Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Desmocollin 3 (DSC3), jäsen kadheriinin geenin superperheen, liittyy patogeneesiin joidenkin syöpien, mutta sen rooli eturauhassyövän (PCA) on edelleen suurelta osin tuntemattomia.

Methods

DSC3 geeniekspression tasolla käytettävissä PCa microarray aineisto tutkittiin käyttäen Oncomine tietokantaa. DSC3 transkripti eturauhasessa solulinjassa paneeli ja itsenäinen kudoksen kohortin (n = 52) arvioitiin kvantitatiivinen PCR (Q-PCR). Epigeneettiset asema DSC3 geenin promoottorin PCA tutkittiin lataamalla kolme aineisto (KOODAAMISEEN Infinium 450K array data ja kaksi metylaation sekvensointi) in UCSC genomin selaimessa. Vaikka pyrosekvensointi analyysi mitattu promoottori DNA: n metylaatio, Q-PCR arvioita saatiin DSC3 transkriptio uudelleen ilmentymisen jälkeen 5-atsa-deoksisytidiini (5-atsa) hoitoon. Kliinistä merkitystä DSC3 ilmaisun tutkittiin Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Lopuksi, toiminnalliset tutkimukset valvonta solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion tehtiin eturauhasen solulinjoissa jälkeen siRNA välittämä DSC3 knockdown tai seuraavan 5-atsa aiheuttama uudelleen ilme. EMT markkereita vimentiinista ja E-kadheriinin ilmentyminen mitattiin Western Blot.

Tulokset

Microarray data analyysit paljastivat merkittävä lasku DSC3 transkriptio ilmaisun PCA verrattuna hyvänlaatuinen näytteitä. Q-PCR-analyysi riippumattoman kohortin paljasti DSC3 transkriptio alassäätöä sekä PCa solulinjoissa ja tuumorikudoksia mutta ei heidän hyvänlaatuinen vastine. Tutkiminen käytettävissä NGS ja Infinium yksilöityjen tietojen rooli epigeneettisellä asetukseksi DSC3 mRNA vähentäminen PCA. Pyrosekvensointi vahvisti lisääntynyt DSC3 promoottori metylaatio syöpäsolulinjoissa ja palauttaminen transkriptioekspressiokuvio upon 5-atsa hoito edelleen vahvistavat tätä epigenetic hiljentäminen mekanismi. Tärkeää on Kaplan-Meier analyysi tulos kohortin osoitti yhdistyksen välillä menetyksen DSC3 ilmaisun ja merkittävästi lisääntynyt riski biokemiallisten toistumisen. Toiminnalliset tutkimukset osoittavat rooli epiteelin-mesenkymaalitransitioon in DSC3 säännellyn solumigraation /invaasion.

Johtopäätös

Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio edistää alas-säätely DSC3 eturauhassyövässä , ja menetys DSC3 ennustaa huono kliiniseen tulokseen.

Citation: Pan J, Chen Y, Mo C, Wang D, Chen J, Mao X, et al. (2014) yhdistys DSC3 mRNA Down-asetuksen Eturauhassyöpä kanssa Promoottori hypermetylaation ja huono ennuste. PLoS ONE 9 (3): e92815. doi: 10,1371 /journal.pone.0092815

Editor: Robert Dante, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale, Ranska

vastaanotettu 13 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 26 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta China National Natural Science Foundation (81272809); Science and Technology Planning Project Guangdongin (2011B050400021) ja Guangdong Key Laboratory of Urology, The First Affiliated sairaala Guangzhou Medical University (2010A060801016). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhassyöpä on toiseksi yleisin syöpä miehillä maailmassa ja yli 900.000 miehiä diagnosoidaan eturauhassyöpä vuosittain [1]. Vaikka PSA on kliinisesti käytetään seulontatestinä herkkyydellä 80%, sen käyttökelpoisuus on rajallinen johtuen sen alhaisen spesifisyys (20%), mikä voi johtaa tarpeettomiin koepaloja ja ylihoito [2]. Huolimatta suuresta vaivaa etsimiseen biomarkkereiden, eturauhassyöpä kliinisen hoidon on edelleen haaste, koska optimaalinen suorituskyky nykyisten ja ennustavia välineet [3].

Tutkimukset, tunnistaa ja kuvata syöpää erityisiä poikkeava molekyylitason tapahtumia myös paljastaa ehdokkaiden mahdollisten biologisten merkkiaineiden hyödyllisyys [4]. Differential DNA: n metylaatio on yleinen eturauhassyövässä, joka johtaa hypermetylaation klo promoottori tuumorisuppressorigeeneille, hypometylaatio klo edistäjiä onkogeenien, ja globaali hypometylaatio johtaa perimän epävakaisuuden myöhemmissä vaiheissa eturauhassyövän [5], [6]. Jotkut yleisesti raportoitu hypermetyloitunut geenien eturauhassyövän kuuluu GSTP1, RASSF1A, ja APC, jotka ovat auttaneet eturauhassyövässä diagnoosi ja prognoosi [7]. Eturauhassyöpä on heterogeeninen sairaus, määrä hypermetyloitunut geenien kohoaa eturauhassyöpä etenee [8], [9]. Tärkeää on molekyyli tapahtumia PCa, kuten geenifuusiot on äskettäin osoitettu antamaan ero DNA-metylaation [5], [9]. Tämä tarkoittaa, että PCa tauti heterogeenisuus voidaan paremmin kuvastaa ero epigenetic allekirjoituksia. Siten luonnehdinta erilaisesti metyloitua aluetta (DMRs) on suuri todennäköisyys, jolloin mahdollisia biomarkkereita kliinisessä käytössä eturauhassyöpään.

jäsenet desmosomiproteiinin kadheriinin perhe, mukaan lukien desmocollins ja desmogleiineiksi, esiintyy pääasiassa epiteelisolujen jossa ne muodostavat liima proteiinit Desmosomi solu-solu risteykseen ja tarvitaan soluadheesion ja Desmosomi muodostumisen [10], [11]. Heikentynyt desmosomiproteiinin toiminto liittyy useita sairauksia vastaan ​​[12]. Yksi mielenkiintoinen toiminnoista on niiden kyky inhiboida solun liikkuvuus, ilmiö merkitystä syövän [10]. Desmocollin 3 (DSC3), jäsen kadheriinin superperheen, myötävaikuttaa Desmosomi välittämää solujen soluadheesiota [11]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat havainneet menetys DSC3 useilla syövän tyyppejä, kuten imusolmukemetastaaseja suun okasolusyöpä, rintasyöpä ja peräsuolen syöpä, jossa laski tasolle liittyy syövän etenemiseen säädeltiin epigeneettisellä muutos [13], [14], [15]. Kuitenkin vähän tiedetään ilmaisun ja sääntelyn mekanismeja DSC3 eturauhassyövän.

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet ilmaisun ja metylaation malleja DSC3 eturauhassyövässä, ja mikä tärkeintä tutki toiminnallista roolia DSC3 ja sen mahdollinen kliininen ennustearvo.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja kudosnäytteitä

Kaikki eturauhasen solulinjat saatiin American Type Culture Collection ja eturauhasen alkusolut PrEC ostettu Lonza kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO 2 soluviljelmässä inkubaattorissa. Eturauhasen syöpäsolulinjoissa pidettiin DMEM: ssä (Invitrogen) (DU145) ja RPMI (LNCaP, 22RV1) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Normaalin eturauhasen solulinja RWPE pidettiin KSF media (Invitrogen) plus 10 ng /ml EGF: ää (Sigma) ja naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja ensisijaisen eturauhasen solujen PrEC viljeltiin PrEGM media (Lonza). Eturauhasen kudosnäytteet kuten eturauhasen hyvänlaatuisen (n = 18), eturauhassyöpä (n = 34) saatiin ensimmäinen Affiliated sairaala Sun Yat-Senin yliopistossa (Guangzhou, Kiina). Kudosnäytteet olivat flash-jäädytettiin nestemäisessä typessä keruuhetkellä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta sallia näytteiden ja kliinisten tietojen tutkittavaksi. Tämä tutkimus ihmiseen kohdistuvan hyväksyi eettinen neuvosto Sun Yat-Senin yliopistossa.

RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen) hyödynnettiin cDNA synteesi (Superscript III, Invitrogen) läsnä ollessa satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen). Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (Q-PCR) suoritettiin käyttäen Virta SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems) Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System. Kaikki oligonukleotidialukkeita saatiin Invitrogen, ja ne luetellaan taulukossa S1. GAPDH-monistus käytettiin sisäisenä kontrollina. MRNA ekspressiotaso määritettiin aikaisemmin kuvatulla käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä [16].

ENCODE aineisto ja Methylplex NGS sekvenointitulosten Analysis

Infinium 450K Bead Array ja alennetulla edustus bisulfiittimodifiointi sekvensointi DNA: n metylaatio tietoja ENCODE konsortio käytettävissä käyttäjän kappaleet UCSC genomin selaimessa hyödynnettiin tässä tutkimuksessa [17]. Methylplex NGS sekvenointitulosten muokattuja kappaleita hyvänlaatuisen solulinjan PrEC ja PCa LNCaP, eturauhasen normaalia, hyvänlaatuinen vieressä, paikallinen PCA ja metastaattisen PCa kudoksia Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa Kim et al. (Genome Res 2011) oli myös ladannut raidat UCSC genomiin selain ja visualisoida [9]. Tämä syvä-sekvensointi dataa aiemmin julkaistu aineisto on talletettu NCBI GEO hakunumerolla: GSE27619.The DSC3 genomin alueella ”CHR 18: 28,570,052-28,622,781” (Hg19) (sekä promoottorin ja koodaavan alueen) tarkastettiin varten ero DNA: n metylaatio .

genomisen DNA: n eristäminen, Bisulfiittikonversio ja pyrosekvensointi

genomi-DNA uutettiin QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) oli bisulfiitin muunnetaan käyttämällä EZ DNA: n metylaatio kulta Kit (Zymo Research) ja käytettiin templaattina PCR-reaktioihin. DSC3 metylaatio arvioitiin käyttäen PyroMark DSC3 metylaatiomääritystä (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, bisulfiitti muunnettu DNA, DSC3 alukkeita, ja Hotstart Master Mix (Qiagen) käytettiin PCR-reaktiossa monistamaan DSC3 genomialuetta kiinnostusta näytteestä. Vahvistus saatiin 45 sykliä 30 s 94 ° C: ssa, 30 s 50 ° C: ssa, ja 40 s 72 ° C: ssa, sen jälkeen, kun ensimmäinen entsyymi aktivointi 15 minuutin ajan 95 ° C: ssa, ja lopullinen venymä 7 min 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet vangittiin streptavidiinilla Sepharose-helmiä (GE Healthcare), denaturoitu tuottaa yhden säikeistä, pestiin ja pariutua Sekvenointialuke, ja sekvenssi määritettiin käyttämällä PyroMark Q24 järjestelmä (Qiagen). Keskimääräinen metylaatio kolmesta erillisestä kantojen katsotaan tässä testissä. Primer sekvenssit ovat osoittavat taulukossa S1. Metylaatiotasoilla yksilöllisesti jokaiselle CpG-sivuston ja sen lasketaan keskiarvot ovat näyttelyssä taulukossa S2.

5-atsa-deoksisytidiinin hoito

LNCaP ympätään 6-kuoppalevyille käsiteltiin seuraavana päivänä merkityillä pitoisuuksia 5-atsa-deoksisytidiini (Sigma) tai vastaava määrä ajoneuvon (DMSO) viiden peräkkäisen päivän ajan. Kasvualusta sisälsi joko 5-atsa-deoksisytidiinin tai ajoneuvon korvattiin 24 tunnin välein. Lopussa hoitojakson aikana kokonais-RNA eristettiin arvioida merkitty transkriptin ilmentyminen Real Time RT-PCR: llä.

Western blot -analyysi

Protein solulysaateista eristettiin, ja proteiinin pitoisuudet olivat määräytyy BCA kit. 20 ug proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (GE Healthcare). Kaivoa inkuboitiin puoli tuntia estopuskurissa, joka sisälsi 5% maitoa seurasi inkubointi yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden, jotka sisältävät E-kadheriini-vasta-ainetta (1:1000,3195S, Cell Signaling); Vimentiinin vasta-ainetta (1:1000,5741S, Cell Signaling) tai GAPDH-vasta-ainetta (1:2000,5174, Cell Signaling). Useiden pesujen Tris puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisälsi Tween-20 (TBS-T), blot inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Signaalit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi järjestelmän valmistajan protokollan mukaisesti (GE Healthcare).

RNA-interferenssi

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille numerot ja transfektoitiin DSC3 siRNA (Dharmacon ) tai ei-suunnattu siRNA kahdesti. Transfektiot suoritettiin OptiMEM (Invitrogen) ja Oligofectamine (Invitrogen) standardimenetelmien mukaisesti. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja maljattiin kolmena rinnakkaisena 8000 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille. Knockdown tehokkuus määritettiin Q-PCR.

Cell Proliferation /Muuttoliike /invaasiomääritys

Soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttäen WST-1 Kit mukaan valmistajan ohjeiden (Clontech Laboratories). Siirtolaisuusjärjestölle /Invasion solut transfektoitiin tai käsitelty. 24 tunnin kuluttua solut ympättiin 8 um insertit (BD Falcon) päällystetty matrigeelin (for invaasio määritykset) tai päällystämättömiä (liikkuvuusanalyysia määritykset) 24-kuoppaviljelylevyillä. Naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan kammioon kuin Chemo houkutinta. 72 tunnin kuluttua, ei-tunkeutuvat solut varovasti poistettiin pumpulipuikolla. Invasiivinen soluja alasivulla kammion värjättiin kristallivioletilla ja ilmakuivattua. Suhteellinen invaasio kvantitoitiin liuottamalla kristalliviolettia väriaineen ja absorbanssin mittaus 560 nm: ssä.

Oncomine Expression and Outcome analyysi

DSC3 ilmentyminen riippumaton julkaistu microarray tutkimuksia uutettiin Oncomine tietokannasta. Aineistot voidaan saada myös NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) alle hakunumeroilla, GSE35988 (Grasso et ai.,); PMID: 19737960 (Arredouani et ai.,); GSE3325 (Varambally et ai.,); GSE3933 (Lapointe et ai.,); ja GSE21032 (Taylor et ai.,). Kaplan-Meier analyysi Taylor et al., (Cancer Cell 2010) aineisto [18], biokemiallisten toistuminen määriteltiin 0,2 ng /ml kasvaa PSA tai toistumiseen sairauden jälkeen eturauhasen, kuten kehittäminen metastaattinen, jos biokemiallinen toistuminen tietoja ei ollut saatavilla. DSC3 ilme arvot luokiteltu matalan ja korkean ryhmiin mediaani sulku.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism ohjelma. Kvantitatiivista tietoa, ryhmät ilmoitettiin keskiarvona ± SEM ja niitä verrattiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA-testi. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi, log-rank testillä. Tilastollinen merkitsevyys perustettiin P 0,05.

Tulokset

DSC3 ilmentyminen vaimennetaan eturauhassyövän

Tutkiakseen ilmentymisen DSC3 transkriptin eturauhassyövän ja hyvänlaatuisen kudoksiin, me käytti Oncomine työkalu analysoida useita julkaistuja microarray geenien ilmentyminen tutkimukset. Meidän analyysi paljasti voimakkaan väheneminen DSC3 mRNA: n ekspression eturauhassyöpäkudoksille verrattuna hyvänlaatuinen yksilöitä. Kuvio 1A kuvaa tasojen DSC3 selostukset neljällä itsenäistä julkaistu microarray tutkimuksia [19], [20], [21], [22]. Kokeellisesti vahvistavat tämän havainnon, testasimme paneelia eturauhasen solulinjojen LNCaP, DU145, 22RV1, hyvänlaatuinen solujen eli RWPE ja PrEC, Q-PCR: llä. Vuonna yhtäpitävä microarray data hyvänlaatuinen solut osoittivat korkeampia selostukset ilmaisu verrattuna syöpäsolulinjoista (kuvio 1 B). Vastaavia ilmentymiskuvio havaittiin GSTP1, tunnettu metyloitu geenin eturauhassyövän jota käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio 1C).

(A) Boxplots esitys DSC3 mRNA: n ekspression neljä itsenäistä eturauhassyövän microarray aineistoja, B = hyvänlaatuinen, T = kasvain. Ensimmäinen tekijä ja tilastollinen merkitsevyys on osoitettu. (B) Q-PCR-analyysi DSC3 ja (C) GSTP1 ilmentymisen paneelin eturauhasen solulinjojen; PrEC-eturauhasen normaaleja epiteelisolujen, RWPE-hyvänlaatuista eturauhasen solulinja, LNCaP, DU145, 22RV1 ovat metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa.

DSC3 alassäätöä PCA välittyy promoottori metylaation

yksityiskohtaisen tarkastelun DSC3 genominen järjestys käyttäen UCSC genomin selaimen paljasti, että läsnä on CpG-saarekkeen sisään DSC3 geenin säätelyalue ”CHR 18: 28,570,052-28,622,781” (Hg19), joka ympäröi transkription aloituskohdasta. Analyysi DNA: n metylaatio tällä alueella ENCODE metyyli 450K Helmet Taulukot ja alennetulla edustus bisulfiittimodifiointi Yhdistelmät (RRBS) aineistot [17] osoitti, että DSC3 geeni promoottori hypermetyloitunut LNCaP verrattuna hyvänlaatuinen solulinjan PrEC (kuvio 2A). Lisäksi analyysi riippumattoman eturauhassyövän DNA: n metylaatio aineisto [9] tuotetaan Methylplex Next Generation Sequencing (M-NGS) paljasti myös DSC3 promoottori metylaatio LNCaP eikä PrEC. Lisäksi tämä tieto osoitti myös lisääntynyt metylaation lokalisoitu ja metastaattisen eturauhassyövän näytteitä eikä hyvänlaatuinen tai normaali eturauhasnäytteissä (kuvio 2B). Sekä solulinja tietojen ENCODE [17] ja solulinja /kudos aineisto M-NGS tutkimuksessa Kim et al. [9], paljasti DNA metylaatio oli erittäin päällekkäistä aluetta sisällä DSC3 promoottori. Emäsparin ratkaisu näihin aineistoja, pystyimme tarkasti kotona on geenivirhe kohteena DNA: n metylaatio. Käyttämällä edellä tiedot seuraavan kerran kokeellisesti tutkittu kromosomaalisen alueen DSC3 promoottori metylaation muutokseen pyrosekvensointi analyysi paneelissa eturauhasen solulinjoissa. Tukeminen suuntaus havaittu julkisesti saatavilla olevien tietojen, pyrosekvensointi analyysi paljasti usein hypermetylaatiota DSC3 promoottorin syöpäsolulinjoissa (3/3) verrattuna hyvänlaatuinen solulinjoilla (0/2) (10% Metylointia sulku) (kuvio 3B). Sen testaamiseksi, onko DSC3 on epigeneettiseltä vaiennetaan metylaation eturauhassyövän, käsittelimme LNCaP-solut, joissa on DNA: n metylaatio inhibiittori, 5-atsa-deoksisytidiini (5-atsa). Transkriptioekspressiokuvio analysoi Q-PCR: llä sekä DSC3 ja GSTP1, jälkimmäinen käytettiin positiivisena kontrollina osoitti induktion molempien mRNA: iden, kun 5-atsa lääkehoitoa, ja pyrosekvensointi osoitti, että väheneminen DNA: n metylaatio on DSC3 promoottorialueen, kun 5- atsa käsittely (kuvio 3C ENCODE Infinium 450K, oranssi = metyloitu (pisteet ≥600), kirkkaan sininen = metyloimatonta (0 pisteet ≤200). LNCaP (1): LNCaP-solut käsiteltiin androgeenin; LNCaP (2): LNCaP tietoja Duke University; LNCaP (3): LNCaP tiedot University of Washington. (B) edustus MethylPlex NGS sekvenointitulosten (PrEC, LNCaP, eturauhasen normaalia, hyvänlaatuinen vieressä, paikallinen PCa ja metastaattisen PCa kudokset) varten DSC3. Metyloitu alueiden havaittiin vastaavan näytteen ryhmät kuvattu huiput ja numeroita y-akselilla tarkoittavat piikkien korkeudet.

(A) sekvenssi on DSC3 promoottorin (CHR 18: 28622751-28622860) ja alue analysoitiin pyrosekvensointi esitetään sinisellä (CHR 18: 28622791-28622820) ja massakeskiön asemat valvottava on merkitty punaisella. CGI, CpG-saarekkeen. (B) Bar juoni kuvaa keskiarvoa prosentin metylaation kolmessa CG tehtävissä eturauhasen solulinjoissa. Blue-prosenttia unmethylation; Oranssi prosentin metylointi; Bi-sulfiitti muunnetaan yleisesti metyloitu gDNA ja sikiön DNA käytettiin positiivisten ja negatiivisten kontrollien vastaavasti. (C) DSC3 ilmentyminen arvioituna Q-PCR: LNCaP-soluja käsiteltiin 5-atsa-deoksisytidiini (5-atsa), GSTP1 sisällytettiin positiivisena kontrollina. (D) Bar juoni kuvaa keskiarvoa prosentin metylaation kolmessa massakeskiön asemat LNCaP käsiteltiin 5-atsa.

DSC3 säätyy alas PCA ja ennustaa huono kliinisten tulosten

tutkia ilmentymistä DSC3 eturauhassyövässä kudoksissa, suoritimme Q-PCR paneelin eturauhasen kudoksissa, kuten eturauhasen hyvänlaatuisesta (n = 18), eturauhasen syöpä (n = 34). DSC3 ilmentymistä huomattavasti vähentynyt eturauhassyövässä (2,4 ± 1,2) verrattuna hyvänlaatuinen kudoksiin (21,8 ± 16,3) (kuviot 4A B). Noin 25-40%: lla potilaista hoidetaan eturauhasen kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä kokevat tauti uusiutuu, alun perin ilmoitti nousu seerumin tason PSA (biokemiallisten uusiutuminen) [23]. Niinpä seuraavaksi pyrittiin määrittämään jos DSC3 inaktivaatio tila liittyi biokemiallisten uusiutuminen jälkeen kirurgisen resektion. Kohti tätä selvitimme Taylor et al. (Cancer Cell 2010) geenien ilmentyminen aineisto [18], joka oli tunnusomaista kasvainten 140 potilaalla on toistumisen tiedot (36 toistuminen). Näytteet erotettiin korkean ja matalan DSC3 ryhmät perustuvat DSC3 mediaani ilme arvo. Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että alhainen DSC3 ryhmä potilailla oli huomattavasti suurempi riski toistumisen kuin korkean DSC3 ryhmän potilailla (riskisuhde: 2,352, 95% CI: 1,198-4,446, log rank p = 0,0125) (kuvio 4C). Tämä viittaa siihen, että DSC3 transkriptin menetys eturauhasen syöpä voi ennustaa huono kliininen tulos. Yhdessä nämä tiedot viittaavat DSC3, jäsen kadheriinin superperheen voisi olla tärkeä rooli eturauhassyövän etenemiseen johtavia huonoon kliiniseen tulokseen.

(A) Q-PCR DSC3 nauhoituksen kohortin hyvänlaatuinen eturauhasen ( n = 18) ja eturauhassyöpää (n = 34) kudoksiin. (B) Yhteenveto histogrammin ilmaisu arvoja DSC3 eturauhasen hyvän- ja kasvainnäytteet. (C) Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että alhainen DSC3 ryhmä potilailla oli huomattavasti kasvanut riski toistumisen kuin korkean DSC3 ryhmän potilailla (P = 0,0125).

vaikutukset DSC3 siirtymisstrategiasta /invaasion potentiaali eturauhasen solujen

DSC3 on yksi liima-proteiinien Desmosomi solu-solu-liitos, jota tarvitaan soluadheesion. Tutkia roolia DSC3 eturauhasessa, transfektoimme hyvänlaatuinen RWPE soluja joko ohjaus tai DSC3 siRNA ja suorittaa solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion määrityksissä. Ohimenevä knockdovvn DSC3 vuonna RWPE lisännyt solumigraatioon ja invaasiota (kuvio 5C), kun taas mitään merkittävää vaikutusta ei havaittu soluproliferaatioon (kuva 5B). Ymmärtää mekanismia DSC3 säännellyn maahanmuuton ja invaasio, testasimme ilmentyminen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) merkki E-kadheriinin ja vimentiinista in RWPE käsitelty joko ohjaus tai DSC3 siRNA. Mielenkiintoista, Knockdown DSC3 vuonna RWPE lisääntynyt vimentiinista ilmaisun, samalla kun estetään E-kadheriinin ilmentymisen (kuvio 5D). Tämä viittasi siihen, että DSC3 voisi säädellä eturauhasen solulinja muuttoliike /invaasion potentiaali aiheuttamalla EMT. Määrittämään vaikutuksen DSC3 uudelleen ilme toiminta eturauhasen solujen migraation ja invasiivisia mahdollisuuden kontrolloida ja 5-atsa käsiteltyjen DU145 soluja arvioitiin. Induktio DSC3 ilmaisun upon 5-atsa hoitoon DU145 solujen johti merkittävään vähentämiseen siirtymä /hyökkäys mahdollisuuksia näiden solujen. Jatkokäsittely näiden solujen kanssa DSC3 siRNA, palautti osittain muuttoliike /invaasion potentiaali (kuvio 5F). Nämä tulokset renderöinti vakuuttavaa näyttöä siitä, että vähentynyt syöpäsolujen muuttoliike /invaasio hoidon jälkeen 5-atsa johtuu pääasiassa induktion DSC3 ilmaisun.

(A) DSC3 Knockdown siRNA hyvänlaatuisen eturauhasen solulinjaan RWPE havaittuna Q-PCR. * tarkoittaa arvoja, jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin ei-Kohderyhmä (NT). siRNA # 2 ja siRNA # 3 ovat kaksi erillistä DSC3 siRNA. (B) vaikutus DSC3 Knockdown proliferaatioon in RWPE soluissa WST-1. (C) vaikutus DSC3 Knockdown muuttoliikettä kautta TranswellTM ja hyökkäyksen kautta Matrigel sisään RWPE soluissa. Muuttivat ja hyökkäsi solut värjättiin Crystal violetti, liukoiseksi ja kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 560 nm: ssä. * Tarkoittaa arvoja, jotka ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin ei-Kohderyhmä (NT). (D) E-kadheriinin ja vimentiinista ilmaisun arvioitiin Western blot analyysissä RWPE käsitelty solu Non-Target siRNA tai DSC3 siRNA. (E) Q-PCR DSC3 käyttäen kokonais-RNA PCA solulinjasta DU145 käsiteltiin 5-atsa tai DSC3 siRNA. (F) siirtyminen ja hyökkäys potentiaali käsittelemättömän ja 5-atsa käsitellylle DU145 arvioitiin TranswellTM tai Matrigel määrityksessä. Muuttivat ja hyökkäsi solut värjättiin Crystal violetti, liukoiseksi ja kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 560 nm: ssä.

Keskustelu

Desmocollin 3 (DSC3) havaittiin olevan usein säädellä vähentävästi useita syöpiä kuten rinta-, suun, peräsuolen ja keuhkosyöpää, ja inaktivointi DSC3 näissä syövissä johtui promoottori hypermetylaation [13], [14], [15], [24]. Kuitenkin tiedetään vähän roolista DSC3 eturauhassyövässä. Kohti tämä ensin verrattiin DSC3 ilmentyminen eturauhassyövässä julkaistuista microarray geenien ilmentyminen tutkimukset käyttäen Oncomine työkalua. Neljä itsenäistä PCa aineistoja osoitti, että DSC3 väheni merkittävästi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna hyvänlaatuinen näytteitä. Meidän osoitti myös yhdenmukainen downregulation DSC3 mRNA syöpäsolulinjoissa. Seuraavaksi tutkitaan eri julkisesti saatavilla aineisto varten metylaatiostatuksen DSC3 geenin promoottorin eturauhassyövässä. Monirivisille todisteiden perustuvan analyysin avulla riippumaton alustoilla kuten Infinium Metylointi 450K Helmi Array (KOODAAMISEEN), Alennettu edustusto bisulfiittimodifiointi Yhdistelmät (KOODAAMISEEN), joka oli ominaista LNCaP ja PrEC solut yhdessä MethylPlex NGS sekvensointi tutkimus, tunnettu LNCaP, PrEC ja eturauhassyövän kliiniset yksilöt tuettu ero metyloinnin DSC3 geenin promoottorin eturauhassyövässä. Olemme myös osoittaneet, että DSC3 geeni epigeneettiseltä vaiennetaan eturauhassyövässä, koska hoito LNCaP kanssa de-metylointiaineen 5-atsa, aiheuttama DSC3 transkriptio ilme. Nykyinen tutkimus osoittaa siten, että DSC3 ilmentyminen on usein menetetään eturauhassyövässä johtuen promoottorin hypermetylaatio samanlainen Aiempien raporttien muissa kiinteitä kasvaimia [15], [24]. Tärkeää DSC3 ilmentyminen eturauhassyövässä kliinisissä näytteissä pystyi ennustamaan huono kliiniseen tulokseen, kun analysoitiin biokemiallisia uusiutumisen.

Toimiva tutkimus on tähän mennessä tunnistettu DSC3 potentiaaliseksi tuumorisuppressorigeeniä, stabiili transfektio on DSC3 ekspressiovektorin keuhkosyövän solulinjat osoittivat, että ektooppinen ilmentyminen DSC3 inhiboi solujen lisääntymistä, ankkurointi riippumattoman kasvun, siirtolaisuuden sekä hyökkäys [24]. Mielenkiintoista havaitsimme lisäys solujen maahanmuuton ja invaasion RWPE eturauhasen solujen kun pudotti DSC3 geeni käyttämällä kahta erityistä riippumatonta siRNA: t eikä valvontaa muille kuin kohde-siRNA. SiRNA-välitteisen hiljentäminen DSC3 ei ole mitään vaikutusta solujen lisääntymistä. Lisäksi knockdovvn DSC3 taas indusoimiseksi vimentiinista proteiinin ilmentymisen, vähensivät tasot E-kadheriinin, mikä saattaa viitata siihen EMT kuin fenotyyppi kun DSC3 geeni alassäädetty. Vaikka sääntelymekanismit ohjaamiseksi DSC3 ilmaisua ei täysin tunneta, DSC3 on TP53 vastaus geenin ja lisäksi villityypin TP53 havaittiin olevan riittävä aiheuttamaan ilmentymisen DSC3 rintasyövässä [15], [25]. Siksi menetys TP53 toimintoa somaattinen mutaatio, jota havaitaan usein edennyt eturauhassyöpä, voi johtaa hypermetylaatiota sen kohdegeenien. Samanlainen suhde havaittiin ERG ilme ja metylaatiostatuksen sen kohdegeenin nimittäin TDRD1 eturauhassyövässä [26], [27]. Kuitenkin lisää tutkimuksia tarvitaan tutkimaan sääntelymekanismeissa DSC3 eturauhassyövän.

selkeyttämiseksi ilmentymisen DSC3 eturauhassyövässä kudosta kohortti peräisin Kiinan väestön, suoritimme Q-PCR eturauhaskudoksiin. DSC3 ilmentyminen merkitsevästi ja voimakkaasti vähentynyt eturauhassyövässä verrattuna hyvänlaatuinen kudoksiin. Koska sen inaktivaation PCA solulinjoissa ja kudoksissa, haluamme arvioida, DSC3 ilmentyminen liittyy huono kliiniseen tulokseen. Meidän analyysi havaitsimme korrelaatiota alas-säätely DSC3 ja huomattavasti suurempi riski biokemiallisten toistumisen. Poikkeava DNA: n metylaatio geenin promoottorit on ominaista syöpäsoluja, ja useita geenejä epigeneettiseltä muuttaa syövän erityisellä tavalla [28]. Eturauhassyöpäpotilailla, korrelaatiot tietyn geenin promoottori hypermetylaation ja Gleason pisteet, patologinen vaiheessa tai kasvaimen uusiutumisen on tunnettu [29]. GSTP1 geeni promoottori metylaatio on laajalti tunnettu useita riippumattomia ryhmiä ja on todettu olevan olla diagnostista arvoa biomarkkerina eturauhassyövässä potilaan kudokseen tai kehon nestettä auttoi noninvasiiviset tunnistus [30]. Hypermetylaatiota DSC3 aiemmin raportoitu markkerina ennustaa kliinistä tulosta peräsuolen ja keuhkosyövän [15], [24]. Niinpä lisää tutkimuksia suurten eturauhassyöpäkudoksen ikäluokat sekä kehon nesteiden tarvitaan edelleen arvioida DSC3 kuin metylointi biomarkkereiden. Tällaiset tutkimukset kattavasti perustaa yhdistyksen välillä DSC3 promoottorin metylaation ja eturauhassyövän kliinisiä tekijöitä.

Johtopäätös

Yhteenvetona DSC3 on alaspäin säännellään eturauhassyövän DNA hypermetylaation. Tämä on ensimmäinen tutkimus, raportoi yksityiskohtaisen analyysin DSC3 mRNA ilmaisun ja geenin promoottori metylaation eturauhassyövässä. Analyysi ilmentymisen DSC3 voi olla hyödyllistä ennustaa kliinisiä tuloksia eturauhassyöpäpotilailla. Tulevaisuuden tutkimukset ovat tarpeen laajentaa näitä havaintoja ja tutkimaan erityisesti diagnostisen /terapeuttista potentiaalia DSC3 eturauhassyövän.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Yhteenveto sekvenssit alukkeiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0092815.s001

(XLSX) B Taulukko S2.

Yhteenveto pyrosekvensointi kolmen massakeskiöaseman eturauhasen solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0092815.s002

(XLSX) B

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Saravana Mohan Dhanasekaran (University of Michigan) tarjoamiseksi MethylPlex NGS sekvenointitulosten heiluminen tiedostoja ja keskustelua, Stephanie Huang kriittisen lukemisen ja ENCODE Project.