Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvaimeen liittyvät makrofagit on osoitettu edistävän kasvaimen kasvua. Ne voivat olla pakollinen funktio angiogeneesissä, invaasio ja etäpesäkkeiden kautta tulehduksellisten välittäjäaineiden. Niiden läsnäolo munasarjasyövän on korreloitu huonon ennusteen näillä potilailla. Ihmisen kationinen antimikrobinen proteiini-18 (hCAP18) /LL-37 tunnistettiin alun perin efektori- molekyylin luonnollinen immuniteetti. Se vapautuu synnynnäisen immuunijärjestelmän solut, kuten makrofagit, torjumaan mikro-organismeja. Aiemmat tutkimukset ovat ominaisia ​​hCAP18 /LL-37 kuin kasvutekijä, joka on osoitettu edistävän munasarjojen syövän etenemiseen. Kuitenkin rooli hCAP18 /LL-37 on in makrofagin edistänyt munasarjojen kasvainten kehittymiseen ja miten sen ilmentymistä ohjataan tässä yhteydessä edelleen huonosti ymmärretty. Tässä osoitamme, yhteistyössä kulttuuri kokeita makrofagien ja munasarjasyöpäsoluja merkittävä kasvu

in vitro

leviämisen ja invaasiokyvyssä kasvainsolujen havaitaan. Nämä tehostettu kasvu ja invaasio ominaisuudet korreloivat hCAP18 /LL-37 induktio. HCAP18 /LL-37 ilmentyminen väheni lisäämällä kaksi neutraloivien vasta-aineiden, TLR2 tai TLR6 sekä Cyp27B1 tai VDR-inhibiittorit. Lisäksi joko TLR2 tai TLR6-vasta pienentää D3-vitamiini signalointi ja kasvainsolun eteneminen

in vitro

. Lisäämällä Cyp27B1 tai VDR-inhibiittorit kumottu TLR2 /6 aktivaation indusoima hCAP18 /LL-37 makrofageissa. Knockdown Kasvainten tuotetun versikaani V1 RNAi näissä kasvainsolujen johti vähentynyt induktion hCAP18 /LL-37 makrofageissa. Versikaani V1 Knockdown esti myös TLR2 ja D3-vitamiinin signalointi, sekä kasvua ja invasiivisuus näiden kasvainsolujen

in vitro

yhteistyössä kulttuuri. Yhteenvetona, olemme havainneet, että versikaani V1 parantaa hCAP18 /LL-37 ilmentyminen makrofagien aktivaation kautta TLR2 ja sen jälkeen D-vitamiini-riippuvaisten mekanismeja, jotka edistävät munasarjojen syövän etenemisen

in vitro

.

Johdanto-osan : Li D, Wang X, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang F, et ai. (2013) Tumor-Tuotettu versikaani V1 Parantaa hCAP18 /LL-37 ilmentyminen makrofageissa kautta aktivointi TLR2 ja D3-vitamiini Signaling edistää munasarjasyöpä Progression

In vitro

. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10,1371 /journal.pone.0056616

Editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2012 Hyväksytty: 15 tammikuu 2013; Julkaistu: 12 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China apurahat (81272603); Tutkimusohjelma komitean Science and Technology of Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvain mikroympäristölle on kriittinen rooli kasvaimen aloittamista ja edistämiseen. Tämä ainutlaatuinen microenvironment sisältää synnynnäisen immuunijärjestelmän solut, lymfosyytit ja sidekudos sekä pahanlaatuisten solujen [1]. Synnynnäisen immuunijärjestelmän solut (tunnetaan myös ydinsoluissa), sisältävät makrofagit, vapautumista sytokiinien ja kemokiinien sekä vaikuttaa kasvaimen kehittymisen [1] – [3]. Kasvaimeen liittyvä makrofagit (TAM) ovat tärkeä osa tulehduksellisten infiltraattien kasvaimissa. TAM on johdettu kiertävä monosyyttistä lähtöaineita kemoattraktantit, erittämä molemmat kasvain ja stroomasolujen [4], [5]. Kliiniset tutkimukset edelleen osoitettava korrelaation korkea populaatiot TAMeja huonon ennusteen munasarja-, rinta-, eturauhas-, keuhko-, ja kohdunkaulan syöpiä [6] – [8]. On yhä enemmän todisteita siitä, että useat proinflammatoristen tekijöiden tuottaman makrofagit, edistää kasvaimen kasvua, angiogeneesiä, hyökkäystä, ja etäpesäkkeitä [1], [5], [9]. Kuitenkin todellinen rooli useita keskeisiä proinflammatoristen molekyylien olla kasvaimen edistämisen ja niiden mekanismit ilmaisun ja toiminto on huonosti.

Ihmisen kationinen antimikrobinen proteiini-18 (hCAP18) /LL-37 on ainoa tunnettu cathelicidin peptidi ihmisellä [10]. HCAP18 /LL-37 on konstitutiivisesti tuotettu lukuisissa solutyypeissä mukaan lukien makrofagit, neutrofiilit, ihon epiteelisolujen ihon, ruoansulatuskanavan ja virtsateiden, jonka lisäkivesten ja hengitysteiden epiteelisolut [11], [12]. HCAP18 geeni koostuu 3 domains: N-terminaalisen signaalipeptidin alueella, erittäin konservoitunut kateliini kaltainen domeeni ja C-terminaalinen alue, jota kutsutaan LL-37-peptidi [13]. LL-37 peptidi ylläpidetään sen pro-peptidin muodossa vuoden pilkkomisen proteaasilla 3 juuri ennen erittymiskykyisiksi [14], [15]. LL-37 peptidi palvelee eri toimintoja eri immuunijärjestelmän reaktioita, kuten immuuni modulaatio, tulehdusreaktio, soluproliferaatioon, angiogeneesiin, ja antiapoptoottisten toimintaa [16]. LL-37 on perustettu myötävaikuttamassa kasvaimien syntyyn ja syövän etenemistä [16], [17]. Tutkimukset ovat osoittaneet munasarjasyöpiä LL-37, myötävaikuttaa solujen lisääntymistä, invaasiota ja syövän etenemisessä suoraan stimulaation kasvainsolujen, aloittamisesta angiogeneesin ja immuunisolujen [14], [18], [19]. Hoidon synteettinen, biologisesti aktiivinen LL-37 peptidin tai siirtogeenisiä ilmentymisen LL-37 lisää merkittävästi keuhko- kasvainsolujen proliferaatiota. Tämä tutkimus viittaa siihen, että LL-37 toimii kasvutekijä ihmisen keuhkosyövän [20]. Lisäksi LL-37 myös katsotaan lisäävän lisääntymistä ja etäpesäkkeiden rinta- kasvaimia ja pahanlaatuisten melanoomien [21], [22]. Yhdessä nämä tulokset tukevat hypoteesia, että LL-37 toimii kasvutekijän transformoiduissa soluissa.

erilaisia ​​ärsykkeitä, mukaan luettuna proinflammatoristen molekyylien, kasvutekijöitä, ravinteita, bakteeri- tuotteita, ja erityisesti tulehdusta ja vahingon ylös -regulate ilmentyminen hCAP18 /LL-37 [16]. Ihmisillä 1,25-dihydroksi-D3 (1,25D3) ylössäätelee ilmentymisen hCAP18 /LL-37 kautta D-vitamiinin reseptorin (VDR) monosyyteissä, makrofageissa, kerationocytes orvaskeden [23], [24]. Aikaisempi tutkimus, joka keskittyi solunsisäinen

Mycobacterium tuberculosis

osoitti TLR2 aktivoitumista ihmisen makrofageissa sääteli ilmentymä VDR ja Cyp27B1 geenejä. Tämä kaskadi tapahtumien lisää tuotantoa 1,25D3, mikä puolestaan ​​johtaa siihen, että induktio hCAP18 /LL-37 [24]. Viimeaikaiset tutkimukset kasvaimen mikroympäris- ovat osoittaneet Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) tuotettujen solujen tekijät, kuten versikaani, jotka ovat tarpeen keuhkojen kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden. Lisäksi tämä prosessi on riippuvainen TLR2-välitteisen myeloidisolun aktivaation [25], jolloin NF-KB: n aktivoitumista inflammatoristen tekijöiden TNFa, IL-6: n tuotantoa [26], [27].

Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia sääntelyn mekanismeja hCAP18 /LL-37 kasvaimen mikroympäristössä. Me raportoimme tässä versikaani V1 peräisin kasvainsolujen parantaa hCAP18 /LL-37 ilmentyminen makrofagien aktivoitumisen kautta TLR2 ja sen jälkeen D-vitamiini-riippuvainen mekanismeja. Lisäksi on tämä ketju solusignalointi tapahtumien joka edistää munasarjojen kasvainsoluproliferaation ja invaasiota. Nämä tulokset ehdottavat uusia mekanismia hCAP18 /LL-37 sääntelyn kasvaimen mikroympäristössä. Lisäksi ne tarjoavat oivalluksia kriittiset tekijät osallistuvat syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa OV-90 ja SKOV3 solut saatiin American Type Culture Collection, ja muita ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa HO-8910, 3AO solut ostettiin Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan Academy of Science. Nämä solut viljeltiin Dulbeccon modifioitu Eagles (DMEM) (Hyclone laboratorioissa. Inc, South, Utah, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 U /ml streptomysiiniä (Hyclone laboratorioissa. Inc). Soluviljelmät suoritettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa 5% CO

2. FCS korvattiin 10% täydennys-inaktivoitua ihmisen seerumia (HS) (saatu veri pankki Tongji sairaalan Tongji yliopiston. Institutional hyväksyntää paikallisten tutkimus- eettisten komiteoiden (sisäinen tarkistus sekä eettiselle hallitusten Tongji sairaala, Tongjin yliopisto ) saatiin ennen tutkimuksen tässä tutkimuksessa) 24 tuntia ennen koetta. Neutraloivien vasta-aineiden anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /ml, klooni # mAb 3D11, HyCult biotekniikan, Hollanti), anti-TLR2 (10 ug /ml, klooni # mAb 383936, R Abcam, Cambridge, UK) ja kanin anti-hCAP18 /LL-37 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), hiiri anti β-aktiinin (1:10000; Sigma Aldrich, Steinheim, Saksa). HRP-konjugoitua vuohen anti-kani (1:5000; Santa Cruz Biotechnology) tai kanin anti-hiiri (1:1000, Dako, Glostrup, Tanska) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena.

RNA: n eristys ja reaaliaikainen PCR

Solun koko RNA: t valmistettiin RNeasy plus mini (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) valmistajan suositusten mukaan. Reaaliaikainen PCR-reaktioseosten on kuvattu aikaisemmin [28]. Lyhyesti, cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptioreaktio käyttäen First Strand cDNA-synteesi (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad) koskevasta AB 7300 reaaliaikaista PCR-järjestelmän koneen (AB Applied Biosystems, Singapore). Seuraavia PCR-alukkeita käytettiin: β-aktiini, 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ’ja 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; hCAP18 /LL-37, 5’-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 ’ja 5′-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3′; VDR, 5’-AAGGACAACCGACGC CACT-3 ’ja 5′-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3′; Cyp27B1, 5’-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 ’ja 5′-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3′; Cpy24, 5’-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 ’ja 5′-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3′; TLR1, 5’-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 ’ja 5′-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3′; TLR2, 5’-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 ’ja 5′-ATTATCTTCCGCAGCTTGC A-3′; TLR3, 5’-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 ’ja 5′-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3′; TLR4, 5’-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 ’ja 5′-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3’; TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 ’ja 5′-A TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3′; CD14, 5’-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 ’ja 5′-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3’. Erityisyys RT-PCR hallinnassa ”ei käänteistranskriptio” valvonnan ja sulamiskäyräanalyysi. Kvantitatiivinen PCR tulokset saatiin käyttämällä ΔΔCT (syklin kynnys) menetelmällä. Data normalisoitiin p-aktiini-tasot kussakin näytteessä.

ELISA-määritys versikaani

Näytteitä soluviljelmän supernatantit analysoitiin ihmisen versikaani ELISA (USCN life science, INC. Houston, TX, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Detektioraja määrityksessä oli 0,107 ng /ml.

Tilastollinen

Arvot näkyvät keskiarvona ± SEM. Vertailut ryhmien välillä analysoitiin t-testi (kaksipuolinen). Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittävä P-arvot alle 0,05.

Tulokset

ilmentyminen hCAP18 /LL-37 makrofageissa edistää leviämisen ja invasiivisuus munasarjasyövän solujen

TAMs korvattiin perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagien varten

in vitro

yhdessä viljelemisen kokeilu oli raportoitu eri ryhmiin. Nämä raportit osoittavat, että perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagien on vastaava toiminto TAMeja [27], [31]. Määrittää vaikutus makrofagien on munasarjasyöpäsoluja lisääntymistä, siirtokuoppaan insertit käytettiin rinnakkaisviljelmätilanteessa malli. Ihmisen perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagien pantiin Transwell-irto ja eri munasarjasyövän solulinjoissa ympättiin pohjassa 24-kuoppaisilla levyillä. Co-kulttuuri soluja kasvatettiin 4 päivää yhdessä viljelemisen DMEM, joka sisälsi 10% HS tai hoito EGF, positiivisena kontrollina. Kasvu HO-8910, OV-90, SKOV3- ja 3AO solut lisääntyi merkittävästi, kun viljeltiin yhdessä ihmisen makrofagien, jotka ovat peräisin perifeerisen veren monosyyteistä (Fig. 1A). Estää hCAP18 /LL-37-toiminto monosyytti-soluja esikäsiteltiin hCAP18 /LL-37 neutraloivan vasta-aineen, ennen kuin yhdessä viljelemisen munasarjasyöpä soluja. Yhdessä kulttuuri kokeissa, joissa monosyyttejä esikäsitelty hCAP18 /LL-37 neutraloivan vasta merkittävän eston HO-8910, OV-90, SKOV3, ja 3AO solujen kasvua havaittiin (Fig. 1A). Ei solujen kasvun inhibitio havaittiin ohjaus IgG1-vasta-aineen yhdessä viljelemisen kokeissa (Fig. 1A). Sen arvioimiseksi, makrofagien aiheuttama munasarjasyöpäsoluja kasvua BrdU syntetisoituneeseen DNA säikeet mitattiin käyttämällä anti-BrdU-vasta-aineiden ELISA-määrityksessä. Johdonmukaisesti havaittu lisäys solujen lisääntymisen, DNA-synteesiin HO-8910, OV-90, SKOV3- ja 3AO solujen huomattavasti lisääntynyt, kun soluja viljeltiin yhdessä makrofagien (Fig. 1 B). Kuten odotettua, lisäys hCAP18 /LL-37 neutraloivan vasta-aineen vähensi makrofagien vaikutuksesta munasarjasyövän solujen lisääntymisen (Fig. 1 B). Seuraavaksi munasarjasyöpäsoluja invaasio tutkittiin. Nämä solut kykyä hyökätä Matrigel-pinnoitettu inserttien myös tehostaa merkittävästi makrofagien (Fig. 1 C, D). Sen jälkeen kun co-kasvatusliuos käsiteltiin hCAP /LL-37 neutraloivan vasta-aineen, sen kasvainsolun invaasiota merkittävästi heikennetty (kuvio. 1C, D). Nämä tulokset viittaavat siihen, suora rooli hCAP /LL-37 edistämisessä kasvainsolun invaasiota. IgG-kontrollivasta-aineella ei ollut vaikutusta munasarjasyövän soluinvaasion (Fig. 1 C, D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että hCAP18 /LL-37 vaaditaan makrofagi-indusoitua proliferaatiota ja hyökkäyksen munasarjasyöpäsoluja.

co-kulttuuri kokeissa munasarjasyövän solujen makrofagien, ihmisen perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagit (1 x 10

4-solut) asetettiin transwell-irto-ja munasarjasyövän soluja (1 x 10

4-solut) ympättiin pohjassa 24-kuoppaisilla levyillä. Soluja esi-inkuboitiin 2 ug /ml anti-hCAP18 /LL-37 tai IgG1-isotyypin kontrolli Ab: n (2 ug /ml) 2 tuntia. Solut viljellään yhdessä DMEM (10% HS) ja 4 päivää. 100 ng /ml EGF: ää (Sigma, Steinheim, Saksa) käytettiin kontrollina. (A) lisääntyminen munasarjasyöpäsoluja mitattiin solujen määrä laskea. (B) Solulisääntyminen mitattiin ELISA (BrdU merkinnät) analyysi. (C) Invasion määrityksessä. Invasion määritykset suoritettiin käyttäen BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto jossa on 8 mm: n huokoskoon PET-kalvo, tasaisesti päällystetty BD Matrigel Matrix. Tulokset ovat keskiarvoja ± SEM, merkittävä ero, n = 3, * p 0,05. (D) Matrigel invaasiomääritys of SKOV3. DAPI-värjäys siirretty kasvainsoluja. Edustavia kohdat näkyvät (a) SKOV3 mitään hoitoa. (B) SKOV3 + makrofageissa. (C) SKOV3 + makrofagien + neutraloivat anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /ml). (D) SKOV3 + makrofagien + IgG1 isotyyppikontrolli Ab (2 ug /ml). (E) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).

Kasvainsolut laukaista aktivointi D3-vitamiinin ja TLR2 signaloinnin ja säätelyn hCAP18 /LL-37 makrofageissa

ilmentymisen tutkimiseksi kuvio hCAP18 /LL-37, ihmisen makrofagit olivat viljeltiin yhdessä SKOV3- soluja. Induktion hCAP18 /LL-37 mRNA (Fig. 2A) ja proteiini (täyspitkä hCAP18 /LL-37 ja halkaistut LL-37, Fig. 2B) pinta nousi makrofageissa. Käänteisesti ei ollut merkittäviä eroja hCAP18 /LL-37 mRNA tai propeptidi havaitun SKOV3- soluissa (kuvio. 2A, B). Ei, kypsä LL-37 ei havaittu SKOV3- soluissa (Fig. 2B). Nämä tulokset osoittivat, että makrofagit ja ei SKOV3-solut edistävät vapautumista LL-37-peptidin. Arvioida tasoa hCAP18 /LL-37 ja halkaistut LL-37 soluelatusainetta teimme western blotting solujen supernatanteissa 24 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuuri. Merkittävä kasvu tasoilla edeltäjän ja katkaistun peptidin havaittiin verrattuna makrofageihin tai SKOV3- solut (Fig. 2C).

Ihmisen perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagien ja SKOV3-soluja inkuboitiin rinnakkain, kuten on kuvattu kuviossa 1 . Total RNA: t ja proteiinit SKOV3- soluja ja makrofageja eristettiin 24 h kuluttua yhteistyön kulttuuri. (A): n ilmentyminen hCAP18 /LL-37 mRNA mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. (B) ekspressio hCAP18 /LL-37-proteiini analysoitiin western-blotilla. β-aktiini toimi latauskontrollina. (C) Western blot solujen supernatanttien SKOV3-, makrofagit, ja yhdessä viljelemisen 24 tuntia. (D, E) induktio VDR, CYP24, Cyp27B1, TLR ja CD14 mRNA mitattiin makrofageissa reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset ovat keskiarvo kertainen muutos ± SEM, merkittävä ero, n = 3, * p 0,05; ns, ei ole merkittävä.

Koska VDR on raportoitu välittävän ekspressiota hCAP18 /LL-37 [23], [24], tutkimme, jos ilmaus VDR ja siihen liittyvien geenien indusoituvat co-kulttuuri. Itse asiassa nousu VDR-mRNA-tasojen havaittiin, kun makrofagit oli viljeltiin yhdessä SKOV3- solut (Fig. 2D). Lisäksi 1,25 D3 catabolic entsyymin CYP24 (tunnetaan myös nimellä Cyp24A1) aiheutettiin makrofageissa, kun he olivat viljeltiin yhdessä kasvainsoluissa. Cyp27B1, joka katalysoi inaktiivisen esiasteen D3 hormoni (25D3) osaksi bioaktiiviset muotoon (1,25D3) [24], mRNA-tasot olivat myös säädellään ylöspäin yhdessä viljelemisen malli (Fig. 2D). On raportoitu, että TLR2 aktivaatio johtaa D-vitamiini-riippuvaisten induktio hCAP18 /LL-37 makrofageissa [32]. TLR2, 6 ja CD14 mRNA-tasot kaikki osoittivat odotetun kasvun viljeltiin yh- makrofagit. Ilmentymistasojen TLR1, TLR3, ja TLR4 ei muutettu näissä makrofagisoluissa (Fig. 2E).

Munasarjasyöpä soluvälitteistä induktio hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, ja Cyp27B1 makrofageissa riippuu TLR2 ja TLR6

vieressä pyrittiin määrittämään, onko induktio hCAP18 /LL-37 oli riippuvainen TLR2 induktion. Ihmisen makrofagien, jotka ovat peräisin perifeerisen veren monosyyteistä inkuboitiin 2 h ja TLR2-neutraloiva vasta-aine tai IgG1-isotyyppiä kontrollivasta-aineella, sitten stimuloitiin 24 h SKOV3 soluravintoliuoksista (SKOV3-CM), jossa 10% HS. Vuonna makrofagisoluja käsitellään TLR2 neutraloivan vasta-aineen merkittävä väheneminen hCAP18 /LL-37 induktio havaittiin, ei ole merkittävää vaikutusta geenin induktio havaittiin kontrollivasta-aineella käsiteltyjen näytteiden (Fig. 3A). Sen määrittämiseksi, induktion VDR, CYP24, ja Cyp27B1 vaikutti myös altistuminen TLR2 neutraloivan vasta-mRNA-tasot mitattiin. Näytteet altistettiin sameTLR2 vasta-aine ei osoittanut mitään induktiota VDR, CYP24 tai Cyp27B1, jälleen ei inhibiittoria vaikuttaa havaittu IgG-vasta-vertailunäytteet (Fig. 3B-D). Nämä kokeet toistettiin käyttäen TLR6 neutraloivan vasta-aineen, sama kuvio inhibition havaittiin, jossa induktion hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, ja Cyp27B1 estetään, että TLR6: n vasta-aineen näytteitä, mutta ei verrokkiryhmässä (Fig. 3A D). Yhdistämällä TLR2 ja TLR6-neutraloivat vasta-aineet tarjotaan mahdollisuus synergistisen inaktivaation vaikutus näiden geenien (Fig. 3A-D). Nämä tulokset osoittavat kasvaimen välittämää induktio hCAP18 /LL-37 vaatii TLR2 /6 aktiivisuutta makrofageissa. Tämä induktio mekanismi uskotaan olevan osallisena D3-vitamiinia signalointi. Vuonna lisätukea mallimme, lisäämällä neutraloivia vasta TLR2 tai TLR6 merkittävästi tukahdutti SKOV3 solujen lisääntymistä ja invasiivisuus (Fig. 4A, B). Yhdistämällä TLR2 ja TLR6-neutraloivia vasta-aineita johti synergistinen inhibitio vaikutus SKOV3 solujen etenemisen (Fig. 4A, B). Nämä tulokset osoittavat aktivoitumista TLR2 tai TLR6 vaaditaan kasvainsolujen etenemistä.

Ihmisen makrofagien esi-inkuboitiin 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti-TLR6 tai IgG1-isotyypin kontrollivasta-aineella (10 ug /ml) 2 tuntia. Sitten makrofagit olivat viljelmässä DMEM (10% HS) tai SKOV3-CM (10% HS) 24 tuntia, ja koko RNA: t uutettiin reaaliaikaisen PCR. (A) hCAP18 /LL-37 mRNA. (B) VDR mRNA. (C) CYP24 mRNA. (D) Cyp27B1 mRNA. Tarkoittaa kertainen muutos ± SEM, n = 3, * p 0,05.

Ihmisen perifeerisen veren monosyyteistä johdettujen makrofagien ja SKOV3-soluja esi-inkuboitiin 10 ug /ml anti-TLR2, 10 ug /ml anti- -TLR6 tai IgG1-isotyypin kontrolli Ab: n (10 ug /ml) 2 tuntia. Solut viljellään yhdessä DMEM (10% HS) ja 4 päivää. 100 ng /ml EGF: ää käytettiin kontrollina. (A) Solujen määrä, leviämisen ja invaasion SKOV3- soluja mitattiin. Mean kertainen muutos ± SEM, n = 3, * p 0,05. (B) Matrigel invaasiomääritys of SKOV3. DAPI-värjäys siirretty kasvainsoluja. Edustavia kohdat näkyvät ilmoitettu. (A) SKOV3 mitään hoitoa. (B) SKOV3 + makrofageissa. (C) SKOV3 + makrofagien + neutraloivat anti-TLR2. (D) SKOV3 + makrofagien + neutraloivat anti-TLR6. (E) SKOV3 + makrofagien + neutraloivat anti-TLR2 ja anti-TLR6. (F) SKOV3 + makrofagien + IgG1 isotyyppikontrolli Ab. (G) SKOV3 + EGF: ää (100 ng /ml).

TLR2 /6-välitteisen ilmentymisen hCAP18 /LL-37 kautta Cyp27B1 ja VDR aktivointi

Cyp27B1 riippuvainen biokonversio 25D3 jotta 1,25D3 on keskeinen piirre D-vitamiinin välittämän hCAP18 /LL-37 ilmentyminen [33]. Sen määrittämiseksi, onko kasvain-indusoidun aktivaation TLR2 /6 parannettu biologinen aktiivisuus Cyp27B1, mikä johtaa hCAP18 /LL-37 ilmentyminen, makrofaagit altistettiin TLR2-TLR6 ligandin Pam2CSK4, läsnä ollessa ja puuttuessa 25D3 media (DMEM ilman seerumia ). Expression of hCAP18 /LL-37 ei vaikuttanut altistuessaan 25D3 tai Pam2CSK4 toisistaan ​​riippumattomia. Kuitenkin hCAP18 /LL-37expression indusoitiin jälkeen samanaikainen altistuminen (Kuva. 5A). Lisäksi esto Cyp27B1 itrakonatsolin tukossa TLR2 /6 aktivointi ja myöhempään lisääntymiseen inhCAP18 /LL-37 mRNA (Fig. 5A). Lisäksi VDR antagonisti ZK159222 esti myös induktion hCAP18 /LL-37 ilmentyminen määritettynä mRNA-tasot (kuvio. 5A). Seuraavaksi yhteistyötä viljellyt ensisijainen makrofagien ja SKOV3-CM (ilman seerumia) läsnäollessa eri 25D3 keskittyminen, ja tasot hCAP18 /LL-37 mRNA mitattiin qPCR. Eräässä toisessa makrofagi /SKOV3-CM co-kulttuuri kokeessa lisäämällä 25D3 huomattavasti hCAP18 /LL-37-mRNA-tasojen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 5B). On huomionarvoista, että SKOV3-CM ilman HS ei indusoi hCAP18 /LL-37 (Fig. 5B) riittämättömän D-vitamiinin elatusaineissa [24], [33]. Nämä tulokset siis viittaavat siihen, että kasvaimen aiheuttama aktivointi TLR2 /6 ihmisen makrofageissa laukaisee hCAP18 /LL-37 ilmentyminen. Lisäksi data tukee tätä ylös asetus riippuu Cyp27B1 ja VDR välittämän endogeenisen tuotannon 1,25D3.

(A) Ihmisen makrofagien esikäsiteltiin VDR antagonisti ZK159222 (10

-7 M) tai Cyp27B1 antagonisti itrakonatsoli (10

-7 M) 2 tuntia ja sitten stimuloitiin TLR2 /6-ligandin Pam2CSK4 (100 ng /ml) läsnä tai poissa ollessa 25D3 (10

-6 M) (DMEM ilman seerumia) 24 tuntia. Expression of hCAP18 /LL-37-mRNA: n määritettiin, kuten on kuvattu kuviossa 3. (B) asetus hCAP18 /LL-37-geenin stimulaation 25D3 DMEM (ilman seerumia) tai SKOV3-CM (ilman seerumia). Mean kertainen muutos ± SEM, n = 3, * p 0,05.

Kasvain-erittyy versikaani V1 aktivoi TLR2 ja TLR6 aiheuttavan hCAP18 /LL-37 ilmentyminen makrofageissa

edellä todettiin, yhteistyössä kulttuuri makrofagien /SKOV3- solua aktivoidaan TLR2 /6 ja siten lisännyt hCAP18 /LL-37 ilmentyminen makrofageissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, määrittelemätön liukoisen tekijät tuottaman SKOV3- solut välittävät tätä prosessia. Kim et ai. osoittivat, että versikaani V1, makrofagiaktivaattori, joka toimii kautta TLR2 ja sen koreseptoreita TLR6- ja CD14, on jopa säädellään monissa ihmisen kasvaimissa kuten munasarjasyövän ja keuhkosyövän, ja parantaa keuhkojen kasvain metastaattista kasvua [25]. Sen määrittämiseksi, onko versikaani V1 voi olla liukoinen tekijä vastaa TLR2 /6 aktivaatio havaittiin tässä tutkimme versikaani V1 ekspressiotasot kasvainsoluissa viljeltiin yhdessä makrofageissa. Kuvio 6A osoitti versikaani V1-proteiinin ekspressio lisääntyi kokosoluliuotteissa ja SKOV3, HO-8910, OV-90, ja 3AO soluja yhdessä viljeltiin 24 h. Tutkia tason versikaani V1 erittymisen munasarjojen kasvainsoluja inkuboimme SKOV3, HO-8910, OV-90, ja 3AO solut kunnostetun alustan makrofageista (M-CM) 24 tuntia. ELISA-määritykset suoritettiin läsnäolon määrittämiseksi eritetyn versikaani V1 solujen väliaineessa.