hypermetylaation on kuvattu laaja joukko geenejä, ja yleisesti johtaa kasvaimen-vaimennin geeni transkription tukahduttaminen [3]. Koska korkea DNA: n metylaation poikkeavuuksien syöpäsoluissa sekä DNA: n metylaation signaali vakaus solunjakautumisen aikana, havaitseminen DNA: n metylaation on arvokas väline kehitettäessä biomarkkereita syövän havaitsemiseen ja ennusteen [7-9]. Useat koko genomin metyloinnin määritykset on suoritettu määritellä DNA: n metylaatio allekirjoitus HNSCC [5, 10-14]. DNA: n metylaatio on

DCC

,

EDNRB

,

DAPK

,

CCNA1

,

p16

,

HOXA9

ja

KIF1A

geenit on havaittu ensisijainen kudoksissa ja biologisissa nesteissä, kuten syljessä ja plasmassa [7, 10, 15, 16], joka on johdettu HNSCC potilaista. DNA: n metylaatio useiden muiden geenien, kuten

MINT31

,

MGMT

,

NID2: ksi

,

ERCC1

, ja

TIMP-3

, on on ehdotettu biomarkkerit HNSCC, joka voidaan havaita potilaan Biofluids [11, 16]. Muut geenit, kuten

CYGB

,

RASSF1A

,

SPARC

,

GSTM1

,

cyclinA1

,

MX1

,

WIF1

,

GNG7

,

CYP1A1

,

ZNF132

,

ZNF154

, ja

ZNF447

ovat osoittaneet korkeat DNA: n metylaation perusterveydenhuollossa HNSCC kasvaimissa [13, 14, 16-23] ja ovat ehdolla edelleen validointiin DNA: n metylaation havaitsemisen kehon nesteissä. Genominlaajuisten tunnistaminen epigeneettiseltä muuttunut geenien HNSCC lisää ymmärrystä mekanismeista syövän. Lisäksi nämä lähestymistavat voivat paljastaa uusia syöpää erityisiä DNA: n metylaatio tapahtumia, joita voidaan käyttää molekyylien osoittamista strategioiden kirurgisen marginaaleja tai kehon nesteiden [7, 24-27].

Tuoreiden tietojen mukaan havaitseminen promoottorin metylaation

EDNRB

ja

DCC

potilailla, joilla on suuri riski suun haavaumia on samanlainen suorituskyky diagnoosi asiantuntija kliininen arviointi [25]. Kuitenkin testit käyttäen

DCC

ja

EDNRB

promoottori metylaatio on rajoitettu 46% herkkyys ja 72% tarkkuus syövän havaitsemiseksi syljen huuhtelee [25]. Vaikka alhainen herkkyys voidaan rajoittaa harvinaisesta syöpään liittyviä muutoksia [11, 25, 28], alhainen spesifisyys herättää teknisistä syistä. Vaikka lisäämällä testi Erotuskynnys voi lisätä spesifisyyttä [10, 25], tämä vaatii cut-off-arvon manipulointi, jotka eivät ole käytännöllisiä kliinisessä ympäristössä. Siksi havaitseminen uusia DNA-markkereita ehdottoman spesifisyys syövän kudoksissa voi parantaa nykyistä biomarkkereiden paneelit ja parantaa mahdollinen kliininen soveltaminen molekyylien osoittamista strategioita [7, 24-26]. Alhainen herkkyys yksittäisten biomarkkereita, jotka ovat erittäin spesifisiä syövästä kudoksia voidaan voittaa yhdistämällä useita erittäin spesifisiä geenejä paneelien uhraamatta yleistä erityispiirteet [11].

Koska kattava luonne suurikapasiteettisten tekniikoiden, tuhansia eri tavoin metyloitu alueet voidaan havaita, kun verrataan kasvain ja normaali näytteet [10]. Heterogeenisuus geneettiset ja epigeneettiset muutokset kiinteissä kasvaimissa on esittänyt haasteita käyttäen tavanomaisia ​​tilastollisia lähestymistapoja, kuten t-testejä tai signaali-kohina testejä. Nämä vaikeudet voidaan minimoida käyttämällä poikkeavien perustuvien analyysien tarjota mitta tilastollisesti merkitsevä heterogeenisen muutoksia kasvaimia. Outlier perustuva analyysi on tarjonnut mekanismi määritellä huomattava, mutta monipuolinen, muutoksia syöpiä. Standardi käytetty menetelmä syövän tutkimukseen harha analyysi on Cancer Outlier Profiili Analyysi (COPA [29]), joka vertaa harha on empiirinen null. Poistamaan matalan signaalin poikkeavuuksien tämä työ toteutetaan COPA-pohjainen tilastojen sijoitus summan harha lähestymistapa sekä asettamaan vähimmäistaso kutsumisesta Peränpitäjänä [30]. Tämä on ensimmäinen paperi hyödyntäen harha analyysi [30] varten biomarkkereiden löytö.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

Ensisijainen kasvain kudosten ja sovitettu syljen huuhtelu näytteet kerättiin HNSCC potilaat Johns Hopkins Hospital jälkeen ilmoittanut, kirjallinen suostumus saatiin. Tutkimus hyväksyttiin Johns Hopkins Medicine Sisäinen Review Board (JHM IRB) ja suoritetaan tutkimuspöytäkirja NA_00036235. Kaiken kaikkiaan kaksi riippumatonta kohorttien HNSCC potilasnäytteiden ja normaali kontrolli näytteitä käytettiin. Kaikki ihmisillä, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen poistui-tunnistetaan sen jälkeen kun kliininen tiedonkeruun. Löytö kohortti koostui 44 ensisijaisen HNSCC kudosten ja 25 normaalin limakalvon näytteitä uvulopalatopharyngoplasty (UPPP) leikkauksia kuin syövän vaikuttaa verrokeilla aikaisemmin julkaistuista tutkimuksista [31-33]. Riippumaton validointi ryhmä koostui primaarikasvaimen kudosten ja sovitettu syljen huuhtelu näytettä 59 HNSCC potilaista, 31 normaali UPPP kudosnäytteitä, ja 35 syljen huuhtelu näytettä ei-syöpä potilailla. Kaikki ensisijainen kudosten ja kehon nesteen näytteitä säilytettiin -140 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki ensisijainen kudosnäytteitä analysoitiin tutkijoita patologian osaston Johns Hopkins Hospital (WHW ja JAB). Kasvainnäytteet varmistettiin olevan HNSCC ja sittemmin microdissected, jolloin saatiin vähintään 75% kasvaimen puhtaus. Kliiniset ominaisuudet kaksi ikäluokat luetellaan S1 ja S2 taulukot. Jakauma HNSCC alatyyppiä molemmissa kohorteissa on tyypillinen jakauma pään ja kaulan alueen syöpä sekä Yhdysvalloissa ja maailmanlaajuisesti, mukaan lukien ~ 30% HPV: n (HPV +) suun ja nielun SCC tapauksissa. Voimassaolo Tämän löydön kohortin, ja sen soveltuvuus useille analyysejä on osoitettu useissa ennen julkaisuissa [31-34]. Pyrkiessään vähentämään ennakkoluuloja ja saada vankka syöpä vaikuta valvonnan verrokeilla valittiin satunnaisesti saatavissa UPPP kudosnäytteet ja syljen huuhtoo, mutta kliiniset ominaisuudet eivät pystyneet etsitään.

DNA: n valmistus

microdissected kasvain kudosnäytteitä tai 250 ul: n eriä syljen näytteitä hajotettiin 1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) liuosta (Sigma) ja 50 ug /ml proteinaasi K: n (Invitrogen) liuos 48 ° C: ssa 48-72 tunnin ajan. DNA puhdistettiin fenoli-kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella, kuten aikaisemmin on kuvattu [35]. DNA suspendoitiin uudestaan ​​LOTE puskuriin, ja DNA: n konsentraatio kvantifioitiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific).

RNA: n valmistaminen

RNA eristettiin mikropaloitelluista kudosnäytteistä kanssa Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion) kohden valmistajan suositusten ja RNA-pitoisuus kvantifioitiin käyttäen NanoDrop.

Arrays

Kymmenen mikrogrammaa RNA ja DNA jätettiin Johns Hopkins Core Facility laadunvalvonnan kyselyn ja näytteen analysointi suuren suoritustehon paneelit. Näytteet ajettiin Affymetrix HuEx1.0 GeneChips (joka sisältää 1,4 miljoonaa koettimia) ilmentämiseen analyysiä ja Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChips (luotaa 27578 CpG dinukleotideissä) varten metylointianalyysi bisulfiittikonversion jälkeen. Kaikki paneelit ajettiin valmistajan mukaan protokollien ja aineisto aiemmin ilmoitettua [31-33]. Affymetrix Expression Data on saatavilla GEO33205 ja Illumina Metylointi Tiedot ovat saatavilla GEO33202. Molemmat aineistoja on saatavilla GEO superSeries GSE33232. Tiedot voi tutustua osoitteessa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE33232.

HPV analyysi

patologia raportteja koskien HPV-asema nielun SCC kasvainten saatiin Johns Hopkins sairaalan patologian osaston. Lisäksi HPV tilan kaikki nielun SCC primaarikasvaimen kudoksista itsenäisesti vahvistaneet kvantitatiivinen PCR (qPCR) käyttäen HPV16 alukkeita ja koettimia on reaaliaikainen PCR-laite [7] suhteen CaSki (ATCC) solulinja, tiedetään olevan 600 kopioita HPV16 kohti genomin. Näytteet, joissa HPV kopiomäärä ≥ 1 copy /genomin /solu tunnistettiin HPV positiivisia.

bisulfiittikäsittelyn ja bisulfiittimodifiointi Genominen sekvensointi

EpiTect bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen) käytettiin muuntamaan metyloimatonta sytosiineista genomi-DNA urasiili. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta monistettiin alukkeilla on suunniteltu käyttäen MethPrimer [36, 37] (S3 taulukko). Alukeparia suunniteltiin sisällä CpG-saarekkeen ympäröivä promoottorialueen lähellä metylointi array antureista. Edustaja näyte löytö kohortti valittiin perusteella eniten eroja metylaation ja samanaikainen lauseketta aikana lasketut harha analyysi kunkin yksittäisen geenin. Bisulfiitti sekvensointi valittiin tässä vaiheessa varmistaakseen, absoluuttinen (ei suhteellinen tai normalisoitu) metylaatiostatuksen useiden CpG dinukleotideissä CpG- saaren lähellä promoottori kunkin geenin. Touch-down PCR suoritettiin [38]. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen) ja puhdistettiin PCR-tuotteet sekvensoitiin (Genewiz). Gene metylaatiostatus määritettiin kuten trichotomous muuttuja (metyloitumaton, hemimetyloidulle tai hypermetyloitunut) mukaisen sekvenssin lukee.

Quantitative metylaatiospesifinen PCR (QMSP) B

QMSP, alukkeet suunniteltiin sisältävät erityisesti CpG dinukleotideissä jotka osoittivat muutokset metylaation näkemänä bisulfiitti sekvensoinnilla. QMSP suoritettiin reaaliaikainen PCR kone normalisoinnin metyloimatonta

β-aktiini

vertailuohjaussignaalit [39]. Taqman PCR kone oli asetettu 38 jaksoa enintään poistaa vääriä positiivisia signaaleja. Bisulfiitti-muunnetaan leukosyyttien DNA terveen yksilön käytettiin negatiivisena kontrollina. Suhteellinen taso metyloitua DNA kussakin näytteessä määritettiin suhde monistetun geenin

β-aktiini

[40] ja kerrottuna 100: sekvenssit alukkeiden ja koettimien käytetään löytyy S3 taulukossa.

Käänteinen transkriptio ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Yksi ug RNA: ta validointi kohortin käänteiskopioitiin käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen geeni ilmentymistä määritykset (S3 taulukko) ja Universal PCR Master Mix on 7900HT reaaliaikainen PCR-kone (kaikki Applied Biosystems) kohden valmistajan suosituksia. Geenin ilmentyminen kiinnostava kvantitoitiin kolmena kappaleena suhteessa

GAPDH

ja

18S

lauseke käyttäen 2-ΔΔCT menetelmä [41].

Tilastollinen analyysi

metylointi datan normalisointi.

promoottori metylaatio data, β-arvot (osuus metylaatio) estimoitiin metyloimatonta (U) ja metyloitu (M) mittauksia anturi tasolla pohjalta. Gene tason arvioita tuotettiin valitsevat suurimman metylaatiotasoilla kaikkien kytketyistä samaan geenin (14477 geenejä yhteensä).

Merkittävät ydin koetin määritys.

Geenien ilmentyminen tiedot olivat normalisoitu vankka multi -array keskiarvo (RMA) analyysi käyttäen Bioconductor oligo paketti [42, 43]. Gene tason arvioita tuotettiin RMA käyttäen ydin antureista, jolloin saatiin 22011 geenien analysointia [31, 32].

Outlier Analysis.

Standardi käytetty menetelmä syövän tutkimukseen harha analyysi on Cancer outlier Profiili Analyysi (COPA), joka vertaa harha jakaumat empiirisen null syntyy permutaatio luokkanimiin [29]. Modifioitu sijoitus summa harha lähestymistapa, muokattu Ghosh [44], käytettiin, jossa pienin muutos tasot asetettiin määritelmään Peränpitäjänä [30]. Tämä poistaa monia harha, jossa muutos ei ollut biologisesti merkityksellisiä (esim metylaatio muuttuu vähemmän kuin 10% minkä tahansa kahden näytettä). Nämä tilastot levitettiin löytö DNA metylaatio tietokokonaisuus, joka sisältää 14477 geenit 44 tuumorikudoksia, jossa signaalit 25 normaalista näytteitä käytettiin luomaan perusviivasta cut-off piste kustakin geenistä. Vasen-hännän ja oikea-hännän harha määritettiin käyttämällä listalla-summa menetelmä [45]. Outlier pisteet laskettiin sekä oikean hännän ja vasemman hännän tapauksissa joka mahdollisti määritelmää harha jotka hypermetyloitunut ja hypometyloidut kasvaimia, vastaavasti [30, 45]. Koska harha analyysi ei ole pisteet cut-off, kynnys valittiin saatiin noin 50 top-pisteytys geenejä. Tämä tilanne katkeamisen 13,2 tunnistettu 37 top ehdokkaita lisävalidointia (S4 taulukko).

Expression-metylaatio korrelaatio.

normalisoitu geenien ilmentyminen tietojen korreloi promoottori metylaatiotasoilla vuonna Metylointilaitteistoon ehdokkaat käyttämällä Spearmanin rank korrelaatio (taulukko 1).

korrelaatio ja Concordance DNA metylointi Detection.

korrelaatiot ZnF DNA: n metylaatio signaalien välillä primaarikasvaimen kudosten ja syljen huuhtelua (havaitsee QMSP määritys ) keskuudessa HNSCC potilaita validointi kohortin arvioitiin kautta Spearmanin kertoimella ja kappa-kerroin. Sopimus vastaavuutta laskettiin käyttäen kappa tilastoja.

Herkkyys ja spesifisyys kvantitointi.

QMSP metylointi arvot syljen näytteet laskettiin käyttämällä standardikäyrää menetelmä ja normalisoituivat metylointi riippumaton DNA kuormituksen valvonta (

β-aktiini

). Metylointi taso kunkin geenin käsiteltiin binäärimuuttuja (metyloitu vs. metyloitumaton) mukaan dichotomizing Metylointilaitteistoon nollassa DNA: n metylaatio havaitsemista QMSP. Koehenkilöt, joilla diagnoosi HNSCC määriteltiin ”taudin esiintyminen”, ja ”sairauden” aiheita olivat määritelty normaalin valvonnan. Oikea positiivinen, tosi negatiivinen, vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia hinnat määritettiin sitten yksittäisiä geenejä. Varten markkereiden yhdistelmää, potilaan luokiteltiin ”test positiivinen”, jos jokin merkkiaineet olivat positiivisia, ja ”test negatiivinen”, jos kaikki markkerit olivat negatiivisia. Herkkyys arvioitiin potilaiden osuutta, jotka olivat testin positiivisia saaneiden sairaus, ja spesifisyys arvioitiin potilaiden osuutta, jotka olivat testi negatiivinen joukossa ilman sairautta. 95%: n luottamusväli (CI) herkkyys ja spesifisyys laskettiin olettaen binomijakauman [46].

Tulokset

tunnistaminen differentiaalisesti metyloitua geenin harha

Vuodesta genominlaajuisten ero DNA metyloituvuutta 44 ensisijaisen kasvaimia ja 25 normaalista kudoksesta valvontaa, biomarkkereiden ehdokasta valittiin perustuen järjestelmään kuviossa 1. perustuen määrä harha näytteitä ja suhteellinen signaalin voimakkuus, 37 huippuluokan ehdokasta valittiin edelleen analyysi (S4 taulukko). Korrelaatio ilmaisun ja metylaation array sallittuja tietoja löytö 24 kandidaattigeenejä (pois 37 alkuperäisen geenien) kanssa biologisesti relevantteja negatiivinen korrelaatio DNA metylaatio ja geenien ilmentymisen (taulukko 1). Erityisesti kaikki 24 kandidaattigeenit osoitti hypermetylaation ja vähentynyttä ilmentymistä Tuumorinäytteissä. Lisäksi kaikki ehdokkaat osoittivat minimaalista DNA: n metylaation signaali normaaleissa kudoksissa, joissa maksimaalinen keskiarvo β-arvon normaalin näytteitä 0,058, eli 6% metylaatio (S1 Kuva ja S5 taulukko). Standardi t-testi osoitti, että 23 ulos 24 geenien (96%) oli tilastollisesti merkitsevä ero DNA: n metylaation välinen normaali ja kaikki kasvain näytteet ja normaalin ja HPV kasvain näytteissä. Yksi geeni,

CCND2

, ei ollut tilastollisesti merkitsevä, joka perustuu t-testi, mutta tämä teki osoittaa eron kasvain ja normaali näytteitä Fisherin tarkka testi perustuu läsnäolo hypermetyloitunut harha Tuumorinäytteissä.

Kaaviokuva ääriviivat integroiva lähestymistapa tässä tutkimuksessa käytettiin, jossa yhdistyvät korkea-seulontaan DNA metylaatio ja geenien ilmentymisen löytämisen kohortti HNSCC: työllisyyden DNA: n metylaatio array tietoja 27578 koettimien yhteensä; normalisoituminen tiedot R, 14477 geenejä yhteensä; harha-analyysi ja cut-off saavat noin 50 top-geenien (13,2 harha pisteet; 37 ykköseksi sijoitettu geenejä kulunut, katso Methods lisätietoja); Integrointi normalisoitu tietojen ilmentymistestissä (22011 geenejä); Spearmanin korrelaatiokertoimen laskelmat (24 geenien kulunut); 7 ZNFs bisulfiitti sekvensointi validointi; qRT-PCR, 5 ZNFs geeniekspression validointi; Validointi 3 ZnF QMSP havaitseminen syljessä ja kasvaimen näytteitä eri ikäryhmät.

Lisääntynyt metylaatio ja väheni geeniekspression muutoksia siinä HPV potilailla

On tunnettua, että HPV + ja HPV HNSCC tapaukset eroavat maiseman geneettisten ja epigeneettiset muutokset [5, 12, 47, 48]. Erottamalla 44 HNSCC potilaiden HPV-tilan, se määritettiin, että 92% (22 24) geenien oli merkittävästi korkeammat metylaation HPV HNSCC, verrattuna normaaliin näytteitä (S5 taulukko). Vain 4% (1 24) hakijoiden oli DNA: n metylaation HPV + HNSCC näytteitä huomattavasti korkeampi suhteessa normaaliin näytteitä (S5 taulukko). Suurin osa, 54% (13 24) geenien oli merkittävästi korkeammat metylaation HPV HNSCC verrattuna HPV + näytteitä, kanssa julkaistujen tietojen [12]. Kasvain näytteissä oli vastaava lasku ehdokkaan geeniekspression (S1 Kuva ja S6 taulukko). Siten 71% (17 24) geenien osoitettiin laskeneen merkittävästi geenien ilmentyminen kaikissa HNSCC näytteissä verrattuna normaaliin näytteitä; 75% (18 24) geenien osoitti merkittävää vähenemistä geeniekspression HPV näytteissä verrattuna normaaliin näytteitä; ja 21% (5 24) geenien oli merkittävästi vähentynyt geenin ilmentyminen HPV näytteissä verrattuna HPV + näytteitä. Vähentyneeseen geeniekspressio Tuumorinäytteissä oli yhdenmukainen koko kasvoi promoottori metylaatio Tuumorinäytteissä (S1 kuvio ja taulukko 1).

validointi promoottorin hypermetylaatiota kandidaattigeenejä

validoimiseksi ero metylointi tila CpG-saarekkeiden lähellä promoottorialueen 24 valittu ehdokas geenit, bisulfiitti sekvensointi suoritettiin 5 edustavia näytteitä normaalin limakalvon näytteiden ja 5 ensisijainen HNSCC kasvaimen näytteitä alkuperäisestä löytö kohortissa. 24-geenit, 22 (92%) osoitti, kasvoi metylaation kasvainten suhteessa normaaliin näytteet (kuvio 2). Kaksikymmentä kandidaattigeenit (84%) osoitti metylaatio yli 50% primaarituumorin, kuten

ADFP

,

FUZ

,

ZNF71

,

ENPP5

ZNF211

,

ja ZNF14

(kuvio 2). Bisulfiitti sekvensointi tiedot korreloivat voimakkaasti tulokset array data, jossa minimaalinen DNA: n metylaation havaittiin normaaleissa näytteissä (S1 kuvio ja kuvio 2).

bisulfiitti sekvensointi Tulokset on esitetty 5 HNSCC tuumorinäytteissä ja 5 normaaleissa kudoksissa alkuperäisestä löytö kohortin varten 24 top-pisteytys kandidaattigeenit (taulukko 1). Varjostetut mustat laatikot edustavat täysin metyloitu promoottorit, harmaat laatikot edustavat hemimetyloidulle promoottorit, ja valkoiset laatikot edustavat metyloitumattomien promoottorit.

Zinc Finger Protein ehdokkaita

Todettiin, että 7 ulos 24 kandidaattigeenejä kuuluivat Zinc Finger Protein (ZnF) ryhmä, ja lisäanalyysi suoritettiin tässä ryhmässä. Jotta tarkentaa ZnF ehdokkaista, DNA: n metylaation analysoitiin erillisessä validointi kohortin 59 kasvaimia ja 31 normaalien kudosten (S2 taulukko). Käyttämällä bisulfiitti sekvensointi menetelmiä, merkittävää lisäystä DNA: n metylaatio viisi geenien havaittiin tässä kohortissa (S7 taulukko). Kuitenkin vähentynyt DNA metylaatio

ZNF141

promoottori validoinnissa kohortin ristiriidassa löytö kohortti tiedot, ja mitään DNA: n metylaation havaittu

ZNF211

näytteistä validointi kohortissa. Kaikkien jäljellä viisi ZnF proteiinin geenejä,

ZNF14

,

ZNF160

,

ZNF71

,

ZNF420

ja

ZNF585B

, DNA: n metylaatio oli merkittävästi korkeampi kasvaimen näytteissä, verrattuna normaaleihin kontrolleihin (S7 taulukko).

ZnF downregulation liittyy promoottorin metylaation

vahvistaa oletusta, että ilmentyminen yksittäisten ZnF proteiinin geenit vaikuttavat metyloinnin niiden promoottorien, qRT-PCR-analyysi sen jälkeen suoritettiin

ZNF14

,

ZNF71

,

ZNF160

,

ZNF420

ja

ZNF585B

ilme näytteet riippumaton validointi kohortin (S2 Kuva). Kaikki mutta

ZNF71

osoittivat merkittävää downregulation ilmaisun Tuumorinäytteissä verrattuna normaaleissa kudoksissa, mikä vastasi lisääntynyt metylaatiotasoilla. Erottaminen kasvaimen näytteiden mukaan HPV kasvain tila osoittaa, että ZnF ilmaisu ei ollut merkitsevästi erilainen HPV ja HPV + potilasryhmille (S2 Kuva ja S7 taulukko).

ZnF DNA: n metylaatio havaitseminen on erittäin spesifinen ensisijainen HNSCC kudoksia

perusteella DNA: n metylaatio tuloksia, oletettiin, että ZnF metylaatio voidaan mahdollisesti käyttää kliinisesti sovellettavissa biomarkkeri HNSCC. Siten QMSP alukkeita ja koetin määritykset suunniteltu

ZNF14

,

ZNF160

ja

ZNF420

. Hyvin spesifinen QMSP määrityksessä

ZNF585B

ei suunnitella, koska sen korkea CpG tiheys.

QMSP määritykset ensin validoitu kaikkien kolmen ZnF geenien kudosnäytteistä. Samanlainen vetysulfiitilla sekvensointi tuloksia, QMSP määrityksiä ei havaittu DNA: n metylaation missä tahansa normaalissa näytteissä, mutta DNA metylaatio havaittiin

ZNF14

,

ZNF160

ja

ZND420

44,1% , 39% ja 32,2% kasvainten vastaavasti. Ainakin yksi ZnF metyloitiin vuonna 57,6% kasvaimen kudokset. (Taulukko 2). Erityisesti 17% potilaista (10 59) oli metylaatio havaittiin kaikilla kolmella ZnF promoottorit. Hieman korkeampia DNA: n metylaation nähtiin HPV ryhmässä, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 3).

Näkyy ovat ZnF QMSP tuloksia 59 HNSCC primaarikasvaimen ja syljen huuhtelu näytteet verrattuna normaalin plasman ja syljen huuhtelu näytteet validointi kohortissa. ZnF promoottori metylaatio kvantifioitiin suhteessa Bact metylaatio ja kerrottuna 100 Plus (+) tai miinus (-) tarkoittaa niiden HPV tilan syöpäpotilailla. NS = normaali syljen huuhtelu näytteen (n = 35), N = normaali ensisijainen kudoksissa (n = 31), TS = syljen huuhtelu päässä HNSCC potilailla (n = 59, 41 HPV + [TS +] ja 18 HPV [TS-] ), T = primäärikasvain näytteitä HNSCC potilaista (n = 59). Ei ollut havaittavissa ZnF DNA: n metylaation normaaleissa näytteissä. Merkitsevä (p 0,05) ero ryhmien välillä on merkitty tähdellä (*), laskettuna Fisherin eksakti testi.

ZnF DNA: n metylaation havaitsemiseen TCGA kohortissa

validoida ZnF DNA: n metylaation ja sen korrelaatio sen erilaisissa HNSCC ikäluokat, The Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip array ja RNA-Seq tietoja ladattu ja analysoitiin Cancer Genome Atlas (TCGA) HNSCC kohortin, joka sisältää 279 HNSCC kasvaimia, mukaan lukien 36 HPV +, Hyväksytty normaali näytteitä. ZnF DNA: n metylaatio oli vähäistä TCGA normaalissa näytteistä (S3 kuvio ja S10 taulukko), kanssa löytämisen ja validointi kohortin tiedot. Kaikki kolme ZNFs oli voimakas negatiivinen korrelaatio DNA metylaatio ja ilme, etenkin

ZNF420

(S3 kuvassa). Erityisesti kaikista DNA: n metylaatio antureita alkaen TCGA, antureista sisällä

ZNF420

promoottori oli korkein DNA metylaation HNSCC näytteissä minimaalisella metylaatio havaitseminen normaaleissa näytteissä. Kaiken havaitsimme korkea välistä yhdenmukaisuutta löydön, validointi ja TCGA kohortteja havaitsemiseksi ZnF promoottorin metylaation käyttäen neljää eri tekniikoita DNA: n metylaatio tunnistus (S9 taulukko).

ZnF DNA: n metylaatio havaitseminen mahdollisina HNSCC biomarkkereita

testatakseen kehittyneistä QMSP määritykset ZNFs havaitsemiseksi DNA-metylaation kehon nesteiden, sovitettu syljen huuhtelu näytteet HNSCC validointi kohortin potilaista käytettiin. Vertailu DNA: n metylaatio signaalien sylki huuhtelu näytteet HNSCC ja ei-syöpä potilailla osoitti, että erityisyys yhdistetyn ZnF paneeli havaita HNSCC näissä kehon nesteiden oli 100% (95% CI: 89,9% – 100%), ja herkkyys oli 22% (95% CI: 12,3% – 34,73%) (taulukko 3). On huomattava, että etsintä ZnF metylaation korrelaatiota kliiniset tiedot eri tilastollisia analyysejä ei havaittu merkitseviä.

Keskustelu

kehittymisestä huolimatta suurikapasiteettisten tekniikoiden ja tunnistaminen lupaavat DNA: n metylaatio markkereita, kukaan HNSCC biomarkkereiden on nykyisin hyväksytty kliiniseen havaitsemiseen ja seurantaa. Keskeinen huolenaihe äskettäin ehdottanut HNSCC biomarkkereiden on korkea väärien positiivisten määrä. Koska HNSCC on hyvin heterogeeninen tauti, on haastava määritellä yhden biomerkkiaineen, jolla on suuri herkkyys ja spesifisyys [10, 11, 25]. Monet ehdotetut biomarkkerit ovat kohtuulliset herkkyys mutta suhteellisen alhainen spesifisyys, ja näiden yhdistelmät biomarkkereiden todennäköisesti johtaa lisääntyneeseen väärien positiivisten [25]. Käyttö tavanomaisia ​​tilastollisia menetelmiä saattavat aliarvioida heterogeenisiä muutoksia pahanlaatuisiksi; kuitenkin, nämä haasteet ratkaistaan ​​käyttämällä äskettäin kehitetty harha analyysi mukailtu COPA. Tietääksemme tämä on ensimmäinen julkaistu teos, joka hyödyntää harha analyysi DNA: n metylaatio biologisten merkkiaineiden kehitystyöhön. Vaikka ZnF ryhmä ehdokkaiden tutkittu tässä työssä saatiin 100%: n spesifisyys, lisätutkimukset saattavat lisätä herkkyyttä tarkistamalla enemmän metyloituja geenin ehdokkaita kehittämistä usean geenin DNA: n metylaatio-pohjainen paneelin HNSCC biomarkkereiden.

olemassa useita julkaisuja, jotka käyttävät suuren suoritustehon DNA metylointianalyysi, mutta monet ovat rajallinen kohortti koot [11-13]. Tämä tutkimus pystyi käyttämään aiemmin julkaistu kohortti koostuu 44 kasvain ja 25 normaalia valvontaa varten löytämisen mahdollisten metyloitua biomarkkereita. Lisäksi biomarkkerit annettiin lisäksi validoitu suuremmassa itsenäinen kohortti (59 kasvain näytettä) ja TCGA (279 kasvain näytteet). Käyttö Illumina 27 DNA: n metylaatio array, jota on käytetty menestyksekkäästi muiden [10-14], sallitaan määritelmä erittäin spesifisiä tulevien biomarkkereita HNSCC. Kuitenkin todetaan, että kattavampi DNA metylaatio syntyminen voi mahdollistaa löytö suuremman määrän ehdokkaan muutoksia.

Korrelaatio metylaation ja ilme on toinen tehokas työkalu, joka käytettiin tässä tutkimuksessa tunnistaa biologisesti relevantteja metylaatiomuutokset että todennäköisesti esiintyy aiemmin syövän kehittymisessä [10, 14]. Vain metylointi tapahtuvat muutokset aiemmin kasvainten kehittymistä mahdollistaa kehittämisen myöhemmin geeniekspression muutoksia. DNA: n metylaatio muutokset eivät korreloineet geenien ilmentyminen eliminoitiin määritellä tarkemmin rajattu paneeli 24 ehdokkaan metyloitu geenin biomarkkereita. Lisäksi korrelaatio DNA metylaatio lausekkeen saatavissa geenien ilmentymisen array auttaa vähentämään yhteen alustaan ​​bias. Useita validointivaiheet tehtiin tässä tutkimuksessa, johon kuului yhteensä kolme kohorttia HNSCC näytteitä, sekä neljä erilaista havaitsemiseen tekniikoita DNA: n metylaatio (Illumina paneelit 27 ja 450, bisulfiitti sekvensointi ja QMSP) ja kolme erilaista tekniikkaa geenien ilmentymisen (Affymetrix array, RNA-Seq päässä TCGA ja qRT-PCR). Tulokset olivat samansuuntaiset eri ikäluokkien ja tekniikoita (S9 taulukko). Validointivaiheet vahvistivat suuri spesifisyys ja luotettavuus havaittujen ZnF DNA metylaatio-pohjainen biomarkkereita HNSCC.

Korkeammalla promoottorin metylaation havaittiin HPV potilailla useassa otaksuttu tuumorisuppressorigeeneille kuten Zinc Finger perheenjäseniä, johdonmukainen