Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat osoittaneet osallistua moniin tärkeisiin solun prosesseja kuten säteilylle herkäksi. VEGF-perheen, tärkeä säätelijä angiogeneesin, myös ratkaiseva rooli säätelyssä syöpäsolun radioherkkyyttä. VEGFR2 välittää suuria kasvun ja läpäisevyys toimia VEGF parakriinisellä /autokriinisella tavalla. MiR-200c, at Nexus epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), ennustetaan kohdistaa VEGFR2. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on testata hypoteesia, jonka sääntely VEGFR2-reitin miR-200C pystyi mukauttamaan radioherkkyyttä syöpäsoluja. Bioinformatiikan analyysi, lusiferaasireportterista määritykset ja biokemialliset määritykset suoritettiin vahvistamaan VEGFR2 suorana kohteena miR-200c. Sädeherkistävä vaikutukset miR-200c on A549-solut määritettiin klonogeeniset määrityksissä. Alavirran säätelevä mekanismi miR-200c tilaa tutkittiin western blotting määrityksissä, FCM, putken muodostumiseen määritykset ja muuttoliike määritykset. Tunnistimme VEGFR2 uutena kohteena miR-200c. Kohdunulkoinen miR-200C lisäsi radioherkkyyttä A549 taas miR-200c alassäätöä vähensi sitä. Lisäksi osoitimme, että miR-200c radiosensitized A549-solut kohdistamalla VEGF-VEGFR2 koulutusjakson sanottuna mikä johtaa esto sen loppupään pro-selviytymisen signaalitransduktioreittiin ja angiogeneesiä, ja toimii mahdollisena kohteena radiosensitizition tutkimukseen.

Citation: Shi L, Zhang S, Wu H, Zhang L, Dai X, Hu J, et al. (2013) MiR-200C Kasvattaa radioherkkyyttä of Non-Small-Cell Lung Cancer A549 by Targeting VEGF-VEGFR2 Pathway. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10,1371 /journal.pone.0078344

Editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 11 syyskuu 2013; Julkaistu: 30 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Hubein maakunnan Natural Science Foundation projekti (nro: 2009CDA061). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Potilaat kärsivät ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) muodostavat noin 85% kaikista keuhkosyöpää [1], [2]. Sädehoito (RT) on tehokas liikennemuotojen laajalti käytetty klinikalla syöpäsoluja vastaan. Kuitenkin monet niistä esiintyy luontainen tai hankittu radioresistance RT johtaa hoidon epäonnistumiseen [3]. Kertyvät näyttöä siitä, että radioresistance ei ole ainoastaan ​​luontaisia ​​ominaisuuksia mutta tuloksena vuorovaikutukset syöpäsolujen ja microenvironment tekijöistä. Paracrine /autokriinisella roolia verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) sitoutumalla sen reseptoreihin on yksi tärkeä osa kasvaimen mikroympäristön ja sen itsesääntelyn. Tukahduttaminen VEGF-geenin ilmentymisen voisi parantaa radioherkkyyttä syöpäsolujen [4], [5]. Ja VEGFR2 yleensä katsoa välittävän päätehtävä johtuvan VEGF. Sädehoitoa yhdistettynä VEGFR2 ja EGFR saarto aiheutti merkittävän kasvaimen vastaisten vaikutusten käytettäessä potilaalle tehdä mallin keuhkosyövän [6]. Molecular esto VEGFR2 voisi parantaa kasvaimen säteily vaste molekyyli- kohdentamalla kasvaimen verisuoniston [7]. Joten paracrine signalointi isännältä VEGF syöpäsolu VEGFR2 saattaa olla merkittävä osa RT vikojen [8].

MikroRNA (miRNA) ovat joukko pieniä ei-koodaavan RNA: iden, joka estää niiden tavoitteen ilmentymistä sitoutumalla 3’alue (3’UTR). Eräs tutkimus, joka tunnistettiin rotan keuhko-erityisiä miRNA by miRNA mikrosirujen paljasti, että miR-200c ilmaistu erikseen normaaleissa rotan keuhkojen kudoksia [9]. Ja menetys miR-200c ilmentymisen saattavat aiheuttaa aggressiivinen, invasiivinen ja solunsalpaajaresistentti fenotyyppi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10]. Lisäksi riippumattomat tutkimukset osoittivat, että palauttaminen miR-200C voivat lisätä herkkyyttä kemoterapeuttisten aineiden erilaisissa kasvaimissa [11], [12]. Joten ei miR-200c olla sama tehtävä sädehoidossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä?

bioinformatiikka- analyysi osoitti, että VEGFR2 oli hyvä ennustettu tavoitteeksi miR-200c on kaksi sitovaa kohtaa. Tässä kokeessa, tutkimme VEGFR2 voitaisiin säädellä miR-200c, joka johtaa modulaatioon radiosentivitiy A549 soluja.

Tulokset

VEGFR2 on välittömänä kohteena miR-200c

bioinformatiikka- analyysi paljasti, että VEGFR2: n (verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori 2) on ennustettu tavoite miR-200c, jotka voivat suoraan inhiboida sen geenin ilmentymistä (Fig. 1A). A549-soluja transfektoitiin miR-200c matkii (50 nM) tai miR-200c estäjät (100 nM) lisäämään tai vähentämään miR-200c ilme. Jäljittelee valvonta (50 nM) tai inhibiittorit valvonta (100 nM) transfektoitiin A549-soluja negatiivisina kontrolleina vastaavasti. Reaaliaikainen PCR osoitti, että miR-200c jäljittelee ja miR-200c estäjät voivat merkittävästi lisätä tai vähentää miR-200c ilmentymisen A549 (tietoja ei esitetty). Edelleen vahvistaa, onko miR-200c voi sitoutua suoraan 3’UTR VEGFR2, suoritimme dual lusiferaasireportterigeenillä määrityksessä käytetään pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmidi A549-soluja. Ohimenevä transfektio A549-solujen pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmidia ja miR-200C jäljittelee johtanut merkittävään laskua lusiferaasiaktiviisuuden verrattuna kontrolleihin (Kuva. 1 B). Sen tutkimiseksi jos miR-200c voi vaikuttaa VEGFR2 proteiinin ilmentymistä A549-soluja, suoritimme western pultti määrityksiä ja totesi, että miR-200C jäljittelee vähensi proteiinin ilmentymistä A549 merkittävästi verrattuna kontrolleihin (Kuva. 1 C).

(A) miR-200c kohdesivustoa tähteen 3′-UTR-geenin VEGFR2 tarkastanut bioinformatiikan. (B) toinen pLuc-VEGFR2-3’UTR konstrukti sisältää villityypin sekvenssi 3’UTR VEGFR2. PLuc-VEGFR2-3’UTR konstrukti kotransfektoitiin miR-200c matkii osaksi A549-soluja. Havaittu lusiferaasiaktiivisuutta 48 h transfektion jälkeen. Ja suhde normalisoitu lusiferaasin arvo näytetään. (C) VEGFR2-proteiinin ilmentyminen A549-soluja mitattiin western blot 48 h transfektion jälkeen. Kukin koe toistettiin kolme kertaa. Keskivirheet keskiarvon esitetty virhepalkeilla. * Osoittaa p 0,05 kontrolliin verrattuna.

MiR-200C Jäljittelee lisäsi radioherkkyyttä A549 Cells taas miR-200c estäjät Vähentynyt Se

tutkia, miR-200c vaikuttaa solujen radioherkkyyttä, A549-solut transfektoitiin miR-200c jäljittelee tai inhibiittorit. Colony selviytyminen määrityksissä kultakantaan radioherkkyyttä arvio, arvioitiin seuraavien 0-8 Gy säteilyä. Transfektio A549 solujen miR-200c matkii (50 nM) vähensi merkittävästi solujen selviytymisen jälkeen säteilyaltistuksen (SER

0,5 1,47, Fig. 2A). Kääntäen, transfektointi A549-solujen miR-200c estäjät (100 nM) aiheutti merkittävää lisäystä solun eloonjäämisen seuraavien 0-8 Gy säteily verrattuna kontrolleihin (SER

0,5 0,79, Fig. 2B).

yli-ilmentyminen miR-200c (A) paransi radioherkkyyttä A549-solujen IR hoitoon, kun taas miR-200c inhibitio (B) osoitti päinvastainen vaikutus. Si-VEGFR2 rakentaa inhiboi VEGFR2-proteiinin ilmentymisen 48 h transfektion jälkeen (C), minkä seurauksena säteilylle herkäksi A549-soluja (D). Jäljittelee ohjaus, inhibiittorit ohjaus ja siRNA ohjaus transfektoitiin A549-soluja vastaavasti negatiivisena kontrollina. Klonogeenisten selviytymisen määritykset toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin. Keskivirheet keskiarvon esitetty virhepalkeilla.

VEGFR2 pudotus tehtiin RNA-interferenssi käyttämällä lipo2000 transfektioreagenssia. Colony -eloonjäämiskoe osoitti knockdovvn VEGFR2 proteiinin ilmentymisen tasoja (Fig. 2C) johti kasvuun radioherkkyyttä A549 (SER

0,5 1,34) (Fig. 2D).

VEGF neutralointi poisti säteilylle herkäksi Effect of miR-200c

tutki vaihtelua VEGF secreation solunulkoisessa väliaineessa jälkeen kohdunulkoinen miR-200c ilmaisua käyttäen VEGF ELISA-määritystä. Eikä merkittäviä muutoksia VEGF secreation seuraavista miR-200c interventio on osoittautunut jälkeen kaksoistestissä (Fig. 3A). Bevasitsumabi (Bev, 1 mg /ml), VEGF-spesifinen esto monoclony vasta-ainetta, lisättiin sitten viljelyalustaan ​​A549 solujen vähentää solunulkoisen VEGF pitoisuus 1 tunti ennen transfektiota. Yhdyskunnan säilymiseen määritykset suoritettiin tutkimiseksi säteilylle herkäksi vaikutus miR-200c kanssa tai ilman VEGF neutralointia. Tulokset osoittivat, että miR-200c eivät voi laskea post-säteilyn hengissäsäilymisosuus ilman VEGF: n indusoiman aktivaation (Fig. 3B).

(A) ELISA-määrityksen havaitsemiseen käytettiin VEGF erityksen muutoksia transfektion jälkeen asennuspalveli- 200c jäljittelee osaksi A549-soluja. Bevasitsumabi (B) ja su1498 (C) levitettiin estää VEGF-VEGFR2 kautta. Sitten klonogeeniset määritykset suoritettiin tutkimaan säteilylle herkäksi vaikutus miR-200c jälkeen VEGF-VEGFR2 tukos. Kukin koe toistettiin kolme kertaa. Keskivirheet keskiarvon esitetään virhepalkeilla.

VEGFR2 tukos poisti säteilylle herkäksi vaikutus miR-200c

VEGFR2 estettiin su1498, tyrosiinikinaasin estäjä endoteelikasvutekijä kasvutekijän reseptoria 2 (VEGFR2). Su1498 lisättiin kasvualustaan ​​ja A549-solut lopulliseen concerntration 5 uM yksi tunti ennen transfektiota. Klonogeenisten määritykset suoritettiin käyttää eloonjäämistä A549-solut sen jälkeen, kun erilaisia ​​annoksia säteilyä. Tulokset osoittivat, että rdiosensitization jonka VEGFR2 inhibitio oli merkittävästi estänyt estämällä VEGFR2 reitin (Fig. 3C). Joten miR-200C lisäsi radioherkkyyttä A549 pääasiassa kohdistamalla VEGFR2 reitin.

MiR-200C esti aktivointi ERK1 /2 ja Akt

lisätutkimuksia siitä alavirtaan signaalitransduktioreaktioteitä VEGFR2 olivat mukana säteilylle herkäksi A549, tutkimme MAPK ja AKT polkuja, jotka olivat tärkeimpiä loppupään pro-eloonjäämisreittejä VEGFR2. A549-soluja transfektoitiin miR-200c jäljittelee tai inhibiittorit. Sitten tutki ekspressiotaso ja aktivaation ERK1 /2 ja Akt jotka ovat tiedoksiannon molekyylejä MAPK ja AKT-reitin. Verrattuna soluihin, käsiteltiin jäljittelee valvonnan aktivointi ERK1 /2 ja Akt osoitettu p-ERK1 /2 ja p-Akt merkittävästi säädellä vähentävästi A549-soluja käsiteltiin miR-200c jäljittelee (Fig. 4). Päinvastoin, miR-200c estäjät aktivoitunut ERK1 /2 ja Akt verrattuna n estäjä valvontaa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että aktivaatio ERK1 /2 ja Akt moduloida säteilylle herkäksi vaikutus miR-200c (Fig. 4).

ektooppinen ekspressoituminen miR-200c inhiboi fosforylaatiota Akt ja ERK1 /2, inhibition asennuspalveli- 200c aktivoitunut Akt ja ERK1 /2 kautta. Jokainen koe toistettiin kolme kertaa.

MiR-200c Inhibioitu Angiogeneesi ja HUVEC-solujen vaeltamiseen

Tutkimme lisäksi, että onko miR-200c, suora säätelijä VEGFR2- voisi säädellä angiogeneesiä endoteelisolujen. 48 tuntia transfektion jälkeen, HUVEC-solut ilman ravintoa yön yli ja ympättiin 96-kuoppalevyille, jotka oli etukäteen päällystetty matrigeeliä. Inkuboitiin 16 tuntia, miR-200c-transfektoidut solut osoittivat merkittävästi heikentynyt putken muodostumisen kyky. Sitä paitsi, alas-säätely VEGFR2 by si-VEGFR2 voisi myös estää angiogeneesiä HUVEC-solujen. Koska maahanmuutto on tärkeä askel angiogeneesin, myös havaittu vaikutusta miR-200c siirtolaisuudesta HUVEC-solujen. Kuten on esitetty kuviossa 5, ektooppinen ilmentyminen miR-200c inhiboi merkittävästi angiogeneesiä ja HUVEC-solujen vaeltamiseen. Toisaalta, tukahduttaminen miR-200c nousi putken muodostumiseen ja muuttoliike noin 30% HUVEC soluista.

HUVEC transfektoitiin miR-200c jäljittelee, miR-200c estäjien tai si-VEGFR2. (A) HUVEC viljeltiin Matrigelillä 48 h transfektion jälkeen. Edustavat kuvat kapillaari kaltaisia ​​rakenteita on muodostettu ja (B) pituus kapillaarirakenteella kvantitoitiin. (C) Transfektoidut HUVEC myös ympättiin ylemmän kammion 8,0 mm huokosten koko 24 kuopan transwell levyt tutkia solujen vaeltamiseen kyky. (D) vaeltavia solut laskettiin ja analysoitiin tilastollisesti. Kukin koe toistettiin kolme kertaa. Keskivirheet keskiarvon esitetty virhepalkeilla. * Osoittaa p 0,05 kontrolliin verrattuna.

Keskustelu

Edellinen teos ryhmämme ja muut on ehdottanut, että VEGF moduloi kasvain selviytymisen kautta eri tavoilla, kuten säteilylle herkäksi [13] – [15]. VEGF indusoi biologisia vaikutuksia parakriinisellä /autokriinisella tavalla sitoutumalla sen reseptoreihin, erityisesti VEGFR2 (KDR, FLK-1). Jotkut prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että terapeuttiset hyödyt sädehoidon voitaisiin parantaa, kun se yhdistetään estäjiä VEGFR2 [16]. Kohdistaminen VEGFR2 polku on uusi tapa voittaa radioresistance että sädehoidon eri syöpiä. Viime aikoina jotkut miRNA osoitettiin moduloida sädehoidon syöpäsoluja. MiR-200c on keskeinen säätelijä epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on liitetty alkionkehityksen syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Ja miR-200c on ilmaistu erityisesti normaalissa rotan keuhkojen kudoksia [9], kun menetys miR-200c ilmaisun aiheuttama aggressiivinen, invasiivinen ja solunsalpaajaresistentti fenotyyppi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10]. VEGFR2 on ennustettu kohteena miR-200c bioinformatiikan analyysi (https://www.targetscan.org). Joten on tärkeää selvittää miR-200C pystyi mukauttamaan radioherkkyyttä syöpäsolujen suuntaamalla VEGFR2 reitin.

dual lusiferaasireportterigeenianalyysissä ja western blot-analyysi, osoitimme VEGFR2 välittömänä kohteena miR-200c . Sitten testasimme vaikutuksia kohdunulkoisen ilmentymisen miR-200C on radioherkkyyttä A549 soluja. Huomasimme, että säätely ylöspäin miR-200c kanssa miR-200c matkii vähensi VEGFR2 proteiinin ilmentymisen ja lisäsi radioherkkyyttä A549-solujen eri annoksia säteilyä. Kuitenkin alas-säätely miR-200c ilmaisutapoja miR-200c estäjät lisääntynyt solujen eloonjäämistä ja laski radioherkkyyttä. Olemme edelleen rakennettu si-VEGFR2 estävän VEGFR2 proteiiniin A549-solut. Tulokset osoittivat, että vähentämällä VEGFR2 ilmaisua käyttäen si-VEGFR2 voisivat tehostaa radioherkkyyttä A549-soluissa, jotka oli yhtäpitävä vaikutuksia VEGFR2 alassäätöä muissa kasvainsolulinjoissa [17], [18]. Joten miR-200c voisi parantaa radioherkkyyttä A549 estämällä VEGFR2 ilme.

Kuitenkin yksi yksittäinen miRNA voisi säädellä satoja kohdegeenien. Joten ei miR-200c radiosensitize A549-solut pääasiassa kohdistaminen VEGFR2 reitin? Su1498 on tyrosiinikinaasi-inhibiittori, joka on spesifinen VEGFR2. Huomasimme, että miR-200c ei radiosensitize A549 kun VEGFR2 estyi su1498. Koska VEGF on tärkein ligandi VEGFR2 toimi parakriinisellä /autokriinisella tavalla, ensin tutkitaan vaihtelua VEGF erittymisen jälkeen miR-200c transfektiota ja totesi, että miR-200c matkii ei voinut vaikuttaa VEGF eritystä A549. Sitten neutraloidaan erittyvä VEGF ulkopuolella A549 bevasitsumabiin ennen transfek- miR-200c, ja sai negatiivisen tuloksen aivan kuin VEGFR2 esto. Joten tämä viittaa siihen, että miR-200c voisi radiosensitize A549-soluja kohdistamalla VEGF-VEGFR2 reitin.

Sitten tutki tarkemmin alavirtaan mekanismeja miR-200c säteilylle herkäksi. MAPK ja PI3K /AKT signalointi transduktioreittejä kaksi tärkeää alavirtaan signalointireiteissä VEGFR2 [19]. Kohdistaminen suoraan ja esto näiden kahden reitin voi lisätä radioherkkyyttä syöpäsoluja. Fosforylaatio p44 /42-MAPK (Thr202 /Tyr204) ja Akt (Ser473), jotka ovat keskeisiä molekyylejä MAPK ja PI3K /AKT signalointireittien, yleensä lisäävät eloonjäämistä syöpäsolujen jälkeen säteilyä. Tutkimuksessamme western blot analyysit tehtiin tutkimaan fosforylaation taso muuttuu Akt ja ERK1 /2 (p44 /42-MAPK) jälkeen tansfection Mir-200c jäljittelee tai inhibiittorit A549-soluihin. Olemme havainneet, että kun taas lisääntynyt ilmentyminen miR-200c johti inhibition Akt ja ERK1 /2-fosforylaation, vähentynyt ilmentyminen miR-200c parannettu Akt ja ERK1 /2-fosforylaation A549.

Hypoxic mikroympäristön ulkoista syöpäsoluihin edistää merkittävästi radioresistance sädehoidon [7]. Tukahduttaminen angiogeneesin merkittävästi parannettu radioherkkyyttä syöpäsoluja. Ja VEGFR2- avainvälittäjä angiogeneesin, voivat vaikuttaa kasvaimen microenviroment (TME), jotka moduloivat syöpäsolun radioherkkyyttä. Tuloksemme viittaavat siihen, että ektooppinen ilmentyminen miR-200c tukahdutti angiogeneesiä HUVEC-solujen.

Lisäksi tutkimme myös muita mekanismeja miR-200c-VEGFR2 vuorovaikutus. FCM tai MTT-määrityksissä, ei havaittu olevan merkittäviä vaikutuksia miR-200c solusyklin, apoptoosin tai proliferaatiota A549-solut (tuloksia ei esitetä).

Yhdessä tuloksemme osoittavat, että miR-200c-inhibitiota VEGF-VEGFR2 signalointiryöpyn voisi radiosensitize ihmisen NSCLC A549-soluja säteilylle, joka on terapeuttinen tavoite säteilylle herkäksi.

päätelmät

tiedot viittaavat siihen, että miR-200c voisi merkittävästi radiosensitize A549 solut kohdistamalla VEGF-VEGFR2 reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

A549-solut, saatu Cell Bank of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. HUVEC-solut American Type Culture Collection (ATCC) viljeltiin endoteelisolujen väliaineessa (ECM, Sciencell, USA). Elatusaine uusittiin joka 2-3 päivä. Ja solut siirrostettiin 1:06 4 päivän välein seuraavan trypsiinikäsittelyllä 0,05% trypsiini-EDTA: ta.

Transient transfektio ja Cell Hoidot

MiR-200c jäljittelee, miR-200c-inhibiittorit, äänen- VEGFR2- jäljittelee valvonnan inhibiittorit valvontaa, ja siRNA valvonta syntetisoitiin Ribobio (Guangzhou, PR China). Solut ympättiin 4 x 10

5 per solu 6-kuoppaisille levyille yksi päivä ennen transfektiota. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfektioreagenssi käytettiin transfektoimaan solut miR-200c matkii (50 nM), miR-200c estäjät (100 nM) tai VEGFR2 pieniä häiritseviä (si) RNA: n (100 nM). Ei-kohdistaminen matkii ohjaimet (50 nM), inhibiittorit valvonta (100 nM) tai siRNA valvonta (100 nM) transfektoitiin soluihin negatiivisina kontrolleina. 6 tuntia transfektion jälkeen, solujen kasvualusta poistettiin ja inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS vielä 24-72 tuntia. Lisäksi kokeet suoritettiin transfektoitujen solujen tai solujen hajoamista. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) tai bevasitsumabi (Roche) ylläpitäjä 60 minuuttia ennen transfektiota.

tunnistaminen miR-200c tavoitteet

Käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen), A549-solut transfektoitiin lusiferaasireportterilla konstrukteja, jotka sisältävät 3′-UTR VEGFR2 tai negatiivinen kontrolli-vektorit (Promega). Transfektio sisälsivät 100 ng fireflyluciferase reportteriplasmidilla ja 50 nM synteettistä miR-200c duplex. A549-solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay (Promega).

klonogeeninen määritys

herkkyys A549-solut säteilytyksen määritettiin klonogeenisten määrityksellä muuttujan säteilyannoksia (0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy) käyttäen lineaarista kiihdytin (Primus K, Siemens, Munchen, Bayern, Saksa). Kun oli inkuboitu 10-14 päivä, muodostuneiden pesäkkeiden fiksoitiin metanolilla ja värjättiin 1% kristallivioletilla. Vain pesäkkeitä, jotka sisälsivät yli 50 solua laskettiin. Tiedot sovitettiin lineaarisesti toisen asteen mallia käyttäen Sigmaplot ohjelmistoa, jossa selviytyminen dikäyrät ja radioherkkyyttä parametrit laskettiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

mittaus VEGF-taso

taso VEGF secreation A549-soluja arvioitiin ihmisen VEGF-ELISA-kittiä (R 0,05 pidettiin merkittävänä.