Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka on säädellään ylöspäin keuhkosyöpä, liittyy aktivointi mitogeenisesta signaaleja ja laukaisee useita signalointikaskadien. Leikellä nämä EGFR cascades, käytimme 14 eri fosfo-EGFR-vasta-aineita määrällisesti proteiinifosforylaation käyttämällä

in situ

läheisyydessä ligaatiomääritys (

in situ

PLA). Fosforylaatio EGFR-Thr654 ja -Ser1046 oli EGF-riippuvaista villityypin (WT) reseptori mutta EGF-riippumaton solulinja, joka kantaa EGFR-L858R-mutaation. Käyttäen ProtoAarray ™, joka sisältää ~5000 rekombinanttiproteiinien proteiinin siru, olemme huomanneet, että AURKA vuorovaikutuksessa EGFR-L861Q mutantti. Lisäksi yli-ilmentyminen EGFR voi muodostaa kompleksin AURKA, ja inhibiittorit AURKA ja EGFR laski EGFR-Thr654 ja -Ser1046 fosforylaatio. Immunohistokemiallinen värjäys vaiheen I keuhkoadenokarsinooma kudoksia osoitti positiivinen korrelaatio AURKA ilmaisun ja fosforylaatio EGFR at Thr654 ja Ser1046 in

EGFR

-mutant yksilöitä, mutta ei

EGFR

WT yksilöitä. Vuorovaikutus EGFR ja AURKA tarjoaa selityksen eron EGR välinen riippuvuus

EGFR

WT ja

EGFR

-mutant soluja ja voi tarjota uusia terapeuttisia strategia keuhkosyöpäpotilaita kuljettavat

EGFR

mutaatioita.

Citation: Chen TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou TY, Wu YC, et al. (2013) Protein fosforylaatiomääritys Profilointi käyttäminen

In situ

Läheisyys ligaatiomääritys: n fosforylaatio AURKA-esiin EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 in Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10,1371 /journal.pone.0055657

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 elokuu 2012; Hyväksytty: 03 tammikuu 2013; Julkaistu: 08 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Science neuvosto (NSC101-2325-B-010-011 ja NSC101-2627-B-010-001), huippuyksikön for Cancer Research Taipei Veterans General Hospital (DOH101-TD-C- 111-007), ja opetusministeriö, Aim Top yliopiston Plan (National Yang Ming University) ja CYH. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti, ja viiden vuoden suhteellinen pysyvyys keuhkosyöpäpotilaiden on alle 15% [1]. On olemassa kahta päätyyppiä keuhkosyövässä: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC, noin 20% keuhkosyövässä) ja ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLC, noin 80% keuhkosyövässä) [2], [3]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), joka on reseptorityrosiinikinaasia (RTK), käynnistää useita signalointireittien liittyvät syövän etenemisessä, kuten osallistuvien solujen proliferaatiota, migraatiota /invaasion ja solusyklin [4] – [7]. Yliekspressio EGFR on havaittu noin 50%: NSCLCs ja liittyy myös huonon ennusteen ja aggressiivinen taudinkulku [8], [9].

EGFR

mutaatiot ovat usein havaitaan pienisoluista keuhkosyöpää (10-40%) [10], [11]. Noin 50%

EGFR

mutaatioita koostuvat poistot eksonissa 19, kun taas 35-45% koostuu L858R mutaation ja 5% koostuu lisäyksiä eksonin 20 tai L861Q mutaatio [10] – [12]. Gefitinibi (IRESSA) ja Erlotinibi (Tarceva) ovat EGFR: n estäjien, joita käytetään kliinisesti hoidettaessa edennyttä NSCLC, ensisijaisesti, että

EGFR

mutaatioita tyrosiinikinaasin domeenit [13] – [16].

EGFR aktivoidaan sitovat sen samaa alkuperää ligandien, kuten EGF: n ja TGFa. Ligandin sitoutumisen villityypin (WT) EGFR johtaa reseptorin dimeroinnin ja aktivointi luontaiset kinaasidomeenin, jota seuraa fosforylaatiota erityisten tyrosiini- tähteiden sytoplasminen häntä [17] – [19]. Dysregulaatio EGFR-aktivoituvien reittien voi johtua mutaatioista, jotka aiheuttavat ligandista riippumatonta reseptorin dimerisaatio, aktivointi ja alavirtaan signalointi [16], [20]. Kun EGF stimulaatio, EGFR tyrosiinifosforylaatio on ”varhainen tapahtuma”, kun taas EGFR seriini /treoniinifosforylaatio, esim. Ser967, tapahtuu aikaviiveellä [21], [22]. Fosforylaatio EGFR monissa tyrosiini sivustoja, kun ligandin stimulaation aloittaa alavirran signalointikaskadien, ja fosforylaatio EGFR on seriini /treoniini on raportoitu vaimentaa näitä signaaleja negatiivista palautetta [23] – [25]. Monet seriini ja treoniinifosforylaatio sivustot ovat läsnä EGFR, mutta niiden toiminta on edelleen epäselvä. Lisäksi signalointi tulos aiheuttama fosforylaatiota eri kohtaan EGFR on monimutkainen ja on vielä selvittämättä kehittämiseen terapeuttisia sovellutuksia.

AURKA proteiinikinaasi on herättänyt huomiota, koska sen yli-ilmentyminen on havaittu useissa epiteeli- pahanlaatuisia kasvaimia [26], [27], kuten rinta- [28], paksusuolen [29], munasarjasyöpä [30] ja keuhkojen syövät [31], seurauksena geenin monistamisen, transkription purkamista tai vikoja proteiinin stabiiliuden ja ohjausyksikön kinaasiaktiivisuuden [32]. Häiriöstä AURKA ja EGFR havaitaan eri syöpätyyppien ja on tärkeä indikaattori ennusteen syövän kehittymisen [33]. Aikaisempi tutkimus osoitti, että EGF-indusoitu rekrytointi ydin- EGFR ja Stat5: n että AURKA promoottori entisestään AURKA geeniekspression [34]. Lisäksi EGFR lisää proteiinin ilmentymistä AURKA aktivoimalla translaatiokoneistolla kautta ERK- ja AKT-reitit [35]. Nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että nämä kaksi proteiinia toiminnallisesti liittyvät.

Äskettäin

in situ

läheisyydessä ligaatiomääritys (

in situ

PLA) kehitettiin havaitsemiseksi ja visualisoida endogeenisen PPI-lääkkeitä ja translaation jälkeiset modifikaatiot proteiinien, esim fosforylaatio, joilla on korkea herkkyys ja spesifisyys [36], [37]. Havaitsemiseksi proteiinin fosforylaation, dual tavoitteet primaarisen vasta-aineen paria [yksi, joka tunnistaa kohde-proteiinin (esim. EGFR) ja toinen, joka tunnistaa fosfo-sivuston kohde (esim. PEGFR-Tyr1068)] on valittu. Jos ohjelman tavoitteet vasta-pari ovat lähellä, sekundaarinen vasta konjugoitu oligonukleotidien on riittävän lähellä palvelemaan templaatteina ligaatio kaksi lineaarista oligonukleotidien DNA ympyrä. DNA ympyrä voidaan monistaa oligonukleotidin yhden sekundäärisiä vasta-aineita käyttäen rengasreplikoitumismekanismin monistusta (RCA). RCA Tuote voidaan sitten hybridisoida fluoresenssileimattua oligonukleotidit tuottaa pisteen signaalin, joka ilmaisee, solunsisäisen sijainnin ja taajuus fosforylaation [36], [37]. Tämä tekniikka on korkea spesifisyys ja herkkyys arvioinnin proteiinin fosforylaation ja antaa uusia mahdollisuuksia tarkasti määrällisesti proteiinifosforylaation ja signaalitransduktion soluissa.

Tässä käytimme 14 eri EGFR fosforylaatiota-sivustoihin kohdistettuja vasta-aineita, joissa

in situ

PLA selvittämään eroja EGFR-WT ja EGFR-L858R mutantti keuhkojen syöpäsoluja. Erityisen kiinnostava on tunnistaa kaksi EGF-riippumatonta fosforylaatiokohdat (EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046) in kantavien solujen EGFR-L858R-mutaation. Lisäksi sekä EGFR-WT ja EGFR-L858R mutantti osoitti fyysinen vuorovaikutus AURKA alle EGF stimulaatiota. EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 fosforylaation väheni, kun soveltamisesta AURKA estäjä, mutta vain EGFR-L858R mutantti solulinjat, joka nosti esiin mahdollisuuden, että terapeuttisen soveltamisen AURKA inhibiittoreiden keuhkosyöpäpotilaiden.

Tulokset

profilointi EGFR fosforylaatiota keuhkojen syöpäsoluja

EGFR fosforylaatiota avainasemassa moduloivan aktivointi signalointipolkujen liittyvän syövän etenemisessä [4] – [7]. On olemassa lukuisia EGFR fosforylaatiokohdat (https://www.phosphosite.org) [38], ja monet niistä ei ole tutkittu laajasti (kuvio 1), koska vasta-aineiden puute ja havaitsemismenetelmiä. Esillä olevassa tutkimuksessa 14 fosforyloitu EGFR-vasta-aineita käytettiin

in situ

PLA määrittää pohjapinta taso EGFR signaloinnin HeLa-soluissa, joka on yhteinen solulinja seulomiseksi (taulukko 1). Kaikki vasta negatiivisen

in situ

PLA määrityksessä HeLa-soluissa, joka on yhdenmukainen sen ajatuksen kanssa, että EGFR aktivoituu kun sitoutuminen sen ligandin ja laukaisee alavirtaan efektorien läpi reseptorin dimerisaation ja fosforylaatiota erityisiä tyrosiinin tähteet sytoplasminen häntä [17] – [19]. Vahvista herkkyyden ja spesifisyyden

in situ

PLA, me sitten käytetään A431-solut, jotka ovat tunnettuja ilmaista korkeita EGFR ja hyper-fosforyloitiin EGFR-Tyr1068 alle EGF stimulaatiota. (Kuvio 2, edustava BlobFinder overlay kuvia näytettiin kuviossa S1). Näin ollen A431-solut valittiin positiivisena kontrollina. PEGFR-Tyr1068 oli voimistuvan noin 15-kertainen, kun EGF stimulaation määritetty

in situ

PLA määrityksessä (kuvio 2A ja 2B), kun taas se oli vain voimistuvan 2,6-kertaisesti määritettynä immunoblottauksella ( Kuva 2C), joka osoittaa korkea herkkyys

in situ

PLA määrityksessä.

EGFR fosforylaatiokohdan tiedot on saatu PubMed ja PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org) .

A431-soluja pidettiin seerumin puutteessa 16 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin EGF: ää (10 ng /ml) seerumittomassa väliaineessa 10 minuutin ajan. (A)

In situ

PLA on erittäin herkkä havaitsemiseksi fosforylaation pEGFR-Tyr1068 jälkeen EGF stimulaation. (B) Kun määritellään näiden kahden signaalin on esitetty. (C) EGFR ja pEGFR-Tyr1068 havaittiin A431-soluissa immunoblottauksella analyysi.

Differential ilmentyminen EGFR fosforylaation jälkeen EGF stimulaation välillä EGFR-WT ja EGFR-mutanttien solujen

EGFR aktivointi käynnistää useita signalointireittien, ja dysregulaatio EGFR-aktivoituvien reittien voi olla seurausta eri

EGFR

mutaatio [39]. Voit selvittää ero fosforylaatiota tilan EGFR fosforylaatiopaikkaa, havaitsimme EGFR fosforylaatiota eri paikoissa H1299 keuhkosyövän soluja, jotka pysyvästi ilmensivät tyhjän vektorin, EGFR-WT tai EGFR-L858R mutantti tai ilman ligandia stimulaatiota. In H1299-EGFR-WT vakaa soluja, 9 14 EGFR fosforylaatiopaikat fosforyloitiin kun EGF stimulaatiota. Loput pEGFR vasta pystynyt osoittamaan signaali immunoblottauksella. Sen sijaan, että EGFR-L858R mutanttisoluja, EGF-indusoitu (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 ja EGFR-Tyr1148) ja EGF-riippumaton fosforylaatiota (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, ja EGFR-Tyr1101) havaittiin (kuvio 3A-3C). Verrattaessa tuloksia

in situ

PLA ja Immunoblottausta kaltaiset fosforylaatio kuvioita havaittiin kaikkien seulotaan fosforylaatiopaikat (taulukko S1 ja kuvio S2). Fosforylaatio kuviot 14 eri EGFR fosforylaatiokohdat määritettynä

in situ

PLA ja immunoblottaus on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

H1299-solut ekspressoivat stabiilisti tyhjän vektorin, EGFR-WT tai mutantti-EGFR -L858R. (A) stimulaation jälkeen EGF: n (10 ng /ml) seerumittomassa väliaineessa 10 minuutin ajan, solu-uutteita alistettiin immunoblottauksella analyysin osoitettua fosfo-tyrosiini-vasta-aineita. EGF-riippuvaisen (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 ja -Tyr1068) ja EGF-riippumaton [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 ja -Tyr1101, -Thr654 (katso alla) ja -Ser1046 (katso alla)] fosforylaatio havaittiin H1299-solut ilmentävät EGFR-L858R mutantti. Fosforylaatio EGFR-Thr654 (B) ja -Ser1046 (C) kanssa tai ilman EGF hoitoa eri keuhkosyövän solulinjat seurattiin

in situ

PLA. Kvantifiointi

in situ

PLA näkyy oikealla. EGFR-Thr654 ja -Ser1046 fosforyloitiin kun EGF hoidon H1299-EGFR-WT-solut, kun taas niiden fosforylaatio oli EGF-itsenäinen H1299-EGFR-L858R soluissa. (D) Immunoblottaus analyysi EGFR-Thr654 ja -Ser1046 suoritettiin EGFR mutanttisoluja (H1975, joka sisältää EGFR-L858R ja -T790M mutantit) ja solut, jotka ekspressoivat EGFR-WT: llä (A549). Fosforylaation EGFR-Tyr1068 indusoitiin EGF. Fosforylaation EGFR-Thr654 ja -Ser1046 oli EGF-riippumattomia H1975 ja H1299-EGFR-L858R soluissa määritettynä immunoblottauksella.

Phospho-EGFR-Thr654 ja fosfo-EGFR-Ser1046 näytteille EGF- riippumaton fosforylaatio H1299-EGFR-L858R mutanttisolut

H1299-EGFR-L858R solulinja, fosforylaatio EGFR-Thr654 (kuvio 3B) ja EGFR-Ser1046 (kuvio 3C) tunnistettiin EGF-riippumattomia fosforylaatiota

in situ

PLA ja western blot analyysit (edustaja BlobFinder overlay kuvia näytettiin kuviossa S3 ja kuva S4). Nämä kaksi fosforylaatiopaikat näytteillä EGF-riippuvaisen fosforylaation H1299 soluissa, jotka ilmentävät EGFR-WT. Lisäksi pEGFR-Thr654 ja pEGFR-Ser1046, joka katsottiin fosforyloituu muiden kinaasien [40] – [42] mutta ei EGFR automaattista fosforylaatio, valittiin tarkistaa toiminnalliset vaikutukset EGFR signalointireitin.

lisäksi arvioitava, ovatko EGF-riippumaton fosforylaatio EGFR-Thr654 ja -Ser1046 tapahtuu vain soluissa yliekspressioon EGFR-L858R ja johtuu häiriöstä EGFR signalointireitin. Käytimme A549 (keuhkosyöpä solut endogeenisen EGFR-WT) ja H1975 (keuhkosyöpä solut endogeenisen mutatoidun EGFR-L858R-T790M) valvomaan niitä. Kuvio 3D osoittaa, että fosforylaatio EGFR-Thr654 ja -Ser1046 oli EGF-riippumaton soluissa, jotka ilmentävät eksogeenisiä ja endogeenisen EGFR-L858R. Siten eri EGFR seriini /treoniinifosforylaatio kuvioita havaittiin kuin EGF-riippumaton fosforylaatiota EGFR-L858R mutanttisoluista.

fyysinen vuorovaikutus AURKA ja EGFR

AURKA on kinaasi, joka ilmentyy voimakkaasti mitoosissa ja on liitetty soluun muutosprosesseja [43]. Haussa lisää substraattien ja vuorovaikutuksessa proteiineja käyttäen ProtoAarray ™ [44], joka sisälsi ~5000 yhdistelmä-DNA-proteiinien proteiini-siru (www.invitrogen.com/protoarray), olemme havainneet, että AURKA vuorovaikutuksessa EGFR-L861Q mutantti, joka käsittää -5% on

EGFR

mutaatioita keuhkosyöpäpotilaita [10], mutta ei EGFR-WT (kuvio 4A). Vahvistaa tämän vuorovaikutuksen, joita voidaan säädellä kinaasiaktiivisuuden AURKA, AURKA-WT ja AURKA-KD (AURKA-K162I mutantti, joka on kinaasi-kuollut), käytettiin samanaikainen immunosaostus, joka osoitti, että EGFR-WT ja EGFR-L858R vuorovaikutuksessa AURKA-WT ja AURKA-KD alla yli-ilmentyminen EGFR ja AURKA (kuvio 4B). Tulokset osoittivat, että katalyyttinen aktiivisuus AURKA ei moduloida vuorovaikutusta EGFR. Koska EGFR-L858R mutantti usein (noin 35-45%) tulee pienisoluista keuhkosyöpää [12], päätimme H1299-EGFR-L858R vakaa solujen edelleen luonnehtia vuorovaikutus AURKA. Tutkia, onko endogeeninen EGFR-AURKA vuorovaikutuksia esiintyy keuhkosyövän solujen ja onko se EGF riippuvainen, haimme

in situ

PLA määrittää EGFR-AURKA vuorovaikutuksen A549 ja H1975 kanssa tai ilman EGF stimulaatio (kuva 4C). Se osoitti sekä EGFR-WT ja EGFR-L858R vuorovaikutuksessa AURKA alle EGF stimulaatiota.

(A) Käytimme ProtoArray ™ tunnistaa EGFR uutena vuorovaikutus kumppani AURKA. Lyhyesti ilmaistuna, rekombinantti his-merkitty ihmisen AURKA koettimena on ProtoArray ™ ihmisen proteiini microarray seitsemän pitoisuuksilla (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 ja 100 ng /ul), kahtena kappaleena. On huomattava, että EGFR-L861Q, mutta ei EGFR-WT, tunnistettiin aluksi vuorovaikutuksessa AURKA. (B) HEK293T- oli kotransfektoitiin Myc-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R ja -L861Q mutantit) ja Flag-AURKA [AURKA-WT ja AURKA-kinaasi kuollut (KD)]. Transfektion jälkeen 48 tuntia, solu- uutteet altistettiin samanaikainen immunosaostus anti-FLAG M2 affmiteettigeeliin. Proteiinin ekspressio määritettiin immunoblottauksella anti-Myc ja anti-FLAG-vasta-aineita. Se osoitti, että sekä EGFR-WT ja mutatoitunut EGFR kumppaniaan AURKA-WT ja AURKA-KD. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin ainakin kolmen erillisen kokeen. (C) EGFR-AURKA vuorovaikutuksen kanssa tai ilman EGF stimulaatiota (10 ng /ml 10 minuutin ajan) määritettiin kautta

in situ

PLA A549 (EGFR-WT) ja H1975 (EGFR-L858R-T790M mutaatioita ). Sekä EGFR-WT ja -L858R mutantti liittyi AURKA alle EGF stimulaatiota. Kvantifiointi

in situ

PLA signaaleja näytettiin oikealla. (D) fosforylaatiokohdat EGFR-Thr654 ja -Ser1046 sovitettu alustan konsensussekvenssejä AURKA. (E) H1975 soluista osoitti selvempää fosforylaatio EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 ja AURKA-Thr288 in nokodatsoli pidätettiin M-vaihe kuin interfaasivaiheessa.

EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 ottelun AURKA fosforylaatio konsensussekvenssit

Koska AURKA liittyy EGFR, tutkimme seuraavaksi AURKA fosforyloi EGFR klo Thr654 ja Ser1046. Viereiset sekvenssit EGFR fosforylaatiopaikat kohdissa Thr654 ja Ser1046 ovat RHIVRKRT

654LRRLLQE ja DSFLQRYS

1046SDPTGAL, vastaavasti. AURKA fosforylaatio motiiveja sisältävät R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T ja R-X-X-S /T (X tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa) [45]. Perustuen nämä motiivit, EGFR-Thr654 vastasivat R-X-X-S /T-konsensussekvenssin ja EGFR-Ser1046 vastasivat R-X-S /T konsensussekvenssi AURKA (kuvio 4D). Vaikka EGFR-Thr654 oli kuitenkin fosforyloituu proteiinikinaasi C (PKC) [42], PKC ei voi olla ainoa kinaasi, joka fosforyloi EGFR tämä jäännös. Koska kinaasiaktiivisuutta AURKA kasvaa M-vaiheessa [46], ensin tunnettu fosforylaation endogeenisen EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 M-vaiheeseen A549 ja H1975-soluissa. H1975-solujen osoitti selvempää fosforylaatio EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 ja AURKA-Thr288 kuin A549-solut. Sen sijaan, EGFR-Tyr1068 osoitti samanlaista fosforylaatiota kuvio M-vaiheen ja välifaasi (kuvio 4E), mikä viittaa siihen, että ilmaisu kuviot fosforyloidun EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 olivat sama kuin AURKA erityisesti EGFR-mutanttien solujen .

EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 fosforylaatio tapahtuu viimeistään EGFR-Tyr1068 fosforylaation jälkeen EGF stimulaation

fosforylaatio EGFR-Tyr1068 jälkeen EGF stimulaation havaittu 0, 2, 5, 10 ja 30 minuuttia H1299 soluissa, jotka ilmentävät EGFR-WT oli nopeampi kuin fosforylaatioon Thr654 ja Ser1046. Fosforylaation EGFR-Tyr1068 oli korkeimmillaan 2 minuutin kuluttua EGF stimulaation, mutta EGFR fosforylaatiota klo Thr654 ja Ser1046 saavutti 10 minuutin kuluttua EGF stimulaation (kuvio 5A). Sen sijaan, EGFR-L858R soluja, ei ollut eroa fosforylaation kinetiikkaan välillä Thr654 ja Ser1046 (kuvio S5). Siten EGFR tyrosiinifosforylaatio tapahtuu ennen muita seriini /treoniinifosforylaatio at Thr654 ja Ser1046, joka koostui edellisen tutkimuksen EGFR seriini /treoniinifosforylaatio aikaviiveellä [21], [22].

(A) fosforylaatio EGFR-Tyr1068 oli nopeampi kuin EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 alle EGF: ää (10 ng /ml) stimulaatio. (B) Soluja pidettiin seerumin puutteessa läsnä ollessa VE-465 (1 nM tai 100 nM), joka on AURKA estäjä, 16 tuntia ja sitten käsiteltiin EGF: ää (10 ng /ml) 10 minuutin ajan. Fosforylaatio EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046, mutta ei pEGFR-Tyr1068, vaimeni VE-465. (C) solut pidettiin seerumin puutteessa läsnä IRESSA (10 uM) 16 tunnin ajan ja sitten se käsiteltiin EGF: ää (10 ng /ml) 10 minuutin ajan. IRESSA, joka on EGFR-inhibiittoria, käytettiin seuraamaan EGFR signalointi H1299-soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti EGFR-WT ja EGFR-L858R mutantti. Fosforylointireaktio by AURKA klo Thr288 tukahdutettiin IRESSA molemmissa solulinjoissa. (D) H1975-soluja käsiteltiin VE-465 ja /tai IRESSA (10 uM) 16 tunnin ajan. VE-465 ja IRESSA voi estää pEGFR-Thr654 ja -Ser1046 vuonna H1975.

AURKA estäjä estää EGFR seriini /treoniinifosforylaatio

Tutkiakseen suhdetta EGFR seriini /treoniinifosforylaatio ja AURKA, joka on AURKA estäjä (VE-465), joka estää AURKA aktiivisuus mitattuna Thr288 fosforylaatio [47], mutta ei proteiinin taso AURKA, levitettiin seurata fosforylaation EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 sekä EGFR signalointireitin (Pakt-Ser473). Under VE-465 käsittely, fosforylaatio EGFR-Thr654 ja -Ser1046 vähentynyt, mutta EGFR-Tyr1068 fosforylaatio ei vaikuttanut (kuvio 5B), mikä viittaa siihen, että fosforylaatio EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 säädeltiin AURKA kinaasiaktiivisuutta.

IRESSA on EGFR estäjä, joka vaimentaa AKT reitin ja estää AURKA fosforylaation

arvioimiseksi sääntelyn EGFR ja AURKA että EGFR-signalointireitin, EGFR-estäjä (IRESSA) käytettiin estämään EGFR autofosforylaation ja sen alavirran signalointia. IRESSA tukahdutetaan AURKA toimintaa ja fosforylaatio EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 (kuvio 5C), joka viittaa siihen, että AURKA voi toimia alavirran kohde EGFR. Sen lisäksi, että EGFR-yli-ilmennetään soluissa, olemme myös osoitti fosforylaation tilan EGFR-Thr654 ja -Ser1046 endogeenisen L858R mutanttisoluja (H1975) alle hoitoon VE-465 ja IRESSA (kuvio 5D). Aleneminen pEGFR-Thr654 ja -Ser1046 havaittiin H1975 kanssa VE-465 käsittelyä. Vaikka IRESSA esti pEGFR-Thr654 ja -Ser1046 on H1975, yhdistelmä IRESSA ja VE-465 voi edelleen vähentää pEGFR-Thr654 ja -Ser1046 in H1975, mikä merkitsee, että nämä kaksi pEGFR sivustoja oli säätelevät sekä EGFR ja AURKA kinaasiaktiivisuutta.

IHC analyysi AURKA, pEGFR-Thr654 ja pEGFR-Ser1046 I vaiheessa keuhkoadenokarsinooma

edelleen arvioimista suhdetta AURKA ja EGFR fosforylaatiota, 25 vaiheen I keuhkoadenokarsinooma näytteet altistettiin IHC värjäys pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 ja AURKA (kuvio 6). Kahdeksantoista näistä NSCLC näytteillä oli

EGFR

mutaatiot määritettynä sekvenssianalyysi

EGFR

tyrosiinikinaasin verkkotunnuksia. Ekspression pEGFR-Ser1046 ja AURKA oli merkitsevästi suurempi kasvaimia kuin viereisen normaalin kudoksen (p = 0,001), 25 pienisoluista keuhkosyöpää (taulukko 2). Lisäksi ilmaus AURKA osoitti positiivinen korrelaatio, jolla on merkittävä korrelaatiokerroin kanssa pEGFR-Thr654 (p 0,05) ja pEGFR-Ser1046 (p 0,001) potilailla, joilla on

EGFR

mutantti, mutta ei

EGFR

WT, kuten analysoitiin Spearmanin epäparametrinen korrelaatio koe (taulukko 3). Yhteenvetona tämä immunokemiallinen värjäystä antaa näyttöä välistä mahdollista yhteyttä AURKA ja mutatoitunut EGFR via -Thr654 ja -Ser1046.

Jokainen sarake kertoo potilaan ja kukin rivi osoittaa vasta-aineen. IHC intensiteetti potilaat määriteltiin 0, 1 ja 2 AURKA, pEGFR-Thr654 ja pEGFR-Ser1046 värjäystä.

Yhteenvetona vuorovaikutus AURKA ja EGFR-L858R mutantti voi selittää eron signalointipolkujen välillä

EGFR

WT ja mutanttien solujen, joita havaitaan usein pienisoluista keuhkosyöpää, ja voivat siten tarjota arvokasta tietoa terapeuttisia sovellutuksia.

keskustelu

dysregulation EGFR aktivoituvien reittien liittyy usein reseptorin mutaatioiden ja ennustaa vastaus tyrosiinikinaasiestäjiksi NSCLC potilailla [48], [49]. Profiilia EGFR fosforylaation

EGFR

mutantti keuhkosyövän soluja jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa olemme (1) analysoidaan systemaattisesti endogeenisten EGFR fosforylaatiota muutoksia tunnistaa erillisiä EGF riippuvuutta eri

EGFR

genotyyppien keuhkosyöpäsoluissa; (2) esitetty uusi suhde AURKA ja EGFR, joka saattaa välittyä kautta AURKA-aikaansaama fosforylaatio tapahtuman EGFR-Thr654 ja -Ser1046 keuhko- syöpäsoluja; ja (3) määritellään ilmaus AURKA, EGFR-Thr654 ja EGFR-Ser1046 keuhkojen adenokarsinooman kudoksissa. Nämä tiedot korostavat tarvetta tarkempaa analysointia varten suhdetta EGFR ja AURKA in

EGFR

-mutant potilaille ja antaa uutta tietoa terapeuttista soveltamista AURKA estäjien keuhkosyöpäpotilaiden.

EGFR- Thr654 tiedetään fosforyloituu PKC ja osallistuu negatiiviseen säätelyyn EGFR signaloinnin jälkeen EGF stimulaation [50], [51]. Lisäksi, fosforylaatio EGFR tähteessä Thr654 on raportoitu liittyvän säteilyn aiheuttamien ydin- EGFR translokaation, joka edistää solujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden lisäämällä transkription sykliini D1, iNOS ja B-Myb [52] – [54]. Kun solu altistetaan ionisoivalle säteilylle, DNA-riippuvaisen kinaasin (DNA-PK) on vuorovaikutuksessa ydin- EGFR ja korjaukset ei-homologisen end-liittymällä DNA-double katkeaminen, joka aiheuttaa radioresistance sädehoidossa. Esillä olevassa tutkimuksessa, EGFR-Thr654 oli konstitutiivisesti fosforyloitu EGFR-L858R mutanttisoluista. Olisi kiinnostavaa tutkia, onko EGFR-Thr654 fosforylaatio vaikuttaa radioresistance aikana sädehoidon EGFR-L858R mutanttisoluista. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että AURKA estäjä vähensi fosforylaatio EGFR-Thr654, joka voisi tarjota mahdollisia avenue uusi kliininen strategian kanssa AURKA estäjä.

Cellular stressitekijöitä, kuten TNF-α ja UV , on raportoitu aiheuttavan fosforylaation EGFR-Ser1046 kautta p38 MAPK ja sitten aiheuttaa EGFR siedätyshoito kun EGF stimulaation ja endosytoosin [55], [56]. Ligandin indusoiman EGFR aktivointi, useita tyrosiiniryhmää, esim. Tyr-1045 ja Tyr-1068, ovat pääasiassa fosforyloitu. Grb2 sitoutuu sitten fosforyloituu tyrosiinin aktivoida MAPK. Tämän jälkeen MAPK fosfory- seriini /tähteiden, kuten Ser-1046, on EGFR kuin palautteen ohjaus. Fosforylaation EGFR-Ser1046 p38 oli myös hiljattain määritettiin olevan keskeinen signaali, joka estää pro-apoptoottisen lohkaisu kaspaasin ja PARP kun TNFa stimulaation [57]. Kun EGF stimulaatio, EGFR on vain hieman fosforyloitiin Ser1046 antaa anti-apoptoosin vaikutus [57]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että EGFR-Ser1046 fosforylaatio on EGF-riippumaton EGFR-L858R mutantti soluja, kun taas EGFR-Ser1046 fosforylaatio on EGF-riippuvaista EGFR-WT-solut. Siten onko EGFR-Ser1046 fosforylaatiota EGFR-L858R mutanttisoluihin johtaa antiapoptoottisena vaikutus optio lisätutkimuksia.

H1299-EGFR-L858R soluilla on alhaisempi EGFR tasolle kuin että H1299-EGFR-WT solut; kuitenkin EGF-riippumaton pohjapinta fosforylaation tasoja L858R soluissa useita Ser, Thr, Tyr tähteet ovat vahvempia kuin EGFR-WT-solut (kuvio 3). Tämä osoittaa, että vaikka L858R mutantti-reseptori oli alhaisempi ekspressiotaso, se oli hyper-fosforyloitiin kuin villityypin reseptorin. Lisäksi EGFR L858R mutantti tiedetään olevan aktiivisempi kuin EGFR-WT aiemmissa tutkimuksessa [16]. Kaiken EGFR fosforylaatiota L858R soluissa oli vähemmän reagoivien EGF. Tämä voi johtua suuremmasta pohjapinta fosforylaation tasoja mutantti-reseptorin tai johtuu sen pienempi ekspressiotason. Koska EGFR signalointi voi lisätä proteiinin ilmentymistä AURKA [34], [35], AURKA voi myös säädellä EGFR fosforylaatiota. Täällä, osoitimme, että EGFR-AURKA vuorovaikutus tapahtui vasta EGF stimulaation (kuvio 4C), mikä tarkoittaa, että AURKA voisivat osallistua EGFR signalointikaskadissa. In nokodatsoli pidätettiin M-vaihe, EGFR-mutantti solut osoittivat selvempi fosforylaatio EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 ja AURKA-Thr288 kuin solut, jotka ilmentävät EGFR-WT (kuvio 4E). EGFR aktivointi tapahtuu läpi AKT reitin ja EGFR voi ylössäätää AURKA ilmentymistä aktivoimalla translaatiokoneistolla kautta AKT-reitin [35]. AURKA estäjä VE-465 tukahdutti AKT polku ja esti EGFR seriini /treoniinifosforylaatio, varsinkin soluissa kuljettavat

EGFR

mutaatioita, mutta ei vaikuttanut EGFR tyrosiinifosforylaatio (kuvio 5B). Kun soluja käsiteltiin EGFR-inhibiittorin IRESSA estää EGFR autofosforylaatioon, fosforylaatiota AURKA katosi (kuvio 5C), joka viittaa siihen, että EGFR-mutantit voivat aktivoivat konstitutiivisesti fosforylaation ja parantaa alavirran signalointia edistää karsinogeneesiä. Kuitenkin suhde AURKA, EGFR-WT, ja mutantti-EGFR on arvioitava edelleen tunnistamiseksi terapeuttisia kohteita keuhkosyöpäpotilaiden.

Yhteenvetona, profiloidaan EGFR fosforylaatiota villityypin ja mutantti-keuhkosyövän soluja, tunnistimme suhde

EGFR

mutaatioiden ja fosforylaation EGFR-Thr654 ja -Ser1046, joka liittyi AURKA ilmaisua keuhkosyöpäpotilaita ja voidaan aikaansaama AURKA. Vuorovaikutus EGFR ja AURKA in

EGFR

mutaatio soluja viittaa siihen, että AURKA inhibiittorit voi olla terapeuttista vaikutusta. Oletamme, että tämä tutkimus helpottaa kehittää tehokas terapeuttinen strategia keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, solusyklin synkronointia, ja EGF stimulaatio

perustaminen H1299 klooneja, jotka ilmentävät stabiilisti tyhjän vektorin (H1299-Vec), EGFR-WT (H1299-EGFR-WT) tai EGFR-L858R mutantti (H1299-EGFR-L858R) kuvattiin aiemmin [16]. A549 (EGFR-WT), H1975 (endogeenisen mutatoidun EGFR-L858R-T790M) ja H1299 stabiileja klooneja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, ja A431-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% kuolemaan johtava naudan seerumia (FBS), 100 U penisilliiniä, 0,1 mg /ml streptomysiiniä, ja 2 mM L-glutamiinia. Kaikki soluviljelmässä reagenssit olivat Invitrogen. Synkronoida solusyklin A549 ja H1975 keuhkosyövän solulinjat, eksponentiaalisesti kasvavia soluja inkuboitiin 100 ng /ml nokodatsoli (Sigma) 16 tuntia. Edistää solujen EGF, solut olivat ilman seerumia 16 tunnin ajan, jonka jälkeen 10 minuutin hoito EGF: ää (10 ng /ml) seerumittomassa alustassa.

immunoblottaus-analyysi

solulysaatit (50 ug) altistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin sen jälkeen polyvinylidenedifluoride (PVDF) (Millipore) käyttäen Bio-Rad siirtojärjestelmä. PVDF-membraani blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa (BD Bioscience), huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Kaikki fosfo-polyklonaalisia EGFR-vasta-aineita (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101