Krooninen sairaus

tiivistelmä

Iron ylikuormitus on liittynyt syövän syntymistä ihmisessä. Intraperitoneaalisesti rauta riumnitrilotriasetaatti aloittaa Fenton reaktion munuaisten proksimaalitiehyeet jyrsijöiden lopulta johtaa yleisyydestä munuaissolukarsinooma (RCC) toistuvan hoitoja. Suoritimme korkearesoluutioinen mikrosirujen vertaileva genominen hybridisaatio tunnistaa piirteitä genomisessa profiilit tämän oksidatiivisen stressin aiheuttama rotan RCC. Tulokset paljastivat laajan laajamittainen genomista muutosten kanssa suosivat poistoista. Poistot ja monistukset oli useita ja joskus hajanainen, mikä osoittaa, että Fenton reaktio on syynä tällaisesta genomisesta muutosten

in vivo

. Taajuus kuvaaja osoitti, että kaksi yleisimmin muuttunut loci vastasi

Cdkn2a Twitter /

2b

poisto ja

Met

vahvistusta. Kasvaimen koot olivat suhteellisesti liittyy

Met

ilmaisun ja /tai vahvistusta, ja klustereiden analyysi vahvisti tuloksemme. Lisäksi olemme kehittäneet menettely verrata koko genomista malleja kopioluvun muutoksia eri lajien perustuu kromosomi syntenic suhteeseen. Patterns rotan RCC voimakkaimmin samankaltaisuus ihmisen RCC joukossa viisi eri ihmisen syövissä, jonka jälkeen ihmisen pahanlaatuinen mesoteliooma, rautaylikuormituksen liittyvän syöpään. Sen vuoksi riippuvaisia ​​raudasta Fenton kemiallinen reaktio aiheuttaa suurten genomisten muutosten aikana karsinogeneesin, mikä voi johtaa erillistä genomi-profiileja. Perustuen ominaisuuksista laaja perimän muutoksia ihmisen syövässä, tulokset viittaavat siihen, että tämä kemiallinen reaktio voi olla merkittävä rooli aikana ihmisen syövän syntymistä.

Citation: Akatsuka S, Yamashita Y, Ohara H, Liu YT, Izumiya M Abe K, et ai. (2012) Fenton Reaction aiheuttaman syövän Wild Type rotilla ssä toistetaan Perimän Muutoksia Havaittu in Human Cancer. PLoS ONE 7 (8): e43403. doi: 10,1371 /journal.pone.0043403

Editor: Kamaleshwar Singh, Texas Tech University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2012; Julkaistu: 29 elokuu 2012

Copyright: © Akatsuka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund (10-24213); Grant-in-Aid for Cancer Research terveysministeriön, Labour and Welfare of Japan; ja Grant-in tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on sairaus kertynyt genomista muutoksia, oletettavasti syynä systemaattinen prosessi aikana solujen vammoja ja korjaus. Ruokamyrkytysepidemian varten syövän synnyn lukuisia kuten γ-säteily, UV-säteily, tulehdus, kemikaalit ja raudan ylikuormitus [1]. Genomista tietoa erilaisten ihmisen syövissä on tällä hetkellä analysoidaan joko array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) [2] tai seuraavan sukupolven sekvensointi [3], [4]. Nämä hankkeet toteutetaan löytää aiheuttajaa geenimutaatioita, jotka johtavat identifioida uusia kemikaaleja tai vasta-aineita suunnattu vuorovaikutuksia vastuullisen signalointi molekyylejä. Tämän vaiheen odotetaan johtavan kehityksen tehokkaiden lääkkeiden. Kuitenkin syövän ehkäisyä jokapäiväisessä elämässä on yhtä tärkeää kuin sen hoito.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet ratkaisemaan roolit rauta-välitteisen oksidatiivisen stressin aikana syövän synnyn käyttäen array-pohjainen CGH. Oksidatiivisen stressin konstitutiivisesti aiheuttama metabolia molekulaarisen hapen [5], mutta säätelee pääasiassa erilaisten antioksidantti järjestelmät. Kuitenkin erilaisia ​​patologisia tiloja, oksidatiivisen stressin kuormat ylitä antioksidanttien [6]. Rauta on yleisin raskasmetalli nisäkkäillä, kuten ihmisillä ja jyrsijöillä. Kun taas rauta on välttämätön hapen kuljetusta osana hemoglobiini, liiallinen rauta on liittynyt syövän synnyn [7], [8], oletettavasti kautta Fenton reaktion [9]. Ionic raudan ovat tuskin liukoinen neutraalissa pH: ssa, mutta rauta nitrilotriasetaatti (Fe-NTA), rauta kelaatti, on liukoinen pH: ssa 7,4 ja on tehokas katalyyttinen agentti Fenton reaktion [10]. Vuonna 1980, ryhmämme todettu, että toistuva vatsaonteloon hallinnot Fe-NTA aiheuttaa yleisyydestä munuaissolukarsinooma (RCC) jyrsijöillä [11], [12]. Myöhemmin, osoitimme, että munuaisvaurion, tapahtuu läpi Fenton reaktiolla erilaisia ​​hydroksyyliradikaali-välitteisen kemiallisten tuotteiden, kuten 8-hydroksi-2′-deoksiguanosiinin [13], [14] ja 4-hydroksi-nonenaali [15] , [16]. On todettu, että rautaylikuormituksen monissa patologisissa tiloissa liittyy katalyyttisten rauta- [17], [18].

Näin arvioimalla koko genomista RCC, voisimme löytää yleisenä periaatteena genomista muutokset alle hapettavasti-stressitilanteissa. Olemme raportoineet

Cdkn2a /2b

poistumaa käyttämällä mikrosatelliittimerkkien analyysi tässä mallissa [19]. Tässä tutkimuksessa arvioimme koko genomin Fe-NTA-indusoidun rotan RCC ja niiden solulinjoissa käyttäen array-pohjainen CGHs. Lisäksi olemme muuttaneet tiedot ihmisen genomiin kromosomi syntenic suhteen ja analysoi yhdistys.

Tulokset

Genominlaajuiset Näkymät DNA Kopioi numero Muutokset Fe-NTA aiheuttama Rat RCC

Viisitoista rotan RCC DNA-näytteitä, jotka sisälsivät 13 primaarikasvaimen näytettä ja 2 solulinjaa näytteitä, hybridisoitiin on Agilent oligonukleotidigeenisirumenetelmää varten CGH kanssa 181978 genomisen lokuksen (GEO liittymistä: GSE36101). Vertaamalla eri array-pohjainen CGH profiilit määrällinen tavalla on vaikeaa. Muutos keskimääräinen kopioluku johtuu polyploidiaa ja saastuminen normaalien solujen. Siksi olemme kehittäneet tilastollinen menetelmä, joka pitää näitä tekijöitä arvioida kromosomi kopiomäärä (Methods S1). Tässä asiakirjassa, array-pohjainen CGH profiilitiedot analyysit perustuvat arvioituun kopioida numeroita tällä menetelmällä.

Array-pohjainen CGH profilointi paljasti, että genomit Fe-NTA-indusoidun rotan RCC ovat usein monimutkaisia ​​ja niillä monet laajat kromosomi muutoksia (kuviot. 1A ja S1). Koko genomin taajuus analyysi 15 näytettä tunnistetaan toistuvia alueita kopionumerolla poikkeavuus Fe-NTA aiheuttama RCC (Fig. 1 B). Kopioi numero aberraatioita määritettiin perustuen jakamisesta log2 suhteen arvot laskettiin uudelleen arvioituun kopioluku joukolle 13 primaarikasvainten ja 2 solulinjoissa (kuvio. S2). Tässä jakelu, kynnysarvot, jotka edustivat voitto ja tappio mukaan valittiin ± 0,377. Kynnys edustaa vahvistusta valittiin klo 0,811 taas homotsygoottinen deleetio (täydellinen menetys) määrättiin asentoon, jossa kopioluku arvioitiin 0. tyypillisin globaali piirre paljastettu taajuuden analyysi oli taipumus menettää laajasti leveä alue kromosomeja, erityisesti kromosomien 3, 5, 6, 8, 9, 14, 15, 17 ja 20. toinen piirre oli usein vahvistus pitkällä pericentromeric alue kromosomissa 4.

(A) edustavia array-pohjainen CGH profiilien kahdelta RCC kasvaimia. Punaiset viivat osoittavat log2 suhteet arvioidun kopioluvun yli johdettua syöpä ploidia vs. perimän asemaa kaikille CGH microarray antureista. (B) Frekvenssijakauma kopioluvun kromosomipoikkeavuuksien koko rotta genomin. Suhteellinen taajuudet vahvistus (tummanpunainen), voitto (tomaatti), tappio (keltainen) ja homotsygoottinen deleetio (tummanvihreä) sisällä 13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoja piirretään jokaisessa perimän aseman. Kaksi syöpään liittyvien loci,

Met

ja

Cdkn2a

, jotka useimmiten vaikuttavat kopiomäärä poikkeavuus on osoitettu nuolilla.

Usein Kromosomi menettäminen Rat kromosomi 5 ja Homozygous poistaminen on

Cdkn2a /2b

Locus

kromosomi 5 tehtiin laaja tappio kopiomäärä, vähintään, että muissa kromosomien (esim kromosomeja 6, 8 ja 20 ) (Fig. 1 B). Kuin se koskee laaja menetys, homotsygoottisia deleetioita useimmin havaittu

Cdkn2a /2b

lokuksen kromosomissa 5 (Fig. 2A). Tämä yleisesti poistettu alue sisältyy kahden loci (

Cdkn2a

ja

Cdkn2b

) kolmesta erillisestä tuumorisuppressorigeeneille (

p16

ja

p19

in

Cdkn2a

;

p15

in

Cdkn2b

) (Fig. 2B). Alasajon

p16 /p19

ja

p15

mRNA ilmentyminen vahvistettiin näytteissä, jotka sisälsivät homotsygoottinen deleetio on

Cdkn2a /2b

lokuksen (kuviot. 2C ja 2D) . Vuonna näytteitä hemizygous häviämä

Cdkn2a

lokuksen (eli FB32-4, FB28-7),

p16

ja

p19

ilmaisuja olivat vaimentua, oletettavasti koska promoottorialueet jäljellä alleelien metyloitiin. Kuitenkin jotkut näytteet joko hemizygous tai ei poisto (esim FB14-3, BF51-1, FB14-6, FB30-5 ja FB33-7) osoitti selvästi yli-ilmentyminen

p16

ja

p19

.

(EN) pylväsdiagrammi esittää alueiden kromosomi tappio (keltainen) ja homotsygoottinen deleetio (tummanvihreä) pitkin kromosomi 5 13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoissa. Pystysuora punainen viiva taustalla ilmaisee asennon

Cdkn2a

lokuksessa. (B) Suurennettu näkymä pylväsdiagrammi keskitettynä

Cdkn2a /2b

loci. Genominen alueet kaikkien RefSeq geenien mukana näytetään alueella kromosomissa on kuvattu pystypalkkeina taustalla. (C) Expression analyysi

Cdkn2a

(

p16

INK4a

ja

p19

Arf

) 13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoissa, käytetään todellisia -Aika PCR erityisiä alukeparien kunkin eri transkriptio. Arvot on

y

-akselin osoittavat suhteellinen mRNA: n ilmentymisen taso verrattuna keskimäärin niitä normaaleissa munuaisissa kolmesta kontrollirottien. (D) Expression analyysi

Cdkn2b

(

p15

Ink4b

) 13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoista reaaliaikaisella PCR: llä. Arvot on

y

-akselin osoittavat suhteellinen mRNA: n ilmentymisen taso verrattuna keskimäärin niitä normaaleissa munuaisissa kolmesta verrokkirottien.

Usein Amplifikaatiot Yli Pericentromeric alueen kromosomi 4 ja monistaminen on

Met

Locus

Yli pitkä osa pericentromeric alueen kromosomissa 4, usein kopiomäärä vahvistuksen ja vahvistusta havaittiin (Fig. 1 B). Genomivahvistuksen ja geeni-ilmentymisen vastaavat pinta-alat kromosomin 4 olivat pääasiassa verrannollinen (Fig. S3). Baari juoni monistettu alue pitkin pericentromeric alue kromosomissa 4 paljasti, että

Met

onkogeeni asuu yleisin päällekkäisiä genomista osassa (Fig. 3A). Kaikkein päällekkäinen jakso, jonka pituus on noin 222 kb koostui monistetun alueen 11/15 näytteitä ja sisälsi vain yhden RefSeq hallittuja geenin (

Met

) (Fig. 3B). Suurempi kuin 5-kertainen

Met

mRNA: n ekspressio havaittiin 6 näytettä joukossa 9 kasvaimia, jotka sisälsivät genomisen monistumisen

Met

(Fig. 3C).

(EN) pylväsdiagrammi esittää vahvistus alueita pitkin 65 Mb pericentrometic kromosomin alueen 4 13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoissa. Neljä laatuja vahvistus on merkitty bar värisävyt; tummempi punainen, sitä suurempi amplitudi. (B) suurennettuna pylväsdiagrammi edellä osoittaa läheisyydessä kaikkein päällekkäisten alue. Genominen alueet kaikkien RefSeq geenien mukana näytetään alueella kromosomissa on kuvattu pystypalkkeina taustalla. (C) Expression analyysi

Met

13 RCC kasvaimia ja kaksi RCC solulinjoista reaaliaikaisella PCR: llä. Arvot on

y

-akselin osoittavat suhteellinen mRNA: n ilmentymisen taso verrattuna keskimäärin niitä normaaleissa munuaisissa kolmesta verrokkirottien.

Yhdessä koskien kromosomipoikkeavuuksia näillä kahdella syöpä -aiheiset loci, joka tutki karsinooma mukaan lukien kaksi solulinjat sisälsivät joko

Met

vahvistus tai

Cdkn2a /2b

poisto (taulukko 1, kuviot. 2B ja 3B). Muita yleisiä geneettisiä muutoksia on yhteenveto taulukossa S1 (20 poistetut geenit, yleinen 2-4 RCC kasvaimet) ja taulukossa S2 (340 monistettujen geenien, yleinen 2-9 RCC kasvaimet). Joukossa

Zbtb38

monistaminen vahvistettu yli-ilmentymisen (Fig. S4).

Kasvain koko Fe-NTA aiheuttama RCC säätelee geneettiset ominaisuudet

tutki assosiaatiot geneettiset muutokset ja eri RCC ominaisuuksia myös yhteenveto taulukossa 1. kaikista suhteiden tutki,

Met

ilmaisun ja kasvaimen koko oli suhteellisesti liittyvät (Fig. 4A). Lisäksi hierarkkinen klusterointi kasvainten perustuen koko kaavoja kromosomaalisten muutosten paljasti, että ryhmä suuria kasvaimia (ts FB7-7, FB30-5 ja FB33-7) vastasi erillisen klusterin (Fig. 4B). Näin ollen kasvaimen piirre, koko aikaan kasvain oli kliinisesti ilmeinen, on liittynyt koko ryhmän-pohjainen CGH profiilit.

(A)

Met

ekspressio korreloi merkitsevästi kasvaimen koko . Pearsonin korrelaatiokerrointa (r) ja vastaava P-arvo kirjoitetaan tontti. (B) Hierarkkinen ryhmittely RCC kasvaimia perustuu koko genomin kuviot kopioluvun muutoksia. Isokokoiset kasvaimia muodostavat erillisen klusterin.

vertailu Kopioi numero Muuttaminen Profiles in Cancer Genomit Between Rotat ja Humans

Voit selvittää yleistä periaatetta laajamittaisen genomista muutokset syöpä poikki nisäkäslajeista, vertasimme syöpä genomien rottien ja ihmisten koko kirjo kromosomaalisia muutoksia. Ensin transformoitu rotan array-pohjainen CGH profiilien päälle ihmisen kromosomeja mukaan synteny lajien välillä. Sen jälkeen vertasimme koko kuviot perustuvat arvioituihin kopioida numeroita moniulotteinen data-analyysi menetelmiä. Huomasimme, että Fe-NTA-indusoidun rotan RCC oli samankaltaisin ihmisen RCC, jonka jälkeen ihmisen pahanlaatuinen mesoteliooma (kuviot. 5A ja 5B).

(A) väri juoni edustaa samankaltaisuuden matriisin poikki rotta RCC ja erilaisia ​​ihmisen syövissä. rRCC, rotta munuaissolukarsinooma; hPDAC, ihmisen haiman adenokarsinooma; hTALL, ihmisen T-solu akuutti lymfaattinen leukemia; hGBM, ihmisen glioblastooma; hRCC, ihmisen munuaissyöpä. (B) numeerinen yhteenveto samankaltaisuuden matriisin. Niiden lukumäärä kussakin neliö osoittaa keskiarvon samankaltaisuutta indeksin (määritelty välille -1000 ja 1000). Katso Materiaalit ja menetelmät osasta lisätietoja.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä kertaa analyysit koko tietojen array-pohjainen CGH soveltaa Fenton kemia aiheuttama syövän syntymistä rotan munuaisen malli [20]. Huomasimme, että oksidatiivisen stressin aiheuttaa laajoja genomista muutoksia siinä aiheuttaman syövän genomin kromosomitasolla (Fig. 1A). On tunnettua, että suurin osa ihmisen pahanlaatuisten kiinteiden kasvainten hallussaan -tappioiden lukuisissa kromosomeissa [21], [22], ja vahvistus voi olla sopiva kohde syövän kemoterapiaa. Aikana karsinogeenisia prosessi tällaisten kasvainten, kromosomi epävakaus ei katsota vaikuttavan liikkeellepanevana tekijänä [23]. Niistä villityypin jyrsijöiden syövän synnyn malleja kuitenkin muutamia malleja ilmoittaa käyttämällä ensisijaista kasvainnäytteestä laajoja geneettisiä muutoksia, koska kromosomi epävakauden [24], [25]. Säteilyn aiheuttamista hiiren pahanlaatuinen lymfooma [26] ja hiiren keuhkon adenokarsinooma aiheuttama 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanoni, syöpää aiheuttavaksi läsnä tupakansavussa [27], paljasti hieman brutto kromosomimuutoksia kuin vastaava spontaani kasvaimia, vaikkakin alhainen resoluutio raportissa (bakteerin keinotekoinen kromosomi [BAC] joukko ~6,500). Tosiasiat että valvonta rotilla ei havaita mitään RCC [11], [12] ja Fe-NTA-indusoidun rotan RCC malli on jokin vastaavuus ihmisen syöpiä genomista solumuutokset kromosomitasolla voimakkaasti tukevat ajatusta, että tämä syövän synty malli jäljittelee todellisen karsinogeeninen prosessi ne ihmiset, joilla ei ole vahvaa syöpäalttiutta piirteitä.

Sitä vastoin hiirillä, joilla on useita geenitekniikalla syöpään liittyvien geenien näyttää geneettinen muutos tällaista [28]. Mielestämme nämä kokeet vastaavat vakiintunutta mutaattori- fenotyyppi [29] ja siten sen syöpää aiheuttava prosessi ihmisillä, joilla on vahva syöpäalttiutta ominaisuuksia, kuten Li-Fraumeni oireyhtymä (

p53

) [30] tai melanooma suvuille (

p16

) [31]. Koska perinnöllinen rotta RCC mallia, me analysoi myös RCC on Eker rottia, jotka eivät näy aggressiivinen ominaisuuksia, kuten etäpesäkkeiden [32], [33], [34]. Havaitsimme, että nämä RCC osoitti nolla tai hienovarainen geneettisiä muutoksia (Kuva. S5). Näin ollen, oksidatiivisen stressin, mukaan lukien indusoidun johtuu liiallisesta raudasta, voi olla yksi syy ihmisen munuaisten syövän synnyn. Todellakin, lukuisat epidemiologiset tutkimukset ovat liittäneet terästeollisuuden työntekijöiden lisääntynyt RCC riski [35].

taajuus juoni analyysi paljasti kaksi merkittävä ominaisuuksia. Ensinnäkin kromosomipoikkeavuuksien päättäisivät pyytää tappiota vastaan ​​ploidisuus jokaisen syövän genomin. Useimmiten poikkeavuus edusti häviämä joko koko kromosomitasolla (monosomia) tai segmenttimuodossa tasolla (Fig. 1 B). Yleisimmät katoamisesta oli

Cdkn2a /2b

lokuksessa. Hallitsevuus menetys profiilia kromosomi muutokset voivat johtua alkuvaiheessa syövän. Olemme aiemmin osoittaneet, että solut hemizygous deleetion

Cdkn2a

ilmaantua jo muutaman viikon kuluttua aloittamisesta Fe-NTA hallinto [36].

Nykyinen analyysi paljasti, että monoallelic menetys kromosomi 5 kokonaisuudessaan tai muusta yhtä laaja alue on merkittävä ensimmäinen tapahtuma. Todellakin, löysimme vain yhdessä tapauksessa (6,7%) on monoallelic menetyksen erittäin kapea alue (~350 kiloemäspareja; kuviot. 2A ja 2B). Fe-NTA katalysoi sukupolven hydroksyyliradikaalien kautta Fenton reaktion, erityisesti luumenissa munuaisten proksimaalisten tubulusten, joka johtaa degeneraation ja nekroosi /apoptoosi näitä soluja [37], [38]. Koska munuainen on elintärkeä elin, joka suorittaa urea erittyminen, uudelleen imeytyminen arvokkaiden molekyylien sekä ionisia homeostaasin ylläpito, uudistaminen jäljellä tubulussoluihin on voimakkaasti edistettävä. Under krooninen oksidatiivista stressiä toistuvat Fe-NTA hallintojen, tämä rappeutuminen ja regenerointiprosessia jatkuisi kuukausia tai vuosia, riski kasvaa mitoosi tapahtumien samanaikaisesti korjaus oksidatiivisen DNA-vaurioita. Uskomme, että tämä oksidatiivista stressi aiheuttaa epänormaalia DNA: n replikaatiota ja kromosomi missegregation, mikä johtaa syntymistä aneuploidi soluja. Yllättäen tämä tapahtumasarja näyttävät esiintyvän kuukausissa, mikä johtaa yleisyydestä (~90%) RCC rotilla kahden vuoden kuluessa. Aneuploidi solut yleensä näytteille fenotyypit yhdenmukaisia ​​lisääntynyt energian tarve ja proteotoxic stressiä. Kuitenkin aneuploidiaa voi edistää kasvaimen kehittymisen mukaisesti seuraavat kaksi hypoteettista mekanismit: 1) aneuploidian voi aiheuttaa proliferatiivisen edun menetyksen kautta G1 /S siirtymän ohjaus olosuhteissa, joissa normaalit euploid solut eivät jaa [39] ja 2) aneuploidian voi edetä tuumorigeneesiä by edistää genomin epästabiilisuuden, lisäten siten evolvability kasvainten [40]. Usein poistaminen

Cdkn2a Twitter /

2b

lokus on havaittu rotalla vatsakalvon syöpää, rautaylikuormituksen liittyvä kasvain [41], joita joko toinen rauta yhdiste (rauta sakkaraatti) [ ,,,0],42] tai asbestin [43]. Nämä yhteiset piirteet eläinmalleissa viittaavat vahvasti siihen, että

Cdkn2a Twitter /

2b

on pääasiallinen tavoite rauta välittämän syövän synnyn. Sama geneettinen muutos havaitaan rotan mesoteliooma aiheuttama moniseinäisiä hiilinanoputket [44], joissa rautaa osallistuminen ei ole vielä osoitettu. Haluaisimme lisätä tähän biologisen merkityksen tuloksemme että homotsygoottinen deleetio

CDKN2A /2B

havaitaan usein ihmisen mesoteliooma liittyvät asbestille altistumisen [45], [46].

Jotkut kasvaimet, joiden jäljellä

Cdkn2a Twitter /

2b

alleeli näytti erittäin korkeat ekspressiotasot kahden tuotteen tästä lokuksesta,

p16 /INK4a

ja

p19 /Arf.

on tällä hetkellä keskustellaan kysymys ihmisen syövässä [47]. On paljon todisteita siitä, että useat kasvaimet osoittavat merkittävää p16 tasoilla solulimassa [48]. Tämä voi olla epäonnistuneen pysäyttää soluproliferaation tapauksessa alavirran

Rb

säätelyhäiriötä [49] tai voi edustaa vaihtoehtoisen mekanismin moduloimiseksi tunnistamattomia reittejä. Tuloksemme osoittavat -50% hemizygous poistamisesta

Rb

. Tämä vaatii lisäselvityksiä kanssa epigenetic analyysiin.

Toinen ominaisuus määritetään taajuus juoni analyysi korkea monistumista rajatussa kromosomialueen kohti centromere kromosomin 4 osoittaen

Met

lokukseen. Alueella, joka kattaa 80 Mb alkaen sentromeerin rotan kromosomissa 4 on syntenic ihmisen kromosomiin 7. Erilaisia ​​ihmisen syöpien, kuten glioblastooma [50] ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [51], on raportoitu satama-monistuksia kromosomiin 7. tyrosiini kinaasi MET on reseptori hepatosyyttikasvutekijän ja sijaitsee ylävirtaan

ras

signaalin transduktioreitin, mikä toimii etu soluproliferaation [52]. Näin ollen, on mahdollista, että kasvaimen koko oli suhteellisesti liittyy

Met

ilmentymisen tasolla (kuviot. 3C ja 4A). Koska me leikellä eläimen heti kun ymmärrämme kasvain, uskomme, että suurikokoisten kasvaimet ovat aggressiivisempia luonteeltaan. On huomionarvoista, että kasvaimen kokoa liittyy myös genomin muutos kuvio (Fig. 4B), ja siihen liittyi vahvistus ja yli-ilmentyminen

Zbtb38

sijaitsee kromosomissa 8 (Fig. S4). ZBTB38 (CIBZ) tukahduttaa transkriptio metyloitua malleja [53], mikä oletettavasti säännellään epigeneettiset mekanismit. Down-regulation of ZBTB38, uusi substraatti kaspaasi-3, indusoi apoptoosin [54], ja tämän geenin on lokalisoitu eturauhassyövän alttiuden lokukseen [54]. Nämä tulokset vahvistavat mahdollisuudesta kasvain luokitusta käyttäen array-pohjainen CGH.

Met

nousi evolutionally myöhään ja on ainutlaatuinen nisäkkäisiin [52]; se voi näin ollen liittyä ainutlaatuisen vahvistus koko genomin.

genomivahvistuksen on arveltu tapahtuvan kautta rikkoutuminen-fuusio-silta sykli [55], [56], [57]. Fenton reaktio aiheuttaa kaksijuosteisen DNA rikkoutumista [10]. Tuloksemme paljasti, että nämä monistuksia koostui seoksesta laaja-matalan tason monistuksia ja hajanainen, kapea korkean tason monistuksissa (Fig. 3A). Tämä viittaa mekanismi positiivista palautetta vahvistusta alkaen laaja-matalan tason vahvistus. Olemme epäillä osallistumista kaksinkertainen minuuttia, ja taudille alttiiden genomista loci. Tämä hypoteesi vaatii lisätutkimuksia. Oli mielenkiintoista, että kaksi tuumoria tukahduttavan geenejä,

Cav1

[58], [59] ja

ST7

[60], jota ympäröi

Met

lokuksen (Fig. 3B) . Tämä voi olla syynä siihen, että

Met

lokuksessa oli nimittäjä rotta RCC. Koko exome tai Genomikartoituksen voivat lisäksi paljastaa uusia toteamuksia pistemutaatio ja kromosomi translokaatio.

Lopuksi vertasimme esillä rotta tulokset vastaavat ihmisen kasvaimista muuntamalla tiedot perustuvat kromosomi synteny (kuviot. 5A ja 5B). Oletettiin, että genominen muuttaminen Fe-NTA-indusoidun rotan RCC oli samankaltaisin ihmisen RCC luultavasti koska kohdesoluja ovat samat. Yllättäen kuitenkin ihmisen mesoteliooma oli toiseksi eniten samanlainen. Nyt on osoitettu, että suurin osa ihmisen mesoteliooma johtuu asbestille altistumisen, ja ensisijainen patogeeninen prosessista on raudan ylikuormitusta [8], [61]. Sama mesodermal alkuperä munuaistiehyiden solujen ja mesoteelisolujen saattaa samankaltaisuutta array-pohjainen CGH profiileja. Endodermaalinen kasvain, kuten haiman adenokarsinooma (PDAC), ja ektodermaalinen kasvain, kuten glioblastoma multiforme (GBM), osoittivat merkittävää eroa genomista profiileja.

Yhteenvetona osoitimme, että toistuvat Fenton reaktioita villin tyyppi rotille syöpä toisteta genomista muutokset samanlaiset kuin ihmisen syövissä, mikä viittaa siihen, oksidatiivisen stressin merkittävänä tekijänä ihmisen syövän synnyn. Tässä munuaisten syövän synnyn mallia, edullisia muutoksia olivat poistetaan;

Cdkn2A /2B

poisto ja

Met

vahvistus olivat tärkeimmät kohdegeenin muutoksia. Vertaileva lajien välinen analyysi osaltaan määrittämään ehdokas syöpää aiheuttavia aineita.

Materiaalit ja menetelmät

Fe-NTA aiheuttama munuaissyövän Model

Fe-NTA aiheuttama syövän synnyn kokeet olivat suoritettiin käyttäen uros F1 hybridi rotat jotka olivat risteytys Fischer 344 ja Brown-Norway sisäsiittoisia kantoja (Charles River, Yokohama, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [62]. Kolmetoista RCC tapausta käytettiin tässä tutkimuksessa, ja histologinen arvosana kasvaimen määräytyi modifioidun Maailman terveysjärjestön luokitus kuten aikaisemmin on kuvattu [62]. Yksityiskohdat on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. eläinkoe ​​valiokuntien Graduate School of Medicine, Kyoto University Graduate School of Medicine ja Nagoyan yliopiston Graduate School of Medicine hyväksyi tutkimuksen. FRCC001 ja FRCC562 ​​solulinjat perustettiin primaarisesta Fe-NTA-indusoidun RCC kuten aiemmin on kuvattu [63].

Array-pohjainen vertaileva genominen hybridisaatio

Genominen DNA kasvaimia ja solulinjoissa oli eristetty Dneasy (Qiagen, Valencia, CA). Array-pohjainen CGH suoritettiin Agilent 185 K rotan genomin CGH mikrosiru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), kuten aiemmin on kuvattu [64]. Kolmetoista ensisijainen kasvaimia ja kaksi solulinjaa Fe-NTA aiheuttama RCC analysoitiin viittaus DNA uutetaan normaali munuainen rotan Brown-Norway imbred rasitusta. Yksi RCC näyte naisten Eker rotta [32] analysoitiin viittaus DNA uutetaan normaali munuainen miespuolisen Eker rotta. Kaksi muuta RCC näytettä mies Eker rottien analysoitiin Rat Genome CGH Microarray 105A (G4436A; Agilent Technologies) käyttäen viite DNA uutetaan normaali maksa toisen miehen Eker rotta. Normalisoitu array-pohjainen CGH tietoja käsitellään tuottaa segmentoidun profiilin pyöreä binary segmentointi (CBS) [65], joilla on muuttunut merkitsevyystasolla (alfa = 0,0001). Menettely tietojenkäsittelyn varten kopiomäärä estimointi yksityiskohtaisesti Methods S1.

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen Isogen reagensseja (Nippon Gene Co. Ltd., Tokio, Japani ) mukaan valmistajan protokollaa. cDNA syntetisoitiin käyttäen RNA PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio, Shiga, Japani) satunnaisia ​​alukkeita. Platinum SYBR Green qPCR SuperMix–UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR-analyysillä. Rat β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat:

p16

INK4a

, 5′-aaacgccccgaacactttc-3 ’ja 5′-gttcgaatctgcaccatagga-3’;

p19

Arf

, 5′-accccaagtgagggttttct-3 ’ja 5′-agagctgccactttgacgtt-3’;

p15

Ink4b

, 5′-tccacaggctagagggaaaa-3 ’ja 5′-gtgcaggtgactccttggtt-3’;

Met

, 5′-ttaagcgagagcacgacaaat-3 ’ja 5′-ccacataggaaaacgcactgt-3’;

Zbtb38

, 5′-gtagctgctgctccaaatcc-3 ’ja 5′-cctgttgagggtggtgaact-3′; β-aktiini, 5’-tgtgttgtccctgtatgcctctg-3 ’ja 5′-atagatgggcacagtgtgggtg-3’.

Human Data

Käytimme ihmisen array-pohjainen CGH data haiman adenokarsinooma (hPDAC) [ ,,,0],28], T-solu akuutti lymfaattinen leukemia (hTALL) [28], glioblastooma (hGBM) [66], mesoteliooma solulinjaa (HMM) [67] ja munuaissyövän (hRCC) [56]. Agilent CGH-array data entisen neljän tyyppisiä ihmisen syövän saatiin NCBI: n Gene Expression Omnibus (GEO) verkkosivuilla (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GEO liittymistä numerot aineistoja ovat GSE7599 (hPDAC), GSE7603 (hTALL), GSE9177 (hGBM) ja GSE22237 (HMM). Ihmisen RCC Tiedot kerättiin analyysien kanssa BAC mikrosiruja (4361 kloonia) [68]. Me määritelty samankaltaisuus indeksi kahden array-pohjainen CGH profiilien seuraavasti. Ensin lasketaan korrelaatiokerroin kanssa log2 suhteet arvioidun kopioluvun yli johdettua syövän ploidia Genomisen paikkoihin, jotka vastaavat kaikkia Agilent 44 K ihmisen CGH microarray koettimia. Sitten me kerrottuna arvo 1 x 10

3 vaihtamisen jälkeen itseisarvo osaksi neliöjuuren.

tukeminen Information

Kuva S1.

Array-CGH profiileja kaikista RCC tutkittu. Punaiset viivat osoittavat log2 suhteet arvioitu kopioluvun yli johdettua syöpä ploidia vs. perimän asemaa kaikkien CGH mikrosirulla antureista.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s001

(PDF) B Kuva S2.

jakelu log2 suhde arvojen arvioitu kopioluvun kaikille koettimet kaikissa mikrosiruja suoritettu.

doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s002

(PDF) B Kuva S3.

Esimerkki globaalin ilmaisun muuttuu linjassa genomista muutos. Erot genomiin ja transcriptome analysoidaan kahden RCC, FB7-7 ottaa laaja-vahvistus kromosomissa 4 versus FB28-7, joilla ei ole merkittävää genomista muutos kromosomissa 4 (A) Taivaansininen circle juoni ilmaisee suhde arvioidaan kopiomääränä perustuvat array-pohjainen CGH (FB7-7

vs

FB28-7). Punainen ympyrä juoni kertoo suhde normalisoitua signaalien Affymetrix ilmaisun microarray (FB7-7

vs

FB28-7). (B) Expression suhde keskiarvoistetaan pitkin kromosomi. Täällä, punainen ympyrä juoni kuvaa keskimääräistä arvoa 2-Mb ikkunat.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s003

(PDF) B Kuva S4.

Zbtb38

mRNA ilmaisu on todistettavasti liittyy sen kromosomi kopioluku. (A) Array-CGH profiilit kaksi RCC kasvaimia kätkeminen vahvistus yli

Zbtb38

lokuksen kromosomissa 8 (B) Expression analyysi

Zbtb38

13. RCC kasvaimia reaaliaikaisella PCR: llä. Arvot

y

akselilla osoittavat suhteellista mRNA: n ilmentymisen taso verrattuna keskimäärin niitä normaaleissa munuaisissa kolmesta verrokkirottien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s004

(PDF) B Kuva S5.

Array-CGH profiilit kolme perinnöllinen (Eker rotta) munuaisten kasvaimia.