Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eikosanoideja bioaktiivisia lipidivälittäjäaineita peräisin arakidonihapon

1 (AA), joka vapautuu sytosolientsyymien fosfolipaasi

2 (CPLA ​​

2). AA metaboloituu kolme suurta väyliä, syklo- oksigenaasin (COX), lipoksigenaasin (LO) ja sytokromi P450, tuottamaan perheen eikosanoidien, jotka erikseen on osoitettu olevan pro- tai antituumorigeenistä toimintaa syöpään. Kuitenkin syövän eteneminen todennäköisesti riippuu monimutkaisia ​​muutoksia useisiin eikosanoidien tuottama syöpäsolujen ja kasvaimen mikroympäris- ja järjestelmällistä tarkastelua spektrin eikosanoidien syövässä ei ole tehty. Käytimme nestekromatografia yhdistettynä tandem-massaspektrometriaa (LC /MS /MS) kvantitoimiseksi eikosanoidien tuotettu keuhko- syövän etenemisen ortotrooppinen immunokompetenteilla hiirimallissa keuhkosyöpä, jossa Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) soluista injektoidaan keuhkoihin hiirissä . Läsnäolo kasvain kasvoi tuotteita sekä syklo-oksigenaasin ja lipoksigenaasin reittejä aika-riippuvaisella tavalla. Verrattaessa kasvaimia kasvatettiin CPLA

2 knockout vs villityypin hiirissä, osoitimme, että prostaglandiinit (PGE

2, PGD

2 ja PGF

2 a) tuotettiin molemmat syöpäsoluja ja kasvain microenvironment ( TME), mutta leukotrieeni (LTB

4, LTC

4, LTD

4, LTE

4) tuotanto tarvitaan CPLA

2 ilmentymistä TME. Virtaussytometriaa käyttämällä, me talteen kasvaimeen liittyviä neutrofiilien ja 2 eri kasvaimeen liittyvien makrofagien kasvain keuhkoissa, ja olemme määritelleet erilliset eikosanoidien profiilit LC /MS /MS: llä. Yhdistelmä virtaussytometrialla ja LC /MS /MS purkaa monimutkaisuus eikosanoidituotannon tuotannon keuhkosyöpää ja tarjoaa perusteet kehittää hoitostrategioita jotka kohdistuvat valitsemalla solupopulaatioden estää tiettyihin luokkiin eikosanoidien.

Citation: Poczobutt JM , Gijon M, Amin J, Hanson D, Li H Walker D, et al. (2013), eikosanoidi Profilointi käytettäessä Orthotopic Model keuhkosyöpään Progression massaspektrometrialla Osoittaa Selective Tuotanto leukotrieenien tulehdussolujen on microenvironment. PLoS ONE 8 (11): e79633. doi: 10,1371 /journal.pone.0079633

Editor: Anthony Peter Sampson, Southamptonin yliopiston School of Medicine, Iso-Britannia

vastaanotettu: 20 elokuu 2013; Hyväksytty: 04 lokakuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Poczobutt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamat NIH R01 CA162226 R01 CA108610 P50 CA058187. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eikosanoidit ovat perheen bioaktiivisten lipidien tuotetaan arakidonihapon metaboliaan. Arakidonihappo (AA) on monityydyttymätön rasvahappo, joka on sisällytetty sn-2-asemassa membraanifosfolipidien. Perheen PLA

2 entsyymit hydrolysoivat membraanifosfolipidien tuottaa vapaita rasvahappoja ja lysofosfolipidit. Vaikka useita muotoja PLA

2 on tunnistettu, sytosolin PLA

2-α, nimetty tässä tutkimuksessa CPLA

2, on spesifinen arakidonoyyli sisältäviä fosfolipidejä, ja on tärkeä entsyymi osallistuu säänneltyjen release AA vasteena mitogeenisen tai tulehduksellisten ärsykkeiden [1]. Vapaa AA voidaan metaboloituu kolmen suuren väyliä [2]. Syklo (COX-1, 2) tuottaa prostaglandiineja, kuten PGE

2 ja SMM

2 sekä tromboksaanien lipoxygenases tuottaa hydroxyeicosatetraenoic hapot (HETEs) ja leukotrieenien, ja sytokromi P450 epoxygenases tuottaa epoxygenated rasvahappoja (EETS). Yli 100 erillistä eikosanoidin on havaittu lajin [3]. Suurin osa näistä molekyyleistä erittyvät soluista ja toimia autokriini tai parakriinistä muoti kautta perheen G-proteiiniin kytkeytyvien reseptorien [4]. Ohjelmisto eikosanoidien tuottaman tietyssä solutyypissä tarjoamista säännellään ilmentymistä entsyymien koulutusjakson, mukaan lukien erityiset loppupään syntaaseilla. Esimerkiksi PGE

2 tuotantoa säännellään ilmentymistä syklo entsyymien sekä prostaglandiini E2 disyntaasit, kun taas erityisiä leukotrieenien, kuten LTC

4 vaativat ilmentyminen 5-lipoksigenaasin sekä LTC

4 syntaasi.

Keuhkosyöpä liittyy eniten syöpäkuolemista sekä miehillä että naisilla, on korostettu uusien terapeuttisten ja ennaltaehkäisevien lähestymistapojen [5]. Tutkimukset erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien keuhkosyöpä, ovat sekaantuneet yksittäiset eikosanoidien välittäjinä syövän aloittamista, etenemistä ja etäpesäkkeitä. Laajimmin tutkittu ovat prostaglandiinien, erityisesti PGE

2. Tutkimukset syöpäsolulinjoissa ovat osoittaneet lisääntynyt tuotanto PGE

2 välittyvät induktion COX-2 ja CPLA

2 ilmaisun [6] – [8]. Prostaglandiini tuotannon kautta estämällä joko CPLA

2 tai COX-2 inhiboi muuttaneet kasvu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut (NSCLC), ja kasvainten kehittymisen hiirissä vastauksena kemiallisten karsinogeenien [9]. Olemme osoittaneet, että hiiret, jotka ovat puutteellisia CPLA

2 (CPLA ​​

2-KO) osoittavat eston keuhkojen kasvain aloittamisesta käytetään kemiallista syövän synnyn malli [10]. Sitä vastoin PGI

2, joka on myös tuotettu alavirtaan COX-entsyymejä, on osoitettu estävän keuhkosyöpä aloittamista, sekä jolla on anti-metastaattinen vaikutus [11]. Lisääntynyt ilmentyminen 5- ja 12-lipoksigenaasin on myös liitetty kasvainten, mukaan lukien keuhkosyöpä [12]. Sitä vastoin ilmaus 15-lipoksigenaasin-2 näyttää menetetty keuhkosyöpää, ja se voi olla antituumorigeenistä rooli [13]. Lipoksigenaasi tuotteet vaikuttavat suoraan kasvainsoluihin, mutta ovat myös sääntelyviranomaisten angiogeneesin ja muokata immuunijärjestelmän toimintaa [12]. Äskettäin epoxyeicosatrienoic hapot (EETS) tuotettu sytokromi P450-reitin ovat sekaantuneet säätelijöinä etäpesäkkeiden, joka toimii ainakin osittain läpi endoteelin-konkreettisia vaikutuksia kaukaisiin elimiin [14]. Vaikka yhdistelmät COX ja lipoksigenaasiestäjistä on käytetty terapeuttisina aineina ja ovat osoittaneet myönteisiä vaikutuksia NSCLC [15], vaikutukset etäpesäkkeitä ei ole tutkittu. Lisäksi tutkimuksissa keskityttiin syöpäsoluja, useat raportit ovat sekaantuneet eikosanoidien nimenomaan PGE

2, säätelijöinä kasvaimen microenvironment (TME) [16], [17]. PGE

2 signalointi kautta EP3 /EP4 reseptoreihin johtaa rekrytointiin liittyvän syövän fibroblastien [18]. PGE

2 on myös osoitettu olevan kriittinen edistämisessä muodostumiseen T-sääntelyyn lymfosyytit [19]. Siten syöpä eteneminen aiheuttaa todennäköisesti monimutkaisia ​​muutoksia useisiin eikosanoidien mahdollisesti vastakkaisia ​​biologisia vaikutuksia. Sekä syöpäsolut ja solujen microenvironment ovat voimakkaita tuottajia eikosanoidien, että syövän etenemiseen riippuu integroidun vastauksena spektrin eikosanoidien tuotettu spatiotemporaalinen tavalla.

rajoituksena keuhkosyöpä tutkimuksen puute sopiva hiiri malleja metastaattisen keuhkosyövän. Olemme hiljattain kehittänyt immunokompetenteille potilaalle tehdä mallin, jossa hiiren keuhkosyöpään solut suoraan istutetaan vasemman koru hiirissä [20], [21]. Nämä solut muodostavat primaarisen kasvaimen, joka ajan 3-5 viikkoa metastasizes imusolmukkeisiin sekä maksa ja aivot. Mallin, olemme osoittaneet, että kasvaimia kasvava hiirillä maailmanlaajuisesti puutteellisia CPLA

2 on selvästi heikentynyt etenemisen ja etäpesäkkeiden [21]. Koska injektoitiin kasvaimen solut ilmensivät villityyppistä CPLA

2, nämä tiedot osoittavat, että tuotanto eikosanoidien solujen kasvaimen mikroympäris- on kriittinen keuhkosyöpä etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kuitenkin kriittinen eikosanoidien välittävät näitä vaikutuksia ei ole määritelty.

Kynnyksellä massaspektrometrianalyysissä lipidien on mahdollistanut mittaus useiden eikosanoidien tuotteita sekä solujen ja kudosten [22]. Tämä tekniikka mahdollistaa kvantitatiivinen määritys on suuri määrä ( 25) erillisiä tuotteita. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli soveltaa massaspektrometrisia lähestymistapaa järjestelmällisesti määritellä muutokset eikosanoidien aikana keuhkosyöpää etenemisen, ja määrittää rooli erillisiä solupopulaatioiden luomisessa tämän profiilin. Käyttäen immunokompetenteille potilaalle tehdä malli villityypin ja CPLA

2 hiirten pystymme arvioimaan osuus kasvaimen mikroympäristön tuotantoon yksittäisten eikosanoidien. Tuloksemme osoittavat monimutkaisen eikosanoidin kuvio aikana syövän etenemiseen, ja tunnistaa erityiset tulehduksellisten solujen TME selektiivisesti edistävät eikosanoidien muodostumista.

koemenettelytavat

Solut

Luciferase ilmentävien Lewisin keuhkokarsinooma solut (LLC-Luc) saatiin ATCC: stä ja ylläpidettiin DMEM: ssä (Corning Cellgro # 19-017-CV), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä /streptomysiiniä ja G418: aa (500 ng /ml).

hiiret

CPLA

2 knockout (CPLA ​​

2-KO) hiiriä C57BL /6 tausta [21], [23] ja villityypin C57BL /6-hiiriä kasvatettiin ja pidettiin Center for Comparative Medicine yliopistossa Colorado Denver. Kokeet tehtiin 12-16viikko hiiristä, sekä miehillä että naisilla, joilla hiirillä eri iän ja sukupuolen tasapuolisesti edustettuina kaikissa koeryhmissä. Kaikki toimenpiteet suoritettiin protokollien hyväksymien Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) yliopistossa Colorado Denver.

Orthotopic Mouse malli

LLC-Luc soluja (2 x 10

5) suspendoitiin PBS: ään, joka sisälsi 15% Matrigel (BD Biosciences) ja ruiskutetaan parenchyma vasemman keuhkolohko kautta rintakehään käyttäen 30G neulaa. Suoraan visualisoida keuhkoissa 4-5 mm viilto tehtiin ihon alle vasen olkapää ja ihonalaisen rasvan poistettiin. Toimenpiteen jälkeen viilto suljettiin käyttäen eläinlääkärin liimaa. Ensisijainen kasvaimen koko mitattiin käyttämällä digitaalista jarrusatulat.

Extraction ja massaspektrometrialla mittaus eikosanoidien

Hiiret lopetettiin 2 tai 3 viikkoa sen jälkeen, kun syöpäsolujen injektion ja koko vasen keuhkolohko sisältävä kasvain oli leikataan, punnittiin ja flash-jäädytettiin nestetypessä. Jäädytetyt kudokset homogenisoitiin 1 ml: ssa jääkylmää sakkaroosia-puskuria (250 mM sakkaroosi, 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita käyttäen moottorikäyttöinen homogenisaattoria. Eriä otettiin proteiinin mittaus. Jäljellä oleva homogenaatti välittömästi sekoitettiin 2 tilavuuteen jääkylmää metanolia. Proteiini mitattiin käyttämällä Bradford-reagenssia (Bio-Rad).

Eikosanoidit uutettiin ja analysoitiin olennaisesti kuten aiemmin on kuvattu, muutamin muutoksin [24]. Kun oli lisätty stabiili isotooppi-leimattua sisäisten standardien (2 ng kutakin, lukuun ottamatta cys-LT:, joista 5 ng lisättiin) ja metanoli-sisältävien homogenaatit, eikosanoidien uutettiin käyttäen kiinteän faasin patruunat (Strata-X 33 um Polymeeri Vastakkainen vaihe, Phenomenex), eluoitiin metanolilla, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 60 ul: aan 2 tilavuutta liuotinta A (8,3 mM ammoniumasetaatti, pH 5,7) ja 1 tilavuus liuotinta B (asetonitriili /metanoli, 65:35 v /v). 25 ui-näyte analysoitiin sen jälkeen LC-MS /MS käyttäen Ascentis C18 HPLC-pylvääseen (150 x 2 mm, 5 um, Supelco) rajapinta sähkösumutus lähde kolmoiskvadrupolisen massaspektrometrin (Sciex API 3000, PE-Sciex , Thornhill, Ontario, Canada). Näytteet eluoitiin virtausnopeudella 200 ul /min lineaarisella gradientilla 25%: sta 100% liuotinta B, joka nostettiin 25%: sta 85% 24 min, 100% 26 min, ja pidettiin 100 % vielä 12 min. Massaspektrometrinen analyysi suoritettiin negatiivisten ionien tilassa käyttämällä useita reaktio seurantaa seuraavat erityiset

m /z

transitions:

369.300→169.100TXB

2

369.300→163.1006-keto-PGF

1α

353.300→193.100PGF

2α

351.300→271.200PGE

2

351.300→233.200PGD

2

333.300→189.100PGA

2 ja PGJ

2

315.300→203.20015deoxy-PGJ

2

351.300→217.200LXA

4

351.300→221.200LXB

4

335.300→195.100LTB

4

335.200→115.1005,6-diHETEs

365.300→195.10020-COOH-LTB

4

351.300→195.10020-OH-LTB

4

624.500→272.200LTC

4

495.400→177.100LTD

4

438.300→333.300LTE

4

319.300→115.1005HETE

335.300→203.2005HpETE

317.300→203.2005oxoETE

319.300→179.10012HETE

319.300→219.20015HETE

343.300→245.20017OH-DHAa

343.300→273.20017OH-DHAb

327.300→283.200DHA

303.300→205.200AA

319.200→191.1005,6-EET

319.200→155.1008,9-EET

319.200→208.10011,12-EET

319.200→175.10014,15-EET

373.300→173.100[

2H

4]-TXB

2

357.300→197.100[

2H

4]-PGF

2α

373.300→167.100[

2H

4]-6-keto-PGF

1α

355.300→275.200[

2H

4]-PGE

2

339.300→197.100[

2H

4]-LTB

4

629.500→272.200[

2H

5]-LTC

4

500.300→177.100[

2H

5]-LTD

4

443.300→338.300[

2H

5]-LTE

4

327.300→116.100[

2H

8]-5HETE

311.300→267.200[

2H

8]-AA

Quantitation suoritettiin käyttäen standardia isotooppia laimennus kuten aiemmin on kuvattu [25]

valmistaminen yksisolususpension ja lajittelun virtaussytometrialla

Hiiret lopetettiin 2,5 viikko sen jälkeen, kun syöpäsolujen injektion kiertoa perfusoitiin PBS /hepariinia (80 U /ml, Sigma), ja vasen keuhko lohkoa, joka sisältää kasvaimia leikattiin. Kudokset 4 hiiret yhdistettiin, hajotettiin mekaanisesti, inkuboitiin 37 ° C: ssa 40 minuuttia kollagenaasi A: ta (1 mg /ml, Roche) ja DNAasi I (40 ug /ml, Sigma), ja käsitellään käyttäen GentleMACS dissociator C putket (Miltenyi Biotec). Tuloksena yksisoluiset suspensiot suodatettiin 70 um solun- (BD), jollei punasoluja lyysi käyttäen hypotoninen puskuri, ja suodatetaan toisen kerran läpi 40 um solun-. Ennen värjäystä, FcyR estettiin anti-CD16 /CD32 (BD Biosciences) 20 minuuttia. Solut värjättiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa seuraavilla vasta-aineilla: CD11-FITC: tä (klooni M1 /​​70, BD Biosciences), SiglecF-PE (Clone E50-2440, BD Biosciences), Ly6G-PE-Cy7 (klooni 1A8, BD Biosciences), F4 /80-APC (Clone CI: A3-1, AbDSerotec), CD11 c-APC-Cy7 (Clone HL3, BD Biosciences). Solut lajitellaan Coloradon yliopiston Cancer Centerin virtaussytometria Core käyttäen XDP–100 (Beckman Coulter). Lajittelutestissä strategian mukaan ilman roskia ja solujen dupleteiksi valon sirontaa, ja kuolleet solut mukaan DAPI (1 ug /ml). Aineisto analysoitiin Kaluza Software (Beckman Coulter).

hoito virtaussytometrialla-lajitellut solut mittaamiseen eikosanoidien muodostumista

Heti lajittelun, 1,5-2,0 x 10

5 Solujen kunkin pelletoitiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään ilman seerumia ja käsiteltiin kalsiumionoforilla (A23187, 0,5 uM) 12 minuutin ajan. Reaktiot lopetettiin lisäämällä jääkylmää metanolia.

Quantitative real-time-PCR

Kokonais-RNA eristettiin virtaussytometrialla-lajitellut solut käyttämällä QIAshredder ja RNeasy Micro (Qiagen) . Uutettu RNA muutettiin komplementaarinen DNA kanssa iScript cDNA synteesi (BioRad). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen MyIQ Real Time PCR Detection System (BioRad) seuraavilla alukkeilla: CPLA

2: Eteen 5′-GTGGTGGCCATTTTGGGTTC-3 ’, Rev 5′-TCGGGGTGAGAGTACAAGGT-3′, COX-2: Eteen 5’-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC-3 ’, Rev 5′-CACGTAGTCTTCGATCACTATC-3’, COX-1: Eteen 5’ATGGATACTGGCTCTGGGAA -3 ”, Rev 5’CTGAGTTGTAGGTCGGAGGG -3 ’, 5-LO: Eteen 5’ACTACATCTACCTCAGCCTCATT-3 ”, Rev 5’GGTGACATCGTAGGAGTCCAC-3 ’, LTC4S: Fwd 5’GTCTTCCGAGCCCAGGTAAA-3’, Rev 5’CGCGCGTATCCCTGGAAATA-3 ’, LTA4H: Fwd 5’ATCTCTCTTCCCATCGCCCT-3′, Rev 5’-CTTTCGGGACAGACACCTCT-3 ’ , TXAS1: Fwd: 5’GCTTCCACCTTCTGTATCCC-3 ’, Rev: 5’TCTCGGTTCTTATTGGGCAG-3’, MAGL: Fwd: 5’CGAACTCCACAGAATGTTCCCTA -3 ’, Rev: 5’ACAAAGATGAGGGCCTTGGGT – 3′, β-aktiini: Eteen : 5’- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3 ’, Rev 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATG- 3’, GAPDH: Fwd 5’CGTGGAGTCTACTGGTGTCTTC – 3 ’, Rev 5’CGGAGATGATGACCCTTTTGGC -3’ Ubiquitin C: Fwd: 5’CCACACAAAGCCCCTCAATC-3 ’, rev: 5’AAAGATCTGCATCGTCTCTCTCAC-3 ’.

Statistical Laskennallinen Analyysit

Käytimme Friedmanin Chi-Square test analyysi arvioida eroa kasvain keuhkojen WT ja CPLA

2-KO hiiret kerättiin 3 viikkoa. Rank tulokset sijasta raaka eikosanoidin tason mittauksia, käytettiin testissä. Käytimme False Discovery Rate (FDR) ohjaimen p-arvot on saatu Chi-Square testin korjaamiseksi useita vertailuja. FDR arvojen katsotaan ”säätää” p-arvot. Olemme päätellä, että yhteys on merkittävä, kun FDR arvo on alle 0,05.

Tulokset

Useita Eikosanoideja lisääntyneet kasvaimen kantavien hiirten

Käyttäen potilaalle tehdä immunokompetenteille hiirimallissa, jossa kasvainsolut injektoidaan hiirten keuhkoissa, olemme aikaisemmin osoittaneet, että menetys CPLA

2 kasvaimen mikroympäristössä esti keuhkosyövän etäpesäkkeiden [21]. Nämä vaikutukset ovat luultavasti osittain muuttunut spesifisten eikosanoidien kriittinen kasvainprogression ja etäpesäkkeitä. Määritellä kirjo eikosanoidien tuotettu keuhkojen syövän etenemisen potilaalle tehdä keuhkosyövän malli käytimme nestekromatografia yhdistettynä tandem-massaspektrometriaa (LC /MS /MS).

Lewisin keuhkokarsinooma solut (LLC-Luc: 2 × 10

5), joka on peräisin keuhkojen adenokarsinooma C57BL /6 hiiren, injisoitiin vasen keuhko lohkoa syngeenisten WT-hiirissä. Koko vasen keuhko lohkoa, joka sisältää kasvaimia kerättiin 2 ja 3 viikkoa injektion jälkeen, sekä vasemmalle lohkoa valvonnan hiiriä, joihin injektoitiin PBS /Matrigel. Eikosanoidien uutetaan korjatuista keuhkoista analysoitiin LC /MS /MS ja normalisoitu proteiinipitoisuuden näytteen. Meillä seurataan useita tuotteita syklo (COX), lipoxygenases (LO), ja sytokromi P450 polkuja. Lisäksi mittasimme vapaa arakidonihappo (AA) ja dokosaheksaeenihappoa (DHA).

WT hiirillä tasot eikosanoidien olivat yleisesti lisääntynyt syövän etenemiseen, mutta joilla oli eriasteista induktion ja eri ajallisten kuvioita (taulukko 1 ja kuva 1). Olemme eriytetty ryhmä eikosanoidien, jotka olivat sääteli 3-7 kertainen aikaisemmalla 2 viikon aikapisteessä (varhainen eikosanoidien): PGE

2, PGF

2α, LTC

4 ja LTE

4 (Fig. 1A). Tasoa tämän alijoukon eikosanoidien kasvatettiin edelleen on 3 viikkoa. Verrattuna Matrigel-hiiriin on injektoitu, PGE

2 on voimistunut 45-kertaiseksi, mikä oli suurin lisäys kaikkien eikosanoidien. LTC

4 ja LTE

4 Myös erittäin lisääntynyt, 12 ja 13 kertaiseksi. Tasot PGF

2α ei lisätä 3 viikkoa. Toinen ryhmä sisältyy eikosanoidien, joita ei ole lisääntynyt ( 2-kertainen), on 2 viikkoa, mutta kasvoi merkittävästi 3 viikkoa (myöhässä eikosanoidien Fig. 1 B). Jotkut myöhään eikosanoidien: PGD

2, TXB

2 (vakaa metaboliitti TXA

2) ja AA tuli erittäin voimistunut (7-10-kertainen verrattuna Matrigel pistetään), kun taas toiset (5-, 12-, 15-HETE, ja DHA) on voimistunut kohtalaisesti (3-4-kertaisesti). LTB

4, joka ei ollut havaittavissa on 2 viikkoa ajankohtana, havaittiin 50%: lla eläimistä on 3 viikkoa. Kaksi eikosanoidien: LTD

4 ja 6-keto-PGF

1α (vakaa metaboliitti SMM

2), olivat ennallaan tai vain marginaalisesti voimistunut joko 2 tai 3 viikon ajan (Fig. 1 C). Kumpikaan lipoksiineiksi eikä P450 tuotteet (5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET), havaittiin milloin tahansa pistettä.

LLC-Luc soluissa tai Matrigel (kontrolli) injektoitiin vasen keuhko lohkoa WT C57BI /6-hiirissä ja kasvain ja hallita keuhkot kerättiin 2 tai 3 viikkoa injektion jälkeen. Eikosanoidin tasot analysoitiin LC /MS /MS ja normalisoitu proteiinipitoisuuden näytteen. Tasot kuvaajiin ilmaistaan ​​taita ohjaus. A. Varhainen eikosanoidien – aiheuttama 3-kertaiseksi 2 viikon, ja edelleen lisäämällä 3 viikkoa. B. Late eikosanoidien – ei voimistunut ( 2-kertainen), on 2 viikkoa, mutta kasvoi 3 viikkoa. C. muutoksia eikosanoidien.

poistaminen CPLA

2 TME differentiaalisesti vaikuttaa eikosanoidien

Koska CPLA

2 on nopeutta rajoittava entsyymi eikosanoidin biosynteesi, mittasimme eikosanoidien tuotantoa keuhkotuumoreita kasvatettu CPLA

2 -knockout hiirillä. Tätä tarkoitusta varten, samalla, että WT-hiiriin injektoitiin, myös ruiskutetaan ajoneuvon (Matrigel) tai LLC-Luc soluja hiirissä maailmanlaajuisesti puutteellinen CPLA

2. Tämän kokeellisen strategian CPLA

2 poistetaan kaikissa soluissa kasvaimen microenvironment, kun taas villityypin ilmentyminen säilyy syöpäsoluja. Eläimet lopetettiin 2 ja 3 viikkoa injektion jälkeen ja eikosanoidin profiileja kasvain tai valvontaa vasen keuhko lohkoa määritettiin LC /MS /MS: llä.

Kuten kuviossa. 2A, kasvu primaarikasvainten ei eronnut villityypin vs. CPLA

2-KO hiiret, yhdenmukaisia ​​aiempien havainto [21]. Analyysi eikosanoidin profiilien (taulukko 2 ja kuvio. 2B) paljasti, että pohjapinta tasoilla eikosanoidien vuonna CPLA

2-KO hiiret olivat yleensä hieman pienempi, mutta ei tilastollisesti eronnut WT ohjaus hiirillä. Keuhko- syövän etenemiseen, eikosanoidien muodostumista lisääntyi sekä WT ja CPLA

2-KO hiirillä; kuitenkin, että kasvu oli merkittävästi pyöristetty kasvain CPLA

2-KO hiirillä. Taso eston CPLA

2-KO hiiret vaihtelivat suuresti eri analyytit, jotka vaihtelevat noin 25%: sta yli 90%: n inhibition. Tämä tulos osoittaa, että kukaan voi tehdä eron eikosanoidien, jotka on tuotettu ensisijaisesti microenvironment (estivät täysin asettamisessa CPLA

2 Knockout), ja eikosanoidien vaikutti sekä mikroympäristön ja syöpäsolut (alennettu osittain). Yksityiskohtainen analyysi eikosanoidituotannon profiilien paljasti, että AA ja DHA osoitti pienintäkään vähentäminen liittyy CPLA

2 puutos, noin 25%: iin 3 viikon aikana (taulukko 2). 5-, 12- ja 15-HETE vähennys oli keskimäärin 50% vuonna CPLA

2-KO hiirillä verrattuna WT hiiriin (taulukko 2). Tuotteet COX-reitin osoittivat eriasteista eston asettaminen CPLA

2 puutos. Vaikka TXB

2 ja 6kPGF

1α vähenivät 80% 3 viikkoa, muut prostaglandiinit (PGE

2, PGD

2 ja PGF

2 a) olivat keskimäärin 50% alemmat kuin WT-hiirissä (taulukko 2 ja kuvio. 2B). Suurin esto liittyy CPLA

2-puutos mikroympäristössä havaittiin leukotrieeni ryhmässä (taulukko 2 ja kuvio. 2B). Kasvu alussa leukotrieenit, LTC

4 ja LTE

4, viivästyi vasta 3 viikkoa CPLA

2-KO hiirillä verrattuna WT hiiret ja niiden tasot alenivat 90% LTC

4 ja 75% LTE

4. Leukotriene LTB

4, joka aiheutettiin 3wk WT kasvain keuhkoissa, ei ole havaittu CPLA

2-KO hiirten milloin tahansa vaiheessa. Tasot LTD

4, kun taas ei kasvanut syövän etenemiseen, oli alempi 80% 3 viikon CPLA

2-KO kasvaimia.

LLC-Luc soluja tai matrigeelin (kontrolli) oli ruiskutetaan vasen keuhko lohkoa WT tai CPLA

2-KO hiirillä. Injektiot tehtiin 3 erillistä päivää ohjaus vs. kasvain ja WT vs. CPLA

2-KO ryhmiä tasapuolisesti edustettuina päivittäin. Vasen lohkoa kätkeminen kasvaimia ja ohjaus keuhkot kerättiin 2 tai 3 viikon kuluttua injektion, eikosanoidien analysoitiin LC /MS /MS ja normalisoidaan proteiinipitoisuuden näytteen. Jokainen piste edustaa yhtä hiirtä. Palkit kuvaavat mediaanit. A. painot kasvain ja ohjata keuhkojen B. Valitse eikosanoidien

Erilliset populaatioiden tulehduksellisten solujen TME on erilaiset eikosanoidin profiilit

TME koostuu useista solutyyppejä, mukaan lukien tulehdussolujen, fibroblastit ja mukautuva immuunijärjestelmän solujen. Aloittamiseksi määrittää, mitkä näistä solupopulaatioiden tuottavat leukotrieenien asetus syövän etenemisen, käytimme virtaussytometrialla eristää tulehdussolujen keuhkoista kasvaimen kantavien hiirten. Käyttämällä markkereita aiemman luonnehtia tulehdussoluja keuhkoissa, määrittelimme neutrofiilien (Neu, CD11 + /Ly6G +), sekä kaksi populaatiot makrofagien, nimetty MacA (SigF + /CD 11 c + /F480 + /CD11 alhainen) ja MacB (F480 + /CD11 + /Ly6G- /SigF-), (Fig. 3A). Perustuen aiempiin tutkimuksiin [26], [27], MacA edustavat asukas keuhkorakkuloiden makrofageissa [27], kun taas MacB on heterogeeninen populaatio koostuu pääasiassa soluttautua monosyytit ja makrofagit, ja sisältää myös interstitiaalinen makrofagit, ja CD11 + dendriittisolujen [27], [ ,,,0],28]. Asettamisessa kasvainten määrä MacB solujen lisääntyi merkittävästi, kun taas MacA väestöstä ei muuttunut merkittävästi verrattuna kontrolliin, joita ei injektoitu syöpäsolujen (Fig. 3B).

LLC-Luc solua injektoitiin otetaan vasen keuhko lohkoa WT tai CPLA

2-KO-hiiret ja kasvain keuhkoissa kerättiin 2,5 viikkoa myöhemmin. Kudokset 4 hiiret yhdistettiin, ja tulehduksellinen solut otettiin talteen virtaussytometrialla. A. Juokseva virtaussytometrillä gating strategiaa käytetään palauttamaan tulehdussolujen: Neu: neutrofiilien (CD11 + /Ly6G +), MacA makrofageja (SigF + /CD 11 c + /Ly6G-) ja MacB makrofagit (F480 + /CD11 + /Ly6G- /SigF-). B. numerot talteen saatujen solujen virtaussytometrialla peräisin injektoimattomat tai kasvain vasen keuhko lohkoa WT ja CPLA

2-KO hiirillä. Tiedot osoittavat keskimäärin 3 eri kokeesta, jossa kukin lajittelun suoritetaan altaan 4 hiirtä. Virhepalkit osoittavat SEM

määrittämään sen eikosanoidien muodostumista, nämä kolme ryhmää tulehdussolujen, me talteen ne virtaussytometrialla keuhkoista kasvaimen kantavien hiirten, ja tutkittiin mRNA: n ilmentymisen entsyymien eikosanoidin-reitin qRT-PCR. Analyysi mRNA paljasti merkittäviä eroja ilmentymistä eikosanoidituotannon reitin entsyymien eri tulehdussolujen (Fig. 4). Kaikki kolme populaatiot ilmaisi CPLA

2, vaikkakin tasot olivat korkeampia MacA soluissa kuin MacB tai neutrofiilien. COX-1 ekspressoitui myös kaikissa 3 solutyypeissä, ja emme havaitse merkittäviä eroja sen tasoa, mikä viittaa siihen, että kaikki nämä populaatiot voivat tuottaa prostaglandiineja. Kuitenkin COX-2: ta ilmentyy selektiivisesti neutrofiilien, heikosti vuonna MacB ja lähes havaitsematon MacA. Koska tulehdussytokiinejä aiheuttaa prostaglandiinien lisäämällä COX-2: n ilmentymisen, olisimme ennustaa, että prostaglandiini tuotanto olisi välittyvän pitkälti neutrofiilien ja MacB. Tromboksaani-syntaasi TXAS1 havaittiin myös kaikissa kolmessa solutyypeissä. 5-LO oli korkein MacA soluissa, Neutrofiilit ilmaistuna 50-70% alhaisempi, ja ilmaisun MacB oli 90% pienempi kuin MacA. Tämä osoittaa, että leukotriene tuotanto asettamisessa syövän etenemisen johtuu suurimmalta osin MacA tai neutrofiilien, jossa palvelukseen MacB väestöstä osallistuu hyvin vähän. LTA4H ilmentyi kaikissa 3 solutyypeissä, kun taas ekspressio LTC4S oli rajoitettu vain MacA soluihin. Kaikki analysoidut entsyymit ilmaistiin samalla tasolla WT ja CPLA

2-KO hiiret, lukuun ottamatta CPLA

2, joka odotetusti ollut mitattavia määriä peräisin olevia soluja CPLA

2-KO . Koska vapaa AA voidaan vapauttaa muita entsyymejä CPLA

2, kuten monoasyyliyhdisteiden glyseroli lipaasia (MAGL) [29] mittasimme MAGL tasot eristettyjä soluja. MacA solut osoitti korkeita MAGL verrattuna joko MacB soluja tai neutrofiilien (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos johtaa ennustus, että CPLA

2 puutos on vähemmän vaikutusta eikosanoidien tuotantoa MacA solujen kuin MacB tai neutrophils.To vahvistaa mahdollisuuksia eikosanoidituotannon tuotannon MacA, MacB ja neutrofiilien populaatiot, solut otettiin talteen kasvain hiiret virtaussytometrillä ja stimuloidaan kalsiumilla A23187. Eikosanoidien muodostumista arvioitiin LC /MS /MS (kuva 5). Yhdessä lajitellut solut, tutkimme eikosanoidien tuotantoa viljeltyjen LLC-Luc syöpäsoluja. Suurin ohjelmistoon eikosanoidien tuotti MacA soluja. Suostumuksella korkean ilmentymisen 5-LO ja yksinomainen ilmaus LTC4S, MacA olivat ainoita, jotka kykenevät tuottamaan kysteinyylileukotrieenien, LTC

4 ja LTD

4. MacA tuotti myös LTB

4, vaikkakin vähemmän kuin neutrofiilien, 5-HETE, ja 5oxoETE. Huolimatta alhainen ilmentyminen COX-2, mutta sopusoinnussa ilmaus COX-1, MacA solut pystyivät tuottamaan PGE

2 ja TXB

2. Mielenkiintoista, eikosanoidien tuotantoa MacA soluja CPLA

2-KO hiirissä väheni verrattuna WT, mutta vain noin 50%. Nämä tiedot viittaavat siihen, että muita reittejä erillään CPLA

2, kuten MAGL teko antaa AA näissä soluissa. MacB solut tuottivat alhaisempi eikosanoidien. Koska sillä ei ole 5-LO, MacB eivät olleet omiaan tuottamaan leukotrieenien. Huolimatta ilmaisun entsyymien syklo koulutusjakson, MacB tuotetaan vain pieniä määriä PGE

2 ja TXB

2, joka vähenivät 80%, jos havaitaan CPLA

2-KO. Neutrofiilit, jotka ilmentävät 5-LO, mutta ei LTC4S, tuotettu LTB

4 tasoille 3 kertaa suurempi kuin MacA, mutta ei kysteinyylileukotrieenien. Sopusoinnussa niiden korkea ilmentyminen COX-2 neutrofiilit PGE

2, tasolla 4 kertaa korkeampi kuin MacA. He myös tuottanut 5-HETE ja TXB

2, alemmalla tasolla kuin MacA soluja. Kun asetus CPLA

2 puutos, neutrofiilituotantoa eikosanoidien väheni yli 90% verrattuna WT hiirillä. Muiden metaboliittien 12-HETE, PGF

2α, 15-HETE, AA, ja DHA tuotettiin kaikkien 3 solutyyppejä. Toisin kuin ydinsoluissa toipunut TME, LLC-Luc solut tuottivat rajoitetun spektrin eikosanoidien. Heidän päätuote oli PGE

2, havaitaan tasoilla noin 10 kertaa suurempi kuin valkosoluissa. Olemme myös havainneet PGF

2α, 15-HETE ja suhteellisen alhainen DHA ja AA. Ei leukotrieenit havaittu, vastaa meidän in vivo -tiedot osoittavat, että leukotrieenien selektiivisesti tuotetaan TME.

Suhteellinen mRNA: n ekspressio soluissa talteen kasvain keuhkoissa virtaussytometrialla. Expression arvioitiin qRT-PCR, normalisoitu geometrinen keskiarvo β-aktiini, GAPDH, Ubiquitin C, ja 18-vuotiaille, ja ilmaistaan% Maximum kesken analysoitiin solun ryhmiä. Kokeet suoritettiin 2 injektoidaan ja analysoitiin altaat hiiriä (4 hiirtä per WT tai cPLA2-KO ryhmä per pool). Täytetyt ympyrät – allas # 1, avoimet ympyrät – allas # 2, bar – keskiarvo altaat.

eikosanoidien muodostumista soluissa talteen kasvain keuhkoissa virtaussytometrialla. Talteen soluja stimuloitiin A23187 (0,5 uM) 12 minuutin ajan. Uutetaan eikosanoidien analysoitiin LC /MS /MS: llä. Kokeet suoritettiin 2 injektoidaan ja analysoitiin altaat hiiriä (4 hiirtä per WT tai cPLA2-KO ryhmä per pool). Täytetyt ympyrät – allas # 1, avoimet ympyrät – allas # 2, bar – keskiarvo altaat.

Keskustelu

Eikosanoidit edustavat suurta perhettä bioaktiivisten signalointimolekyylien monipuolisia ja mahdollisesti vastakkaisia ​​biologisia vaikutuksia. Vaikka paljon työtä on keskitytty tiettyihin eikosanoidien ja niiden rooli syövän, ei ole ollut systemaattinen yritys määritellä, missä laajuudessa nämä molekyylien ympäristössä syövän. Suuri määrä kirjallisuutta on määritellyt molemmat pro- ja antituumorigeenistä rooleja tuotteiden sekä syklo ja lipoksigenaasin reittejä [30], [31]. Tutkimuksemme käytti immunokompetenteille potilaalle tehdä mallin keuhkosyövän etenemisen, yhdistettynä lipidomic massaspektrometrian lähestymistapa osoittaa, että keuhkosyöpään etenemistä liittyy nousu useiden eikosanoidien johdettujen tuotteiden sekä syklo ja lipoksigenaasin polkuja. Yksittäiset eikosanoidien osoittivat eri aikaan riippuvuuksia, jossa osajoukko korotetaan aikaisessa ajankohtana analysoidaan, kun taas toinen osajoukko näytti olevan enemmän viivästynyt aikana induktio. Useat tuotteet (esim 6k-PGF

1α) ei muutettu, ja tuotteet sytokromi P450 kautta tai lipoksiineiksi ei ole havaittu mallimme.