Krooninen sairaus

tiivistelmä

Bezielle (BZL101) on ehdokas suullinen huume, joka on osoittanut lupaavia tehoa ja erinomainen turvallisuus varhaisessa vaiheessa kliinisten tutkimusten kokeneille rintasyöpä. Bezielle on vesipitoinen ote yrtti

Scutellaria barbata

. Olemme raportoineet aiemmin, että Bezielle oli valikoivasti sytotoksisia syöpäsoluja säästäen ei-transformoitujen solujen. Kasvaimen, mutta ei ei-transformoiduissa soluissa, Bezielle indusoidun ROS ja vakavia DNA-vaurioita, jota seuraa hyperactivation PARP, ehtyminen solun ATP ja NAD, ja inhibitio glykolyysin. Osoitamme tässä, että kasvainsolut ”mitokondriot ovat ensisijainen lähde reaktiivisia happiradikaaleja aiheuttama Bezielle. Hoito Bezielle indusoi progressiivisesti korkeampaa mitokondrioiden superoksidi sekä peroksidi-tyyppinen ROS. Esto mitokondrion hengitystä estää sukupolven molempia ROS ja suojaa soluja Bezielle aiheuttama kuolema. Lisäksi glykolyysin, Bezielle estää oksidatiivisen fosforylaation kasvainsoluissa ja kuluttaa mitokondrioiden varakapasiteetti riistää solujen kykyä tuottaa ATP: tä. Kasvain solut puuttuvat toimivat mitokondriot ylläpitää glykolyyttisissä aktiivisuus läsnäollessa Bezielle mikä tukee hypoteesia, että mitokondriot ovat ensisijainen kohde Bezielle. Metabolinen vaikutukset Bezielle kohti normaalit solut eivät ole merkittäviä, suostumuksella alhainen hapettumista että Bezielle aiheutetaan niitä. Bezielle on näin ollen lääke, joka selektiivisesti kohdistettu syöpäsolujen mitokondrioita, ja on erottaa muista tällaisista lääkeaineista sen kyky aiheuttaa ei vain estämällä OXPHOS mutta myös glykolyysin. Tämä tutkimus antaa parempi käsitys mekanismi Bezielle: n sytotoksisuus, ja sen perusteella selektiivisyyttä syöpäsoluja.

Citation: Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen I, Shtivelman E (2012 ) Bezielle selektiivisesti tavoitteet Mitochondria syöpäsolujen estää Glykolyysi ja OXPHOS. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10,1371 /journal.pone.0030300

Editor: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Kanada

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 03 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat kokonaan BioNovo, Inc. Ei ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajan ollut merkitystä päätöksessä tutkimukseen Bezielle kuin solunsalpaajaksi, mutta ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät myöntävät, että he ovat palkattuja työntekijöitä ja varastossa haltijoille BioNovo, Inc, ja että tämä tutkimus, kokonaisuudessaan, tukivat varoja BioNovo. Bezielle (BZL101) on Bionovo patentoima kasvitieteellinen lääkeainekandidaatti (FDA-IND: 59521) ja metastaattisen rintasyövän. Bionovo: n US-patentti nro 7700136 koskee menetelmää, jolla hoidetaan rintasyöpää käyttäen uutetta Scutellaria Barbata. Tämä patentti kattaa myös käyttöä Bionovo n oma BezielleR formulaatioon monoterapiana rintasyövän. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Bezielle (BZL101, FDA IND # 59,521) on valmistettu uute maanpäällisten osien yrtti

Scutellaria barbata

että on syövän ominaisuuksia.

S. barbata

uute osoitettu olevan sytotoksista aktiivisuutta erilaisissa kasvainsolulinjoissa

in vitro

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] ja antituumorivaikutus

in vivo

[11], [12], [13] malleissa munuaisen, hepatosellulaarinen ja eturauhasen syöpä. Vielä tärkeämpää on, kaksi alkuvaiheen kliinisissä tutkimuksissa Bezielle osoittivat lupaavaa tehoa ja erinomaista turvallisuutta edenneen rintasyövän [14], [15]. Vaiheen I kliinisen tutkimuksen kuusitoista potilasta, jotka kaikki menivät läpi useita hoidot ennen tutkimusta tietoja voitiin vastausta. Neljällä potilaalla oli stabiili tauti yli 90-päivää (25%) ja 3/16 oli SD 180 päivää (19%). Viisi potilasta oli tavoite kasvainregressio [15]. Myöhemmät pienimuotoista kärjistyminen tutkimus, jossa on parannettu muotoilu Bezielle osoitti samalla lupaava teho [14]. Tarve uusien lääkkeiden hillitä sairastuvuutta ja kuolleisuutta metastaattisen syöpiä ei voi korostaa liikaa. Erityisesti suun kautta saatavilla lääkkeitä, joilla on vähemmän myrkyllisyys tarvitaan kiireellisesti. Bezielle täyttää nämä täyttämättömiä tarpeita, ja suurempia kliinisissä tutkimuksissa tarjota enemmän lopulliset tiedot koskevat turvallisuudesta ja tehosta suunnitellaan.

Olemme raportoineet aiemmin, että Bezielle tappaa selektiivisesti kasvainsoluja säästäen ei-transformoitujen solujen

in vitro

[8], [15]. Tämä selektiivisyys saattaa selittää sen ylivoimainen turvallisuusprofiili osoittanut aikaisen vaiheen kliinisissä tutkimuksissa verrattuna muihin hyväksyttyjä sytostaattien hävittämisestä. Tähän mennessä analyysit solujen vaikutuksia Bezielle ovat osoittaneet, että perusta Bezielle n selektiivisyys on induktio korkea reaktiivisen hapen (ROS) tuumorisoluissa, joka on voimakkaasti vaimentunut normaaleissa soluissa. ROS aiheuttama Bezielle aiheuttaa vakavia DNA-vaurioita ja hyper aktivointi PARP-1 kasvainsoluissa. Merkittävää on, Bezielle aiheuttama vaatimaton DNA-vaurioita ei-transformoituja soluja, jotka oli korjattu eikä liity hyper aktivointi PARP [8]. Kasvainsoluissa, aktivoituminen PARP köyhdytetyn NAD +: n ja ATP, joita käytetään syntetisoimaan poly-ADP riboosi PAR-ylation useiden solun proteiinien mukana DNA-vaurioiden korjaus, transkription ohjaamiseen ja säätämiseen solukierron [16], [17] , [18]. Ehtyminen sytosolin NAD + on todennäköisesti syy myöhemmin selektiivisen inhibition glykolyysin [19], [20], [21], joka on havaittu Bezielle kasvaimen, mutta ei normaaleissa soluissa [8]. Esto Glykolyysivaiheen sekä romahtaminen redox tilan (ilmenee ehtymiseen NADPH ja GSH kasvainsoluissa käsiteltiin Bezielle) ovat todennäköisesti syynä solukuoleman laukaisee Bezielle. Itse asiassa tuloksemme osoittavat, että Bezielle indusoi pääasiassa nekroottisen kuoleman [8], että tiedetään liittyvän hyperactivation PARP-1 [21], [22], [23]. Tuore yksityiskohtainen yhdistetyn proteomiikka ja metabolomic analyysi rintasyövän soluja käsiteltiin Bezielle paljasti induktion oksidatiivisen stressin vahinkoja seurasi uudelleenjako metabolisen vuot [24]. Erityisesti kolme perhettä osallistuvien entsyymien ylläpitoon redoxpotentiaalin vaikutti Bezielle: glutathione- ja tioredoksiini liittyviä proteiineja ja peroxiredoxins. Suurin osajoukko proteiinien vaikuttavat Bezielle olivat mukana metaboliareitit, kuten glykolyysin, Krebs sykli ja rasvahappojen aineenvaihduntaan. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että Bezielle kriittisesti vaikuttaa kasvainsolujen aineenvaihduntaan kautta hapettumista.

Tässä tutkimuksessa olemme edelleen analysoineet mekanismeja Bezielle solukuolema ja sen selektiivisyys. Me raportoimme että mitokondriot ovat ensisijainen solu tavoite Bezielle, ja edellä kuvattu solu seuraukset hoidon Bezielle laukeavat efektien läpi tämän kasvitieteellinen uutteen mitokondrioissa. Tutkimalla metaboliset vaikutukset Bezielle olemme havainneet, että Bezielle inhiboi ei ainoastaan ​​glykolyysin, vaan myös oksidatiivinen fosforylaatio, mikä vaarantaa sekä solujen energian tuotantoon reittejä.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta

Bezielle uute valmistettiin, kuten on kuvattu aiemmin kliinisen materiaalia [15]. Lyhyesti, kuivattu raaka-yrtti jauhettiin hienoksi jauheeksi, lisätään suhteessa 1:10 (paino tilavuuteen) on esilämmitetty vesi ja haudutetaan 80 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Supernatantti oli erillään liukenematonta kiintoainetta sentrifugoimalla 5000 rpm, ja jollei pakastekuivausvaiheeseen. Saatu jauhe liuotettiin veteen 50 mg /ml, ja steriilisuodatettiin ennen käyttöä.

difenyleenioksi- jodonium (DPI), N-asetyyli-kysteiini, apocynin, FCCP (p-trifluorimetoksi karbonyyli syanidia fenyyli hydratsoni), antimysiini A ja muut kemikaalit hankittiin Sigmalta. Fluoresoiva indikaattorit ROS CM-H

2DCFDA ja MitoSox Red olivat Molecular Probes /InVitrogen. Vasta-aineita PAR olivat Becton-Dickinson, jotta NOX4 mistä Epitomics, että alayksikköä 2 mitokondrion kompleksin IV välillä Mitosciences, LC3 peräisin Abgent ja SQSTM Cell Signaling.

Soluviljely ja hoitoja

Kaikki solulinjat saatiin ATCC: ltä. MDAMB231 kasvatettiin RPMI 10% FCS. MCF10A kasvatettiin DME /F12, jossa 5% FCS: ää, 50 ug /ml aivolisäkeuutetta, 10 ug /ml insuliinia, 0,5 ug /ml hydrokortisonia ja 0,02 ug /ml EGF: ää (Sigma). Hs578T ja SKBr3 soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FCS: ää. Valmistaminen vesiuutteen Bezielle on selostettu aikaisemmin [8]. Soluja käsiteltiin Bezielle 250 ug /ml (kuivapaino per tilavuus), ellei toisin mainita Legends kuvioihin, tai vedellä (merkintä ”käsittelemätön” koko paperi). Kaikki hoidot Bezielle tehtiin kokonaan kasvualustaa puuttuvat pyruvaattia.

mittaus ROS

tuore varastojen ROS indikaattorien CM-H

2DCFDA ja MitoSox Red valmistettiin DMSO: iin pitoisuudessa 0,5 mM, ja laimennetaan lämpimällä elatusaineeseen pitoisuuteen 2,5 uM. Väliaine, joka sisältää yhden indikaattorin väriaineet lisättiin soluihin. Inkuboinnin jälkeen viljelmät koettimien kanssa 20 minuuttia, solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin trypsiinillä ja otettiin talteen analyysiä varten FACS: llä. Fluoresenssia CM-H

2DCFDA kerättiin FL1 kanavalla, ja MitoSox Red on FL2-kanavalla. Kunkin kokeen sisältyvät solut, joita ei ollut käsitelty kanssa Bezielle. Fluoresenssin tasot näiden käsittelemättömien soluille mielivaltainen arvo on 1, ja fluoresenssi Bezielle käsiteltyjen solujen on esitetty kuvioissa, koska ”kertaiseksi” käsittelemättömiin soluihin.

Lentivirus – välitteinen siRNA ja geeniekspression

NOX4 vaiennettu, kuusi shRNA konstrukteja LKO plasmidivektoriin ostettiin Open Biosystems /Thermo. Virukset tuotettiin HEK293-soluissa mukaan valmistajan ohjeiden ja käytetään transdusoimaan soluja, jota seurasi valinta käyttäen ennalta määrätty pitoisuus on puromysiinin.

Mittaukset solujen elävyyden, solujen lukumäärän ja apoptoosin

Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen CCK-8 kit (Dojindo). Solukuolemaa analyysi tehtiin käyttämällä anneksiini V /propidiumjodidivärjäys sen jälkeen virtaussytometrialla. Solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä niiden kasvatusväliaineita pestiin PBS: llä ja värjättiin anneksiini V- FITC (BioVision) ja propidiumjodidia (PI), ja analysoitiin heti 5 minuutin inkubaation avulla CellQuest- ohjelmiston FACScan (Becton Dickinson). ATP kvantitoitiin ATP Bioluminescence iinianalyysikitissä HS II (Roche Applied Science).

kvantifiointi pelkistettyä glutationia käyttäen fluoresoiva koetin monobromobimane

Solut 96-kuoppaisilla levyillä, käsiteltiin kuten halutaan, hoito media poistettiin ja substituoitu väliainetta, joka sisälsi 8 ​​uM monobromobimane (MBB). Fluoresenssi luettiin levylukijalla suodattimilla asetettu eksitaatio 360 nM ja emissio aallonpituudella 460 nM.

Western blot-analyysi

kokosolulysaateille elektroforeesi SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille . Membraanit blotattiin vasta-aineita suositellaan pitoisuuksina yli yön 4 ° C: ssa ja sitoutuneet primaaristen vasta-aineiden havaittiin käyttäen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Blotit kehitettiin käyttäen SuperSignal tehostetun kemiluminesenssin (Pierce) ja kuvattiin Kodak Imager ISR2000.

Comet määritys

Comet analyysit suoritettiin käyttäen Comet määritys pakki Trevigen mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut kerättiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: llä. Solut yhdistettiin sulaan, matalan sulamispisteen agaroosia 37 ° C: ssa ja pipetoitiin asti Comet dioja. Agaroosi annettiin jähmettyä 4 ° C: ssa 30-40 minuutin ajan, ja objektilasit upotettiin kylmään lyysiliuosta (Trevigen, Inc.) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Objektilasit upotettiin seuraavan juuri valmistettuun alkali- liuosta (300 mM NaOH: a ja 1 mM EDTA: ta) 20 minuutin ajan ja suoritettiin elektroforeesi samassa emäksisessä puskurissa 15 V (0,5 v /cm) ja 300 mA: ssa 25 min. Objektilasit huuhdeltiin vedellä ja kiinnitettiin 70% etanolilla 5 minuutin ajan. Ilmakuivauksen jälkeen tumat värjättiin SYBR vihreä (Trevigen, Inc.) ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla. Prosenttiosuudet solujen komeettoja kvantitoitiin kaksi tarkkailijaa sokeaksi identiteettiä dioja. Tumat myös valokuvattiin ja analysoitiin TriTek CometScore kuva-analyysi-ohjelmisto. Olive tail hetkellä määritelty tuote prosenttiosuus DNA häntää ja siirtymä aseman keskimääräinen massakeskipisteisiin päät ja hännät, määritettiin vähintään 40 solua näytettä kohti.

Metabolinen analyyseja Seahorse XF96 Solunulkoisilla Flux Analyzer

solut maljattiin yön XF96 PET 96 kuoppalevyille kokeellisesti ennalta määrätty määrä (10 x 10

3 solua kohti hyvin MDAMB231 ja 12 x 10

3 solua kuoppaa kohti MCF10A). Metabolinen vuot analysoitiin Seahorse XF96 analysaattori kohti valmistajan ohjeiden aikaisemmin kuvatulla [25]. Basal ECAR (solunulkoinen happamoituminen korko, mph /min), OCR (hapenkulutus hinnat, vuonna pmoolia O

2 /min) ja PPR (normalisoitu protoni tuotantomäärä, nmol H + /min) mitattiin 4 sykliä. Kukin sykli koostui 3 minuutissa median sekoitusaika ja 5 minuuttia mittausten ajan. Mittaamisen jälkeen pohjapinta tasoilla ECAR ja OCR 4 sykliä, mitokondrio uncoupler FCCP 1 uM automaattisesti ruiskutetaan koekaivoja jotta määrällisesti suurin hengitystä kapasiteettia, eikä mitokondrioiden varauksesta. Seuraavat: yksi sykli mittausten estäjä mitokondrion kompleksin III Antimysiini- 5 uM ruiskutettiin koekaivoja, ja toinen mittausjakso suoritettiin sen varmistamiseksi, että hapen kulutus oli mitokondrioiden alkuperää. Jokainen kokeellinen piste oli keskimäärin 6-10 replica kuoppiin kussakin kokeessa, ja kokeet toistettiin vähintään 3-4 kertaa. Kokeelliset tiedot katsottiin hyväksyä ainoastaan, kun vaihtelut pH-arvojen välillä sekoitus ja toimenpide syklit olivat alle ,05-0,1 pH-yksikköä. Näin varmistettiin, että ECAR tietoja ei ole keinotekoisesti muutettu muutokset pH-arvoja, ja itse asiassa lähes yhdenmukainen muutoksia PPR arvoihin. Normalisoituminen saadut arvot XF96 määrityksissä suoritettiin käyttäen kvantifiointiin solujen DNA kokeelliseen levyjen kanssa CyQuant määritystä (Promega). Kaikki XF96 tiedot ilmaistaan ​​ECAR tai OCR-arvot normalisoitu DNA-pitoisuutta.

Tulokset

rooli mitokondrioiden induktioon ROS ja solukuoleman Bezielle

ovat raportoineet aiemmin, että Bezielle on selektiivisesti sytotoksinen rintasyövän solulinjoissa, mutta ei ei-transformoitujen solujen, kuten kuolemattomiksi maitorauhasen parit ja fibroblastien, jotka ovat suhteellisen resistenttejä solumyrkkyvaikutuksessa [8]. Olemme sen jälkeen testattiin Bezielle n sytotoksisuutta yli kaksi kymmeniä syöpäsolun linjat ja neljä erilaista kuolemattomia solulinjoja ja ensiöparit. Havaitsimme, että keskimäärin ei-transformoidut solut ovat paljon vähemmän herkkiä Bezielle että tasyöpäsolulinja (käsikirjoitus valmisteilla). Kuvio 1A havainnollistaa näitä havaintoja kaksi solulinjaa: rintasyöpä linja MDAMB231 ja kuolemattomaksi epiteelin linja MCF10A. Olemme havainneet, että herkkyys Bezielle yleensä ei korreloi suoraan leviämisen määrä solulinjojen (tietoja ei esitetty). Näin ollen, leviämisen määrä ei-transformoitujen MCF10A soluissa on itse asiassa hieman suurempi kuin syöpäsolulinjojen MDAMB231, ja on paljon korkeampi kuin muiden rintasyövän solulinjat, jotka ovat herkkiä Bezielle [8].

. Bezielle indusoi solukuoleman kasvainsolut, mutta on vähemmän sytotoksinen kohti ei-transformoitujen rintarauhasen soluihin. Rintasyöpäsolulinjaa MDAMB231 ja ei-transformoituja line MCF10A käsiteltiin Bezielle ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen CCK-8 määritys kit. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 4). B. Soluja käsiteltiin Bezielle 250 ug /ml: ssa puoli tuntia tai 6 tuntia, ladattu ROS herkkä antureista, ja analysoitiin virtaussytometrialla vihreälle (H

2DCFDA) tai punainen (MitoSox) fluoresenssi. Tulokset ilmaistaan ​​kertainen fluoresenssin käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin koetin-sisältävistä soluista. Tulokset ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 3). Merkittävät erot MDAMB231 ja MCF10A ilmoitetaan (** P 0,01). C. Western blot-analyysi MDAMBRho-0-solut valitaan matalan pitoisuuden etidiumbromidia vahvistaa poistaminen mitochondrially koodatun alayksikköä 2 hengityksen monimutkaisia ​​IV, ja näin ollen inhibitioon OXPHOS. D, analyysi ROS induktion Rho-0-solut suoritettiin, kuten on kuvattu BE-analyysi solukuoleman induktion Bezielle Rho-0-solut suoritettiin, kuten on kuvattu julkaisussa A. Merkittävät erot ilmoitetaan ryhmät on merkitty (* P 0,05; ** P 0,01).

induktio kuoleman syöpäsolujen Bezielle on suora seuraus induktion ROS ja oksidatiivisen stressin, koska yhtäaikainen käsittely antioksidantteja N-asetyyli-kysteiini (NAC) tai pyruvaatti esti DNA-vaurioita ja solukuolemaan [8]. Meidän tavoitteena oli tunnistaa solujen lähteiden Bezielle-indusoidun ROS. Solulinjat käsiteltiin Bezielle eri aikoina ja täynnä solun läpäisevä indikaattorit ROS CM-H

2DCFDA joka tulee fluoresoiva vastauksena peroksidin tyypin happiradikaaleja [26], tai MitoSox Red, hyvin selektiivinen mitokondrioiden superoksidi [ ,,,0],27]. Olemme havainneet vähitellen ajasta riippuvainen kasvu ROS rintasyövän solulinjoissa MDAMB231 ja SKBr3, mutta ei MCF10A soluissa hoidon jälkeen Bezielle (kuvio S1). Kuvio 1B havainnollistaa ROS tasoilla 30 minuuttia ja 6 tuntia hoidon jälkeen. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen fluoresenssin yli, joka nähdään käsittelemättömiä soluja ladattu fluoresoivaa indikaattoria. MDAMB231 tuotti enemmän ROS kuin MCF10A solujen jo ensimmäisen 30 minuutin inkubaation Bezielle, mutta ajan ero ROS tasot indusoitiin kahden solulinjan tuli yhä selvemmin. Kuuden tunnin käsittelyn sekä peroksidia ja mitokondrioiden superoksidi nousivat noin viisi ja kuusi-kertaiseksi, vuonna MDAMB231 soluissa. Kasvu ROS tasoilla MCF10A oli paljon vaatimattomampi, ja tuskin ylitti kaksinkertaiseksi yli pohjapinta ROS pitoisuussuositukset 6 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 1 B). On mahdollista, että jatkuva kertyminen ROS kasvainsolulinjoissa liittyy suoraan niiden herkkyyttä Bezielle.

Nämä tulokset aiheuttivat kysymykseen luonteesta peroksidi tyyppi radikaalien aiheuttama Bezielle: nimittäin, ei Bezielle aiheuttaa sekä peroksidia ja superoksidi, tai on peroksidi pelkkä muuntaminen tuote mitokondrioiden superoksidi? Ottaen huomioon, että superoksidi on lyhytikäinen laji reaktiivisen hapen, korkeaa tasoa se havaittiin 6 tuntia johtuvat todennäköisesti jatkuvan mitokondrioiden. Vastaavasti korkea peroksidi tyyppi ROS voitaisiin saadaan muunnettaessa superoksidi peroksidi mukaan superoksididismutaasi.

Jotta voidaan tutkia roolia mitokondrion superoksidi solukuoleman aiheuttama Bezielle, olemme palkanneet hyvin testattu menetelmä käytöstä poistamisen mitokondrioiden hengityksen viljelemällä soluja etidiumbromidin läsnä ollessa. Viljelyn jälkeen solujen pitoisuus on alhainen etidiumbromidia ja 6 viikkoa, nämä solut (MDAMB231Rho-0) ovat menettäneet ekspression mitokondrioiden koodaamien proteiinien mitokondrion genomissa, kuten nähdään kuviossa 1C, mikä tekee mitokondrioiden ei toimi. Tämä vahvistettiin myös tutkimalla mitokondrioiden hapenkulutusta MDAMB231 Rho-0 solujen, joka oli vähentynyt huomattavasti (katso alla, kuvio. 6). Rho-0-soluja käsiteltiin Bezielle, ja tutkittiin induktio ROS ja solukuoleman. Kuviossa 1D on esitetty, että MDAMB231 Rho-0-solut, kuten odotettua, eivät tuota mitokondrioiden superoksidi vastauksena Bezielle, vahvistaa tehtävän mitokondrion elektronin liikenteen induktio ROS mukaan Bezielle. Tasot peroksidia syntyy Bezielle käsitelty Rho-0-solut hieman kasvoi 30 minuutin inkuboinnin, mutta osoitti kasva enää ajan kuluessa (kuvio 1 D), tukee voimakkaasti ehdotusta, että korkea peroksidipitoisuudet voi johtua suurelta osin muuntaminen mitokondrioiden superoksidi. Tärkeintä on, MDAMB231 Rho-0-solut vahvasti suojattu indusoimaa solukuolemaa Bezielle (kuvio 1 E), mikä viittaa keskeistä roolia mitokondrioiden kasvainsolujen kuolemaa käsiteltiin Bezielle.

Mahdolliset muut solulähteet ROS aiheuttama Bezielle

tiedot edellä kuvattu voimakkaasti syytöstä mitochondrially syntyy superoksidia Bezielle sytotoksisuuteen. Vaikka induktio mitokondrioiden superoksidia Bezielle on täysin estetty Rho-0-solut, CM-H

2DCFDA havaittavissa peroksidi tyyppi ROS, kuten edellä on mainittu, ei ole poistettu kokonaan (kuvio 1 D). Olemme katsoneet sitä mahdollisuutta, että jotkut muut solun entsyymejä, jotka pystyvät tuottamaan peroksidia tai extra-mitokondrioiden superoksidi voivat myötävaikuttaa aiheuttamaa oksidatiivista stressiä Bezielle. Olemme käyttäneet estäjiä useiden solun entsyymejä, jotka tuottavat ROS: difenyleenioksi- jodonium (DPI) ja apocynin eston NADPH oksidaaseja; allopurinoli estää xantine oksidaasi, nordihydroguaiaretic happoa (NDGA) estää LOX, ja Nitro-L-arginiini-metyyliesteri (L-NAME) inhiboida typpioksidin syntaasia. MDAMB231-soluja käsiteltiin Bezielle läsnä kunkin nämä inhibiittorit, ja solukuolemien sekä ROS induktio kvantitoitiin asiaa määrityksissä. Mikään estäjien vähentää ROS tasoilla Bezielle käsiteltyjä soluja lukuun ottamatta DPI (ei esitetty, ja kuvio 2A). Vastaavasti, lukuun ottamatta DPI, mikään ei osoittanut suojaavaa vaikutusta solun kuoleman (ei esitetty).

. MDAMB231-soluja inkuboitiin Bezielle puuttuessa tai läsnä 0,75 uM DPI: ssa 6 tuntia ja tutkittiin ROS. B. solukuolemaa MDAMB231cells käsitelty Bezielle 24 tunnin poissa tai läsnä ollessa 0,75 uM DPI. Kaikki tulokset A ja B ovat keskiarvo ± keskivirhe (N = 3). Merkittävä ero (* P 0,05; ** P 0,01) välillä osoitti ryhmät nähdään. C, solukuoleman -rintakarsinoomasolujen SKBr3 käsitelty Bezielle 24 tunnin poissa tai läsnä ollessa 0,75 uM DPI. Tulokset ovat keskiarvo kahdesta kokeesta.

Kuvio 2A esittää eston sekä peroksidi tyyppi ROS ja mitokondrioiden superoksidituotantoon DPI Bezielle käsiteltyjä soluja. Havaittu voimakas esto mitokondrioiden superoksidia DPI oli odottamaton, koska esto NADPH oksidaasien (NOx) ei pitäisi olla syvällinen vaikutus mitokondrioissa, vaikka jotkut julkaistut tutkimukset viittaavat siihen, että on olemassa rajat talk välillä Nox aktivointi ja mitokondrioiden tuotantoa superoksidi [28], [29]. Kuitenkin, DPI on myös raportoitu olevan voimakas estäjä mitokondrioiden superoksidin todennäköisesti läpi ei-spesifinen esto NADH-ubikinonia oksidoreduktaasi mitokondrion kompleksin I [30].

Ei ole yllättävää, inhibitio Bezielle indusoidun ROS jonka DPI oli suojaava vaikutus Bezielle solukuolema (kuvio 2B). Vaikka DPI yksin oli hieman sytotoksinen soluille, se vaimenee voimakkaasti indusoimaa solukuolemaa Bezielle (kuvio 1E). Sulkea pois mahdollisuutta, että vaikutukset DPI hoito ovat erityinen piirre MDAMB231 soluja, olemme tutkineet vaikutuksia DPI solukuoleman ylimääräinen rinsyöpäsolulinja SKBr3. SKBR3 solut osoittivat vielä vahvemman suojan DPI kuin MDAMB231, mikä osoittaa, että suojaava vaikutus DPI kohti Bezielle ei ole yksittäinen ilmiö (kuvio 2C).

Olemme siis tutkia, mikäli ei-fagosytoottiseksi NOX tiedetään ilmaistaan ​​rinta- kasvaimissa [29], [31] voisi osallistua Bezielle sytotoksisuuteen. Tulokset näistä kokeista on esitetty kuvassa S2. Lyhyesti, vaikka NOX4 näyttää voimistuvan Bezielle kasvainsoluissa, osittainen hiljentäminen sen ilmentymisen MDAMB231 soluissa osoitti että NOX4 tuotettu ROS eivät merkittävässä asemassa solukuoleman aiheuttama Bezielle.

Kysymys, kuitenkin edelleen pysynyt noin mekanismi mitokondrioiden ROS vähennys DPI. Olemme havainneet, että DPI, jopa alhaisessa konsentraatiossa käytetään tässä, estää mitokondrion hengitystä (katso jäljempänä), ja näin ollen itse asiassa toimii estäjä OXPHOS, samanlainen ablaatio mitokondrioiden toimintaa Rho-0-solut.

induktio DNA-vaurioiden

Bezielle aiheuttaa oksidatiivisen DNA-vaurioita, joka on kriittinen sen kyky valikoivasti tappaa syöpäsoluja [8]. Olemme tutkineet, miten puute toiminnallisten mitokondrioiden ja hoitoa DPI vaikuttaa induktion DNA vaurioita Bezielle sisään MDAMB231 soluissa. Solut käsiteltiin Bezielle analysoitiin Comet määritys kahden parametrin DNA-vaurion: prosenttia solujen vaurioitunut DNA, ja oliivin hetkellä (heijastaa laajuus DNA-vaurioita yksittäisissä soluissa). Kuten kuviosta 3A nähdään, käsittely Bezielle johti vähitellen yhä enemmän solujen DNA-vauriota jopa 6 tuntia. Tuon ajan jälkeen piste, kuolleet solut huonontunut tai vakavasti vaurioitunut DNA alkoi varaamiseen, jolloin komeetta määrän laskeminen oli vaikeaa. Analyysi komeetta takaosan liike (kuvio 3B) paljasti jyrkkää lisäystä DNA vaurioita solua kohden aiheuttama Bezielle ajan. Lisääntyvä määrä DNA-vaurioita solua kohti ajasta riippuva tavalla korreloi hyvin havaittu nousu ROS tasoilla (kuvio 2B).

. MDAMB231 ohjaus solut (MM231), MDAMB231 Rho-0 variantti (RHO-), tai MDAMB231-solujen läsnä ollessa, DPI (+ DPI) käsiteltiin Bezielle annettu aika ja altistettiin emäksisiä Comet määrityksen analyysi. Tulokset on esitetty prosentteina soluja, jotka muodostavat komeettoja, keskiarvo ± S.E. (N = 3). Merkittäviä eroja (* P 0,05; ** P 0,01) välillä Rho-0 ja kontrolliryhmää, ja DPI-käsiteltyjen ja kontrolliryhmien näkyvät. B. Samat kokeet kuin A, mutta tulokset näytetään keskiarvo oliivi hetkiä komeettoja aiheuttama Bezielle kolmessa solupopulaatioiden. Vähintään 50 komeettoja analysoitiin kohti kunakin ajankohtana neljässä erillisessä kokeessa. Merkittäviä eroja (** P 0,01) ei havaittu kontrolli solujen ja sekä Rho- ja DPI-käsiteltyjen ryhmien. C. Prosenttiosuudet MCF10A solujen osoittaa DNA-vaurioita eri aikoina inkuboinnin jälkeen Bezielle, tulokset ovat keskiarvo ± S.E. (N = 3). Merkittäviä eroja (* P 0,05; ** P 0,01) solujen välillä käsiteltiin 30 minuuttia verrattuna sekä 2 ja 6 tuntia näytetään. D. Western blot-analyysi PARP aktivointi (PAR) on osoitettu soluissa, joita käsiteltiin Bezielle 1 tunnin ajan. Esitetään myös, ettei ilmentymisen mitochondrially koodatun proteiinin (kompleksi IV alayksikkö II) Rho-0-solut, ilmaisu mitokondrioiden proteiinin VDAC koodattu tuman DNA: han, sekä β-aktiini latauskontrollina. E. MDAMB231-soluja ja MDAMB231-Rho-0-soluja käsiteltiin Bezielle varten ilmoitettu ajat ja analysoitiin mahdollisia poly-ADP-ribosyloi proteiineja. β-aktiini toimii latauskontrollina.

MDAMB231 Rho-0-solut, alle puolet solujen käsitellyn populaation osoitti DNA-vaurion läsnäollessa jopa 6 tunnin jälkeen (kuvio 3A), ja oliivi hetkellä analyysi havaittu alhainen DNA vaurioita solua kohden, joka ei kasvanut ajan myötä (kuvio 3B). Läsnäolo DPI oli rajallinen vaikutus solujen määrä DNA vaurioita, mutta oli voimakas estävä vaikutus kasvuun DNA-vaurioita solua kohti ajan. Heikko vaikutus DPI lukumäärään solujen DNA-vaurioita saattaa liittyä heikompi suojaava vaikutus DPI vastaan ​​Bezielle aiheuttamaa kuolemaa verrattuna suoja Rho-0-solut (kuvio 1 E ja 2B).

Olemme lisäksi analysoitiin Bezielle indusoidun DNA-vaurioita MCF10A soluissa, ja ovat havainneet, että vaikka jatkuva läsnäolo Bezielle kasvun media, DNA-vaurioita näissä soluissa voitiin vähentää asteittain ajan myötä (kuvio 3C). Ehdotamme, että paljon alhaisempi ROS indusoituu MCF10A soluissa (kuvio 1 B) johti rajoitettu tasoja DNA-vaurioita, jotka onnistuneesti korjattu. Tämä saattaa selittää ajasta riippuva väheneminen DNA-vaurioita MCF10A soluissa.

Olemme dokumentoitu hyper aktivoitumisen PARP kasvainsoluissa käsitelty Bezielle, ja sen rooli solukuoleman induktioon. Olemme tutkineet jos PARP aktivoitiin MDAMB231 Rho-0 solujen tai DPI-käsitellyissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 3D, PARP on voimakkaasti aktivoitu MDAMB231-soluja. Rho-0 solujen, PARP aktivointi oli merkittävästi vähemmän kiinteää. DPI-käsiteltyjä soluja, Bezielle aktivoitu PARP tasoille näiden havaittu kontrolli versus Rho-0-solut (kuvio 3D). PAR-ylation proteiinien MDAMB231 soluissa jatkui tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta Bezielle, mutta Rho-0 solujen aktivoitumista PARP oli paitsi paljon heikompi, mutta myös ohimeneviä (kuvio 3E). Kaikkiaan edellä mainitut tiedot osoittavat, että puuttuu toiminnallisia mitokondrioita esti voimakkaasti induktion ROS, DNA vaurioita, aktivointi PARP ja solukuoleman Bezielle. Yhteenvetona toteamme, että mitokondriot ovat ensisijainen solu tavoite Bezielle.

Syöpäsolut käsitelty Bezielle läpikäyvät romahdus oksidatiivisen puolustusjärjestelmää

Aiemmin julkaistut analyysin transkription aiheuttamien muutosten Bezielle kasvainsoluissa [8] osoitti, että glutationin redoksijärjestelmän harjoittaa soluvasteen Bezielle, johtopäätös tukevat viimeaikaiset proteomic ja metabolomic analyysit [24]. Näin ollen kohonnut ilmentyminen cystathionine-beeta-syntaasin ja glutamaatin kysteiini ligaasi muokkaaja GCLM havaittiin Bezielle kasvaimen soluissa, mutta ei ei-transformoiduissa soluissa. Siksi tutkimme tasot pelkistettyä glutationia (GSH) käsitellyissä soluissa Bezielle. Tulokset kuviossa 4A esittävät vahva ja nopea lasku GSH MDAMB231 soluissa. Tasot GSH oli jonkin verran pienentynyt MCF10A, mutta lasku GSH oli suhteellisen lieviä eikä jatkuvaa. Pitemmillä inkubaatioajat, GSH lähes kokonaan tyhjentynyt MDAMB231 soluissa (ei esitetty). GSH on tärkeä antioksidantti, ja muuntaminen hapettuneen GSH (GSSG) ja GSH vaatii NADPH. Olemme siis tutkinut tasot NADPH käsitellyissä soluissa Bezielle. Senkin jälkeen, kun vain 4 tuntia (kuvio 4B), oli syvällinen ehtyminen NADPH MDAMB231-soluja.