Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, toiminnalliset merkityksen heparaanisulfaatti (glukosamiini) 3-

O

-sulfotransferase 2 (

HS3ST2

) hypermetylaation ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Menetelmät /Principal havainnot

HS3ST2

hypermetylaation leimasi kuudessa keuhkosyövän solulinjat, ja sen kliininen merkitys analysoitiin 298 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset ja 26 makean pakastetut kudokset 324 NSCLC potilaiden. MS-HRM (metylaatiospesifinen korkean resoluution sulaminen) ja EpiTYPER

TM määritykset osoittivat huomattavaa hypermetylaatiota CpG-saarekkeen on promoottorialueen

HS3ST2

kuuden keuhkosyövän solulinjat. Vaiennettu geeni demetyloitunut ja uudelleen ilmaisseet käsittelemällä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC). Promoottori määritys osoitti myös ydin promoottorin aktiivisuutta HS3ST2 säädeltiin metylaatio. Eksogeeninen ilmentyminen HS3ST2 keuhkoissa syöpäsoluissa H460 ja H23 inhiboi solumigraatio, invaasio, solujen lisääntymisen ja että pudotus on HS3ST2 vuonna NHBE soluissa indusoi solujen vaeltamiseen, invaasio, ja solujen lisääntymistä

vitro

. Negatiivinen korrelaatiota ei havaittu mRNA ja metylaatiotasoilla of HS3ST2 26 makean pakastetut kasvainten kudokset (ρ = -0,51,

P

= 0,009; Spearmanin rank korrelaatio).

HS3ST2

hypermetylaation havaittiin 95 (32%) 298 ensisijaisen NSCLCs. Potilaat, joilla on

HS3ST2

hypermetylaation 193 solmussa-negatiivinen vaiheen I-II NSCLCs mediaani seuranta-aika 5,8 vuotta oli huono kokonaiselinaikaa (riskisuhde = 2,12, 95% luottamusväli = 1,25-3,58,

P

= 0,005) verrattuna ilman

HS3ST2

hypermetylaation säätämisen jälkeen ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, adjuvanttihoito toistuminen, ja erilaistumista.

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus viittaa siihen, että

HS3ST2

hypermetylaation voi olla itsenäinen prognostinen indikaattori kokonaiselossaoloaika solmussa-negatiivinen vaiheen I-II NSCLC.

Citation: Hwang jA, Kim Y , Hong SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et ai. (2013) Epigeneettiset inaktivointi heparaanisulfaatin (Glukosamiini) 3-

O

-Sulfotransferase 2 Keuhkosyöpä ja sen rooli kasvainten synnyssä. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10,1371 /journal.pone.0079634

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: toukokuu 22, 2013; Hyväksytty: 25 syyskuu 2013; Julkaistu: 12 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Hwang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Center (NCC 1110140-1 ja 1110100-2), Korean Healthcare teknologian t perhe-, Korean tasavalta. (A084947AA202308N100010A), ja National Research Foundation of Korea (NRF) avustus rahoittama Korean hallitus (MEST) (nro 2011-0029138), Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita varhaisen havaitsemisen ja hoidon viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, ennuste on edelleen huono, yleisen 5 vuoden pysyvyys leijuu alle 15% [1]. Huono ennuste keuhkosyöpäpotilaiden johtuu pitkälti mikrometastaasin, mikä parantaa epätodennäköisempää, ja osittain korkea määrä toistumisen jälkeen parantava resektiota; potilaat, joilla on vaiheen I keuhkosyöpä on viiden vuoden eloonjäämistä 50%, jos syöpä on levinnyt läheisiin imusolmukkeisiin tai muilla alueilla. Yli 80% uusiutumista esiintyy kahden ensimmäisen vuoden aikana; uusiutuminen jälkeen parantava kirurginen resektio sopivilla imusolmukedissektiossa alueella 20%: sta 50% riippuen patologinen vaiheessa [2]. Siten löytö molekyylitason biomarkkereita havaita varhain ja potilaiden on suuri riski toistumista on selvästi tärkeä.

Heparaanisulfaatti (HS) on lineaarinen polysakkaridi, joka on havaittu kaikkien eläinten kudoksissa, ja se esiintyy proteoglykaani, jossa kaksi tai kolme lineaarista heparaanisulfaatin glykosaminoglykaani (GAG) ketjut kovalenttisesti kiinnitetty erityistä seriini- tähdettä ydinproteiinista kautta tetrasakkaridi linkkerin [3]. HS ketjut kootaan ydinproteiinista entsyymit Golgin laitteessa ja koostuvat toistuvista disakkaridiyksiköistä vuorottelevista glukuronihappoa (GlcA) tai iduroni- (IdoA) happo ja

N

asetyyli glukosamiini (GlcNAc). Kokoonpanon aikana, ne tehdään useita peräkkäisiä muutoksia alkaa

N

deasetylointimenetelmässä ja

N

-sulfation on glukosamiinijäännöksiä. Vieressä tämä ensimmäinen muutos, jotkut GlcA tähteet epimeroida iduronihappoyksikköä jonka C5 epimeraasin ja sitten 2-O-sulfatoitu, jossa edelleen sulfaatiokohtaa 6-O ja 3-O asemissa glukosamiinijäännöksiä jolloin saadaan kypsä ketjuja [4,5 ]. Muutokset ovat tärkeitä hienorakennetta heparaanisulfaattiproteoglykaanit (HSPG) ja spesifisyys heparaanisulfaatin-proteiini-vuorovaikutuksen.

Heparaanisulfaatti

(

glukosamiinia

)

3-O-

sulfotransferaasien

2

(

HS3ST2

), jäsen heparan sulfaatti biosynteettinen entsyymi perhe, hänellä heparaanisulfaatti glukoosiaminyyliryhmä 3-

O

-sulfotransferase toimintaa, joka muuttaa GAG ketjut [6,7].

HS3ST2

hypermetylaation on viime aikoina raportoitu erilaisia ​​syöpiä, kuten rintasyövän [8,9], paksusuolen ja peräsuolen syövän [8,10,11], mahasyöpä, [12] hematological kasvain [13], keuhkosyöpä [8], haimasyöpä [8], eturauhassyöpä [14], ja kohdunkaulan syövän [15,16].

HS3ST2

hypermetylaation löydettiin korkealla taajuudella duktaalikarsinooma in situ rintasyövän [9] ja sytologia yksilöiden CIN 3 (CIN3) [15], mikä viittaa siihen,

HS3ST2

hypermetylaation luultavasti tapahtuu aikaisin malignin transformaation aikana rinnasta ja kohdunkaula.

HS3ST2

osoittaa myös korkean metylaation eturauhassyövän uusiutumisen [14]. Lisäksi taajuus

HS3ST2

hypermetylaation on korkea korkealaatuista levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia leesio (HSIL) kohdunkaulan verrattuna matala-asteista levyepiteelikarsinooma intraepiteliaalisia leesio (LSIL) [16]. Kuitenkin kliinis merkitys

HS3ST2

hypermetylaation edelleen heikko keuhkosyövässä. Saadakseen paremman käsityksen roolista

HS3ST2

hypermetylaation ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), me tunnettu

HS3ST2

hypermetylaation kuudessa keuhkosyövän solulinjat ja tutki vaikutusta hypermetylaatiota

HS3ST2

fenotyyppiin ja ennusteen keuhkosyövän parafinoidut kudoksia 298 ensisijainen ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLCs).

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kudosnäytteet

Kuusi ihmisen keuhkosyövän solulinjat (H23, H226, H460, H520, H1650, ja A549) ja kaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen solulinjoja (HBEC ja NHBE) saatiin American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Soluja viljeltiin nimetty kasvualustaa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT) ja 1% antibiootti-antimykoottia (Invitrogen, USA). Kaksikymmentäkuusi makean pakastetut kasvain ja vastaavat normaaleissa kudoksissa, sekä 298 parafinoidut tuumorikudoksia, saatiin kaikkiaan 324 NSCLC potilaiden, joille tehtiin parantava resektion laitoksella rintakehä ja Cardiovascular Surgery, Samsung Medical Center, Seoul, Korea välillä elokuuta 1994 ja marraskuun 2005 tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board at Samsung Medical Center, ja kirjallinen lupa käyttöön kudosten saatiin kunkin potilaan ennen leikkausta. Leikkauksen jälkeisen seurannan selviytymisen tai toistumisen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [2]. Patologinen TNM määräytyi ohjeiden American sekakomitean Cancer [17].

Perimän DNA: n uutto ja natriumbisulfiitin muutos

H kasvaimen alueet sisälsivät vähintään 75% kasvainkudoksessa. Genomi-DNA viljellyistä soluista ja 26 tuoretta jäädytettyä kasvain ja vastaavat normaalit kudokset ja 298 parafinoidut tuumorikudoksissa uutettiin käyttäen MagAttract DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) ja DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA), vastaavasti. Yksi mikrogramma genomista DNA: ta muutettiin natriumbisulfiitti käyttämällä EZ DNA Metylointi-Gold Kit (ZYMO Research, Irvine, CA).

MS-HRM määrityksen, EpiTYPER

TM testissä ja metylaatiospesifistä PCR

Saat erittäin metyloituja alueet

HS3ST2

promoottori, 2 kb alue, joka sisälsi 1,5 kb

HS3ST2

promoottorin analysoitiin metylaatiospesifistä korkearesoluutioinen sulaa (MS-HRM) määritys on LightCycler®480 reaaliaikainen PCR-instrumentti (Roche, Switerland). Metylaatiostatuksen 1,5 kb: n alue, joka on havaittu olevan erittäin metyloidaan MS-HRM määrityksen edelleen analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä EpiTYPER

TM-määritys (Sequenom, San Diego, CA) analysoida metylaatio tilat yksittäisten CpG: t. Analysoidaan alueet ovat edustettuina kuviossa 1A. Alukkeita kutakin määritystä varten suunniteltiin käyttäen SEQUENOM (San Diego, CA) EpiDesigner ohjelmisto (taulukko S1 ja S2). Metylaatiostatuksen

HS3ST2

on 298 formaliinilla kiinnitetyt paraffiiniin upotetut kudokset määritettiin käyttämällä metylaatiospesifinen PCR (MSP), jossa on kaksi sarjaa alukkeita (taulukko S3), joka kattaa promoottorialueen, kuten aiemmin on kuvattu

2. Reaktiot kuuma aloitettiin 94 ° C: ssa ennen kuin lisättiin 2,5 yksikköä Taq-polymeraasia. Monistus suoritettiin yli 35 sykliä (30 s 94 ° C: ssa, 30 s hehkutus lämpötilassa, 30 s 72 ° C: ssa), mitä seurasi 4 minuuttia 72 ° C: ssa. Saadut tulokset MSP-analyysi oli visuaalisesti tekee kaksi tekijää (Y Kim ja D-H Kim). Näytteet, joissa on vahvempi kaistan intensiteetti kuin negatiivisena kontrollina metylaatiospesifinen PCR merkitty metyloitu, ja näytteet, joilla ei ole näkyvissä PCR-tuotetta pidettiin metyloimaton.

(A) CpG-saarekkeen kartta

HS3ST2

promoottori ja tutkituilla alueilla MS-HRM ja EpiTYPER määritys. (B) metylointi asema

HS3ST2

ensin arvioitiin kuusi keuhkosyövän solulinjat ja kaksi keuhkoputken epiteelisolujen ratoihin MS-HRM. (C) metylointi asema yksittäisten CpG: t on 1,5 kb: n promoottorialueen (HRM-04, 05, 06, 07, 08, ja 09) analysoitiin kvantitatiivisesti solulinjoissa käyttäen EpiTYPER

TM-määrityksessä. Metylointi tasot kuvattu värin muutos jatkuvalla asteikolla punaisesta (0% metyloituja) valkoiseen (100% metyloituja). (D) Transcript tasot

HS3ST2

verrattiin toisiinsa erittäin metyloitua keuhkosyövän solulinjat ja keuhkoputkien epiteelisolujen riviä qRT-PCR (musta palkki). Talteenotto

HS3ST2

transkriptio arvioitiin hoidon jälkeen kuuden keuhkosyövän solulinjoja 5-atsa-dC 72 tuntia (harmaa palkki vs. valkoinen bar;

P

-arvot perustuvat Wilcoxonin allekirjoitettu-rank-testi). (E) metylointi tila CpG: t noin erittäin metyloitua ATG-alue

HS3ST2

geenin arvioitiin hoidon jälkeen 5-atsa-dC: ssa 72 tuntia. Heatmap esitetään tyypillisiä malleja demetylaatio syöpäsoluissa vastauksena 5-atsa-dC, ja prosenttiosuudet tarkoittavat keskimääräistä metylaatiotasoilla.

Analyysi HS3ST2 ilmaisun

ekspression tutkimiseksi ja HS3ST2 tasolla mRNA, cDNA syntetisoitiin kaksi ug kokonais-RNA: sta käyttäen SuperScript

TM III Ensimmäinen Strand Synthesis System (Invitrogen, CA). MRNA: n ilmentyminen HS3ST2 analysoitiin käyttäen RT-PCR: ää ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin LightCycler

® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH käytettiin referenssinä geeni, ja suhteellinen ilmaisun taso laskettiin käyttämällä ACk

T-menetelmä (ACk

T = C

T GAPDH – C

T HS3ST2). Koe suoritettiin kolmena kappaleena ja qRT-PCR-alukkeita käytettiin samoja kuin RT-PCR: llä. Alukkeet suunniteltiin sisältämään eksonin eksonin risteykseen (taulukko S3).

5-atsa-dC hoidon in vitro

Kuusi keuhkosyövän solulinjoja inkuboitiin 10 uM 5-atsa-2 ”-deoxycytidine (5-atsa-dC, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen mRNA: n ekspressio ja metylaatio kvantitoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja EpiTYPER

TM määrityksessä, vastaavasti.

Reporter määrityksessä

Serial poistomuodosteet HS3ST2 promoottorin luotiin, ja eripituisia promoottorialueiden (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) amplifioitiin käyttämällä PCR-alukkeita (taulukko S4) ja kloonattiin pGL3-basic-vektorista. Promoottorisekvenssin oli

in vitro

metyloitu CpG-spesifisten

Sss

I metylaasin (New England Biolabs, Ipswich, MA). Promoottori toiminta Metyloitujen ja metyloimattomien konstruktioita verrattiin Dual lusiferaasianalyysissä (Promega, Madison, WI).

Cell muuttoliike, invaasio, ja runsaudenmäärityksessä

in vitro

solumigraation, invaasio, ja leviämisen määrityksissä pAcGFP1-C1-

HS3ST2

cDNA-klooni valmistettiin käyttäen alukkeita taulukossa S3, ja H460- ja H23-solut transfektoitiin yhtä ug pAcGFP1-C1-

HS3ST2

ja pAcGFP1-C1 (tyhjä vektori) käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, HS3ST2 ilmentyminen vahvistettiin immunoblottauksella käyttämällä ensisijaista suunnattuja vasta-aineita GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology, CA) ja α-tubuliinin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Solumigraation tutkittiin antamalla solujen siirtyä alaspäin yli yön 37 ° C: ssa yli 8-m huokosten suodatinpanos (BD, USA) ja sitten värjäämällä 1% kristalliviolettia; liuennut solut mitattiin 564 nm: ssä VERSA

max mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, USA). Invaasio Analyysi suoritettiin laskemalla Diff-Quick

TM (Sysmex, Japani) värjätyistä soluista Matrigel päällystetyn insertin jälkeen 48 tunnin inkuboinnin. Sillä lisääntymisen määritys, kuopat ympättiin 1 x 10

3 solua per kuoppa ja MTT-määritys suoritettiin 24 tunnin välein; jakautuviin soluihin mitattiin absorbanssilla 570 nm: ssä.

knockdovvn HS3ST2

HS3ST2 erityisiä Sirna (siRNA kohdesekvenssin 5′-CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3 ’Cat. No. SI00442015, Qiagen) tai negatiivinen kontrolli siRNA (luett 10272810, Qiagen) transfektoitiin NHBE soluihin. 72 tunnin kuluttua transfektion vaimentaminen HS3ST2 vahvistettiin immonublotting käyttämällä ensisijaista vasta suunnattu HS3ST2 (Cat. No. PA5-26522, Thermo Scientific) ja normalisoitu β-aktiini. Vaikutus HS3ST2 pudotus on solumigraatio, soluinvaasion ja soluproliferaatiota analysoitiin kuten edellä on kuvattu.

Quantitative metylaatiospesifinen PCR

metylointi aseman CpG-saarekkeen on promoottorialueen

HS3ST2

26 makean pakastetut tuumorikudoksissa analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä fluoresenssiin perustuvaa kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, MethyLight, kuten on kuvattu Gonzalo et ai [10]. Lyhyesti, MethyLight reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 12,5 ui, joka sisälsi 1,0 ui ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta, 900 nM kutakin aluketta ja 250 nM-TaqMan-koettimella. Lämpöjaksotusta reaktiot suoritettiin käyttäen 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA), ja

ALU-C4

geeniä käytettiin sisäisenä viitteenä normalisoida määrän tulo DNA [18]. Alukkeet ja fluoresenssileimattuja TaqMan-koettimet, joita käytetään tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa S5.

immunohistokemia Ki-67

immunohistokemiallinen analyysi Ki-67 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19] . Osa Ki-67-positiivisia soluja (Ki-67 merkintöjä indeksi) määriteltiin prosentteina ytimien värjäytyi positiivisesti vasta-aineen kanssa.

Tilastollinen

Wilcoxonin summa testi ( tai

t

-testi) ja Fisherin testiä (tai Chi-squared test) käytettiin yhden muuttujan analyysiin jatkuvan ja kategorisen muuttujia, vastaavasti. HS3ST2 mRNA tasojen kasvain kudosten ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin verrattiin käyttämällä Wilcoxonin-rank-testi. Spearmanin järjestyskorrelaatiokerroin laskettiin arviointiin korrelaatio ilmaisun ja metylaation

HS3ST2

. Vaikutus

HS3ST2

hypermetylaation eloonjäämiseen tai toistumista arvioitiin Kaplan-Meier selviytymisen käyrät, ja merkitystä erojen ennuste ryhmien välillä arvioitiin log-rank-testi. Coxin suhteellisten riskien analyysi tehtiin arvioida vaaran suhteet

HS3ST2

hypermetylaation eloonjäämisestä jälkeen valvoa mahdollisten sekoittavien tekijöiden.

Tulokset

Analyysi metylaation ympäri HS3ST2 promoottori

metylaatiostatuksen

HS3ST2

noin

HS3ST2

promoottorin analysoitiin käyttämällä MS-HRM (kuvio 1 B) ja EpiTYPER

TM määrityksissä (kuvio 1 C) kuuden keuhkosyövän solulinjat ja kaksi normaalia keuhkoputken epiteelisolujen linjat. Metylaatiostatuksen 2,0 kb: n alue, joka sisältää promoottorisekvenssin

HS3ST2

seulottiin ensin MS-HRM. Merkittäviä sulamiskäyrä- dissosiaatiota havaittiin kuudessa fragmentteja (HRM-04, 05, 06, 07, 08, ja 09) välillä keuhkosyövän solulinjoja ja normaali keuhkoputken epiteelisolujen linjojen (kuvio 1 B). Koska metyloitua sytosiini vaatii suuremman sulamislämpötila kuin metyloitumattoman sytosiinin, sulamiskäyrät metyloitua fragmentit siirretään oikealle verrattuna normaaleihin solulinjat. Arvioidaan metylaatio tilat yksittäisten CpG: t on 1,5 kb promoottorialueen lukien kuusi fragmentit, me analysoitiin kvantitatiivisesti yksittäisen CpG: t kanssa EpiTYPER

TM määrityksessä (kuvio 1 C). Normaali solulinjat hypometyloidut kokonaan 1,5 kb sekvenssejä, mutta keuhkosyövän solulinjat yleensä hypermetyloitunut ympäri ATG translaation aloituskohta. Vaikka jotkut CpG: t ATG translaation aloituspaikasta on

HS3ST2

olivat osittain metyloitu H226 ja H1650 soluja, useimmat CpG: t olivat erittäin metyloitu muissa keuhkosyövän solulinjat.

5-atsa-dC indusoi demetylaatio ja uudelleen ilmentyminen vaiennettu HS3ST2

Sen tutkimiseksi, mikäli downregulation

HS3ST2

on riippuvainen hypermetylaatiota geenin, analysoitiin uudelleen -ilmaisu (kuvio 1 D) ja demetylointi (kuvio 1 E) on vaiennettu

HS3ST2

by qRT-PCR: llä ja EpiTYPER

TM määrityksessä hoidon jälkeen keuhkosyövän soluja 10 uM 5-atsa-dC: ssa 72 tuntia. HS3ST2 mRNA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuudessa keuhkosyövän solulinjoja kuin kahtena keuhkoputkien epiteelin solulinjoista (musta palkki, kuvio 1 D). Vaiennetaan

HS3ST2

uudelleen ilmentyy kaikissa keuhkosyövän solulinjat jälkeen 5-atsa-dC hoidon (valkoinen palkki, kuvio 1 D). Muutos tason metylaation vastauksena 5-atsa-dC analysoitiin edelleen yksittäisten CpG: t ympäri erittäin metyloitua ATG-ala

HS3ST2

geenin (kuvio 1 E). Vaikka aste demetylaatio erosivat keskuudessa solulinjoissa, demetylaatio havaittiin kaikissa solulinjoissa seuraavat 5-atsa-dC hoitoon. Demetylaatio esiintyi enemmän olennaisesti H460 tai H1650 soluja, jotka olivat vähemmän tiheään metyloitu, kuin tiheään metyloituja H23-soluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että

HS3ST2

hypermetylaation voi liittyä transkription downregulation geenin.

HS3ST2

promoottorin aktiivisuus väheni promoottorin metylaation

Promoottori aktiivisuus mitattiin H23-soluissa (kuvio 2A) ja HEK-293T-solut (kuvio 2B), jonka Dual Luciferase assay onko

HS3ST2

metylaatio vaikuttaa geenin transkriptioon. Neljä rakennetta (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) kutakin metyloitu ja metyloitumaton promoottorisekvenssit tuotettiin. Metyloidut konstruktit

HS3ST2

promoottorin saatiin SSSI metylaasilla (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), kun läsnä on S-adenosyylimetioniinin. Promoottorin aktiivisuus joukossa metyloimattoman konstruktit

HS3ST2

promoottori ei ollut verrannollinen pituus kunkin rakentaa soluissa, mutta promoottorin aktiivisuus erityisesti pieneni, kun promoottorisekvenssit välillä -742 bp ja -495 bp poistettiin. Metyloidulle konstruktioita, promoottori aktiivisuus oli samanlainen kaikissa konstruktioita ja olennaisesti alhainen verrattuna vastaavan metyloitumattomien konstruktioita. Tämä havainto viittaa siihen, että ydin-promoottori käsittää DNA-alueen -742 bp kautta -495 bp transkription aloituskohdan.

Dual lusiferaasiaktiivisuudet neljä HS3ST2 promoottorikonstrukteja mitattiin H23 (A) ja HEK- 293T (B) solulinjat. Yksi kb promoottorikonstruktiin oli sarjatuotantona poistettu, ja lusiferaasin aktiivisuus kutakin konstruktia verrattiin konstruktioita käsiteltiin (harmaa palkki) ja ilman SSSI metylaasilla (musta palkki).

HS3ST2 esti solujen vaeltamiseen, invaasio, ja leviämisen

tutkimiseksi toiminnon

HS3ST2

kasvainten synnyssä keuhko-, solumigraatio, invaasio, ja leviämisen olivat tarkastellaan H460 ja H23-keuhkosyövän soluja.

HS3ST2

cDNA kloonattiin pAcGFP-C1 ja transfektoitiin H460- ja H23-solut: tiedot H23 solut ovat kuviossa S1. Yli-ilmentyminen transfektoiduissa pAcGFP-C1-

HS3ST2

seurattiin RT-PCR: llä (kuvio 3A), qRT-PCR: llä (kuvio 3B), ja immunoblottaus (kuvio 3C). Yliekspressio

HS3ST2

vähensi migraatiota kapasiteettiaan 53% (

P

= 0,0017, kuviot 3D ja 3E). Soluinvaasiota aktiivisuus laski 83% H460 transfektoiduissa soluissa pAcGFP-C1-

HS3ST2

(

P

= 0,0019, kuviot 3F ja 3G); soluproliferaatiota myös huomattavasti vähentynyt ajan myötä (kuviot 3 H 3I). Nämä havainnot viittaavat siihen, että

HS3ST2

voi estää keuhkojen kasvaimien syntyyn vähentämällä solumigraation, invaasio tai soluproliferaation keuhkosyöpä.

(AC) pAcGFP-C1-

HS3ST2

oli transfektoitiin H460 keuhkosyövän soluja. Erityiset yliekspressio

HS3ST2

verrattuna tyhjän vektorin varmistettiin RT-PCR: llä (A), qRT-PCR: llä (B), ja western-blottauksella (C). (PO) H460-solut ympättiin Boyden kammiossa tyhjällä vektorilla tai yhdellä ug pAcGFP-C1-

HS3ST2

vuonna transwell muuttoliike (D G) kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Stained vaeltavien solujen ja tunkeutuvat solut esitetään (D) ja (F), tässä järjestyksessä; vaeltavien solut mitattiin absorbanssilla 564 nm; tunkeutuvat solut laskettiin mikroskoopin alla. Tulokset esitetään suhteessa

vitro

siirtämisestä tai invaasion indusoimattomaan H460 soluja (100%). (H I) H460-soluja, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla tai pAcGFP-C1-

HS3ST2

viljeltiin 96-kuoppaisella alustalla analysoida vaikutus

HS3ST2

solun kasvuun. Solujen proliferaatio mitattiin MTT-määritystä, ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe (SE) kolmena kappaleena kokeita.

knockdovvn HS3ST2 lisääntynyt solujen maahanmuuton soluinvaasiota ja solujen lisääntymistä

Vahvista tiedot HS3ST2 kohdunulkoisen ilme, vaikutukset

HS3ST2

knockdown solun maahanmuuttoa, invaasio, ja soluproliferaatiota analysoitiin NHBE keuhkoputken epiteelisoluissa. 72 h kuluttua on

HS3ST2

Knockdown, hiljentämisen varmistettiin immunoblottauksella (kuvio 4A). Knockdovvn

HS3ST2

aiheutti lisäys solujen proliferaation (kuvio 4B). Solujen migraation ja invaasion myös kasvoi 45% ja 79% vuonna vaiennetaan NHBE soluissa, vastaavasti (kuviot 4C 4D).

(A) HS3ST2 siRNA transfektoitiin NHBE soluihin, ja siRNA-välitteinen knockdovvn vahvistettiin Western blotit. (B) Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä määrittää arvioimalla absorbanssi muunnetun väriaineen aallonpituudella 570 nm. (C squamous, okasolusyöpä cDifferentiation tiedot puuttuvat 68 tapauksessa CSV Lataa CSV

analysoida suhdetta

HS3ST2

hypermetylaation solujen lisääntymistä, Ki-67 ilmentyminen arvioitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 5D). Ki-67 leviämisen indeksi havaittiin olevan merkittävästi erilainen mukaan metylaatiostatuksen

HS3ST2

(

P

= 0.02; Kuva 5E): keskimääräinen Ki-67 leviämisen indeksi oli 29% ja 22% kasvaimista ja ilman

HS3ST2

hypermetylaation, vastaavasti. Suhde Ki-67 leviämisen indeksi ja

HS3ST2

hypermetylaation oli myös samanlainen adenokarsinooma (

P

= 0,04) ja okasolusyöpä (

P

= 0,009).

Survival analyysi

uusiutuminen-elinaika (RFS) ja kokonaiseloonjääminen verrattiin mukaan metylaatiostatuksen

HS3ST2

poikki kasvain vaiheessa. Vaikutuksen analysoimiseksi on

HS3ST2

hypermetylaation potilaan ennusteeseen, me ositettu tiedot kasvaimen vaiheesta, koska kasvain vaihe liittyy merkittävästi potilaiden eloonjäämisen NSCLC.

HS3ST2

hypermetylaation ei liittynyt RFS (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin vaikutus on

HS3ST2

hypermetylaation eloonjäämiseen osoitti eri mallia mukaan osallistuminen imusolmuke 248 vaiheen I-II NSCLCs. Saat 193 solmu-negatiivinen vaiheen I-II NSCLCs, 5 vuoden pysyvyys oli 59% ja 71% potilailla, joilla ilman

HS3ST2

hypermetylaation, vastaavasti (kuvio 6A). Ja tämä ero oli merkitsevästi erilainen (

P

= 0,04). Kuitenkin kokonaiselossaoloaika ei ollut merkitsevää eroa potilaiden välillä ja ilman hypermetylaatiota

HS3ST2

55 imusolmukkeisiin tapauksissa (

P

= 0,69; kuva 6B).

Kaiken eloonjääminen verrattiin mukaan metylaatiostatuksen

HS3ST2

193 solmussa-negatiivinen vaiheen I-II NSCLCs (A) ja 55 imusolmukkeisiin vaiheen I-II NSCLCs (B).

HS3ST2

hypermetylaation ryhmässä, joilla ei ole osallistumista imusolmuke osoittivat merkittävää haitallista vaikutusta eloonjäämiseen (

P

= 0,04).

COX suhteellisten riskien analyysi

Stratifioitu Coxin suhteellisten riskien analyysi (taulukko 2) ja 248 vaiheen I-II NSCLCs tehtiin valvoa mahdollisten sekoittavien vaikutusten muuttujien, kuten iän, sukupuolen, kasvaimen koon, adjuvanttihoito toistuminen, ja erilaistumista ja laskea riskisuhde (HR). Potilaat, joilla on

HS3ST2

hypermetylaation 193 solmussa-negatiivinen NSCLCs oli 2,12-kertainen (95% luottamusväli [CI] = 1,25-3,58;

P

= 0,005) suurempi epäonnistumisen riski verrattuna ilman

HS3ST2

hypermetylaation. Kuitenkin kokonaiselossaoloaikaa potilailla, joilla osallistuminen imusolmuke ollut merkitsevästi erilainen mukaan metylaatiostatuksen

HS3ST2

(HR = 0,84, 95% CI = 0,34-+3,82;

P

= 0,69).

HS3ST2

hypermetylaation

HR

95% CI

P