Krooninen sairaus

tiivistelmä

adenovirukset (mainokset), erityisesti HAdV-5, ovat olleet geneettisesti varustettu kasvaimeen rajoitettu toistettavuusmahdollisuudet mahdollistaa sovellusten onkolyyttistä syövän hoidossa. Tällaisia ​​onkolyyttisten adenovirukset ovat olleet hyvin siedettyjä syöpäpotilailla, mutta niiden antituumoriteholla on vahvistettava. Tältä osin on katsottava, että syöpäsolut, riippuu niiden kudoksen alkuperän, voivat poiketa huomattavasti normaalista isäntäsoluista, joihin mainokset sovitetaan monimutkaiset virus-isäntä vuorovaikutusten. Niinpä virusreplikaatioon tehokkuus, ratkaisevaa onkolyyttisten toimintaa, saattaisi olla optimaalinen syöpäsoluissa. Siksi olemme analysoineet sekä replikointi kinetiikka HAdV-5 ja viruksen aiheuttama transcriptome ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (HBEC) verrattuna syöpäsoluja. Tämä on ensimmäinen raportti genominlaajuisten ilmentymisen profilointi mainokset heidän omalla isäntäsoluissa. Olemme havainneet, että E1A ilmentymisen ja virus-genomin replikaatio ovat nopeinta HBEC ja huomattavasti viivästynyt melanoomasolujen. In squamous cell keuhkosyöpä soluja, havaitsimme välituote HAdV-5 replikaation kinetiikka. Tarttuva hiukkanen tuotanto, virusten leviämisen ja lyyttisen aktiivisuuden HAdV-5 oli heikennetty melanoomasoluissa versus HBEC. Expression profilointi alkaessa virusgenomin replikaation paljasti, että HAdV-5 indusoi voimakkaimman muutoksia solujen transcriptome on HBEC, minkä jälkeen keuhkosyöpä ja melanoomasoluja. Havaitsimme näkyvä sääntely liittyvien geenien solusyklin ja DNA aineenvaihduntaa, replikointi ja pakkaamista HBEC, joka on sopusoinnussa tarve aiheuttaa S-vaihe viruksen lisääntymiselle. Silmiinpistävän, melanoomasoluissa HAdV-5 laukeaa vastakkaiset asetus mainittujen geenien ja, toisin kuin keuhko- syöpäsoluja, ole heikkoja S-vaiheessa induktio havaittiin käytettäessä E2F-promoottori, kuten toimittaja. Tuloksemme antavat perusteet parantaa onkolyyttisiä adenovirusten joko mukauttaminen virusinfektion kohdentaa tuumorisoluihin tai moduloimalla kasvainsolujen toimintoja tukemaan paremmin virusreplikaation.

Citation: Dorer DE, Holtrup F, Fellenberg K, Kaufmann JK Engelhardt S, Hoheisel JD, et ai. (2011) Replication ja viruksen aiheuttama transcriptome of HAdV-5 normaalissa Isäntäsolut versus Cancer Cells – Erot Merkitys Adenoviraaliset Oncolysis. PLoS ONE 6 (11): e27934. doi: 10,1371 /journal.pone.0027934

Toimittaja: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 28 lokakuu 2011; Julkaistu: 30 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Dorer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Helmholtz Association of National Research Centers (Helmholtz-yliopiston ryhmä Grant), The Intramural Program Saksan Cancer Research Center (DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum) ja apurahoja Helmholtz International Graduate School for Cancer Research on DED, FH, ja JKK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

adenovirukset (mainokset) on syntymässä syöpähoitojen perustuu niiden teho tartuttaa ja hajottamaan syöpäsoluja, prosessi kutsutaan virusonkolyysiä [1], [2]. Tämä hoito on ainutlaatuinen vahvistus vaikutus kuin tartunnan kasvaimen solut tuottavat jälkeläiset leviävien infektio kasvain. Lisäksi etuna on se, että toimintatavan onkolyyttisten mainokset eroaa tavanomaisista hoitoja, jonka syöpäsolut, kehittävät usein resistenssin. Rajoittaminen virusreplikaation tuumorisoluihin on olennaisesti tarvitaan soveltamiseksi mainokset syövän hoidossa. Tältä osin laaja tuntemus Ad rakenne, genomin organisaatiota ja replikaatiosykli yhdistetään teknologioita Ad suunnittelu helpottaa järkiperäisen kehittämisen onkolyyttisten Ilmoitukset [2], [3]. Todellakin, onkolyyttisten viruksia jäljellä kasvain selektiivisyys on muokattu perustuu läheisesti HAdV-2 ja HAdV-5. Tämä saatiin aikaan joko mutatoimalla geeniä toimintoja, joita täydennetään syöpäsoluissa, mutta ei normaaleissa soluissa, tai kohdistamalla ilmentyminen olennaisia ​​viruksen geenien kasvainsoluihin [1], [2], [4]. Useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaiset engineered Mainokset hyvin siedetty potilailla, mutta niiden terapeuttinen teho on parannettava [5], [6]. Tässä yhteydessä mahdollisuuden järkevä suunnittelu Mainosten on jälleen keskeinen etu, sillä se helpottaa kehittyneiden onkolyyttisten aineita. Vastaavasti tutkimukset parantaa Ad tuloa syöpäsolujen tai lisätä terapeuttisen geenejä onkolyyttisten mainokset on raportoitu [2], [7], [8].

Adenoviraaliset oncolysis edellyttää tehokasta Ad replikaatiota kohdennettua syöpäsoluja. Edellinen työ alalla ei ole riittävästi katsoi syöpäsolujen riippuvainen kudoksen alkuperän, voivat huomattavasti poiketa normaalista Ad isäntäsoluissa. Siten virus ei törmännyt Soluympäristössä se on sovitettu kattavia viruksen isäntäsolun vuorovaikutuksia. Tämän seurauksena Ad replikointi, solun hajoamista ja leviäminen voisi olla optimaalinen. Erityisesti, HAdV-2: n ja -5 ovat evoluution sovitettu toistamaan epiteelisoluissa ja hengitysteiden [9], mutta on kehitetty terapiassa erilaisia ​​kasvaimen tavoitteita. Itse asiassa, mutaatiot HAdV-5, jotka lisäävät viruksen replikaatioon ja leviämiseen kasvainsoluissa on raportoitu [10] – [12]. Yksi esimerkki on deleetio

E1B19K

, joka on anti-apoptoottista aktiivisuutta. Poistaminen

E1B19K

on johtanut lisääntynyt voimakkaasti HAdV-5 replikointi ja oncolysis keuhkojen syöpäsoluja. Kuitenkin, vähentynyt replikaatio on raportoitu syöpäsoluja, jotka ovat peräisin muista kudoksista, mukaan lukien melanooma solujen [11], [13] – [15]. Nämä havainnot taas piste solutyyppiä riippuvuus Ad-isäntäsolun vuorovaikutusta ja näin ollen Ad replikointi tehokkuus: Erot apoptoosin ohjelmoinnin normaalin ja syöpäsolujen, mutta myös eri syöpäsoluja todennäköisimmin aiheuttavat eri permissivity on

E1B19K

-deleted HAdV-5.

Koska pakollinen solunsisäisiä loisia mainokset ovat riippuvaisia ​​solujen energian tuotantoon ja biosynteettisten koneita. Itse mainokset ovat toteuttaneet erilaisia ​​ja monimutkaisia ​​molekyylitason mekanismit, joilla olosuhteet isäntäsolun että varmistetaan tehokas virus lisääntymiselle. Nämä ovat parhaiten tutkittu HAdV-2 ja -5 ([16], [17] ja siinä olevat viitteet). Vastaavasti, tuotteen varhaisen viruksen geeniekspressiota – lisäksi antaa tarvittavia proteiineja replikaatioon virusgenomin – manipuloida solun ympäristön tukemaan viruksen replikaatiota useita mekanismeja, erityisesti suora ja epäsuora modulaatio solun transkription ([17] – [19] ja viitteet). Ensimmäisen viruksen geeni on tuotu esiin Ad-infektio on E1A, joka koodaa proteiinien perhe, jotka johtuvat vaihtoehtoisesta silmukoinnista. E1A-proteiinit indusoivat edelleen alussa Ad-geenien ja manipuloida transkription solun geenien suoraan tai epäsuorasti [20], [21]. Suurin E1A-proteiinia (13S) sisältää vahvaa transaktivaatiodomeenin joka indusoi transkriptio kun E1A vuorovaikutuksessa DNA-sitovia proteiineja. Sekä 13S ja 12S E1A proteiinit sitoutuvat pRb, mikä vapauttaa E2F transkriptiotekijöiden välillä pRb-E2F-kompleksit. E2F proteiinit aktivoivat sitten transkription virus- ja solujen geenien kautta E2F-sitoutumiskohtia ([17], [19], [22], [23] ja siinä olevat viitteet). E2Fs laajalti aiheuttaa solujen geenien S-vaiheen solusyklin, joita tarvitaan myös Ad genomin replikaatiota. Lisäksi transkription toiminta E1A proteiinit välittävät vuorovaikutusta paneelin solun tekijöitä, jotka estävät tai aktivoivat transkriptiota, esimerkiksi histoni acetylases ([17], ja siinä olevat viitteet). Toinen Ad varhainen proteiini, E1B55K, sisältää vahvan transkription sorron domain. Sitoutumalla p53-transaktivaatiodomeenin se toiminnallisesti kytkeytyy p53 päässä transkription aktivaattori on repressorin [24]. Lisäksi E1B55K yhdessä E4orf6 laukaista hajoaminen p53 [25]. Tuloksena sulku- p53-reagoiva proapoptoottisten geenien ehkäisee apoptoosin laukaisee epänormaali stimulaation solusyklin mukaan E1A.

eteviä Ad infektio on saatu laajat tutkimukset, jotka olivat enimmäkseen suoritettiin HAdV-2 tai -5 HeLa ja muiden syöpäsolujen ja keskittynyt yksittäisiin Ad geenejä [17]. Niinpä Ad infektio normaalissa ympäristössä natiivi isäntäsolujen, esim. ensisijainen epiteelisolut hengitysteiden varten HAdV-5, on harvoin tutkittu (useimmat näistä tutkimuksista analysoitu valikoivuutta onkolyyttisten mainokset, katso keskustelu). Huomaa, että HeLa-soluissa poikkeavat normaalista Ad isäntäsoluja, koska ne ovat kohdunkaulan syövän alkuperästä ja on laajalti siirrostettiin. Lisäksi ne sisältävät ihmisen papilloomavirus geenejä, jotka vaikuttavat solujen toimintaan tärkeää Ad lisääntymään. Tutkimukset että tutkitaan, miten yksittäiset Ad geenit vaikuttavat solutoiminnoille eivät pidä monimutkaisen verkoston virus-isäntä vuorovaikutusten aikana virustartunnat. Tältä osin sirutekniikalla edustaa tehokas työkalu genominlaajuisten seuranta ohjelmoida solun geenin ilmentymisen aikana Ad-infektio. Itse asiassa aikaisemmat microarray tutkimukset ovat osoittaneet, että HAdV-2: n ja -5 infektioita kohdistaa useisiin solureiteillä [26] – [30]. Näitä tutkimuksia on suoritettu HeLa-solujen kanssa ja ensisijainen fibroblasteissa. Miten Ad infektiot moduloida genominlaajuisten geenin ilmentymistä äidinkielen isäntäsolujen ei ole tutkittu tähän mennessä. Niinpä vertaileva analyysi Ad aiheuttaman geeniekspressioprofiilien syöpäsoluja vastaan ​​natiivi Ad isäntäsoluja, joka on kiinnostava kehittämiseen onkolyyttisten mainoksia, ei ole tähän päivään mennessä.

Tässä tutkimuksessa siis tutkittava miten Ad infektio syöpäsolujen eroaa Ad infektio normaalista isäntäsoluissa. Tätä varten suoritimme vertaileva analyysi HAdV-5 replikaation kinetiikka ja lyyttinen aktiivisuus ensisijainen keuhkoputken epiteelisoluissa, keuhkojen okasolusyöpä ja melanoomasoluja. Valitsimme tämän joukko soluja, koska ne edustavat normaalia HAdV-5 isäntäsoluissa solut kasvaimista peräisin HAdV-5 isäntäsoluihin ja tuumorisolut peräisin liity solutyypistä, vastaavasti. Olemme ryhtyneet harjoittamaan genominlaajuisten ilmentymisen profilointi HAdV-5 infektio normaaleissa keuhkoputken epiteelisoluissa ja syöpäsoluja. Riippuvaista solutyypistä eroja HAdV-5-indusoidun solujen transcriptomes arvioitiin bioinformatiikan analyysi.

Tulokset

lyyttistä tehoa ja replikaation tehokkuuden HAdV-5 normaaleissa ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen ja syöpä solut

ensimmäinen arvioi tehokkuutta HAdV-5 leviäminen riippuvaista solun hajoamista ja replikointi vaihtelevat natiivin HAdV-5 isäntäsoluihin ja syöpäsoluja. Primäärisistä ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBECs) käytettiin myös tutkimuksessa, koska ne edustavat natiivia HAdV-5 isäntäsolut hengitysteiden epiteelin parhaiten. Niitä verrattiin keuhkosyövän soluja SK-MES-1, SW900 (molemmat okasolusyöpä) ja A549 (adenokarsinooma), ja melanoomasoluja SK-MEL-28 ja Mel624, ja edelleen ihmisen ensisijainen normaalit solut, nimittäin fibroblastit ja keratinosyytit . Vuonna sytotoksisuusmääritys, me havaitsimme, että leviäminen riippuvainen solujen hajoamiselle HAdV-5 oli samalla tavoin tehokas HBECs, SW900 ja A549-solut, mutta vaimennetaan SK-MES-1-soluja ja vielä kahden melanoomasolulinjoja (Fig. 1A ). Sytotoksisuuden HAdV-5 keratinosyyttien oli samanlainen HBECs, kun taas mitään solun tappamista ei havaittu ensisijainen fibroblastien mittaushetkellä. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että lyyttinen teho HAdV-5 on riippuvaista solutyypistä ja voidaan voimakkaasti vähentää syöpäsoluissa verrattuna HBECs. Huomattavaa on, että vähennetään lyyttinen teho HAdV-5 SK-MEL-28 ja Mel624 soluja ei voida katsoa tehottomaan viruksen soluun sitoutumisen ja merkintä, koska nämä solut osoittivat voimakasta ilmentymistä HAdV-5-reseptorin CAR (Fig. S1) ja olivat vielä alttiimpia transduktio jonka replikaatiovialliset HAdV-5 vektori kuin HBECs, A549 ja SW900-soluissa (taulukko S1). Tämä osoittaa selvästi, että alennettu lyyttisen aktiivisuuden HAdV-5 melanoomasolujen määritetään jälkeistä merkintä vaiheen virusreplikaation. Sen sijaan, fibroblastit puuttui CAR ilmaisun ja oli vaikea transdusointiin. Koska solut värjättiin 8 päivää infektion jälkeen, mikä mahdollistaa useita kierroksia virusreplikaation, tulokset sytotoksisuusmääritys osoittavat eroja tehoa HAdV-5 replikaatiota ja levitä melanoomasoluja ja HBEC. Siksi meidän seuraava verrattuna HAdV-5 replikaatiota HBECs, SW900 ja SK-MEL-28 suoremmin kvantifiointiin tarttuvan viruspartikkelin tuotannon aikana yhden kierroksen lisääntymään (Fig. 1 B). Tarttuva virus hiukkanen tuotanto HBECs oli 100 kertaa suurempi kuin SK-MEL-28 at 36 h ja 48 h infektion jälkeen. Virustiitterit korkeimmillaan varten HBEC 48 h, kun taas ne jatkoivat kasvuaan, kunnes 72 h SK-MEL-28, kun he huipussaan tiitterillä edelleen pienempi kuin HBECs. Tarttuva hiukkanen tuotanto SW900-solut osoittivat samanlaisia ​​kinetiikkaa ja HBECs, mutta jäi noin 10 kertaa pienempi. Voimme päätellä, että HAdV-5 replikointi viivästyy SK-MEL-28-soluissa verrattuna HBECs ja SW900-soluissa, mikä on sopusoinnussa sytotoksisuustiedot.

(A) Sytotoksisuus: Eri solutyyppejä tartutettiin joko villin tyypin HAdV-5 (

paino-

) tai replikaatiovialliset ohjaus virus HAdV-5 CMV-GFP (

GFP

) klo mÕIS 10

1 ja 10

-4 TCID

50 /solu. Soluja primaarisista ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (HBEC, solut yksi kahdesta luovuttajien antaa samanlaiset tulokset on esitetty), okasolusyöpä keuhkojen (SK-MES-1, SW900), keuhkon adenokarsinooma (A549), melanooma (SK-MEL -28, Mel624) ensisijainen ihmisen esinahan fibroblasteja (HFF) ja ensisijaisen ihmisen keratinosyyttien (PHK). Inkubaation jälkeen kahdeksan päivää, elossa solut kiinnitettiin ja värjättiin kristallivioletilla. Lung solut (

jäljellä paneelit

) osoitti kaiken kaikkiaan vahvempi sytotoksisuus verrattuna melanoomasoluja (

keskikuvat

). (B) Replication: HBEC, SW900 tai SK-MEL-28-soluja infektoitiin 1 TCID

50 /solu HAdV-5. Yhden tunnin inkuboinnin bisiirrosteiden poistettiin ja solut pestiin kolme kertaa. Solut ja supernatantit kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ja tarttuvia viruspartikkeleita kvantitoitiin määrittämällä TCID

50. Pylväät edustavat keskiarvoa kolminkertaisten infektioiden ja virhepalkkeja standardipoikkeamat. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä (

p≤0.05

) eroista SK-MEL-28 ja HBEC sekä SK-MEL-28 ja SW900 (*), tai välillä SW900 ja HBEC (**). Lisäykset viruksen tiitterit olivat merkittäviä (

p≤0.05

) ja HBEC kunnes 48 h: ssa ja SK-MEL-28 vasta 72 tuntia infektion. Sillä SW900 virustiittereitä ei todettu merkittävää kasvua kuluttua 36 h (

p = 0,056 48 tuntia vs. 36 tuntia

).

Kinetics viruksen geenien ilmentymistä ja genomin replikaatio HAdV-5 in HBECs ja syöpäsolujen

tutkimme seuraavaksi kinetiikka HAdV-5 replikaation HBECs ja syöpäsolujen tarkemmin määrällisesti viruksen geenien ilmentymistä ja genomin replikaation (Fig. 2). Koska näissä kokeissa käytettiin määrittämään ajankohtana myöhemmin geeniekspressioprofilointi, ne suoritettiin vastaavasti standardoituja menettelyjä, eli soluja viljeltiin microarray kasvualustaa ja infektoitiin viruksella tiitterit tuloksena 80% infektion tehokkuus kunkin solutyypin (taulukko S1). Virus-DNA-replikaation viivästyi melanoomasoluja (SK-MEL-28, 20 h; Mel624, 24 h) ja SK-MES-1-solut (20 h) verrattuna SW900-solujen (16 h) ja HBEC (16 h tai 12 h, riippuu luovuttajan) (Fig. 2B). Ensisijainen fibroblastit osoittivat myöhään (24 h), mutta ensisijainen keratinosyyttien varhaisessa (16 h) virus-DNA-replikaation. Nämä erot HAdV-5 replikointi kinetiikka välillä solutyyppien korreloivat hyvin eroihin virus lyysin ja tarttuvan hiukkanen tuotanto (ks. 1). Analyysi E1A mRNA: n ilmentymisen kinetiikan paljasti, että erot DNA-replikaation alkua välillä solutyyppien heijastaa vastaava eroja aikaisten geenien ilmentymisen: HBEC, SW900 ja keratinosyytit osoitti alkaa nopeasti E1A mRNA ilmaisun saavuttaa lähes enimmäismäärät 8 h infektion jälkeen . Sitä vastoin melanoomasoluja, SK-MES-1 ja fibroblastien entistä hitaammin ja jatkuva lisääntyminen E1A mRNA: n ekspressio havaittiin (Fig. 2A). Syynä eroja E1A ilmentymisen välillä solulinjoissa on epäselvä. Ohimenevä transfektio kokeiluja toimittaja sisältävän plasmidin ensimmäinen 557 bp HAdV-5 genomi ei paljastanut merkittäviä eroja E1A edistäjän /promoottorin aktiivisuuteen solutyyppejä (Fig. S2). Late viruksen geenien ilmentymisen peilattu kinetiikkaan viruksen genomin replikaation, odotetusti (Fig. 2C). Voimme päätellä, että HAdV-5 lisääntymään ja hajoamiseen ovat huomattavasti nopeampaa HBECs kuin melanooman soluissa. Replikointi ja lyysi keuhkojen syöpäsoluja on, riippuu solulinjassa, nopea tai väli. Muiden ensiöparit, replikointi kinetiikka olivat riippuvaisia ​​solutyypistä: epiteelin keratinosyytit osoitti nopean ja mesenkymaalisten fibroblastit, kuten on raportoitu aiemmin [27], [30], osoitti hidasta replikointi kinetiikkaa.

Ihmisen ensiöparit (

vasen paneelit

) ja kasvainsolulinjoissa (

oikea paneeli

) infektoitiin HAdV-5 tittereillä johti 80% infektiotehokkuus (

katso

Kuva. 1

nimiä solutyyppejä, HBEC d1, HBEC d2 ovat HBEC eri luovuttajilta

). Inokulantit poistettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu yksi tunti. Kokonais-RNA ja DNA kerättiin jokaisesta osoitetun ajankohtana ja analysoitiin E1A (A) ja kuitu (C) mRNA-tasot ja viruksen genomin kopioiden (B), tässä järjestyksessä, qPCR. Tulokset edustavia kokeita esitetään; toistaminen kokeet tuottivat sama aika pistettä alkamisen E1A ja kuidun mRNA: n ilmentymisen ja viruksen genomin replikaatio. Sillä HBEC d2, genomin kopio numeroita ei ole määritetty 20 h ja 24 h, koska rajallinen määrä tältä luovuttajalta saatuja soluja.

Vertaileva HAdV-5-aiheuttamat muutokset solujen geeniekspression syöpäsoluja vastaan ​​HBECs

tutkimme seuraavaksi solun geenin ilmentyminen on eri vaikuttaa Ad infektion syövän verrattuna normaaleihin soluihin. Siksi teimme vertaileva analyysi HAdV-5-infektion aiheuttamiin muutoksiin transcriptomes of HBECs (2 eri luovuttajilta), okasolusyöpä keuhkosyövän soluja (SK-MES-1, SW900) ja melanoomasoluja (SK-MEL-28, Mel624 ). Soluja viljeltiin käyttäen standardoituja olosuhteita ja väliaineita (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja) ja infektoitiin HAdV-5: n tiitterit tuloksena 80%: n transduktioteho kunkin solutyypin tai olivat mock-tartunnan. Solut kerättiin ajanhetkellä ilmaantumiseen virusgenomin replikaation, koska tuolloin keskeisiä muutoksia solujen transcriptome valmisteilla viruksen DNA-replikaation odotettiin. Lisäksi aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, vähemmän muutoksia aikaisemmin pistettä muihin soluihin [27], [28], [30]. Valitsemalla Tänä ajankohtana kunkin solun tyypin erikseen, mukaan kinetiikka esitetään kuviossa. 2, voisimme säätää erojen viruksen replikaation kinetiikka välillä solutyyppejä. Kokonais-RNA puhdistettiin ja käytettiin n ilmentymisen profilointiin. Microarray tiedot ovat saatavilla verkossa klo ArrayExpress tietokantaan (hakunumero E-MEXP-3125). Aikana bioinformatiikan analyysi geenien ilmentymistä terveillä näytteissä määriteltiin vakaassa tilassa ja verrattiin geenin ilmentymisen tasot tartunnan näytteissä. Siten määritimme viruksen aiheuttama solujen transcriptome eli infektio-specific geeniekspression muutokset kunkin kennon tyypin erikseen luomatta bias välisellä solutyyppiä vaihtelut eri geneettisissä taustoissa (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja).

Löysimme vahvin muutoksia geenien ilmentymisen HAdV-5 infektion HBECs, jonka jälkeen keuhkosyöpä solut, kun taas geenien ilmentyminen oli paljon vähemmän vaikutusta HAdV-5 infektion melanoomasolujen (katso myös korrespondenssianalyysi kuvassa. S3). Molemmat numerot solun geenien merkittävästi säätelee HAdV-5-infektio (taulukko 1) ja kansi muutoksia geenien ilmentymisen (ArrayExpress, E-MEXP-3125) olivat suurimmat HBECs ja oli alhaisin melanoomasoluja. Nämä tulokset korreloivat replikaation tehokkuutta HAdV-5 näiden solujen: HBECs osoitti sekä tehokkain HAdV-5 replikaation ja vahvin viruksen aiheuttama geenien ilmentyminen, kun taas melanoomasolujen sekä replikaation tehokkuutta ja viruksen aiheuttamat muutokset geenien ilmentyminen oli pienimmillään.

Koska ilmaisua profilointi Ad infektion normaalien hengitysteiden epiteelisolujen ei ole aiemmin ilmoitettu, ensin arvioi HAdV-5 aiheuttaman solujen transcriptome in HBEC. Tuloksemme osoittavat induktion liittyvien geenien DNA: n replikaatioon ja solusyklin, kromatiinin organisaatio, ja nukleotidin aineenvaihduntaa, kun taas osallistuvat geenit erilaistumiseen, asetuksessa (enimmäkseen negatiivinen) leviämisen, ja solukuolema sääntely oli tukahdutettu (taulukko 2 ja taulukko S2).

Seuraavaksi vertasimme geenien ilmentyminen allekirjoitukset HAdV-5 infektion HBECs ja syöpäsolujen eri bioinformatiikan analyysit. Hierarkkinen ryhmittely differentiaalisesti geenien viiden analysoitiin solutyyppejä esiin kaksi klustereita geenejä, jotka osoittavat vastakkaiset asetuksen melanoomasoluissa versus HBECs, eli geenejä, jotka indusoidaan HBECs, mutta tukahdutettu yhdessä tai molemmissa melanoomasolulinjoja (kehystetty kuviossa . 3A, suurennettuna kuvassa. S4). Mielenkiintoista on, että suurempi klusteri on erittäin merkittävää kerääntymistä osallistuvien geenien DNA: n replikaatioon, nukleotidi aineenvaihduntaa, solusyklin säätelyssä ja DNA-vaurioita vastaus (Fig. 3B), joka löytyi myös pienempiä klusterin (tässä merkitystä kertymistä ei saavutettu, koska pieni määrä geenejä). Valitun geenin on lueteltu taulukossa 3. Nämä solun toimintoja on laajasti raportoitu indusoituvan Ad-infektion [17], ja näiden klustereita sisältää useita geenejä voimakkaimmin indusoituu HBECs (katso taulukko 2). Niinpä on hämmästyttävää, että HAdV-5 ei aiheuttaa tai usein jopa tukahduttaa näiden geenien /solun toimintojen melanoomasolujen. Geeni ekspressiotietojen saatu mikrosiruanalyysillä validoitiin kvantitatiivinen PCR (Kuva. S5). Edelleen bioinformatiikan lähestymistapa tunnistaa solureiteillä eniten eri tavalla säädellään HAdV-5-infektion melanoomasolujen versus HBECs, teimme Nerokkuus reitin analyysi geenin ilmentymisen tiedot. Olemme tunnistaneet G1 /S siirtyminen sääntelyverkon keskeisten pro-S-vaiheessa geenejä (

E2F

,

CCNE

,

CDK2

,

Cdc25A

) indusoi in HBECs, mutta tukahdutettu tai ei säännellä melanooman soluissa (Kuva. S6). Voimme päätellä, että HAdV-5-infektion melanoomasolujen ei saada aikaan paneeli S-vaiheeseen liittyvien geenien solukierron säätelyssä, nukleotidi aineenvaihduntaa ja DNA: n replikaatio ja korjaus, jotka indusoituvat natiivin HAdV-5-solut, HBEC.

(A) Hierarkkinen klusterointi geenien Multi-Experiment Viewer (

MeV 4.5.1

), joka perustuu noin. 1000 merkittävimmin geenien (

katso

Materiaalit ja menetelmät

datan suodatus kriteerit

). Klustereita geenien osoittaa vastakkaisten sääntelyä HAdV-5 infektion HBEC versus melanomasolua kehystetty. Suurennoksia näistä klustereista on esitetty kuvassa. S4. (B) luettelot geenien klusterin 2 tehtiin geeni ontologian analysoinnin Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (

DAVID;

david.abcc.ncifcrf.gov). P-arvot GO termejä korjattiin useita testejä käyttäen Benjamini-Hochberg algoritmia.

Analyysi S-vaiheessa induktion HAdV-5 infektio käyttäen E2F-1 promoottori kuten toimittaja

Kuten geeniekspressioprofilointi osoitti, että HAdV-5 ei indusoi geenejä kriittisesti mukana S-vaiheessa prosesseissa melanoomasoluissa, me seuraavaksi suoritetaan itsenäisen biologisen määrityksen tutkimaan S-vaiheeseen induktion HAdV-5 infektio. E2F-1: n promoottori, joka indusoituu voimakkaasti aikana S-vaiheen, käytettiin reportterina Ad-indusoidun S-vaiheeseen pääsyn [31]. HBEC, SW900, SK-MES-1, A549, SK-MEL-28 ja Mel624 solut transfektoitiin lusiferaasireportteri- plasmideja, jotka sisältävät joko E2F-1: n promoottori tai konstitutiivisen SV40-promoottorin hallinnassa. Transfektoidut solut myöhemmin superinfektoitu joko HAdV-5 tai HAdV-5 CMV-GFP E1-poistettu, replikaatiovialliset ohjaus virus. Kvantifiointi reportterigeenin ilmentymisen (Fig. 4), kävi ilmi, että keuhkosyövän soluja, infektio HAdV-5 indusoi E2F-1-promoottorin, mutta ei SV40-promoottori, paljon vahvempi kuin replikaatiovialliset viruksen valvonta. Sen sijaan, E2F-1 promoottorin induktio HAdV-5 infektio oli vähäinen tai puuttuu melanooman soluissa. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa myös geeni-ilmentymisen profilointi tiedot ja osoittavat, että S-vaiheessa induktion HAdV-5 on tehokas HBEC, mutta huono melanoomasoluissa.

(A) lusiferaasireportterigeenillä sisältävät plasmidit E2F-1 tai SV40-promoottorin fragmentteja transfektoitiin ilmoitetuilla solulinjat. 24 tunnin kuluttua solut infektoitiin HAdV-5 (

paino-

) tai replikaatiovialliset HAdV-5 CMV-GFP (

gfp

) tittereillä johtaa 80%: infektio. Lusiferaasiaktiivisuudeksi määrällisesti kaksikymmentä tuntia tartunnan. Pylväät edustavat keskiarvoa kolminkertaisten transfektioista /infektioiden ja virhepalkkeja heijastavat keskihajonta. Tähdet osoittavat tilastollista merkitystä vertailtaessa HAdV-5 HAdV-5 CMV-GFP (

* p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

). (B) Eri tietojen esittämisessä esitetään A-kuvassa: Taita muutos promoottorin aktiivisuuden HAdV-5 verrattuna HAdV-5 CMV-GFP.

Keskustelu

Tuottava Ad infektio on riippuvainen solun, joka tukee eri vaiheissa virusreplikaation aikana. Siksi mainokset ovat kehittyneet strategioita manipuloida solun ympäristön isäntäsoluissa. Välitön aikainen ja varhain virusproteiineja luoda monimutkaisen verkoston vuorovaikutusta isäntäsolun toimintojen jotta voidaan torjua isännän puolustusta ja aiheuttaa solureiteillä toistamiseen tarvittavat virusgenomin. Tämä sisältää uudelleen ohjelmointi solujen geenin ilmentymisen. Tässä kuvaamme ensimmäistä kertaa HAdV-5 infektio aiheuttama transcriptome varten HBECs, joka edustaa niiden natiivi isäntäsoluissa. Ensin määritellään kinetiikka HAdV-5 replikaatiota HBECs, joka on seuraava: E1A ilmentymisen alkaa ennen 4 tuntia infektion (h.p.i.) ja tasaantuu 8 h.p.i .; ensimmäinen lisäys viruksen genomissa ja kuidun mRNA kopiota tapahtuu 8 tai 12 HPI, riippuu luovuttajan ja tarttuva partikkeli tuotanto saavuttaa tasanteen 48 hpi. Tätä seuraa tehokas virus levisi yksisolukerroksen, havaittuna sytotoksisuus määritys jälkeen alhainen tiitteri infektion. Genominlaajuisten ilmentymisen profilointi HAdV-5-tartunnan HBECs alkaessa virusgenomin replikaatio, kun merkittäviä muutoksia isäntäsolun aikaisin viruksen geenejä odotetaan, paljasti merkittävän kasvun ilmaus 424 ja laskua varten 519 18631 arvioida geenejä. Niinpä geeni tukahduttaminen oli näkyvästi tänä ajankohtana, vaikka otetaan huomioon, että se on vaikeampi havaita kuin geenin induktion vuoksi puoliintumisaika mRNA läsnä ennen infektiota. Geenit mukana solusyklin, DNA: n kahdentuminen, chromatin järjestämisestä ja nukleotidin aineenvaihdunta oli kertynyt ilmen- tymisen lisääntymisen geeni väestöstä. Tämä sisältyi

E2F-2

, osoittaa vahvin kasvu mRNA: n ilmentymisen (11,5-kertainen),

CCNE1

ja

CCNE2

(sykliini E1 ja E2, 7.9- ja 6.2 kertainen),

RRM2

(ribonukleotidireduktaasia M2, 5,2-kertainen),

CDC25A

(3,5-kertainen),

MCM2

,

7

ja

10

(3-, 3.3- ja 3.3-kertainen),

EXO1

(eksonukleaasi 1, 3,1-kertainen),

RFC3

ja

4

(replikointi tekijä C3 ja 4, 2.8- ja 2.1-kertainen),

PCNA

(lisääntyvien solujen tuman antigeeni, 2,2-kertaiseksi) ja useat histoni, chromatin kokoonpano tekijä ja sentromeerin geenejä. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten, jotka on muodostettu, vaikka muut solutyypit, että S vaihe induktio Ad-tartunnan saaneiden solujen vaaditaan virusreplikaation edetä. Määrä geenejä ja induktio hinnat että me raportoimme ehkä jopa aliarvioida, koska emme synkronoida HBECs ennen infektiota jotta asianmukaisen vertailun syöpäsoluja. Geenejä toimintaa erilaistumista negatiiviseen säätelyyn leviämisen (mukaan lukien

CDKN1A

, -2,9 ja

CDKN2B

; -2,73), ja solukuolemaan sääntely oli kertynyt tukahdutettu geeni väestöstä (vahvin tukahduttaminen oli lisäkilpirauhasen hormonien kaltaisia ​​hormoni, 16,1-kertainen). Huomattavaa on, että emme tunnistaa kertymistä liittyvien geenien immuniteetin ilmen- tymisen lisääntymisen geenipooli.

HAdV-5 infektio on harvoin tutkittu normaaleissa hengitysteiden epiteelisolujen ennen. Useat tutkimukset onkolyyttisten mainokset ovat verranneet pääasiassa hengitysteiden epiteelisolujen kasvainsolujen sytotoksisuuden ja tarttuvan hiukkanen tuotanto määrityksiä arvioida selektiivisyyden ja tehokkuuden viruksen mutanttien [32] – [39]. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että tuotanto tarttuvan HAdV-5 hiukkasten ensisijainen hengitysteiden epiteelisoluissa on tehokas ja huiput noin 48 h p.i. [37], [39], joka on sopusoinnussa tuloksemme.

Aikaisemmat tutkimukset ilmentymisen profilointiin Ad infektio on suoritettu HeLa-solujen ja ihmisen fibroblasteissa. Varten HeLa-solut, HAdV-2-infektio MOI 100 on raportoitu säännellä 76, 60, tai 382-geenien yli 1,5-kertainen 6 h, 10 h tai 20 HPI, vastaavasti (12000 analysoitiin 6 h, 7500 geenejä 10 h ja 20 h) [26], [28]. Toisessa tutkimuksessa havaittiin 75 4600 geenien säännelty yli kaksinkertaiseksi vuoteen HAdV-5 24 h.p.i. HeLa-solujen [40]. Onko pienempi määrä säänneltyjen geenejä verrattuna HBECs tutkimuksessamme johtuu muutosta HeLa-solujen on vaikea arvioida, koska menetelmäerojen. Tältä osin tutkimuksemme osoitti pienempi määrä geenien sekä keuhkosyövän ja Melanoomasolulinjojen verrataan suoraan HBECs (katso alla). S-vaiheen geenien on raportoitu indusoituvan Ad-infektion HeLa-soluissa, mukaan lukien

CDC25A

(1,8 10 h),

UNG

(1,6) ja histoni-geenit [28], jonka löysimme myös HBECs. Päällekkäisyyksiä esiintyy myös vaimentua geeneistä:

MYC

(-1,9 vs. -2,4 vuonna HBEC);

THBS1

(trombospondiini-1; -2,6 vs. -9,4 vuonna HBEC);