Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkea MYC ilmentyminen liittyy lähes kaikkiin ihmisen syövissä. JQ1, kemiallinen yhdiste, joka inhiboi MYC ilme on terapeuttisesti tehokas prekliinisissä eläinmalleissa in keskiviivan syöpä, ja Burkittin lymfooma (BL). Tässä osoitamme, että JQ1 ei estä MYC ilmaisu samassa määrin kaikissa tuumorisoluissa. BL-solut osoittivat ~90% lasku MYC transkriptio käsiteltäessä JQ1 kuitenkaan ole vastaavaa vähennys nähtiin useita ei-BL soluissa. Molekyylirakennetta, nämä erot näyttävät johtuvat vaatimukset Brd4, aktiivisin version Positiivinen Transcription elongaatiotekijä B (P-TEFb) sisällä Super Venymä Complex (SEC), ja transkriptiotekijöitä kuten Gdown1 ja MED26 sekä myös muita tuntemattomia solu tekijöihin. Tutkimuksemme osoittaa, että sääntely korkeita MYC sen erilaisissa syöpäsoluissa ohjaa ainutlaatuinen sääntelymekanismeja ja että tällainen yksinomainen sääntely allekirjoitusta kullakin syöpäsoluissa voitaisiin käyttää kohdennettuihin terapeuttisten.

Citation: Fowler T, Ghatak P, hinta DH, Conaway R, Conaway J, Chiang CM, et al. (2014) asetus

MYC

Expression ja Differential JQ1 Herkkyys syöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (1): e87003. doi: 10,1371 /journal.pone.0087003

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu 23 syyskuuta 2013 Hyväksytty: 16 joulukuu 2013; Julkaistu: 23 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Fowler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain varoja CM. C (NIH CA103867, CPRIT RP110471, ja Welch säätiö I-1805), ja A.L.R (American Heart Association, 12GRNT12180023). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: J.E.B. on vähemmistö osakeallokaatio sisään Tensha Therapeutics. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

lymfoomat ovat yleisesti luokitellaan kahteen luokkaan: Hodgkinin ja non-Hodgkinin lymfooma (NHL) [1]. Kaksi yleisintä muotoja aggressiivinen NHL ovat hajanainen suuri B-solulymfooman (DLBCL) ja Burkittin lymfooma (BL) [1], [2], [3]. Translokaatio proto-onkogeenin

MYC

yhdeksi immunoglobuliinin geenilokusten [

IG-MYC

translokaatio; enimmäkseen t (8; 14) q24; q32 tyyppi] johtaen poikkeavaan

MYC

ilmaisua pidetään hallitseva geneettinen tapahtuma synnyssä BL ja noin 10% DLBCL [4]. Sitä paitsi translokaatio,

Myc

voi läpikäydä kasvaimia synnyttävän purkamista kautta korkean tason geenimonistuman sekä mutaatioita cis-säätelyelementtejä useilla syövän tyypit (esim myelooma, paksusuolen syöpä ja neuroblastooma) [5], [6] . Lisäksi vaikka suurin BLS ovat vapautettu C-

MYC

(tästedes kutsutaan

MYC

) ilmaisu seurauksena olevan

IG-MYC

translokaatio, suurin osa ei -BLs eivät kanna

IG-MYC

translokaatiot, mutta muita geneettisiä poikkeavuuksia johtaa vapautettu

MYC

ilme. Vaikka korkea ilmentyminen rajoittuu BLS, MYC tavoite ilme vaihtelee alemmalla tasolla koko ei-BL ja väli- lymfoomat ja muodostaa negatiivisen prognostinen markkeri näissä lymfoomat.

MYC dimerisoituu MAX sitomaan kohdesekvenssin (E -kohtaan) ja säädellä geeniekspressiota. MYC paitsi aktivoi transkription vaan myös tukahduttaa kohdegeenin ilmentymisen joko suoran biding (jossa Miz-1 transkriptiotekijä) tai säätelemällä mikro-RNA: iden (MIRS) [7]. Kuitenkin toiminta MYC on monimutkainen, koska kahden viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että MYC ei ole erityistä transkription allekirjoituksen, mutta toimii täydentää lähtö nykyisten transkription ohjelmien tietyssä solussa mieluummin kuin suorittamalla omien transkription ohjelman [8], [9] .

MYC

kuuluu luokkaan geenejä kutsutaan Primary muuniresponssigeeneinä (PRGs) monet sataman keskeytetty Pol II proksimaalisessa promoottorin alue, joka aktivoitaessa voi nopeasti siirtyä käyttämään pitenevä Pol II ja toiminnallinen transkriptio [10]. Riippuvan signaalin stimulaatio johtaa parannetun asetylointi histonin 3 lysiinin 14 (H3K14Ac) ja kahdella H4 lysiinin paria, H4K5 /12 tai H4K8 /16, joka on tapahtuma, joka tulee ratkaiseva sitoutumisen bromodomain (BRD), proteiineja, jotka rekrytoida transkriptiotekijöitä tarvittavat transkriptio [11], [12]. Rekrytointi positiivinen transkription elongaatiotekijä b (P-TEFb) ja mahdollisesti yleinen aloittamista cofactor sovittelija, on tärkeä rooli Brd4-säädellään monien geenien transkription kuten

MYC

. Todellakin, kun palkkaamista Brd4, P-TEFb fosforyloi venymään tekijät DSIF (Spt4 ja Spt5), negatiivinen elongaatiotekijä (NELF), ja Pol II johtaen vapautuminen pysähtyi Pol II ja myöhemmin murtovenymä transkription [10], [13] ja äskettäin tarkistetaan [14]. Yhdessä nämä ja muut tulokset viittaavat siihen, että venymä transkription on kriittinen sääntelyn kannalta orchestrating

MYC

sääntelyä [10].

Kuten monet MYC-prosesseista tarvitaan homeostaasiin ja kasvua, terapeuttinen strategiat suunnattu modulaatio

MYC

ilmaisun sijaan suoranainen tukahduttaminen vaikuttaa houkuttelevalta. Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation ensimmäinen kuvattu thienodiazepine analogien estävän tehokkaasti chromatin sitoutumisen bromodomains liittyvien BET perhe [15]. Sen jälkeen, läheistä sukua pienmolekyylisalpaaja-, JQ1, on havaittu olevan terapeuttisesti tehokas prekliinisissä eläinmalleissa [16], [17], [18]. Nämä ja niihin liittyvät pienten molekyylien kilpailukykyisesti miehittää asetyyli-sitova taskuihin BET bromodomains, jolloin vapautuminen BET proteiinien (erityisesti Brd4) alkaen chromatin [19]. Huolimatta näistä lupaavia mielenosoituksia, JQ1 ei estä

MYC

lauseke samassa määrin kaikissa tuumorisoluissa [19]. Näin ollen on tärkeää ymmärtää, miksi JQ1 on tehokas vain tietyt

MYC

-riippuvaista syöpiä, joka voi viime kädessä päättää kliininen teho tätä yhdistettä potilailla.

Havaitsimme, että vaikka JQ1 käsittely laski Brd4 käyttöaste samassa määrin solutyypeissä testattu, kyky JQ1 vähentää

MYC

transkription solujen välillä eroja. In JQ1-herkkien solujen estäminen tapahtui tasolla syntyvän transkription vaikuttavien Pol II ”keskeytetty” Pol II-Ser5-P ”, pitenevä” Pol II-Ser2-P, ja P-TEFb käyttöaste. Lisäksi on eroa täyttöaste jäsenten Super Venymä Complex (SEC), ja tekijöitä, jotka liittyvät RNA Polymerase II, osoitteessa

MYC

promoottori alueille kahdessa solutyypissä. Yhdessä meidän tiedot osoittavat korkeita

MYC

ylläpidetään eri syöpäsoluissa kautta erillisten mekanismien tasolla transkription pidentymisen eri kehuja transkriptiotekijöitä ja tämän vuoksi niihin kohdistetaan eri JQ1 herkkyys.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

kypsät hiiren B-solulymfooma BAL17 [20], ihmisen BL linjat Akata [21], Raji [22], ja Ramos [23], ja ihmisen epiteelin HeLa-S3 [24] viljeltiin RPMI-elatusaineessa, jossa HEPES (Invitrogen), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliini, 100 ug /ml streptomysiiniä, 1 mM natriumpyruvaattia, 0,5 mM 2-merkaptoetanolia liuos (Invitrogen) ja 10% naudan sikiön Calf Sera (Atlanta Biologicals). RNA perustuvissa määrityksissä käytetään 1-2 x 10

6 solua ja 2 x 10

7-soluja käytettiin Kromatiini Immunosaostaminen (chip). JQ1, liuotettu DMSO: hon, laimennettiin media 1 uM ja inkuboitiin solujen kanssa 2 tuntia 37 ° C: ssa. Ei vaikutuksia transkriptioon havaittiin DMSO kontrolleihin (tuloksia ei ole esitetty). Kokeet kuvassa S1 (File S1), joihin liittyy BCR stimulaation koostui 2 tunnin esikäsittely 1 uM JQ1 seurasi 30 minuutin altistus vasta-ainefragmenttien spesifinen joko ihmisen tai hiiren BCR (Jackson Immuno-).

RNA-Real Time PCR-analyysi

suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Ct-arvoja laskettiin keskiarvo ja signaali ilmoitetaan suhteena kohde yli ActB mRNA kautta lineaariyhtälöitä kunkin alukeparia. Myc alukkeet luetellaan S3 (File S1) ellei alla.

mRNA Primers-hiiri

Myc Alukkeet ole listattu kuviossa S3 (File S1) B

In1 /Ex1 5′-AGAGCTCCTCGAGCTGTTTG

5′-CGTCTACATTCAAGACGCAGA

ActB 5′- AGGCATGGAGTCCTGTGGTATC

5′-AGCCACAGGTCCTAAGGCCAG.

Fos 5′- GGATTTGACTGGAGGTCTG

5′- TGGGCTCAGGGTCGTTGA

mRNA Primers Human

Myc Alukkeet ole listattu kuviossa S3 (File S1) B

In1 /Ex2 5′- GCACCAAGACCCCTTTAACTC

5′-TCCTGTTGGTGAAGCTAACGEx2 /IN2 5′- AGCGACTCTGGTAAGCGAAG

5′-GTGGCCCGTTAAATAAGCTG

ActB 5′- CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT

5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG

Fos 5′-CTCCGGTGGTCACCTGTACT

5′-GTCAGAGGAAGGCTCATTGC

Western-blottaus

Nuclear otteita 2 x 10

6 solut altistettiin 10% (Myc) tai 6% (Brd4) SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blottauksella. Ensisijainen aineilla (kaniinin anti-C-terminaali Brd4-C IgG ja kanin anti-Brd4-S484 /488-phos) [26], [27], kanin anti-CREB IgG (Soluviestintä) ja toisen (vuohen anti-kani piparjuuri peroksidaasiin liitetty IgG, Invitrogen) vasta-aineita 1:1500. Täplät visualisoitiin Novex ECL kemiallis-luminescent Alustan Regent Kit (Invitrogen) ja tiheysmittaus suoritettiin ChemiDoc MP Imaging System (Biorad).

Strand-erityisiä Detection

380 ng RNA: 1 uM lopullinen alukekonsentraatio käytettiin kutakin RT-reaktiossa käyttäen Invitrogen n kloonatun AMV First Strand synteesi kit. Strand-spesifisiä alukkeita; for (+) lohkoon käänteisen vastaavia alukkeita TSS-ala (+17 hiiren ja +11 ihmisen) ja (-) lohkon eteenpäin vastaavia alukkeita loppuun geenin (+3948 hiiren ja +4791 ihmisen, sekvenssit kuviossa S3, File S1). Standard reaaliaikainen PCR-monistus käytettiin, jossa on esitetty alukkeiden ja niiden kumppaneita, kuviossa S2 (File S1), ja tuloksena Ct-arvoja muutettiin suhteellisen ng ja normalisoitiin alkukonsentraatio kromosomaalisen RNA: ta.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

tavallinen ChIP koe suoritettiin ja on kuvattu aiemmin [25]. PCR-alukkeet ja järjestelmä on esitetty kuviossa S3, File S1. Ct-arvoja laskettiin keskiarvo ja signaali edustettuina% tulo DNA kautta lineaariyhtälöitä kunkin alukeparia.

ChIP Vasta

Kanin polyklonaalista anti-hiiri-RNA Pol II (N-20, sc -899, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser5P hiiren monoklonaalista (sc-47701, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser2P H5 hiiren askites (Covance), H3K36me3 kanin polyklonaalista (ab9050, Abcam), anti-sykliini T kanin polyklonaalista (H-245, sc-10750, Santa Cruz), kanin anti-C-terminaali BRD4 IgG [27], MED26 hiiren anti-MED26 /CRSP7 (Ab50619, Abcam), Gdown1 lampaan anti-Gdown1 IgG [28], anti- AFF4 aineella [29] ja anti-ELL2 aineella [29].

Sequencing Analysis

Kuva S2 (File S1) esittää sekvenointitulosten peräisin Kalifornian yliopistossa Santa Cruz Genome Browser (UCSC GB) kappaleet ”wgEncodeUtaChIPseqBaseOverlapSignalHelas3Pol2” (HeLa S3) ja GEO tietokokonaisuus GSM920942 (Raji), kartoitetaan ihmisen genomin rakentaa hg18. Kalifornian yliopistossa Santa Cruz Genome Web Browser asettamalla normalisoitu korkein huippu on TSS.

Tulokset

Differential JQ1 Herkkyys

Suoritimme annoksesta ja ajasta riippuvaa testaus of Brd4 inhibitioastetta JQ1 ja huomattava vaikutus

MYC

transkriptio eri soluihin, kuten HeLa-S3-soluissa, joiden MYC ilmentyminen raportoitu [19] olevan vastustuskykyisiä JQ1 hoitoon. Kuviossa. 1A, testattu solulinjat ilmentävät

MYC

korkealla tasolla, verrattavissa tasolle havaittiin huipulla ensisijaisen naiivia lepää B-solujen induktion (tuloksia ei esitetty). Vakaan tilan mRNA tasot

MYC

ei-BL hiiren B solulymfoomalinjassa (BAL17) että yli ilmaisee

MYC

tasoisena BL soluihin ja HeLa-solut osoittivat merkittävää herkkyyttä JQ1 (Fig. 1A). Sekä HeLa ja BAL17-solut jatkettiin tämän resistenssin pitoisuuksina jopa 5 uM (tuloksia ei esitetty), kun taas

MYC

RNA BL soluissa oli tasaisesti laski ~90%, kun käsiteltiin 1 uM JQ1 ajaksi kaksi tuntia (Fig. 1A). BL solut raportoidaan ilmaista 2- 5-kertaisesti enemmän

MYC

erityinen RNA kuin B-solulinjat ilman translokaatio [30]. Vaikka Western blotting d osoittavat Raji BL se ilmentää enemmän MYC-proteiinia, mikä on yhdenmukaista mRNA tiedot (Fig. 1A), JQ1 käsittely laski MYC-proteiinin ekspression Raji, mutta ei HeLa ja BAL17 (tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että JQ1 vastus tapahtunut sekä ei-lymfooma ja lymfoomåsolulinjojen edustavat sekä hiiren ja ihmisen lajeja.

BAL17 (Hiiren B-solu), Human HeLa, ja ihmisen BL Raji-soluja ja käsitellyt tai käsittelemättömät 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. (A) mRNA: n analyysi suoritettiin kolmena rinnakkaisena, on raportoitu suhteessa ActB mRNA: n ekspressio, ja on esitetty, kun keskiarvo ja keskihajonta kolmesta kokeesta. (B) havaitseminen ensisijaisen transkription PCR-monistuksella käyttäen alukkeita poikki sisäistä eksoni /introni rajojen

MYC

suoritettiin kolme kertaa ja ilmoitetaan suhteessa ActB mRNA ilmaisun. (C) Strand-spesifisiä transkription havaittiin nauha spesifisten käänteistranskriptiotuotteiden monistus, kuten yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät, jota seuraa standardi PCR-menetelmillä. Nämä kokeet tehtiin kahdesti.

Koska mRNA tuotanto ei välttämättä korreloi ensisijainen transkripti tuotantoon [25], [31], testasimme vaikutus JQ1 Ensisijaiseen transkriptio. Analyysi ensisijainen transkriptio suoritettiin alukkeilla vastaan ​​eksoni /introni rajojen

MYC

(kaavamaisesti Supplemental Fig. 3 ja /tai lueteltu materiaalit ja menetelmät), osoitti, että ensisijainen transkriptio herkkyys JQ1 tapahtui rinnakkain mRNA: n kanssa (Fig. 1 B). Näin ollen, pitkä, ja oletettavasti täyspitkä, ensisijainen transkriptit olivat joko resistenttejä (BAL17 tai HeLa) tai herkkiä (Raji) ja JQ1. Siksi ero JQ1 vastausten korreloivat ensisijainen transkription ja ei tapahtunut tasolla transkription jälkeinen muutos, kuten liittämiseen ja mRNA: n tai proteiinin stabiilisuuteen.

Divergent transkriptio on yleinen monien promoottoreita organismeihin ja näytelmiä tärkeä rooli geenisäätelyn [32]. Todellakin, antisense transkriptio

MYC

lokus on havaittu useissa solulinjoissa [33]. Koska meillä on vain mitattiin yhteensä vakaassa tilassa RNA: ta (Fig. 1A), onko ero JQ1 herkkyys heijastaa eroja mahdollista transkription peräisin 3′-päästä on testattu. Vaikka antisense transkription sekä BAL17 ja HeLa-soluja oli pieni verrattuna aistia transkription, se oli paljolti riippumattoman JQ1 (Fig. 1 C, vasen ja keskimmäinen paneeli). Laaja ero tasojen sense ja antisense-transkriptit havaittiin keskuudessa eri solulinjoissa on tällä hetkellä selittämätön mutta saattaa heijastaa yhdistelmä transkription ja transkription jälkeisen vaikutuksia. Riippumatta, kuten sense transkriptio, antisense transkriptio peräisin

MYC

lokukseen Raji-soluja estyi JQ1 (Fig. 1 C, oikea paneeli). Näin ollen, vaikka enemmän antisense transkriptio havaittiin Raji-soluja, ero JQ1 herkkyys ei todennäköisesti johtuu eroista antisense selostukset.

JQ1 Johtaa Laskua Brd4 Käyttöaste vuonna Kestää ja herkkien solujen

havaitsimme, että Brd4 rekrytointi väheni JQ1 sekä solutyypeissä-siis ero JQ1 herkkyys eri solujen välillä ei johtunut läpäisevyyttä. Havaitsimme myös, että Brd4 värväyksen transkription aloituskohdasta (TSS) oli noin 2,5-kertainen enemmän Raji (+11) soluja verrattuna BAL17 (+17) (Fig. 2A). HeLa esillä Brd4 rekrytointi ja JQ1 herkkyys samanlainen BAL17 (tietoja ei esitetty). Lisäksi merkittävä määrä Brd4 käyttöasteen todettiin rungon kautta

MYC

kaikissa soluissa testataan, vaikka oli korkeampi koodaavan alueen käyttöaste BAL17 soluissa. Vaikka yleisesti liittyvät 5′-pään tehostajia ja promoottoreita, Brd4 on osoitettu miehittää koodaavan alueen PRGs kuten c-

fos

ja

MYC

[26].

Solut olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. (A) Kromatiini Immunosaostaminen (chip) poikki

MYC

anti-C-terminaali Brd4 vasta-aine. Kukin koe suoritettiin kahdesti, analysoitiin kolminkertaisena kautta reaaliaikainen PCR ja ilmoitetaan keskiarvona ja keskihajonta kahden kokeen. Edustus promoottorin alueella

MYC

on säädetty suunta. (B) Western blotting havaitsemiseksi (äärimmäisenä vasemmalla) Brd4 (~180 KD) ja (keski) Brd4-S484 /488-phos (P-Brd4, ~220 KD) suoritettiin kolme kertaa. Epäspesifinen bändi havaittiin phopsho-Brd4 vasta-aine on merkitty tähdellä. Tyypilliset tulokset esitetään densitometrisesti analyysin suhteen CREB ilmaisun, jota käytetään normalisointia ohjaus (äärimmäisenä oikealla).

Promoottori rekrytointi Brd4 vaatii fosforylaation S484 ja S488 ja poistaminen tällä alueella johtaa vähentynyt CycT ja Pol II käyttöasteen ja transkriptio [26]. Yhdenmukainen ChIP määrityksellä, Western-blottaus osoitti korkeampaa yhteensä Brd4 Raji-tumauutteiden verrattuna HeLa ja BAL17, vaikka Brd4-S484P /S488P Raji-soluissa oli hieman vähemmän kuin BAL17 ja HeLa (Fig. 2B). On mielenkiintoista, että P-BRD4 band HeLa-soluissa vaelsivat nopeammin kuin joko Raji tai BAL17 P-Brd4 band heijastaen ehkä pienen eron laajuutta tai työkohteen fosforylaation. Kuitenkin ero fosforyloidun Brd4 (aktiivinen muoto) eri solujen välillä ei ehkä selittää erot JQ1 herkkyyttä.

Brd4 vuorovaikutuksessa tekijöitä, jotka rekrytoida Pol II transkription tai ajaa transkription kompleksin pysähtyen venymään tilaan (tarkistetaan [10]). Lisäksi vähennys toiminnallisten Brd4 seurauksena vähentynyt huomattavasti Pol II käyttöaste osoitettiin aiheuttaa tappion P-TEFb [26]. Vaikka taso ja malli P-TEFb käyttöaste sekä käsittelemätöntä JQ1 herkkiä ja resistenttejä solutyyppejä olivat samanlaisia, JQ1 hoito /Brd4 esto väheni P-TEFb täyttöaste vain Raji-soluja (Fig. 3). Nämä tulokset osoittivat tasot BRD4 riippuvuuden säilyttämiseksi P-TEFb käyttöaste vaihtelee eri solulinjoissa (Fig. 3).

BAL17 ja Raji-soluja ei joko käsitelty tai niitä käsiteltiin 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. Rekrytointi P-TEFb havaittiin Chip määrityksiä. Jokainen koe analysoitiin kolminkertaisena kautta reaaliajassa PCR suoritettiin kahdesti, ja ilmoitetaan keskiarvo ja keskihajonta kahdessa kokeessa.

RNA Pol II Rekrytointi

Seuraava määritetty, jos ero JQ1 selektiivisyys johtui ero yleensä transkription laitteessa rekrytointi, edustaa RNA Polymerase II (Pol II). Vaikka koko Pol II pieneni suuresti rungon kautta

MYC

Raji-soluissa upon JQ1 hoitoa, se ei ole muutettu vuonna JQ1 resistenttien BAL17 linja (Fig. 4A). Molemmat solutyypit osoitti, Pol II käyttöasteen P

0-promoottori, jonka on osoitettu korreloivan hyvin korkea transkription [34]. Monet aktiivisesti puhtaaksi geenit (myös

MYC

) näytteille keskeytetty Pol II niiden lähimmistä promoottorit [35]. Yhdenmukainen tämän käsitteen, havaitsimme korkea promoottorin liittyvien Pol II molemmissa solutyypeissä, vaikka kaksi kertaa enemmän Pol II todettiin proksimaalisessa promoottorin (suunnilleen vastaava P

0 promoottorialueen) in BAL17 ( -354) verrattuna Raji (-279). Mielenkiintoista, koska pani Brd4 ja P-TEFb (kuviot. 3 ja 4), yhteensä Pol II pelkistettiin sivuston välittömästi alavirtaan (0,6 kb) ja TSS ja jyrkästi lisääntynyt jälkeenpäin (Fig. 4A).

Solut olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. (A) Pol II havaittiin vasta-ainetta vastaan, N-terminaalin Pol II (B) Pol II seriini 5-P (C) Pol II seriini 2-P. Chromatin ChIP määritykset suoritettiin kahtena kappaleena. Kukin koe analysoitiin kolmena kappaleena kautta real-time PCR, suoritetaan kaksi kertaa, ja se ilmoitetaan keskiarvo ja keskihajonta kahden kokeen.

Koska fosforylaation karboksi-terminaalisen domeenin (CTD) ja RNA Pol II liittyy transkription säätelyyn aloittamisesta ja venyminen monet promoottorit [36], [37], analysoimme näitä tapahtumia kahdessa solutyypissä puuttuessa ja läsnä JQ1. Vaikka RNA Pol II fosfo-Ser5 (Pol II S5P) tasot BAL17 soluissa pysyi vakaana jälkeen JQ1 hoidon, Pol II S5P tasot Raji-soluja olivat herkkiä JQ1 (Fig. 4B). Yllättäen kuitenkin Pol II S5P tasot olivat tulenkestävä P

0 ja TSS sivustoja (Fig. 4B, oikea paneeli), mutta herkkä jälkipuoliskolla geenin kanssa pieni muutos alkaa alavirtaan

MYC

P3-promoottori (+2244) ja yhä herkkä alempana rungon geenin. Onko merkittävä määrä Pol II-Ser5P 3 ’käyttöaste esitetty tässä suoraan johtuu 3′ Brd4 käyttöaste tai ylitarjonta transkription komplekseja ”varmuuskopiointiin” mikä vähentää venymä ja myöhemmin tauot 3’- pää on tuntematon.

Vaikka Ser5 fosforylaatio liittyy pätevän mutta keskeytetty Pol II, Ser2 fosforylaation Pol II CTD (Pol II S2P) edustaa pitenevä Pol II [37]. Puuttuessa JQ1, Pol II S2P käyttöaste molemmissa solutyypeissä tapahtunut koko kehoon geenin, jossa on piikit promoottorialueiden, ja 3′-pään. Yllättäen, kun taas promoottori ja TSS-liittyvä Pol II S2P tasot Raji-solut olivat herkkiä JQ1, alavirran alueet viimeisen P

3 ei esiintynyt JQ1 herkkyys, kunnes viimeisen 3 ’UTR (+5472) (Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että valtaosa täysin venymistä RNA-polymeraasi II näissä JQ1 herkkien solujen oli refraktorinen JQ1. Olemme myös havainneet JQ1 riippuva kasvu Pol II-Ser2P on BAL17 linjan ja vaikka tämä kasvu oli vähäistä klo promoottori ja TSS alueilla, se oli hyvin selkeä 3’- terminaalissa.

erot H3K36me3

Yksi mahdollinen tapa hahmotella välillä tuotantoketjun vaikutukset Pol II-Ser2 käyttöaste on määrittää rakenteessa tri-metylaation histoni 3 lysiini 36, H3K36me3, mikä on osoitus äskettäin kulkee pitenevä transkriptio monimutkainen [37]. Vuonna BAL17-soluissa, JQ1 hoito paransi H3K36me3 signaaleja koko geenin (Fig. 5). Mutta Raji-soluja, JQ1 hoito laski H3K36me3 P

0 kautta TSS kunnes P

3 alueella. Kuitenkin sen P3 H3K36me3 tuli immuuniksi JQ1 (Fig. 5), kuten havaittiin Pol II S2P (Fig. 4C), mikä viittaa siihen, että kun RNA Pol II oli venymän tilassa, se oli herkkä JQ1. Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että

MYC

kanna transkription komplekseja vaihtelevalla Brd4 riippuvuutta eri solutyyppejä ja että Brd4 esto johti ero vastauksena tasolla siirtyminen keskeyttämällä venymään.

Cells olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. ChIP määritykset suoritettiin kahtena kappaleena. Jokainen koe analysoitiin kolminkertaisena kautta reaaliajassa PCR suoritettiin kahdesti, ja ilmoitetaan keskiarvo ja keskihajonta kahdessa kokeessa.

Tarvikkeet transkriptio Pidennys Factors

P- TEFb usein toimii alayksikköä Super Venymä Complexes (SEC), joka koostuu P-TEFb ja seosta yksi kolmesta ELL perheen jäsentä, joista yksi kahdesta EAF perheen jäsentä, joista yksi kahdesta AF4 perheenjäsenten (AFF1 ja AFF4), ja joko ENL tai AF9 [29], [38]. Koska SEC perheen Pol II pidentymisen tekijöitä raportoidaan sisältävän kaikkein katalyyttisesti aktiivinen versioita P-TEFb aktiivisesti korkean tason transkription ja säännellä tarkistuspiste vaiheessa transkription liittyy pidentymisen [29], [39], [40] tarkastelimme SEC rekrytointi

MYC

eri solutyyppejä. AFF4 raportoidaan toimia keskeinen sitova alustan venymä tekijöitä monissa SEC kokoonpanoissa ja kohdistaa

MYC

ja säätelevät sen ilmentymistä syöpäsoluissa [39]. Taso AFF4 käyttöaste BAL17 soluissa oli alhainen ja refraktaarisia JQ1 (Fig. 6A, yläpaneeli), mutta lisääntyivät läsnäollessa JQ1. Sen sijaan AFF4 rekrytointi Raji-soluja oli paljon suurempi ja herkkä JQ1. Vaikka AFF4 promoottorin käyttöaste Raji-soluja, erityisesti noin 2244 päällä, oli vaihteleva puuttuessa JQ1, se oli merkittävästi vähentynyt, kun läsnä on JQ1. Lisäksi sopusoinnussa Pol II S2P ja H3K36me3 tuloksia, JQ1 herkkyys katosi yllättäen P

3 promoottorialue (+2244), jälleen viittaa siihen, että pitenevä transkriptio monimutkainen oli tehonnut JQ1 (Fig. 6A, alapaneeli) .

Soluja joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 1 uM JQ1 2 tunnin ajan. (A) AFF4 havaittiin ChIP koko pituus

MYC

geenin sekä BAL17 ja Raji-soluja. (B) havaitseminen AFF4, ELL2 ja MED26 että promoottorialueet käsittelemättömän ihmisen HeLa- ja Raji-soluja. ChIP määritykset suoritettiin kahtena kappaleena. Jokainen koe analysoitiin kolminkertaisena kautta reaaliajassa PCR suoritettiin kahdesti, ja ilmoitetaan keskiarvo ja keskihajonta kahdessa kokeessa.

jälkeen tarkasteltiin täyttöaste toisen SEC komponentin, ELL2, jonka on raportoitu olevan rooli siirryttäessä keskeytetty Pol II venymään [40]. Testasimme myös täyttöasteen Sovittelija komponentin (MED26) sekä Gdown1. Vaikka ensimmäinen liittyy aloittamista, rooli Sovittelija rekrytointiin Pol II transkription venymään tekijöitä ja fosforylaation Pol II CTD säännellä Pol II katkonaista venymä on syntynyt [41]. Sovittelija monimutkainen voimakkaimmin liittyy Pol II sisältää MED26, joka on osoitettu lisäävän aktivoitumista transkription in vitro suuremmassa määrin kuin muut muodot Sovittelija monimutkainen ja keskeisessä asemassa SEC rekrytointi ja MYC transkriptio [41]. Gdown1 on Pol II sitovan proteiinin osoitettu olevan tarpeen sovittelija-riippuvainen vaste transkriptiotekijöiden [42]. Tarkoituksenmukaista tässä tutkimuksessa, Gdown1 on äskettäin osoitettu lisäävän stabiilisuutta keskeytetty Pol II ja säädellä P-TEFb toimintaa [28].

Koska saatavilla vasta-aineita ELL2, Med26 ja Gdown1 olivat lajien (ihminen) erityiset käytimme HeLa ja Raji-soluja näissä kokeissa. Ottaen huomioon erot keskittyi P3 alueella keskityimme yleisestä promoottorialue (P

0, TSS, ja P

3) testata eroja näiden solulinjojen. Kuten havaitaan BAL17-solut, HeLa-solut osoittivat alhainen AFF4 rekrytointi tällä alueella verrattuna Raji-soluja (kuvio. 6B). Yhdenmukainen AFF4 rekrytointi tuloksia, lisääntynyt ELL2 käyttöaste lähellä P

3 nähtiin Raji-soluja verrattuna HeLa-solut. MED26 käyttöaste osoitti kuvio on samanlainen kuin muiden SEC komponenttien lisäystä, joskin vaatimaton, lähellä P

3-promoottorin Raji-soluja (kuvio. 6B). Lopuksi havaittiin, että Gdown1 seurasi kuvio samanlainen kuin SEC ja Mediator kasvaessa noin P

3-promoottorin Raji-soluja (kuvio. 6B).

Keskustelu

Due tärkeyteen

MYC

synnyssä hematopoieettisia maligniteetteja, lisäponnisteluja on suunnattu kahden viime vuosikymmenen kohti ymmärrystä sen valvomisen. Silti, koska

MYC

yliekspressio aiheuttaa lukuisia geneettisten vaurioiden, yhtenäiset säännöt sen transkription säätelyyn puuttuu edelleen. Viimeaikaiset edistysaskeleet tällä alueella ovat löytö pienmolekyylisalpaaja-, JQ1 jotka vähentävät

MYC

ilme ja on terapeuttisesti tehokas prekliinisissä eläinmalleissa keskiviivan syöpä ja BL soluissa. Kuitenkin, JQ1 ei estä

MYC

ilmaisu samassa määrin kaikissa syöpäsoluissa, lisäksi alleviivausta, että

MYC

transkriptio on ehkä eri valvonnan eri syöpäsolutyyppien. Yhdenmukainen tämän käsitteen, olemme havainneet, että JQ1 inhiboi

MYC

ilmentymistä kaikissa BL peräisin olevat solut testattiin, mutta ei inhiboi

MYC

ilmentymistä joissakin muissa syöpäsolulinjoissa, kuten havaittiin aikaisemmin (19) . Koska

MYC

vapauttaminen voi tapahtua eri liikennemuotojen, me arveltu, että erillisiin lymfooma fenotyyppejä, korkean tason

MYC

ilmentyminen voi kuulua valvonnan eri transkription ja epigeneettiset sääntelymekanismeja, joka voi olla herkkiä tai resistenttejä JQ1 /Brd4 esto. Tässä tutkimuksessa selvitimme nämä mekanismit, joilla

MYC

transkription ja epigeneettiset allekirjoitukset liittyy erityisesti solutyyppejä siinä toivossa, että nämä allekirjoitukset paremmin määrittelemään lymfooma alatyyppejä ja tarjota uusia hoitokeinoja tutkia kliinisesti aggressiivista B solulymfooma .

Vaikka BL-solut ovat heterogeeninen paljon kanssa eroja pituuden Ig /MYC translokaatio joka kuulemma kääntää eriasteista

MYC

yliekspressio [43], BL solut käsissämme (kuvio . 1 ja kuva S1, File S1), ja toiset [19], ovat tasaisesti estettävissä on

MYC

ilmaisun kautta Brd4 esto JQ1. Tämä esto näyttää olevan riippumatta siitä, ovatko ne EBV positiivinen tai negatiivinen BL linjat (tutkimuksemme ja viite 19). Brd4 ensisijaisesti liittyy 5′-päähän promoottorit ja tehostajat [44], [45], [46], ja vaikka me näemme merkittävämpi tasolle Brd4 klo TSS vuonna Raji-soluja (kuvio. 2), myös tarkkailla Brd4 käyttöaste koko rungon

MYC

geenin JQ1 resistentit solut (Fig. 2). Yksi funktio Brd4 on P-TEFb rekrytointi ja P-TEFb täyttöaste ei rinnakkain Brd4-estäjä herkkä

MYC

transkriptio, vaikka on vain vähän eroa P-TEFb täyttöaste käsittelemättömissä soluissa joko resistenttejä tai herkkiä solut. Näyttää siis siltä, ​​että soluissa vastustuskykyisiä JQ1, joka on Brd4-riippumaton mekanismi toimii rekrytoida tai pitää P-TEFb ja tuottavat suuria määriä

MYC

transkriptio.

Koska SEC komponentteja AFF4 ja ELL2 osansa

MYC

sääntelyä ja transkription venymä, me arveltu, että kasvua näissä yhteistyössä tekijät saattavat rentoutua Brd4 vaatimukset. Yllättäen niiden lisääntynyt läsnäolo todella korreloi vaaditaan suurempaa Brd4 (Fig. 6). Asema lisääntynyt SEC komponenttien kanssa MED26 ja Gdown1 ympäri P3 promoottori viittaa korkea transkriptioaktiviteettia tai sääntelyyn tarkistuspiste tällä alueella, joka ei ole läsnä soluissa, jotka ovat vastustuskykyisiä JQ1 (yhteenvetona kuviossa 7).