Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on noin 1 miljoona tapausta kolmanneksi yleisin syöpä maailmassa. Laaja tutkimus on käynnissä tulkita taustalla geneettinen kuvioita toivoa parantaa varhaisen syövän diagnosointiin ja hoitoon. Tähän suuntaan, nykyinen edistyminen seuraavan sukupolven sekvensointiteknologioihin on mullistanut syövän genomiikka. Kuitenkin yksi vastalause näistä tutkimuksista on edelleen suuri määrä geneettistä vaihtelua tunnistetaan ja niiden tulkinta.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä esittelemme ensimmäistä työ kokonaisuudessaan exome NGS ensisijaisen paksusuolen syöpiä. Suoritimme 454 koko exome pyrosekvensointi kasvaimen sekä viereisen ei vaikuta normaaliin paksusuolen kudosta microsatellite vakaa (MSS) ja mikrosatelliitti epävakaa (MSI) paksusuolen syöpäpotilaiden ja tunnistettu yli 50000 pieniä nukleotidin muunnelmia kunkin kudoksen. Mukaan perustuvia ennusteita MSS ja MSI tautimekanismien tunnistimme kahdeksan kertaa somaattisen kuin synonyymi vaihtelut MSI syöpiä kuin MSS ja pystyimme toistamaan tulos neljä muuta CRC. Meidän bioinformatiikan suodatus lähestymistapa rajanneet nopeudella merkittävin mutaatioita 359 MSI ja 45 MSS CRC ennakoidun muuttunut proteiinin toimintoja. Molemmissa CRC, MSI ja MSS, löysimme somaattiset mutaatiot solunsisäinen kinaasidomeenia luun morfogeneettinen proteiini-reseptorin 1A, BMPR1A, geeni jossa toistaiseksi ituradan mutaatioita liittyvät juveniili polypoosi, ja osoittavat, että mutaatiot toiminnallisesti heikentää proteiinin toimintaan .

Johtopäätökset /merkitys

Olemme päätellä, että syvä sekvensointi kasvain exomes yksi voi kyetä ennustamaan mikrosatelliittimerkki tilan CRC ja lisäksi tunnistaa mahdollisesti kliinisesti merkityksellistä mutaatioita.

Citation: Timmermann B, Kerick M, Roehr C, Fischer A, Isau M, Boerno ST et ai. (2010) Somaattiset mutaatiot profiilit MSI ja MSS peräsuolen syövän Merkitty kaikkiaan Exome Next Generation Sequencing ja bioinformatiikan analyysi. PLoS ONE 5 (12): e15661. doi: 10,1371 /journal.pone.0015661

Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 elokuu 2010; Hyväksytty: 19 marraskuu 2010; Julkaistu: 22 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Timmermann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan liittovaltion opetus- ja tutkimusministeriö (01GS08105 ”Mutanom,” 01GS08111 ”Intestinal modifiointiaineiden”) ja Max Planck -instituutissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä noin 1 miljoonaa tapausta maailmanlaajuisesti. Viime vuosikymmenien aikana on käynyt selväksi, että CRC kehittyy läpi useita reittejä, ja että nämä reitit voidaan karkeasti määritelty perustuen molekyyli kuvioita kuten eheyden yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän (MPR) tai mutaatiokaavojen ja epigeneettiset kuvioita. Puute MMR heijastuu DNA mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joka on myös liitetty hoitotulokset, mutta joka on edelleen validoitu lisää kliinisiä tutkimuksia [1], [2], [3], [4], [ ,,,0],5], [6].

Suurikapasiteettinen Sangerin sekvensoinnilla tutkimukset toisaalta ovat osoittaneet, että mutaatio taajuus ehdokas syöpägeenit saattavat olla paljon suurempi kuin odotettiin, ja että tietty yhdistelmä mutaatioiden voisi vaikuttaa kasvain ominaisuudet [7], [8], [9], [10], [11]. Kehittämisen kanssa seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tekniikat jaksotusta suoritusteho on kasvanut dramaattisesti, ja kustannukset ovat laskeneet. Lisäksi ja erityisen tärkeitä hoitopaikassa, NGS voidaan soveltaa formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin FFPE Kudosaineen sekä erittäin hajonnut DNA, joka on rutiininomaisesti valmistetaan patologian yksiköissä tai löydetty antiikin DNA [12], [13]. Useissa tutkimuksissa on käytetty NGS teknologioiden tunnistamiseksi taustalla mutaation monogenetic sairauksiin [14], [15]. Kuitenkin vain rajoitettu määrä tutkimuksia raportoimaan seuraavan sukupolven sekvensointi tunnistaa uuden ehdokkaan syöpä geenit; yksi varhaisimmista Tutkimuksissa tarkasteltiin sytogeneettisesti normaali akuutti myelooinen leukemia, rintasyöpä genomien [16], [17]. Lisäksi tutkimuksia pahanlaatuinen melanooma ja pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat ovat tarjonneet ensimmäinen oivalluksia genomiseen muutoksia aiheuttamien ultraviolettivalon altistumista tai tupakansavulle [18], [19].

perehtyä genomien Mikrosatelliittimarkkerien vakaa ja epävakaa kolorektaalisyövissä ja tunnistaa toiminnallisia asiaan mutaatiokaavojen käytimme hybridisaatioon perustuva koko exome DNA syömällä lähestyminen 454 seuraavan sukupolven sekvensointi [20]. Soveltamalla tiukkoja bioinformatiikka analyysit, me rajanneet määrä toiminnallisesti merkittäviä somaattisten mutaatioiden MSI 359 ja 45 MSS syövissä, mikä korostaa tiettyjä mutaatio kuvioita riippuen Mikrosatelliittimarkkerien asemasta. Pystyimme vahvistamaan tuloksemme sekvensoimalla exomes neljän uuden CRC tapausta (yksi MSI, kolme MSS) käyttämällä eri rikastamiseen ja sekvensointitekniikan. Näistä mutaatiot ovat BRAF MSI syövän ja KRAS ja TP53 että MSS syöpä, edelleen korostaen pätevyyttä valikoimaan lähestymistavan [21]. Lisäksi toiminnallinen characterizations tunnistaa toistuvia somaattisia mutaatioita BMPR1A, proteiini, joka on liittynyt tähän mennessä juveniili polypoosi, syöpä taipumus oireyhtymä.

Tulokset

Sequence-erityisiä rikastamiseen ja Sekvensointistrategia

sekvensoitiin kasvain ja vastaavat normaalin paksusuolen kudokset kahdelta potilaalta, joilla on korkea laatu adenokarsinooma (G3), potilas 1, jossa on microsatellite instable ja potilas 2 kanssa microsatellite vakaa kasvain (taulukko 1, kuva S1). Määrittämiseksi ituradan mutaatioiden sekvensoimme lisäksi kasvainkudoksessa kunkin potilaan vieressä ei vaikuta normaalin koolonin kudokseen. Käyttämällä Illumina sekvensointi ja SNP paneelit huomasimme, että kasvain potilaan 1 on kopioluvun vakaana, kun taas potilas 2 oli eroja jota käytetään uudelleenarviointi tunnistettu suuren tiukkuuden mutaatioita (taulukko S3).

Analysoimme täydellinen exomes yli 135000 eksonia yhden lukea haulikon 454 sekvensointi (kuva 1, kuva S1, kuvio S2, taulukko 2). Vaikutuksen arvioimiseksi kattavuuden syvyys herkkyyteen ja spesifisyyteen sekvenssivariantti havaitsemisen, genotyyppi puhelut Affymetrix SNP array 6,0 verrattiin vaiheittain kutsutulle nukleiinihapon kantoja ja johti tarkkuus on yli 99% (kuva S3) . Sen lisäksi, että SNP array, käytimme Sanger-sekvensoinnilla vahvistaa 23 valitaan mutaatioiden (taulukko S5, kuva S5).

(A) Venn-kaavio on kuvattu eksonien normaalin ja kasvaimen näytteitä. Captured eksonit vähintään yhdellä luku- laskettiin. (B) edustaja normalisoitu kattavuus-jakelu juoni. Osa syötti peitossa eksonien genomissa saavuttamisessa coverages yhtä suuri tai pienempi kuin normalisoitu kattavuus on merkitty x-akselilla. Keskimääräinen kattavuus per eksonista jaettiin keskimääräisellä kattaa kaikki eksonien.

tunnistaminen somaattisten mutaatioiden koodaussekvenssit varten MSI CRC

etsiminen variantteja koodaavat alueet löysimme 12767 ja 12518 pieni ydin- vaihtelut 6428 ja 6205 geenejä, kasvaimen ja normaali vastaavasti. Näiden varianttien 1428 valvonta- ja 2404 kasvaimen keskimääräinen Heterotsygoottisuuden tai vähäinen alleelin taajuus pienempi kuin 1% tai ei ole aiemmin raportoitu dbSNP tai 1000 Genomes Project (kuva 2). Koska indeleitä (pienet lisäykset ja poistot) at homopolymeeriset sivustot ovat merkittävä lähde sekvensointivirheitä on 454 alustan emme välittäneet tämäntyyppisen muutoksen analyysien.

(A) Kaaviokuva bioinformatiikan SNV havaitsemiseen työnkulun. (B) uuttaminen toiminnallisesti asiaa somaattisten mutaatioiden MSI ja MSS kolorektaalisyövissä. Vaihtoehdot havaittiin GS Reference Mapper ennen niiden suodatetaan niiden lokalisointi, merkitsemällä dbSNP130 tai 1000genomes, somaattinen ja toiminnallisesti vajaatoiminta. Vuodesta dbSNP130 tai 1000genomes varianttien taajuuksilla yli 1% käytettiin. MSI CRC 359 vaihtoehtoja ja MSS CRC 45 kanssa ennustettu muutettu proteiinin toiminnot tunnistettiin.

somaattisten variantti havaitsemisstrategiaa suunniteltiin minimoimaan väärien positiivisten somaattisten variantti puhelut sijaan määrittää tsygoottisuus. Käytimme kaksivaiheista lähestymistapaa, jossa on kaksi eri sitovuusasteita havaita varianttien kasvain ja hyvänlaatuisia kudosten samanlainen Pleasance

et al.

[18]. Ensimmäisessä vaiheessa, kasvain variantit kutsuttiin alle tiukat kriteerit, jotka on määritelty verrattuna SNP genotyypityksen array tietoja. Toisessa vaiheessa selvitettävä kasvaimen variantti oli ituradan tai somaattiset. Pitääkseen vääriä negatiivisia kurssi hyvänlaatuinen kudoksessa alle 10%, asetamme kattavuutta cut-off 5-kertainen, jonka alapuolella ei havaintojen pohjalta siitä, onko muunnos oli somaattisen tai ituradan. Jos kattavuus cut-off oli täytetty, yksi luku osoittaa sama muunnos hyvän- ja kasvainkudoksen johti luokittelu variantin kuin ituradan.

Tätä strategiaa tunnistimme 915 somaattinen kuin synonyymi vaikuttavia mutaatioita 864 geenejä. Suurin osa somaattisista mutaatioista olivat missensemutaatioita (65%). Kuitenkin monet (7%) sijaitsevat transloimattomia alueita geenien ja voisi näin ollen johtaa muuttuneeseen ilmentymiseen tai lisääntynyt rappeutuminen mRNA. Lisäksi noin 0,5% näistä mutaatioista ovat osoitteessa liitoskohdat ja voisi vaikuttaa silmukointitapahtumista, jotka johtavat muuttuneeseen transcriptome rakenne. Lisäksi kolme somaattisten variantteja todettiin miRNA alueilla (taulukko S6). Nämä mutaatiot ovat erityisen kiinnostavia, koska miRNA ovat sekaantuneet master sääntelyviranomaisten kasvaimen homeostaasin. Analyysi tietyntyyppisten nukleiinihapon muunnelmia, mukaan lukien tunnetut ja tuntemattomat muunnokset, osoitti olennaisesti odotettua hinnat nukleotidin vaihdon, määritettynä laskutoimituksia dbSNP130 (kuva S4).

Funktionaalianalyysi mutaatioita varten MSI paksusuolen syöpä

Koska kaikki eivät 1,304 somaattisista mutaatioista ovat todennäköisesti patologisesti asiaan, pyrimme tunnistamaan ne, jotka todennäköisesti tuhoavat proteiinien toimintaa tai vaikuttavat erittäin säilyneitä aminohappoja ja saattaa siksi olla toiminnallisesti tärkeää. Käytimme Polyphen ja MutationTaster luokittelu työkaluja ennustaa toiminnallisia seurauksia aminohappo- muutoksia tai lukukehysmutaatioita ja totesi, että 359-geenit oli vähintään yksi mahdollisesti tuhoisia mutaatio (taulukko S1) [22], [23].

mahdollisesti tuhoisa somaattiset mutaatiot, 309 sijaitsi asemissa erittäin konservoituneita 44 eri lajia, kuten opossumi

(Monodelphis domestica) B, kanaa

(Gallus gallus) B ja nahkiainen

(Petromyzon marinus )

. Näistä 259 oli sijoitettu ilmentyvät geenit paksusuolessa, joista 47 oli korjaus, reseptori, tai kinaasi-geenit. Visualisointi valittujen mutaatioiden proteiinirakenteista osoittaa, että nämä nukleotidit ovat proteiinin pinnalla, aiheuttaa mahdollisesti häiritsi proteiini-proteiini vuorovaikutusten.

Catalog Somaattiset mutaatiot Cancer (COSMIC) tietokanta on kattava kokoelma syöpää liittyviä mutaatioita. Noin 39% meidän mutatoituja geenejä on jo kuvailtu tietokannassa, ja 13% löytyivät Wood

et al

[10]. Samoin nämä edelliset tietokannat, löysimme

BRAF

p.V600E mutaatio MSI tapauksessa ja tunnistimme

KRAS

ja

TP53

mutaatioita MSS kasvain.

BRAF

mutaatioita esiintyy noin 10%: CRC, pääasiassa MSI ja 30-35% kaikista potilaista, joilla satunnaista kolorektaalisyövissä kuljettaa somaattisten

KRAS

ja

TP53

mutaatioita. Nämä havainnot osoittavat edelleen herkkyys Luokituspalveluidemme strategiaa.

Mutaatiotutkimukset maiseman MSS paksusuolisyövän

MSS paksusuolisyövän tunnistimme 10622 pieni ydin- muunnelmia. Kun sama suodatuksen prosesseja MSI syövän käyttäen dbSNP tietokantaan ja tiedot 1000 Genomes Project 1288 variantit pysyivät joka oli joko alhainen esiintyvyys tai olivat tuntemattomia. Näistä 198 oli somaattisen ja 45 ennustettiin muuttaa geenin toiminnan perusta MutationTaster ja Polyphen laskelmat (kuvio 2B, taulukko S2) [22], [23]. Mitä tulee kopioida useita muunnelmia viisi 45 tunnistetut mutaatiot sijaitsevat monistetaan alueilla, ja odotetusti kukaan alueilla, joilla on deleetioita. Suhteet lukee viitaten sekvenssi mutatoitunut sekvenssi enintään suhdelukuja kopioluvun vakaita alueita, joka tukee SNV-kutsuvan algoritmilla.

Toisin kuin 1304 somaattisten mutaatioiden MSI kasvain löytyi 198 somaattiset mutaatiot MSS kasvain, joka osoittaa, että viallinen MMR järjestelmän MSI kasvaimia johtaa merkittävään kasvuun mutaationopeudet kolorektaalisyövässä.

Lisäksi tarkastellaan risteyksissä molempien syöpätyyppeihin löysimme BMPR1A, WDTC1 (WD ja tetratricopeptode toistaa 1 ) ja EHD3 (EH-domeenin, joka sisältää 3) mutatoitunut molemmissa kasvaimia. Valinta perustui toiminnallinen vajaatoiminta suurella todennäköisyydellä Polyphen ja MutationTaster [22], [23]. Kaikki mutaatiot sijaitsevat proteiinin pinnalla ja ovat erittäin konservoituneita. Koska löydettiin merkittäviä syöpään liittyvien reittien liitetään vain BMPR1A mutta ei WDTC1 tai EHD3, ja lisäksi ituradan mutaatioita BMPR1A on tunnettu riskitekijä juveniili polypoosi, päätimme BMPR1A ylimääräisiä funktionaalisia määrityksiä (kuvio 3, kuvio S5) . Käyttämällä toimittaja määrityksiä villin tyypin ja mutatoitunut BMPR1A proteiinit pystyimme osoittamaan, että mutatoitunut proteiinit voimakkaasti heikentynyt niiden signaaleina ja että stimulaation BMP2 johtaa alennettua suurin aktiivisuus (kuvio 3D).

(A ) Suhteellinen Venn kaavio. Fraktioita kutsutaan SNVs identtinen Genomit Projektitiedot ja dbSNP130. Vain tietoja, joiden vähäinen alleelin tiheyden tai keskimääräisen heterotsygotiamäärä tunnettiin ja alle 1% käytettiin vertailussa. (B) jakelu synonyymejä, missense, nonsense ja vaikuttavia mutaatioita alusta tai lopetuskodonin näkyvät suhteessa kaikkiin somaattisista mutaatioista. (C) BMPR1A mutaatioita p.W487R ja p.E502G sijaitsevat proteiinin kinaasidomeenia BMPR1A. Viite aminohapot vihreällä, mutatoitunut muodot näkyvät punaisella. Net rakenne vasemmassa alempi puoli osoittaa ATP sitova alue. (D) BMPR1A mutaatioiden määrä aleni signalointi acitivity. Aktiivisuus paino- mBMPR1A, mBMPR1A E502G ja mBMPR1A W487R määritettiin C2C12-soluissa käyttäen Smad-reagoiva Luciferase reportterigeenimäärityksessä. Indusoi Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu Renilla acitivty. Aktiivisuus transfektoimattomia soluja asetettiin 0%: iin ja aktiivisuus paino- mBmpr1a oli asetettu 100%. Merkittäviä eroja laskettiin kahden tailed t-testiä ja merkitään: * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.

MSI kolorektaalisyövissä satama jopa 8 kertainen enemmän koodaus somaattisia mutaatioita kuin MSS syöpien

analyyseihin tähän mennessä perustunut 454 koko exome sequencings yhden kolorektaalisyövän potilas jokaista Mikrosatelliittimarkkerien tila. Edelleen vahvistaa, että lisääntynyt määrä koodaus mutaatioiden MSI syöpiä voidaan yleistää ja ei johdu käytetyn teknologian ( ”array” rikastamiseen ja 454 sekvensointi) Sekvensoimme exomes neljän uuden peräsuolen syövät, kukin yhteensopivat normaaleissa kudoksissa. Tällä kertaa käytimme ’in liuoshybridisaatio ”kaappaamiseen DNA jälkeen kiinteään sekvensointi. Kun sama suodatusproseduurit kuin kuvattiin ensimmäisen kahden potilaan me taas määräytyy jopa 8-kertainen mutaatio hinnat MSI peräsuolen syöpään kuin MSS syöpiä (taulukko 3). Tässä suhteessa löysimme 532 ei-synonyymejä somaattisten SNVs erillisessä MSI CRC ja vain 65, 74 ja 76 kolmen MSS CRC tapausta. Siten erot mutaatio hinnat ovat toistettavissa ja riippumattomia sekvensointitekniikan käytetty.

Keskustelu

Käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi, Sekvensoimme exomes MSS ja MSI paksusuolen syöpäpotilaiden , jossa keskimääräinen coverages noin 20-kertaisesti. Käytimme kaksipuolisen luokitus algoritmi paljastaa toiminnallisesti asiaan mutaatioita. Tätä lähestymistapaa käyttäen osoitamme ensimmäistä kertaa, että joukko-capture NGS yksivaiheisen työnkulku on tehokas työkalu syvälle luonnehdinta kiinteiden kasvainten ja osoittavat, että MSI kasvainten kuljettaa kahdeksan kertaa enemmän toiminnallisia asiaa mutaatioita kuin MSS kasvaimet (kuvio 2) .

toiminnallinen vaikutus somaattisen vaihtelut ennustettiin käyttämällä kahta toiminnallista Ennustusalgoritmien, Polyphen ja MutationTaster, ja löysimme 359 somaattisten mutaatioiden MSI ja 45 MSS syöpä, jotka ovat erittäin todennäköisesti aiheuttavat toimintakyvyn heikentymisen [ ,,,0],22], [23]. Heterogeenisuus mutatoituja geenejä viittaa siihen, että ei ole tiettyä geeniä

sinänsä

mutta kyseinen polku on merkittävä rooli kasvainten kehittymiseen. Tässä suhteessa löydämme merkittävää rikastumista mutaatioita syöpään liittyvien reittien, kuten syövän, solujen kehitystä ja DNA-replikaatioon, rekombinaation ja korjauksen (taulukko S5). Mielenkiintoista, löydämme 50% merkittävimmistä rikastettu reittejä MSS syövän myös merkittävästi rikastettu väyliä MSI syöpä, mikä osoittaa, että vaikka MSI syöpien satama lisääntynyt määrä mutaatioita molempien syöpiä voisi kehittyä päällekkäisiä tautimekanismien.

Historiallisesti mikrosatelliittimarkkereita testaus kolorektaalisyövissä oli ensimmäinen ennakoivan testi tunnistaa taustalla mismatch korjaus (MMR) mutaatio. Koska yli 90% perinnöllinen ei-polypoosin peräsuolen syöpiä (HNPCC) osoittavat MSI, mikrosatelliittimerkki asema on tullut yleinen diagnostinen merkkiaine MMR. Lisäksi selviytymisen etuja ja terapeuttisia vaikutuksia on raportoitu potilailla, joilla on MSI kasvaimia [5], [24]. Käyttämällä ultradeep sekvensointi yhden konservoituneen alueen, UCR41, de Grassi ja kollegat osoittavat, että tällä alueella on suurempi mutaationopeudet HNPCC näytteissä kuin myös terveiden ja ehdottaa, että tämä voitaisiin käyttää herkkien molekyylien määritys perimän epävakaisuuden [24]. Olemme laajentaneet analyysien koko exomes ja löysi 8-kertaiseksi eroja määrä somaattisen mutaation MSI ja MSS kolorektaalisyövissä. Vertailun vuoksi tutkimuksessa Greenman

et al.

Joka raportoi sekvensointi 518 proteiinikinaasin geenien 210 ihmisen erilaisiin syöpiin löysi noin 25-kertainen mutaatio hinnan MMR-puutosta syöpiä [9]. Nämä ovat kuitenkin ekstrapoloinnit ja toisin kuin tutkimuksessamme ne sisältyvät kasvaimia eri alkuperää ja tutkittiin kaikki somaattiset mutaatiot riippumatta toiminnallisten merkitystä. Meidän sekvensointi lähestymistapa myös havainnut somaattisen

MLH3

mutaatio MSI kasvain, joka, vaikka

MLH3

mutaatiot eivät kuulu klassisen MMR mutaatioiden CRC, saattaisi edistää microsatellite epävakaus fenotyyppi [25]. Lisäksi yhdistelmä MSI ja

BRAF

mutaatio, havaittuna MSI kasvain kuvattu, on useimmiten löytynyt CpG-saarekkeen metylaation fenotyypin 1 (CIMP1) kasvaimia, jotka liittyvät

MLH1

promoottori metylaatioita [21], [26]. Promoottori metylaatio puolestaan ​​liittyy geenien mekanismeja, jotka on suggestiivinen selityksenä MSI tilan kasvaimia. Toisaalta, on ehdotettu, että kromosomi epävakaus (CIN) ja CIMP edustaa kaksi itsenäistä ja käänteisesti mekanismit epävakauden [27]. CIMP-negatiiviset tapaukset liittyvät p53 (71%) ja

KRAS

(33%) mutaatioita, mutta harvoin havaitaan

BRAF

(2%) mutaatioita. Koska löysimme suuri kopioluku muunnelmia sekä

KRAS

ja

TP53

mutaatioita MSS kasvaimen analysoitu tämä kasvain on todennäköisesti CIMP-negatiivinen [5], [24].

sekvensointi ja analyysi strategia olemme esittäneet voisi olla pohjana tuleville luokittelun työkalut kolorektaalisyövissä koska se voi sallia samanaikaisesti havaitsemisen lisääntynyt mutaation taajuus MSI kasvainten sekä havaitsemisen taustalla MMR vika. Lisäksi pystyimme havaitsemaan mutaatioita geenien usein liittyy tiettyjä alatyyppejä peräsuolen syöpien, kuten

BRAF, KRAS

ja

TP53

. Sisäpuolella etusijalle geenit, kattaa kaikki geenit, jotka kulkevat kaikki valintasuotimet,

BMPR1A

erottuu mutatoitunut molemmissa tapauksissa. Yleinen rakenne osoittaa, että mutatoitunut aminohapot ovat kaikki sijaitsevat C-terminaalinen solunsisäinen heliksin nipun proteiinikinaasidomeenin ja viittaa siihen, että proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tuhotaan [28]. Ituradan

BMPR1A

mutaatiot altistavat juveniili polypoosi; kuitenkin, meidän havainnot osoittavat, että myös somaattisia mutaatioita saattaa olla tärkeä rooli satunnaista peräsuolen syövän kehitystä [29], [30], [31], [32], [33].

Näiden lisäksi mutaatiot olemme myös löydetty useita mutatoitunut syöpälääkkeen tavoitteita tai geenejä, jotka liittyvät hoitotulokset, kuten

BRAF, KRAS, FGFR2

ja

mTOR

, mikä saattaa auttaa valitsemaan optimaalisen lääkkeen yhdistelmiä. Sinänsä samanlainen kohdennettuja uudelleenjärjestely-lähestymistavat ja bioinformatiikan suodatus strategiat saattavat tulla kultainen standardi räätälöityjä peräsuolen syövän hoitoon tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus on hyväksynyt eettinen komitea lääketieteellinen yliopisto Graz. Uusien näytteiden potilaat ovat kirjallisesti ilmoittaneet suostumuksensa. Vanhoilla näytettä (15-vuotias) no tietoon perustuvan suostumuksen ollut saatavilla, siis kaikki näytteet ja lääketieteellisten tietojen Tässä tutkimuksessa käytetyt ovat peruuttamattomasti nimettömiksi.

Case esitys ja kudosnäyte kokoelma

Potilas 1 oli korkealaatuinen (G3) adenokarsinooma proksimaaliseen paksusuolen, järjesti pT-3C, PN 0, pM-X, PR-0, mikrosatelliitti epävakaa (kuvio 1A). Lisäksi, tässä tapauksessa valittiin, koska sen kromosomaalisen vakautta määritetään genomin laajuinen seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) (kuvio 1 B). Potilas 2 oli korkea-asteen (G3) adenokarsinooma proksimaaliseen paksusuolen, järjesti pT-4B, PN 2, pM-X, Mikrosatelliittimarkkerien vakaa.

Ihmiskudoksen saadaan leikkauksen aikana oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä . Kryoleikkeet (3 pm paksu) valmistettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla arvioida kasvainsolun sisältöä. Dissections suoritettiin mikroskoopin saavuttaa kasvainsolun pitoisuus 80%. DNA eristäminen suoritettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), mukaan valmistajan ohjeiden.

Koko Exome DNA rikastus ja Genome Sequencer FLX sekvensointi

Perimän DNA Molempien kudosten alistettiin koko exome järjestyksessä kaapata käyttäen Roche /NimbleGen n 2.1M Human Exome Array. Tämä matriisi perustuu rakentaa 36,3 ihmisen genomin sekvenssissä, ja kaappaa koodausalueissa 16755 NCBI RefSeq geenien (noin 180000 koodaavat eksonit) sekä 493 miRNA alueilla. Tuumorin ja normaalin kudoksen DNA alistettiin koko exome sekvenssin syömällä mukaan valmistajan protokollaa. DNA leikattiin sumuttamalla hajottamatta koot alle 800bp, puhdistettu (Zymo Research) ja lopussa kiillotettu käyttäen T4-DNA-polymeraasia ja T4-polynukleotidikinaasia. Linker adapterit pSel3 (5 ’- CTCGAG AAT TCT GGA TCC TC – 3’) ja pSel4-P (5 ’- Phos /GAG GAT CCA GAA TTC TCG AGT T – 3’) ligoitiin ja koon valinta suoritettiin käyttäen AMPure DNA Purification helmet (Agencourt). Laatu oli ohjata Bioanalyzer järjestelmään. LM-PCR suoritettiin LMPCR3 alukkeita (5 ’- CUC GAG AAU UCU GGA UCC UC – 3’), ennen kuin kirjastoa käytettiin hybridisaatiota 42 ° C: ssa 72 tuntia. Taulukot pestiin kaksi kertaa 47,5 ° C: ssa, kaksi kertaa huoneenlämpötilassa ja kaksi kertaa 42 ° C: ssa pesu- puskurit, kuten suositellaan. Sitoutunut genominen DNA eluoitiin 125 mM NaOH: lla 10 min ajan huoneenlämpötilassa ja monistettiin LM-PCR: llä käyttäen alukkeita LMPCR3. Jää monistettiin näytteet altistettiin kvantitatiivinen PCR mitata suhteellinen rikastamiseen.

rikastettu Nimblegen DNA: ta käytettiin rakentamaan yksijuosteisen Genome Sequencer FLX (454 /Roche) kirjastot. Sen jälkeen kun emulsio PCR sekvensointialukkeita hybridisoitiin templaatti ja helmet inkuboitiin Bst DNA-polymeraasia, apyraasia, ja yksijuosteinen sitova proteiini. Pyrosekvensointi suoritettiin 70 x 75 mm picotiter levyn 13 erillisessä sekvensointi ajoja. Sen jälkeen oletus raaka tietojenkäsittelyn resequencing leikkaus suodatinta käytetään lisäämään datanannon. (Käytetyt parametrit: doValleyFilterTrimBack = false, vfBadFlowThreshold = 6, vfLastFlowToTest = 168, errorQscoreWindowTrim = 0,01).

sekvensointi suoritimme 13 Genome Sequencer FLX kulkee, joka tuotti yli 558 milj emäksiä ja 1.430.000 lukee ajoa kohti . Lukee rinnastettiin ihmisen viittaus genomin, NCBI rakentaa 36 (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg18/) käyttäen GS Reference Mapper Versio 2.0.0.12 (Roche). Paras ottelut genomissa käytettiin sijaintipaikaksi lukee useita tulitikut. Vain ainutlaatuinen lukee jonka pituus on vähintään 50 bp käytettiin lisäanalyysiä (ks ajaa tilastotiedot välilehti. 2).

havaitseminen varianttien suoritettiin GS Reference Mapper Versio 2.0.0.12 (Roche). Turhat lukee vähennettiin ennen variantti tehtävissä. Vain HCDiff (korkea luottamus erot) GS Mapper ohjelmistoa käytettiin perustana variantin havaitsemiseksi [20]. HCDiff tehtäviä olettaa ainakin kolme lukee kanssa variantti sekä myötä- lukee mukana; vaihtoehtoisesti laatupisteet muuttuvien asemissa on oltava yli 20 (tai yli 30, jos homopolymeeri viiden tai useamman emäksen on mukana). Ylimääräisinä laatukriteerit käytimme vain variantteja kattavuus 10 × laadukkaita lukee.

Koko Exome ”liuoksena” DNA rikastus ja vankka sekvensointi

rikastusta ja vankka kirjasto valmistelu tehtiin mukaan Agilent SureSelect Target rikastus protokolla Applied Biosystems vankka järjestelmä. Lyhyesti, koko genomista DNA leikattiin ja pää korjattu. Saat sovitin ligaatiot 30x ylittäviä sovittimia käytettiin. Koko valinnat 150-200 emäsparin DNA-fragmentit tehtiin seurasi nick-käännös ja monistusvaiheena Platinum polymeraasilla (Invitrogen) ja Pfu-polymeraasia (Fermentas). Sillä hybridivalikointi kirjastot säädettiin 500 ng 3,4 ul: n tilavuudessa ja lisätään SureSelect Block ratkaisuja. Hybridisaatiot suoritettiin 24 tunnin ajan 65 ° C: ssa, hybridit uutettiin 500 ng M-280 streptavidiini-Dynabeadseja (Invitrogen), ja lopuksi eluoitiin 50 ui eluointipuskuria. Monistamisen jälkeen Platinum polymeraasilla kirjastojen kvantitoitiin qPCR ja DNA: n konsentraatio suurennetaan kunnes saavutetaan osa 10-20% monoklonaalisia mallia helmiä emulsiossa PCR käyttäen yhteensä 0,7-biljoona helmiä. Peräkkäiset helmi rikastamiseen ja laskeuman 130 miljoonaa helmiä per vuosineljännes slide (quad) seurasi standardi 50 emäsparin fragmentti ajoja. Jokainen neljästä potilaan näytettä analysoitiin yhdellä quad.

Mapping suoritettiin Bioscope linjaus putki käyttäen siemen ulottuvat algoritmi epäsuhta rangaistus pisteet -2.0. Yhden nukleotidin variantit (SNV) kutsuttiin kanssa DiBayes algoritmin integroitu Bioscope pakkauksessa.

Yhden nukleotidin muunnos (SNV) havaitseminen

Tissue materiaalit genotyypattiin annetun Affymetrix 6,0 array mukaan valmistajan protokollaa. Array kannat laatupisteet (p-arvo) 0,1 käytettiin verrattuna sekvenointitulosten. Sekvensointitiedot kantoja käytettiin, jos niiden kattavuus ylitti 3-kertaisesti. Tämä syntyy 46000 ja 49000 asentoja kasvain ja hyvänlaatuisen kudoksen vastaavasti, jotka olivat oikeutettuja vertailua. Määrittämään vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia hinnat, asetamme array data vakiona ja erottaa välillä viite puhelun ja SNP puhelu riippuvuus array data.

havaitsemiseen somaattisen variantteja, on bimodaalinen strategia levitettiin kasvain variantteja kutsutaan alla tiukat kriteerit, kun taas variantit kontrollikudoksen kutsuttiin käyttämällä vähemmän tiukat kriteerit: äänikynnyksen lukee oli asetettu variantteja 15% kaikista lukee tietyssä asemassa kasvain. Vähemmän tiukkoja kriteereitä käytettiin vaativat kontrollikudoksen variantteja, joissa on vähintään yksi variantti lukea ja vähintään kattavuus cutoff 5. peittojen alle 30-kertainen yhden vaihtoehdon lukea hyväksyttiin.

Capillary Sequencing

Follow-up vahvistus tunnistettu SNVs suoritettiin ABI 3730 (Applied Biosystems) kapillaarisen sekvensointi väline tavanomaisten menettelyjen mukaan.

määritys Kopioi numero variaatioita

valmistaminen yhden luku- kirjastojen ja sekvensointi suoritettiin käyttäen Solexa sekvensointialustamme (GenomeAnalyzer Mx, Illumina) seuraten valmistajan ohjeita. Kuva-analyysi ja pohja calling suoritettiin käyttäen Kirjopääsirkku 1.9.5_14 ja Bustard 1.9.5_14 ja lukee linjattu Ihmisen genomin (NCBI36) käyttäen Bowtie 0.9.7.1 [34]. Kopioi numero analyysi tehtiin R käyttäen DNAcopy paketti [35]. Lyhyesti, DNA lukea taajuudet määritettiin jäteastioita 50 Kb. Log2 taajuus suhde vastaavan jäteastioita laskettiin kasvaimen ja normaalissa kudoksessa. Mediaani suhteilla keskitetty nollaan kokeilu viisasta. Log suhdelukuja tasoitetaan DNAcopy käyttämällä oletusarvoja ja kopioluvun vaihtelu havaittiin DNAcopy käyttämällä kynnystä kahden keskihajonnan.

genotyypitys on Affymetrix 6,0 array suoritettiin valmistajan protokollan. Alueet kopioluvun voitto ja tappio määritettiin pariksi ja analyysi käyttäen Hidden Markov Model (HMM) Partek Genomics Suite -ohjelmisto (Partek Inc, St.Louis, MO) kanssa oletusparametriasetuksilla. Sillä pariksi analyysi, kopiomäärä arvot muodostetaan vertaamalla kasvain ja hyvänlaatuinen kudosta profiileja samasta potilaasta.

Bioinformatics työnkulun

Kunkin kudoksen, vaihtelut olivat selityksin käyttämällä geeniä mallien tuottamat Ensembl ( Ensembl 54.36, www.ensembl.org). Kaikki muutokset kartoitettiin kaikille transkriptio malleihin, mikä johti useiden merkinnät usean loci. Esimerkiksi, muunnos voi johtaa aminohapon muutos yhdessä transkripti ja näkyvät UTR toiseen.