Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpää on korkean esiintyvyyden kanssa huomattavaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta. Heikennettyä ilmentyminen DNA-vaurion vasteena proteiinin Xeroderma pigmentosum komplementaatioryhmässä C (XPC) on kuvattu virtsarakon syöpä. XPC olennainen rooli pääasiallisena aloitteentekijänä ja vahinkojen ilmaisimen maailmanlaajuisen genomin nukleotidin Leikkauskorjauksessa (NER) UV-induced vaurioita, tilaa vieviä DNA additiotuotteet ja juosteensisäisellä siltoja, kuten tekemät kemoterapeuttisen aineen Cisplatin. Siksi XPC proteiini saattaa olla informatiivinen biomarkkereiden ohjata henkilökohtaista hoitoa strategioita osajoukko virtsarakon syöpätapauksista. Siksi mittasimme XPC ekspressiotaso ja toiminnallinen NER aktiivisuus 36 rakkokasvaimista standardoidulla tavalla. Me optimoidut olosuhteet dissosiaation ja

in vitro

kulttuurin ensisijainen virtsarakon syövän solut ja vahvisti heikennettyjä XPC ilmaisun noin 40% kasvaimista. Kuitenkin NER aktiivisuus oli samanlainen yhteistyöhön viljellään villityypin soluja kaikissa paitsi yhdessä 36 rakkokasvaimista. Olemme päätellä, että (i) toiminnallinen NER puute on suhteellisen harvinainen ilmiö virtsarakon syöpään ja (ii) XPC proteiinin tasot eivät ole käyttökelpoisia biomarkkerina NER vaikutusta näissä kasvaimissa.

Citation: Naipal KAT, Raams , Bruens ST, Brandsma I, Verkaik NS, Jaspers NGJ, et ai. (2015) Heikennettyä XPC Expression ei liity Heikentynyt DNA Repair in virtsarakon syövän. PLoS ONE 10 (4): e0126029. doi: 10,1371 /journal.pone.0126029

Academic Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, SAKSA

vastaanotettu: 05 tammikuu 2015; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2015; Julkaistu: 30 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Naipal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: tutkimus näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta Euroopan yhteisön seitsemännestä puiteohjelmasta (FP7 /2007-2013) avustussopimuksen nro TERVEYS-F2- 2010-259893 (DDResponse) JH, RK ja DVG, URL: https://cordis.europa.eu/fp7/home_en.html; Hollantilainen Cancer Society (KWF) avustus nr. 2011-5030 JH, URL: https://www.kwf.nl/Pages/default.aspx; ja Vereniging Trustfonds Erasmus University Rotterdam JB, URL: https://www.eur.nl/eur/fondsen/trustfonds/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BC) on viidenneksi yleisin maligniteetti Euroopassa esiintyvyys on yli 150000 tapauksissa johtaneet yli 50000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Virtsarakon kasvaimia läsnä joko ei-lihas-invasiivisen (NMIBC) (70%) tai lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä (MIBC) (30%) [2]. MIBC on potentiaalisesti tappava sairaus, jossa on 5 vuoden pysyvyys 50-60% [3]. Therapy of MIBC liittyy lähinnä leikkaus ja systeeminen kemoterapia-hoitoja, jälkimmäinen lähinnä toistuvia ja etäpesäkkeitä.

On olemassa selvä kliininen tarve uusien systeemisen hoidon strategioita MIBC, koska selviytymisen MIBC potilaiden on ole parantunut viime vuosikymmeninä. Hoidot kohdistaminen kasvainspesifisen väyliä on osoitettu olevan tehokkaita erilaisissa syövissä, kuten rinta-, munasarja- ja munuaissyövän mutta BC tällaisia ​​hoitoja ei ole käytettävissä. Therapies kohdistaminen DNA-vaurioita vastaus (DDR) mekanismit ovat lupaavia lähestymistapoja syöpähoidon [4]. DDR mekanismit ovat välttämättömiä ylläpitämiseksi genomista vakautta DNA korjaukseen, solusyklin säätelyssä ja apoptoosin. Toiminnallisuutta erityisiä DDR reittien on tärkeä parametri, joka vaikuttaa herkkyyteen pahanlaatuisten solujen DNA: ta vaurioittavat kemo- ja sädehoidon. Lisäksi kohdistaminen erityisiä puutteita DDR väyliä saattaa johtaa entistä tehokasta hoitoa. Esimerkiksi DDR vika aiheuttama

BRCA1

tai

BRCA2

mutaatiot rinta- ja munasarjasyövän herkistää nämä kasvaimet estäjiä poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) [5,6] . Siten määritetään DDR asema yksittäisten kasvaimet voivat olla arvokkaita syövän hoidossa valinta.

nukleotidi- Leikkauskorjauksessa (NER) vastaa korjaus monenlaisia ​​erityyppisiä DNA vahinkoja tuottaman ympäristöä mutageeniset ja syöpää aiheuttaville aineille. Rakenteellisesti jotka eivät liity vaurioita korjattiin NER sisältää UV indusoi Helix vääristymiä, tilaa vieviä DNA additiotuotteet ja juosteensisäisellä ristisidoksia (esim lääkkeellisesti kuten sisplatiini) [7]. Kaksi suurta subpathways of NER kuuluvat globaalin genomin NER (GG-NER) ja transkriptio kytketty NER (TC-NER). Kseroderma pigmentosum komplementaatioryhmä C (XPC) on erityisesti mukana GG-NER ja toimii vahinkoja tunnustamista proteiinia monimutkainen HR23B. Vasta kun vahinko tunnustamista XPC-HR23B ydin NER proteiinit rekrytoidaan vaurio ja NER toteutetaan [8]. Tämä viittaa siihen, että XPC on nopeutta rajoittava tekijä GG-NER.

Useat tekijät osoittavat, että NER geenit osansa kehittymistä ja etenemistä BC; polymorfismit tietyissä NER geenien lisätä BC riskiä erityisesti tupakoitsijoilla [9-12]. Lisäksi osoitettiin, että heikennetty ilmentymisen NER proteiinin XPC on läsnä ~ 40% kaikista rakkokasvaimista ja osasyynä syövän etenemistä [13]. Lisäksi, hypermetylaatiota

XPC

geenin promoottori on huomattavasti korkeampi BC verrattuna normaaliin limakalvoon ja se liittyy korkeampi patologinen vaiheessa, läsnä ollessa metastaasin ja p53 mutaatioita [14]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tietty

XPC

vikoja BC aiheuttaa viallinen NER ja huono lopputulos alaryhmässä kasvaimia. Toisaalta,

XPC

viat voidaan käyttää hyväksi yksilöllistä kohdennettuja kemoterapiaa. Valikoivasti kohdistettu NER vika käyttämällä yhdisteitä, jotka aiheuttavat erityisiä DNA vaurioita, joiden korjaaminen edellyttää NER, esim. Sisplatiini, lisääntynyt sytotoksisuus voitiin saavuttaa NER puutteellinen syöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa, pyrimme tunnistamaan XPC ekspressiotasot yksittäisissä kliinisissä BC näytteitä yhdessä funktionaalisen NER aktiivisuutta, koska lähtökohtana yksilöllistä hoitoa . Perustimme toistettavissa tapa hankkia lyhytaikainen yksikerroksinen soluviljelmässä tuoreista virtsarakkokasvain yksilöitä suorittamaan meidän määrityksiä ja päätellä, että alhainen XPC ilmaisua ei välttämättä johtaa viallinen NER.

Materiaalit Menetelmät

kokoelma ihmisen virtsarakon syövän näytteitä

BC näytteitä (n = 105) kerättiin Erasmus MC Rotterdam. Yhdeksän kasvain näytteet saatiin radikaali cystectomy ja jäljellä Trans Virtsaputken Kaarileikkaus (TUR). Kun korjuu, kasvain näytteet kuljetetaan suoraan laboratorioon kuljetuselatusaineeseen (RPMI-1640, 10% vasikan sikiön seerumia ja antibiootteja). Kaikki näytteet olivat sitten annetaan yksilöllinen koodi ja tutkijat sokaisi varten potilastiedot. Kaikki kasvain näytteet arvioitiin jälkeen standardin HE värjäystä ja kasvaimen vaiheen ja laatu arvioitiin patologi WHO: n mukaan luokittelu 1973 ja 2009.

virtsarakkonäytteet kerättiin kirurginen jäljellä materiaalia. Mukaan sairaalaan politiikkaa potilaille tehtiin tietoinen siitä, että jäljellä oleva materiaali voidaan käyttää tutkimustarkoituksiin, ellei potilasta päättää olla osallistumatta. Kaikki materiaalit olivat koodattu siten, että tutkijat eivät voi jäljittää tietoja potilaan. Siksi ei nimenomaista kirjallista /suullista tietoon perustuva suostumus saatiin ja tarve kirjallinen /suullinen suostumus oli luopunut Institutional Review Board Erasmus MC ja tämän tietyn tutkimushankkeen ja menettely hyväksyi IRB (METC-2012-113).

Kudosviljelytutkimusten

Kasvaimen näytteet käsin viipaloitu pienemmiksi paloiksi käyttäen kirurgisia sakset ja seuraavaksi altistaa dissosiaatio käyttäen Miltenyi Biotec Kasvain dissosiaatio Kit yhdessä gentleMACS Dissociator mukaan valmistajan protokollaa. Solususpensioita ympättiin lasipeitinlevyihin AmnioMax-C100 (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja ilmakehän hapen. Jos riittävä määrä kasvainsoluja kiinnitettiin, pieni määrä villityypin ihmisen fibroblastit, C5RO, lisättiin kulttuurin toimia sisäisen valvonnan standardoituja suunnittelematon DNA-synteesi (USD) määritys, joka suoritettiin seuraavana päivänä. Erottaa C5RO solujen kasvainsoluista, niiden sytoplasma oli etukäteen merkitty 2.0μm polystyreenihelmet [15].

Virtsarakon solulinjat saatiin ATCC: stä (HT-1197 [ATCC CRL-1473] ja T24 [ATCC HTB-4] ja viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% FCS ja antibiootit.

Unscheduled DNA Synthesis (UDS) määritys

UDS määritys suoritettiin UV-säteilee solujen 16 J /m

2 UVC valo ja myöhemmin merkintöjä solujen kanssa kolmen tunnin ajan 20 uM 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinia (EDU, tymidiinianalogi) kasvualustaan ​​(kinkku F10 ilman tymidiiniä, 10% dialysoitua FCS, antibiootteja) [16, 17]. sen jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin väliaineessa, jota oli täydennetty 10 uM tymidiiniä 15 minuuttia poistamaan ei-spesifisen edu sitoutumisen. solut kiinnitettiin käyttäen 3,7% formaldehydiä PBS: ssä, joka sisälsi 0,5% Triton X-100. edu sisällyttäminen visualisoitiin fluoresenssimikroskopisesti käyttämällä Click-sitä kemiaa (Life Technologies) mukaan valmistajan protokollaa ja kvantifioidaan kuva-analyysi käyttämällä FIJI (ImageJ).

immunofluoresenssi

visualisoida XPC-proteiinin, kiinteän soluja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen XPC (Santa Cruz D-10; sc-74410 laimennettu 1/1000) ja 90 min ja toisen Alexa 488 tai 594 konjugoitu vasta-aine 60 minuutin ajan, ennen asennettavaksi DAPI sisältävät kiinnitysväliaine (Vectashield). Vasta- aineen testattiin XPC villityypin (C5RO) vs XPC puutteellinen (XP21RO) soluja.

Kuva-analyysi

XPC sekä UDS värjäys vähintään 50 yksittäistä kasvainsolujen ytimiä oli kvantifioidaan vakio kuvankäsittelyohjelma (ImageJ) ja verrataan ainakin 20 C5RO ytimien samalla dian. Sen jälkeen, standardoitu XPC ja UDS tasot kasvainsoluissa laskettiin:

immunohistokemia värjäys

visualisoimiseksi XPC on formaliinilla kiinnitetyt parafiiniin upotettuja (FFPE) osia virtsarakon kasvaimet, osat kuumennettiin 95 ° C: ssa 15 min antigeenin haku puskurilla (DAKO S1699) ja läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 PBS: ssä 20 minuutin ajan. Primaarista vasta-ainetta (anti-XPC Santa Cruz D-10, sc-74410 laimennettu 1/1000) lisättiin, jonka jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Toissijainen HRP-vasta-aineita inkuboitiin 60 min huoneenlämpötilassa ja visualisoitiin käyttämällä DAB peroksidaasia kemiaa (DAKO K6438). Näytteet analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä immunohistokemiallista pisteytysjärjestelmä (S1 Kuva). Tämä immunoreaktiivisuus pisteytys (IRS) järjestelmä ottaa huomioon positiivisten solujen prosenttiosuuden ja intensiteetti havaittu värjäytymistä [18].

immunoblottauksella

Immunoblottaus suoritettiin käyttämällä kanin polyklonaalista anti-XPC [19 ] ja hiiren monoklonaalinen anti-Tubuliinin (klooni: B-512, Sigma-Aldrich), yksi tunti huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden IRDye 800CW aasin anti-hiiri-lgG (H + L) (LI-COR) ja IRDye 680RD aasin anti-kani-lgG (H + L) (LI-COR) yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoidaan Odyssey 3.0 (LI-COR).

Colony selviytymisen

150 solua kuoppaa kohti ympättiin kuuden kuoppaisilla levyillä ja kaikissa olosuhteissa maljattiin kolmena kappaleena. Seuraavana päivänä, kun solut olivat kiinnittyneet, niitä käsiteltiin 0, 2, 4, 6, ja 8 J /m

2 UVC. Sen jälkeen, kun 8 päivää inkuboinnin jälkeen solut värjättiin 0,1% Coomassie Brilliant Blue vähintään 30 min. Pesäkkeet laskettiin GelCount (Oxford Optronix).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen IBM SPSS Statistics v21 ja GraphPad Prism V5.

Tulokset

XPC ilmentymistä virtsarakon syövän

Neljäkymmentä seitsemän 105 kerättyjen kasvain näytteet sisälsivät riittävästi kasvain tuottaa FFPE osiin. XPC proteiinin ilmentyminen tutkittiin näissä 47 kasvaimissa immunohistokemiallisesti ja monenlaisia ​​XPC tasojen havaittiin. Suurin osa (58%) näytteistä näkyy voimakas XPC lauseke (IRS = 3), kun taas 38% näytteistä näytetään alentuneet (IRS = 1 tai 2). 4% (2 tapausta) vain taustatasoja havaittiin (IRS = 0) (kuvio 1A ja S1 kuviossa). XPC tasot eivät osoittaneet merkittävää korrelaatiota kasvain vaiheessa (Kruskal-Wallis; p = 0,53) eikä myöskään kasvaimen (Mann-Whitney; p = 0,66) (kuvio 1 B ja 1 C).

. Frekvenssijakautuman XPC IRS luokitusten 47 TURB näytteissä. B. taajuus jakelu XPC IRS luokitukset perustuvat kasvaimen vaiheessa. Erot IRS luokitusten eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (Kruskal-Wallisin testi, p = 0,5266). C. Frequency jakelu XPC IRS luokitukset perustuvat kasvaimen. Erot IRS luokitusten eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (Mann- Whitney testi, p = 0,6612).

optimoiminen ex vivo kulttuuri dissosioituneista virtsarakon syöpäsolujen

Myöhemmin, tutkimme eroja in XPC proteiinin ilmentyminen korreloi vaihtelusta DNA korjaus kapasiteetti. NER aktiivisuus voidaan kvantifioida mittaamalla korjaus liittyvä DNA-synteesiä (kutsutaan myös suunnittelematon DNA-synteesi (UDS)). UDS määritys mittaa sisällyttäminen leimatun nukleosidin, 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinin (edu), altistumisen jälkeen UV-C-säteilyä (pääasiassa 254 nm), ja määritetään soluissa, jotka eivät ole parhaillaan S-vaihe-riippuvaisena DNA- synteesi [20]. UDS määritys vaatii yhden solun kerros soluja, koska UV-C säteily ei tunkeudu sisään paksu kudosbiopsioista. Siksi toistettava menetelmä perustettiin saamiseksi lyhyen aikavälin yksikerroksinen soluviljelmässä tuoreista virtsarakkokasvain yksilöitä.

Ensimmäinen vertasimme useita dissosiaation menetelmiä saada soluviljelmissä lähtien BC otetussa lasipeitelevyihin. Entsymaattinen dissociations käyttämällä erilaisia ​​proteaaseja johti alhainen onnistumisprosentti hinnat suhteessa kasvaimen solujen kiinnittymistä. Me pidetään kiinnitys onnistuu, kun kasvainsolujen kiinnittynyt enemmän kuin 5%: n viljelymaljalla pinnan. Kiinnitys välillä 5-30% katsottiin väli, kun taas yli 30% ilmoitti sopiva kiinnitys (taulukko 1). Olemme Saatu kiinnitetty kasvainsolujen vain 35% kasvaimista, kun Collagenase VII hoitoa, kun taas mitään kiinnitys saavutettiin trypsiini tai Dyspase hoitoja (taulukko 1). Erityisesti, jos solujen kiinnittymisen lasipäällyslevyn, pieni solumöykkyjen liitteenä tehokkaammin kuin yksittäiset solut (S2A kuvio). Toisaalta, dissosiaatio määritykset käyttämällä Miltenyi Biotec Kasvaimen dissosiaatio kit ja gentleMACS dissociator johti yhden solun kerroksen viljelmiä noin 80% kasvaimista (taulukko 1). Erottamaan nämä urothelial syöpäsolujen fibroblasteista, jotka usein saastuttaa tällaiset primääriviljelmiä, teimme värjäytymistä vastaan ​​sytokeratiinia 18. Jos sopiva kiinnitys enemmistön värjättyjen solujen positiiviseksi sytokeratiini- 18, joka ilmaisee puhdasta urothelial kasvain soluviljelmässä (S2B kuvio) . Toisaalta, kasvainbiopsioissa että näytetään cauterization vaikutukset HE värjäys, joka osoittaa diatermisen kasvaimen poisto, eivät kiinnittyneet peitelaseja mahdollisesti johtuen (kasvain) solukuolemaa liiallisen lämmityksen. Lisäksi Tuumorinäytteiden näytteet peräisin cystectomy yksilöt kiinnitetty menestyksekkäästi vain yksi yhdeksästä näytteitä, mikä osoittaa, että invasiivinen virtsarakon kasvaimet ovat vaikeasti kulttuuri

ex vivo

yhdessä solussa kerros.

Eri pinnoite strategioita peitinlaseja, kuten gelatiinia, fibronektiiniä tai Poly-L-lysiini ei johtanut parempaan solujen kiinnittymiselle (tietoja ei ole esitetty). Lopuksi testasimme eri soluviljelyalustoja lisätä kiinnitys kasvainsolujen. Media koostuu DMEM tai RPMI-1640 (molemmat täydennetty 10% FCS ja antibiootteja) osoitti solujen kiinnittymisen alle 50% näytteistä, kun taas AmnioMax-C100 väliaine saavuttaa liitteenä yli 80% näytteistä (taulukko 2). Yhdistelmä Miltenyi Biotec dissosiaation menetelmä ja AmnioMax-C100 väliaine käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa ja johti lyhytaikainen yksikerroksinen BC kasvain soluviljelmässä kahden päivän kuluttua kasvaimen poiston.

UDS virtsarakon syöpä näytteet

Funktionaalinen NER-aktiivisuus analysoitiin liitteenä syöpäsolujen 36 eri rakkokasvaimista käyttäen UDS määritystä. Lisäksi arvioimme XPC-proteiinin tasot samoissa soluissa immunofluoresenssivärjäyksellä. Tilanne XPC ja UDS suoritettiin käyttäen scoring menetelmä, joka verrattuna keskimäärin värjäytymisen intensiteetti kasvainsolujen, että normaalien ihmisen C5RO fibroblastit, jotka olivat yhdessä viljeltiin samalla peitinlasi kuin kasvainsoluja. Fibroblastien sekoitettu viljelmät leimattiin 2 um polystyreenihelmet erottamaan niitä kasvainsoluja (kuvio 2). Lähes 42% (15/36) ja virtsarakon kasvaimet ilmaisivat vähintään kaksi kertaa alhaisempi XPC proteiinia kuin co-viljeltiin fibroblastien (0-50%) (taulukko 3). Useimmat kasvaimet näkyvät lähellä normaalin XPC proteiinia (50-180% yhteistyön viljeltyjen fibroblastien). Emme havainneet XPC värjäytymisvoimakkuuksia alle 5%, tason tyypillinen XPC-puutosta fibroblasteissa (XP21RO) saatu XP-potilas (kuvio 3A). Merkillistä, XPC ilme osoitti hyvin heikkoa korrelaatiota kanssa UDS näissä kasvaimissa: R

2 = 0,32 (kuvio 3B). Useimmat kasvaimet, joilla on suhteellisen alhainen XPC tasot näytetään normaali UDS tasot (kuviot 2B ja 3). Normaali UDS (yli 50% viljeltiin yh- fibroblasteja) havaittiin 34 ulos 36 kasvainnäytteet (taulukko 3). Kaksi kasvaimet oli vähentynyt UDS (alle 50% viljeltiin yh- fibroblastien kontrollit), mutta yksi näistä UDS oli lähes 50%, paljon korkeampi kuin havaittu XPC

– /- solut (kuviot 2C ja 3A) . Toinen kasvain osoitti XPC ja UDS olivat samat kuin XPC

– /- solut. Valitettavasti puutteen vuoksi materiaalin enää geneettistä analyysiä tästä kasvain voitaisiin suorittaa. Johtopäätökset, suhteellisen alhainen XPC ilmaisun voi silti tukea NER aktiivisuus ja vähentynyt XPC ilmaisua ei välttämättä vaikuta NER aktiivisuus ex vivo viljellyissä BC soluja.

. Ylävasen kuva näyttää kaikki DAPI ytimiä. Oikealla on valoisa kenttä (BF) kuva, jossa C5RO solu on leimattu soluliman polystyreenipallosten. Seuraava: XPC fluoresenssivärjäys näytetään XPC proteiinin ilmentyminen kasvainsoluissa olevan samanlainen kuin viereisen villityypin fibroblasti. Ylempi oikea kuva: edu fluoresenssivärjäys näyttämään UDS signaali syöpäsolujen olevan samanlainen verrattuna viereiseen villityypin fibroblasti. B. Keskirivi kuvien edustaa virtsarakon kasvain näyte, jossa alempi XPC ilmaisu verrattuna C5RO soluihin kuitenkin normaalin UDS. C. Alarivi kuvien edustaa virtsarakon kasvain, jolla on alhainen XPC ilme sekä alhainen UDS tasolle. Valkoinen nuoli osoittaa villityypin C5RO solu. Muut ytimet edustavat erityisiä virtsarakon syöpä näyte.

. Jokainen kasvain on edustettuna sitä vastaavaan pisteet XPC ja UDS tasot prosentteina viljeltiin yh- C5RO soluissa. Kasvaimia ei näy XPC niinkin alhaisilla tasoilla kuten XP21RO, joka on XPC solulinjaan. Yksi kasvain osoitti UDS tulokset samanlainen XP21RO. B. scatterplot UDS ja XPC tulokset kunkin kasvaimen. XPC tasot ovat usein vähemmän kuin 50%. Kaksi kasvaimet näyttää UDS tasot ovat alle 50%, mutta yhdestä näistä UDS ovat lähellä 50%. Determinaatiokerroin (R

2 = 0,32) tarkoittaa ei tai hyvin heikko korrelaatio.

Tämä havainto on odottamaton valossa aiemman julkaisun osoittaa, että XPC ekspressiotasot vaihteli keskuudessa pieni paneeli yksittäisten perustettu BC solulinjojen ja että yksi solulinja alhainen XPC proteiinin taso oli laskenut DNA korjaus kapasiteetti. Saimme tässä solulinjassa (HT-1197) peräisin ATCC keräys ja verrataan sen kanssa BC solulinjan normaalin XPC ilme (T24). Yllättäen emme havaita eroa XPC proteiinin tasot eikä UDS tasot normaalien fibroblastien, T24 ja HT-1197-soluissa, vaikka saaduissa fibroblasteissa XP potilas (XP21RO) osoitti selvästi vähentänyt XPC proteiinin tasot ja pienentää UDS (S3A kuvio) . Myöhemmin, vertasimme XPC tasoon HT-1197 ja muut tunnetut XPC-taitavia ja vajausta solujen immunoblottauksella (S3B kuvio). Jälleen HT-1197 ei näy alennettu XPC tasolla, kun taas tunnetut XPC-vajaiden solujen osoitti selvästi puuttuessa XPC proteiinia. Olemme myös herkkyysanalyysia HT-1197 ja T24 UV-C säteily suorittamalla yhdyskunnan säilymiseen määrityksessä eikä löytänyt eroa herkkyydessä (S3C kuvio). Tämän vuoksi päättelemme, että HT-1197 ei ole vähentynyt XPC proteiinin taso eikä vähentänyt NER kapasiteettia.

XPC ilmaisun ja uusiutumisen riski BC

Lopuksi tutkia kasvaimen uusiutumisen on vaikutusta on XPC proteiinin ekspressiotasot keräsimme lisää kliinisesti merkityksellisiä tietoja ja verrataan XPC proteiinin tasot ensisijainen NMIBC kuin toistuvia NMIBC. XPC tasot eivät eronneet merkitsevästi (Mann-Whitney; p = 0,58) näiden kahden ryhmän (S4A kuvio). Myös XPC proteiinin tasot eivät eroa merkittävästi (Mann-Whitney; p = 0,77) välillä kasvaimia, jotka osoittivat toistuminen vuoden sisällä ja kasvaimia, jotka eivät. Nämä tiedot kertyi potilaiden seurantaan, riippumatta siitä, onko analysoitu BC näyte oli primaarikasvaimen tai toistumisen (S4b kuvio). Tämä tarkoittaa, että XPC ekspressiotasoja huonosti korreloivat riskiä toistumisen NMIBC.

Keskustelu

Aiempien tutkimusten [13,14], huomasimme, että heikennetyt XPC proteiinin ilmentyminen on yhteinen ilmiö BC, sekä dissosioituneissa kasvainsoluissa sekä FFPE näytteissä. Aikaisemmat tutkimukset eivät analysoi funktionaalinen NER toimintaa BC. Siksi olemme kehittäneet

ex vivo

soluviljelmässä suorittaa UDS määritykset, toiminnallinen testi NER toimintaan. Täällä olemme varmistaneet, että XPC ilmaisu vaihteli suuresti ensisijainen BC näytteet, mutta yllättäen, huomasimme, että alensi XPC proteiini tasoilla eivät yleensä vaikuta NER kapasiteettia BC. Vielä tärkeämpää on, funktionaalinen NER puute näyttää olevan paljon harvinaisempia BC kuin olisi odotettavissa perustuvat aikaisempiin tutkimuksiin. Alentuneita XPC proteiinia näissä kasvaimissa näytti riittää toiminnallisesti tukea NER. Lisäksi olemme eivät havainneet korrelaatiota XPC ilmaisun ja kasvaimen tai vaiheessa emmekä tarkkailla suhteessa kasvaimen uusiutumisen riskiä. Olemme päätellä, että XPC proteiini tasoja ei pitäisi käyttää biomarkkerina valita rakkokasvaimista alentuneisiin DNA korjaus kapasiteetti.

Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että vakavia toiminnallisia NER puutteita, jotka antavat yliherkkyyttä aiheuttavia kemikaaleja NER-korjattavissa vahinko, ovat harvinaisia ​​BC. Siksi on epätodennäköistä, että heikentynyt NER aktiivisuutta voidaan hyödyntää terapeuttisesti BC. Lisäksi taajuus XPC vikojen BC voidaan yliarvioida kirjallisuudessa, koska emme löydä XPC eikä NER vika HT-1197 solulinja, josta aikaisemmin oli raportoitu satamaan tällaisia ​​vikoja [13]. Erot havaitsemismenetelmä on XPC ekspressiotasoja tai DNA korjaus kapasiteetti voisi selittää näitä eroja. Tästä huolimatta monet raportit viittaavat siihen, että

XPC

geenipolymorfismien voivat vaikuttaa BC riski tai prognoosi [10,12,21]. Se on vielä tuntematon, ovatko nämä polymorfismit vaikuttavat XPC ilmaus mutta se saattaa olla, että alentunut XPC ilmaisun ja polymorfismit on hienovarainen vaikutus NER toimintaa, mikä voi osaltaan lisätä mutageneesiä ja syövän synnyn, varsinkin silloin, altistuminen tietyille DNA: ta vaurioittavat aineet esim tupakansavun. Tutkimuksemme on ensimmäinen kuvaamaan korrelaatio toiminnallisten NER aktiivisuus ja XPC proteiinin tasot mitattiin suoraan ensisijainen virtsarakon syöpään. Meidän määrityksessä, NER aktiivisuus yli 50% (yhteistyön viljeltyjen fibroblastien) pidettiin normaali ja lievä väheneminen ei noudetaan. Toisaalta, UDS analyysit suoritettiin useita NER geenivirheitä, hiiren sekä ihmisen soluihin, osoittavat merkittävästi alensi NER toimintoja (alle 50% viljeltiin yh- fibroblasteja). Tämä päättää, että UDS määritys on sopiva havaitsemaan NER puute. Vuonna XP21Ro soluissa ilmenee XPC tasoilla noin 5% korreloivat hyvin 10% jäljellä NER aktiivisuutta. Mikään kasvainten analysoitu osoitti tämän alhainen XPC, mikä viittaa siihen, että havaittu XPC tasot pystyvät tukemaan lähellä normaalia NER ja että XPC ei todennäköisesti ole nopeutta rajoittava näissä kasvaimissa. Ex vivo primaarikasvaimen kulttuuri mallia käytettiin tässä tutkimuksessa oli erityisen suunniteltu ja optimoitu, jotta tarkasti analysoida NER ominaisuudet yksittäisten virtsarakkokasvain näytteitä. Primaarikasvaimen hajotettiin ja solut viljeltiin lasipeitinlevyihin helpottamiseksi standardoituja UDS määrityksiä ja XPC mittaukset immunofluoresoivalla kuvantaminen. Tämä kulttuuri järjestelmä osoitti vankan toistettavuus ja siksi voidaan käyttää seulomaan kliininen kasvain näytteet käyttäen funktionaalisia

ex vivo

määrityksiä. Korkea onnistumisprosentti Tämän menetelmän estää käyttöön valinnan aiheuttama harha seuraus ainoastaan ​​alaryhmä syövän kliininen yksilöitä. Näin ollen tämä viljelymenetelmä voidaan edistää tunnistamista biomarkkerit, jotka voivat ennustaa vaste syövän hoitojen

kokeellinen suunnittelu on se etu, että muut solut voidaan viljellä yhdessä sellaisten kasvainsolujen, kuten sisäisen valvonnan, poistamalla kokeellinen vaihtelu näytteiden välillä. Itse asiassa, useita ohjaus soluja voidaan sisällyttää käyttämällä polystyreenipallosten erikokoisia tai fluoresoiva väri. Tällä tavoin myös huomannut, että yksi kasvain pienemmillä UDS osoitti korkeampaa jäljellä korjaus kapasiteetti kuin XPC

– /- solu, joka osoittaa, että NER ei ollut täysin kumottu kyseisessä näytteessä.

Niinpä tärkeä ensimmäinen johtopäätös meidän tuloksista on, että XPC tasoa ei voida käyttää biomarkkerina ohjaamaan hoidon valintaa tai hoitovaste NER-korjattavissa DNA: ta vaurioittavien aineiden BC. Olemme myös päätellä, että

ex vivo

viljelyjärjestelmästä ja UDS määritys soveltuvat hyvin työkalujen käyttöä kasvaimia (muu kuin BC), joilla on heikentynyt NER aktiivisuutta. Lisäksi uusi toiminnallinen DNA korjaukseen määrityksiä voitaisiin kehittää aktiivisuuden arvioimiseksi muiden DNA korjaukseen reittejä kasvainsoluissa ja lopulta tunnistaa DNA korjaus vikoja, jotka voitaisiin hyödyntää terapeuttisesti. Erityisesti tämä tutkimus korostaa merkitystä toiminnallisten määritysten tulosten arvioimiseksi on enemmän epäsuoria mittauksia, kuten RNA: n ja proteiinien ilmentyminen tasoilla.

tukeminen Information

S1 Kuva. Immunoreaktiivisuus pisteytysjärjestelmä (IRS).

A. IRS pisteytysjärjestelmä. B. Edustavia kuvia XPC värjäytymisen virtsarakon syöpään näytteitä eri IRS

doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s001

(PDF)

S2 Kuva. Pienet solumöykkyjen kiinnittämiseksi kattamaan luistaa.

A. Edustavia Kirkas kuvat osoittavat eri möhkäleitä saman kasvaimen kiinnittämällä kansi luistaa ja ripustus. B. Jos asianmukaisen kiinnityksen suurin värjättyjen solujen positiiviseksi sytokeratiini- 18, mikä osoittaa puhtaan kasvain soluviljelmissä eikä saastuttavia fibroblasteissa. Sininen = DAPI, vihreä = sytokeratiinista 18.

doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s002

(PDF)

S3 Fig. HT-1197 näyttää normaalia XPC proteiinia ja UDS tasolla.

A. Immuunifluoresenssivasta kuvia verrataan XPC ja UDS tasoja XP21RO, T24 ja HT-1197-solujen kuin C5RO soluja. XP21RO tiedetään olevan puutteellinen XPC ja UDS. Mitään eroa ei nähty välillä T24 ja HT-1197. Sininen = DAPI, BF = Kirkas kuva osoittaa C5RO soluja leimattiin 2 um polystyreeni helmiä, vihreä = XPC ekspressiotaso, punainen = UDS tasolla. Valkoinen nuolet osoittavat ytimet kunkin solulinjan. B. Immunoblot for XPC vertaamalla HT-1197 ja T24, tunnettu XPC puutteellinen ja villityypin fibroblasteissa. C. Colony -eloonjäämiskoe osoittaa pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti HT-1197 ja T24-solujen jälkeen UV-säteilyä. Ei eroa HT-1197 ja T24 havaitaan. Virhe palkit osoittavat keskihajonnan perustuu neljään itsenäisen kokeen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s003

(PDF)

S4 Fig. XPC proteiinin tasot ja toistumisen kasvaimia.

A. Kasvaimet jaettiin kahteen ryhmään, primaarikasvaimista ja toistuva kasvaimia, ja standardoitu XPC proteiinin ilmentymiseen pisteitä verrattiin näiden ryhmien. Ei havaittu merkitsevää eroa näiden ryhmien välillä. Mann-Whitney testi, p = 0,58. B. Potilaiden seuranta osoittavilla mitään eroa XPC tasoilla kasvaimia, jotka eivät toistu vuoden kuluessa TUR ja kasvaimet, jotka toistuisi. Kukin tietopiste edustaa yhtä kasvain. Vaakasuora viiva edustaa mediaani ja virhepalkkeja osoittavat kvartiilivälejä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0126029.s004

(PDF) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää kliininen tiimi urologian osasto ja patologian osaston Erasmus Medical Center Rotterdam tukea keruussa tutkimusmateriaalia.