Krooninen sairaus

tiivistelmä

lipokaliini-tyyppinen prostaglandiini D syntaasi (L-PGDS) on jäsen lipokaliini superperheen, joka koostuu sekretorisen transporter proteiineja, ja se sitoo erilaisia ​​pieniä hydrofobisia molekyylejä. Tämän toiminnon ansiosta olemme raportoineet mahdollisuutta käyttää L-PGDS uutena lääkkeenantovälineeseen huonosti vesiliukoisia lääkkeitä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, kehittäminen lääkkeen antojärjestelmän avulla L-PGDS, joka mahdollistaa suoran kliinistä käyttöä 7-etyyli-10-hydroksi-kamptotesiini (SN-38), joka on huonosti veteen liukeneva syöpälääkettä . Kun läsnä on 2 mM L-PGDS, pitoisuus SN-38 PBS: ssä kasvoi 1130-kertainen verrattuna PBS: ssä. Kolorimetriset kokeet osoittivat, että L-PGDS sidottu SN-38, jonka moolisuhde on 1: 3, joiden dissosiaatiovakio arvo 60 uM. Tulosten perusteella

in vitro

kasvun inhibitiotesti paljasti, että SN-38 /L-PGDS kompleksit osoittivat korkeaa tuumorin vastaista aktiivisuutta 3 ihmisen syöpäsolulinjoja, eli Colo201, MDA-MB-231, ja PC-3, jossa on teho on samanlainen kuin SN-38 yksinään. Laskimonsisäinen SN-38 /L-PGDS komplekseja hiirille, joilla Colo201 kasvaimia oli voimakas kasvainten vastainen vaikutus. Suoliston mukosiitti, joka on yksi sivuvaikutuksia tämän lääkkeen, ei havaittu hiirillä, joille annettiin SN-38 /L-PGDS komplekseja. Yhdessä L-PGDS mahdollistaa suoran käytön SN-38 kanssa vähemmän sivuvaikutuksia.

Citation: Nakatsuji M, Inoue H, Kohno M, Saito M, Tsuge S, Shimizu S, et ai. (2015) Human lipokaliini-Type Prostaglandiini D syntaasi-Based Drug Delivery System for heikosti vesiliukoista Anti-Cancer Drug SN-38. PLoS ONE 10 (11): e0142206. doi: 10,1371 /journal.pone.0142206

Editor: Han-Chung Wu, Academia Sinica, Taiwan

vastaanotettu: 10 elokuu 2015; Hyväksytty: 19 lokakuu 2015; Julkaistu: 03 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Nakatsuji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Avustukset 25242046 (TI), ja 21200076 (TI) Japanista Society for Promotion of Science (http: //www .jsps.go.jp /englanti /).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat yhdisteitä, joilla anti-kasvain toiminnan tiedetään olevan veteen liukenematon, ja on vakavia sivuvaikutuksia normaaleihin kudoksiin ja elimiin, mikä rajoittaa niiden tehon ja kliinistä käyttöä niitä [1]. Joitakin yleisiä lähestymistapoja parantaa liukoisuutta syöpälääkkeiden ovat kemiallinen modifiointi huumeiden ja käyttö liukoisuutta, kuten orgaanisia liuottimia, pinta-aktiivisia aineita, lipidejä, syklodekstriini, ja pH modifiointiaineita. Kuitenkin kemiallinen modifikaatio huumeiden laskee niiden teho monissa tapauksissa. Käyttö liuotusaineita rajoittavat niiden myrkyllisyys ja taipumus aiheuttaa lääkkeen epävakautta. Niinpä lääkkeiden jakelujärjestelmiä (DDSs) huonosti vesiliukoinen syöpälääkkeet joka hyödyntää tehokkaasti erilaisia ​​nanokokoluokan antovehikkeli kuten liposomit, polymeeri misellejä, ja dendrimeereissä on tutkittu intensiivisesti [2-5]. Nämä perustettu DDSs ovat kuitenkin myös havainnut joitakin ongelmia, jotka liittyvät myrkyllisyys, immunogeenisyys, hemolyysi, ja trombogeenisuus [6, 7]. Sen vuoksi on olemassa pakottava tarve kehittää uusia DDS huonosti vesiliukoinen syöpälääkkeiden; ja siten paljon vaivaa on keskittynyt parantamaan tehoa, parantaa turvallisuutta ja lisätä liukoisuutta näiden lääkkeiden.

aiemmin raportoitu, että uusi DDS käyttäen lipokaliini-tyyppinen prostaglandiini D syntaasi (L-PGDS, kuvio 1A), jäsen lipokaliini perheen proteiinin ja ei-myrkyllisiä ja ei-immunogeeninen molekyyli, voisi helpottaa lääke- ja kliinisen kehityksen heikosti vesiliukoisia yhdisteitä, kuten diatsepaami ja 6-nitro-7-sulfamoylbenzo [f] kinoksaliini -2,3-dionin käyttöön joko suun kautta tai laskimoon [8]. L-PGDS on monikäyttöinen proteiini joka toimii PGD

2 tuottava entsyymi [9], raadonsyöjä reaktiivisia happiradikaaleja [10], ja sekretorisen kuljettaja proteiini useita pieniä lipofiilisten molekyylien [11]. Lisäksi olemme hiljattain raportoitu, että L-PGDS toimii puhdistusaineena ja biliverdiini, joiden hajoamistuotteita ovat mukana aneurysman subarachnoid verenvuoto aiheuttama vasospasmeja ja hermosolukuoleman [12]. L-PGDS on tyypillinen lipokaliini kertainen, joka koostuu kahdeksan stranded antiparalleelisen β-tynnyri, ja sisätilojen tämän piipun muodostaa hydrofobisen ontelon [13-15], joka voi sitoutua monenlaisia ​​lipofiilisen ligandien sisällä [11, 16 ].

(A) Crystal rakenne ihmisen L-PGDS (molekyylimassa: 18777,7, ATE ID: 3O2Y). (B, C) Kemialliset rakenteet on SN-38 (suhteellinen molekyylimassa: 392,4) ja CPT-11 (suhteellinen molekyylimassa: 677,2).

SN-38, 7-etyyli-10-hydroksi- -kamptotekiini (kuvio 1B), on puolisynteettinen analogi, anti-syöpä alkaloidi kamptotesiini, joka on kohdistettu DNA topoisomeraasi I: n [17]. Kuitenkin, huolimatta sen voimakas anti-kasvain aktiivisuus, SN-38 ei ole käytetty suoraan kliinisessä käytännössä johtuen sen huonosta vesiliukoisuudesta [18]. Lisäksi laktonirenkaan SN-38 näyttää palautuvia pH-riippuvaiset hydrolyysin ja pH: ssa alle 5,0, SN-38 esiintyy aktiivisessa muodossa läheinen laktonirengas sen rakenteissa, vaikka se voidaan muuntaa inaktiiviseksi karboksyloiduiksi muoto fysiologisessa pH avaamalla rengas [19]. Näin ollen on vaikea hyödyntää SN-38 alle fysiologisen tilan. Sitä vastoin, irinotekaanihydrokloridi (CPT-11, kuvio 1C), joka on vesiliukoinen aihiolääke SN-38, käytetään yhdessä fluoripyrimidiinit ensilinjan terapia potilaille, joilla on edennyt paksusuolen syövän [20]. Kuitenkin kemiallinen muutos SN-38 vähentää sen antituumorivaikutuksen, mikä 1000-kertaisesti vähemmän sytotoksinen aktiivisuus CPT-11 verrattuna, että SN-38 vastaan ​​eri syöpäsolulinjoja

in vitro

[21 22]. Niinpä suoran käytön SN-38 aktiivisena muotoon käyttäen DDS voi olla suurta hyötyä syövän hoidossa.

Täällä yksityiskohta kehittää DDS käytetään ihmisen L-PGDS, joka mahdollisti suoraan käyttöön SN-38. Olemme tutkineet vaikutus L-PGDS liukoisuudesta SN-38, ja tutki vuorovaikutusta L-PGDS ja SN-38 käyttäen isoterminen titrauksella kalorimetriaa (ITC) ja saxs (SAXS). Sytotoksista aktiivisuutta SN-38 /L-PGDS komplekseja arvioitiin käyttämällä ihmisen peräsuolen syöpä, rintasyöpä, ja eturauhassyöpäsolulinjoissa. Niiden anti-kasvain aktiivisuutta tutkittiin Colo201 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen ksenograftimallissa. Arvioida sivuvaikutuksia näiden kompleksien, teimme histopatologinen analyysi ja mitataan ekspressiotasot inflammatoristen sytokiinien ohutsuolessa. Lopuksi suoritetaan anafylaksia testi arvioimiseksi immunogeenistä tehoa L-PGDS. Tulokset, jotka yhdessä osoittivat ihmisen L-PGDS olevan voimakas lääkkeenantovälineeseen SN-38.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

SN-38 hankittiin Tokyo Chemical Industry Co. Ltd (Tokio, Japani); ja CPT-11, Yakult Honsha Co., Ltd (Tokio, Japani).

Rekombinanttisen ihmisen L-PGDS

C65A /C167A (ε

280 = 25900 M

-1 cm

-1) -substituoitu L-PGDS ilmaistiin glutationi

S

-transferase fuusioproteiinin

Escherichia coli

BL21 (DE3; TOYOBO, Osaka, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [16]. Fuusioproteiini sidottiin glutationi Sepharose 4B (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, UK) ja inkuboitiin yön yli 165 yksikköä trombiinia vapauttaa L-PGDS. Rekombinanttiproteiini puhdistettiin edelleen geelisuodatuskromatografialla kanssa HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Bio-Sciences) 5 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8,0) ja dialysoitiin sitten fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS).

Liukoisuus mittaukset

ylimäärä SN-38 lisättiin PBS-puskurilla (pH 7,4). SN-38 /PBS suspensiota esi-inkuboidaan 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sekoitettiin sitten L-PGDS ratkaisu. Tämä liuos sekoitettiin sitten 37 ° C: ssa 6 tuntia ja sen jälkeen väkevöitiin käyttäen Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (Millipore Corporation, Bedford, MA). Absorptiospektrin suodos saatiin käyttämällä 1,0 cm: n valoa polku kvartsikyvettiin ja DU800-spektrometri (Beckman Coulter, Pasadena, CA). Pitoisuudet SN-38 määritettiin spektroskooppisesti perusteella molaarinen absorptiokerroin ε

380 DMSO SN-38 = 20,985 M

-1 cm

-1.

Isoterminen titraus kalorimetriaa (ITC) mittaukset

Kalorimetriset kokeet suoritettiin MicroCal VP-ITC väline (GE Healthcare Bio-Sciences), näytteen kanssa PBS-puskurissa (pH 7,4), joka sisälsi 5% DMSO: ta (v /v) on 37 ° C: ssa. L-PGDS (840 uM) injektioruiskussa on käännetyn titrattiin 50 mM SN-38 solussa. Titrauskokeet koostui 50 injektioita välein 300 sekunnin välein. Injektiotilavuus oli 2 tai 5 ui kutakin injektiota, ja solu sekoitettiin jatkuvasti 286 rpm. Vastaava kuumuus laimentamisen L-PGDS titrataan puskuri käytetään korjaamaan datan. Termodynaamiset parametrit arvioitiin käyttäen yksi-sarja riippumattomien sitoutumiskohtien mallin toimittama MicroCal alkuperä 7.0 ohjelmisto.

saxs (SAXS) mittaukset

SN-38 /L-PGDS komplekseja PBS-puskurissa vietiin suodattimen läpi poistamaan liukenemattomia yhdisteitä. Proteiinin pitoisuus kussakin näytteessä säädettiin sopivaksi SAXS kokeissa (3,0 mg /ml 12,0 mg /ml). SAXS kerättiin tietoa palkki linja BL40B2 Spring-8 (jäljempänä Synkrotronisäteilyn laitos, Hyogo, Japani), ja kaikki koemenettelyt olivat samat kuin aiemmin on kuvattu [23]. Kaksiulotteisesti tallennettu sirontakuviot muunnettiin yksiulotteinen profiilien pyöreä keskiarvon. Maksut sironnan intensiteetit liuotin poistettiin raakadatasta vähentämällä intensiteetin käyrä saadaan puskuriliuosta. Jotta voidaan laskea jäyhyyssäde kutakin proteiinia, sironta profiili analysoitiin Guinier approksimaatio kuten kuvataan kirjallisuudessa ja edellisessä raportissa [23]. Kussakin vaiheessa välisesti häiriöitä ja vaikutus aggregaatiota otokseen huolellisesti poistettu.

Soluviljely

Ihmisen koolonisyöpäsolulinja Colo201 ostettiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani); ja ihmisen rintasyöpä MDA-MB-231, American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ihmisen eturauhassyöpäsolulinja PC-3 oli ystävällisesti professori R. Yamaji (Osaka Prefecture University, Osaka, Japani). Colo201 ja PC-3-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Wako, Osaka, Japani), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiootti-Anti-sieni (Life Technologies, Carlsbad, CA), kun taas MDA-MB-231-soluja viljeltiin D-MEM (Wako), joka sisälsi 10% FBS: ää.

in vitro

kasvun inhibitiotesti

vaikutuksia SN-38 /L-PGDS komplekseja, sn 38, ja CPT-11 kasvaimen solujen kasvua tutkittiin suorittamalla WST-8 määritys (Nacalai Tesque, Kioto, Japani). Paksusuolen adenokarsinoomaa-johdettu Colo201, rinta- adenokarsinooma johdettu MDA-MB-231, ja eturauhasen adenokarsinooma-johdettu PC-3-soluja käytettiin tässä kokeessa. Nämä solut ympättiin 96-kuoppalevyille tiheyksinä 5 x 10

3 solua /kuoppa 8 x 10

3 solua /kuoppa. Sen jälkeen, kun 24-tunnin viljelyn jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN-38 /L-PGDS komplekseja, SN-38 tai CPT-11: ssa 48 tuntia, ja sitten WST-8-liuos lisättiin viljelyalustaan. Sen jälkeen soluja inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi formatsaanin valmistettu WST-8 mitattiin 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa, Malli 680 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

eläinten tutkimuksen

Kaikki käytetyt hiiret tässä tutkimuksessa oli ostettu Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japani). Hiiret majoitettiin on 12-h /12 tunnin valo-pimeä aikataulu ruokaa ja vettä saatavilla

mielin määrin

1 viikko, jotta toipuminen stressiä kuljetuksen. Kaikki eläin koetoimenpiteet oli hyväksynyt Osaka Prefecture University Animal Care ja Käytä komitea (Luvan numero: 21-135). Kaikki leikkauksia tehtiin isofluraanianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

In vivo

kasvun estäminen määrityksessä

Viisi viikkoa vanhoja BALB /c-nude hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 5 x 10

6 Colo201 soluja. Kun tuumorin tilavuus oli noussut 150 mm

3, nämä hiiret jaettiin satunnaisesti 6 testiryhmiin. SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 1,0, 2,0 tai 2,8 mg /kg /d, CPT-11: n annoksella 4,0 tai 20 mg /kg /d, tai yksinomaan PBS: ää annettiin suonensisäisesti joka toinen päivä 2 viikkoja. Pituus (a) ja leveys (b) kasvaimen ja ruumiinpaino mitattiin joka päivä ja tuumorin tilavuus laskettiin 1/2 (a x b

2).

Patologinen tutkimukset on ohutsuolen limakalvon

PBS: ää tai SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 2,8 mg /kg /d annettiin suonensisäisesti 5 viikkoa vanhoja koiraspuolisia ddY-hiiriä samalla annoksen ohjelma kuin ne, joita käytetään kasvun eston määrityksessä

in vivo

. Päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen, hiiret tapettiin, ja niiden pienet suolet eristettiin sitten. Näytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla, kuivattu, ja upotettiin parafiiniin, minkä jälkeen osat 5 um paksuus valmistettiin ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysillä

Kokonais-RNA uutettiin ohutsuoleen käyttämällä RNAiso Plus (TaKaRa, Shiga, Japani) mukaan valmistajan protokollaa. RNA käänteistranskriboitiin reagenssien kanssa on PrimeScript RT reagenssipakkauksen (TaKaRa). Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen THUNDERBIRD

® qPCR Mix (TOYOBO), ja vahvistus seurattiin PCR-laite Dice

® Real Time System II (Takara). Käytetyt alukkeet Analyysin lueteltu S1 taulukossa.

Anafylaksiaa test

Kuusi viikkoa vanhoja koiraspuolisia ddY hiiret herkistyneet joko kanan ovalbumiinin (OVA, Sigma, Tokio, Japani) tai L -PGDS. OVA: lla (2 mg /ml) tai L-PGDS (2 mg /ml) suspendoitiin vastaava määrä 13 mg /ml alumiinihydroksidia (Sigma), kuten adjuvanttia, ja suspensiota (100 ui) annettiin subkutaanisesti kunkin hiiren . 14 päivän jälkeen, joko OVA tai L-PGDS (1 mg /ml) annettiin laskimoon ja kehon lämpötilaa seurattiin käyttämällä thermofocus ei-yhteyttä infrapuna lämpömittari, THERMOFOCUS (TECNIMED srl, Varese, Italia).

tilastollinen

tiedot analysoitiin käyttämällä Studentin

t

testiä kun ryhmät olivat yhtä hyviä varianssit (F-testi) tai Welch testi, kun he osoittivat epätasainen varianssit (F-testi). Tuloksia pidettiin merkitsevä 5% merkitsevyystasolla (

P

0,05). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia.

Tulokset

parantaminen liukoisuutta SN-38 L-PGDS

vaikutuksen tutkimiseksi L-PGDS liukoisuudesta SN-38, mittasimme pitoisuus SN-38 PBS: ssä tai ilman L-PGDS. SN-38 voitaisiin liuottaa PBS vain korkeintaan 1,5 uM ilman L-PGDS. Kuitenkin, kun 2 mM L-PGDS lisättiin PBS, liukoisuus SN-38 nostaa 1700 uM, joka oli 1130-kertainen verrattuna PBS: ssä. Lisäksi toteutimme ITC ja SAXS mittaukset tutkimaan yksityiskohtaisten sitovien tila SN-38 L-PGDS. ITC mittauksissa titraamalla L-PGDS SN-38, havaitsimme hapoista, mikä osoitti suotuisia entalpia muuttuu sitoutumisen (kuvio 2A, ylempi paneeli). Jälkeen integroimalla kunkin piikin pinta-alan, integroitu lämpöä saadaan sitoutumaan SN-38 piirrettiin moolisuhde ([L-PGDS] /[SN-38]) (kuvio 2A, alempi paneeli). Sitova isotermi sovitettiin käyttäen yhden joukko riippumattomia sitoutumiskohtien malli, ja tulokset osoittivat, että L-PGDS muodostivat 1: 3 kompleksi SN-38 dissosiaatiovakiolla (

K

d ) arvo SN-38: L-PGDS 60 ± 4,0 uM. Arvot entalpian muutos ja entropian aikavälin sitoutumisen SN-38: L-PGDS olivat -17 ± 0,13 ja -8,5 ± 0,22 kJ /mol, vastaavasti. Nämä tulokset osoittivat, että vuorovaikutus L-PGDS ja SN-38 oli entalpian-odotuksiin. Seuraavaksi SAXS mittaukset, sironnan intensiteetti käyrät L-PGDS ja SN-38 /L-PGDS kompleksit paljasti, että L-PGDS ja SN-38 /L-PGDS kompleksit olivat monodispergoituneiden ilman näkyviä aggregaatiota jopa proteiinipitoisuus 640 uM (kuvio 2B). Nämä käyrät olivat samanlaisia, mutta ilmeisesti erilainen vain pienen kulman alue (vastavuoroinen vektori (

S

) 0,02 Å

-1, kuvio 2b, upotus). Arvot jäyhyyssäde L-PGDS ja SN-38 /L-PGDS monimutkainen laskettiin olevan 18,1 ± 0,09 ja 16,5 ± 0,20 Å, vastaavasti. Nämä tulokset osoittivat, että rakenne L-PGDS kutistuivat, kun proteiini sitoutuu SN-38.

(A) Kalorimetriset titraus SN-38: L-PGDS. L-PGDS injektioruiskussa oli käänteisesti titrattiin SN-38 solussa. Ylempi paneeli esittää muutosta lämpöä ajan kuluessa L-PGDS titrattiin SN-38. Alempi paneeli esittää normalisoitu muutos lämpöä vähentämisen jälkeen vertailutiedot L-PGDS injektiot PBS. Yhden kokonaisuus riippumattomia sitoutumiskohtien mallia käytettiin sopivaksi sitova isotermien. (B) SAXS profiilit L-PGDS (punainen viiva) ja SN-38 /L-PGDS kompleksi (sininen viiva). Nämä profiilit saatiin ekstrapoloimalla kaikki tiedot eri pitoisuuksina (12, 9,0, 6,0, ja 3,0 mg /ml), jolloin nolla-pitoisuus. Logaritmi sironnan intensiteetti on esitetty funktiona vastavuoroista vektorin (

S

). Insertti osoittaa logaritmi sironnan intensiteetin pienessä

S

alue.

In vitro

kasvun estäminen määrityksessä

Tutkiakseen inhiboivaa vaikutusta SN-38 /L-PGDS kompleksin solun kasvuun

in vitro

, mittasimme antituumorivaikutuksen SN-38 /L-PGDS komplekseja vastaan ​​3 ihmisen syöpäsolulinjoja, Colo201, MDA-MB-231, ja PC-3, suorittamalla WST-8 määrityksissä. SN-38 /L-PGDS komplekseja, SN-38, ja CPT-11 liuotettiin erikseen PBS: ään ja laimennettiin elatusaineeseen sopivina pitoisuuksina. Kaikki näytteet vähensi solujen elinkelpoisuuden kaikki 3 syöpäsolulinjoja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuvio 3). Laskettu IC

50-arvot on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. IC

50-arvot SN-38 /L-PGDS komplekseja kasvuun Colo201, MDA-MB-231, ja PC-3-solut olivat 35 ± 6,5, 900 ± 190 ja 10 ± 1,5 nM, vastaavasti, mikä osoittaa, että kompleksi oli voimakkain vastaan ​​PC-3-soluja. Sitä vastoin, kuin CPT-11: n kasvuun Colo201, MDA-MB-231, ja PC-3-solut olivat 26 ± 4,1, 35 ± 5,2, ja 9,8 ± 0,75 uM. Siten estäviä vaikutuksia näiden SN-38 /L-PGDS-komplekseja solun kasvuun oli 39- 980-kertaisesti tehokkaampi kuin CPT-11. Lisäksi IC

50-arvot SN-38 varten kasvun esto Colo201 ja PC-3-solut olivat 15 ± 0,66 ja 18 ± 2,4 nM, vastaavasti, joka on samanlainen kuin SN-38 /L-PGDS monimutkainen. Siten SN-38 näytti korkea sytotoksinen aktiivisuus, kun se oli mahdollista liuottaa veteen. Siinä tapauksessa, MDA-MB-231-soluja, SN-38 1 uM, sen suurin pitoisuus PBS, vähensi solujen elinkelpoisuuden vain noin 80%, ja näin ollen IC

50-arvo SN-38 ei voisi olla saatu (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittivat, että SN-38 /L-PGDS kompleksi oli lääkkeen teho on samanlainen kuin SN-38 alone.

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. (

n

= 6).

In vivo

kasvun inhibitiotesti

arvioitiin kasvaimen vastainen aktiivisuus SN-38 /L-PGDS komplekseja hiirillä, Colo201 kasvaimia. Kuvio 4A esittää vaikutuksen laskimonsisäisestä SN-38 /L-PGDS komplekseja kasvain BALB /c-nude-hiirillä kasvaimen niiden oikeaan kylkeen. PBS-saaneessa ryhmässä, progressiivinen kasvu kasvaimen tilavuuden ja oli 572 ± 62,8 mm

3 päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen PBS: ää. CPT-11 saaneessa ryhmässä (4,0 mg /kg /d), kasvain kasvoi nopeasti päivä riippuvaisella tavalla ja saavutti 555 ± 31,3 mm

3 päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen CPT-11, ei näy yhtään antituumorivaikutus. Tämä malli päivän riippuvainen kasvu oli samanlainen kuin PBS-käsitellyistä hiiristä käytettiin kontrollina. Sitä vastoin, vaikka tuumorin kasvu käsitellyillä hiirillä, joilla on korkea annos CPT-11 (20 mg /kg /d) oli lähes sama kuin havaittu PBS-käsitellyillä hiirillä päivään 6 ensimmäisen annon jälkeen, kasvu jälkeenpäin oli estyy. Kasvain tilavuus oli merkitsevästi erilainen kuin PBS-saaneessa ryhmässä jälkeen päivän 11, ja saavutti 231 ± 36,5 mm

3, mikä on 40,4% siitä PBS-saaneessa ryhmässä päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen. Toisaalta, vaikka kasvaimen kasvu hiirillä, joita hoidettiin SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 1,0 mg /kg /vrk oli lähes sama kuin havaittu PBS: llä tai CPT-11-käsiteltyjen hiirten päivä 4 ensimmäisen annon jälkeen, kasvu jälkeenpäin estyi. Kasvain tilavuus oli merkitsevästi erilainen kuin PBS-saaneessa ryhmässä jälkeen päivän 11, ja saavutti 301 ± 37,9 mm

3, mikä on 52,6% siitä PBS-saaneessa ryhmässä päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen. Lisäksi hiiret käsiteltiin SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 2,0 mg /kg /vrk (joka on ekvimolaarinen annos CPT-11 annoksella 4,0 mg /kg /d) tai 2,8 mg /kg /d, kasvaimen regression jälkeen havaittiin päivänä 4. Kun päivän 8, tuumorin tilavuus käsiteltyjen hiirien SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 2,0 mg /kg /d tai 2,8 mg /kg /d oli merkittävästi pienempi kuin nähdä PBS saaneessa ryhmässä ja oli 249 ± 19,9 ja 212 ± 36,9 mm

3: lla, joka oli 43,5 ja 37,1%, vastaavasti, että PBS-saaneessa ryhmässä päivänä 15 jälkeen ensimmäisen annoksen. Siten SN-38 /L-PGDS kompleksi osoitti merkittäviä ja annoksesta riippuvaa anti-kasvain aktiivisuutta. SN-38-annettua ryhmää (0,0029 mg /kg /d; sen suurin pitoisuus PBS: ssä), mutta kasvain kasvoi päivässä riippuvalla tavalla kasvaimen kasvuun samanlainen, että PBS: llä tai CPT-11-annettuna ryhmä (4,0 mg /kg /d) ja saavutti 536 ± 79,6 mm

3 päivänä 15 ensimmäisen annon jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että SN-38 /PBS-liuosta ei ollut merkittävää tuumorin vastaista aktiivisuutta

in vivo

. Lisäksi, jotta voidaan arvioida sivuvaikutuksia SN-38 /L-PGDS monimutkainen, me tallennettu kehon paino hiirillä päivittäisen hoidon aikana (kuvio 4B). PBS saaneessa ryhmässä, kehon painon muutos ei havaittu. CPT-11 saaneessa ryhmässä (20 mg /kg /vrk), mutta kehon painon havaittiin, ja ei ole palautunut normaalille tasolle on day15 ensimmäisen annon jälkeen. Toisaalta, SN-38 /L-PGDS kompleksit annostellun ryhmissä, huomattava laihtuminen ei havaittu 15 päivän kuluttua annosta. Nämä tulokset, yhdessä, viittaavat siihen, että laskimonsisäisesti SN-38 /L-PGDS komplekseja pienellä annoksella osoitti suurempi antituumorivaikutus kuin CPT-11.

(A) Kasvaimen tilavuutta PBS: llä, CPT-11- ja SN-38 /L-PGDS kompleksi hallitseman ryhmiä. Colo201-soluja istutettiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen hiirillä. PBS, CPT-11: n annoksella 4,0 tai 20 mg /kg /d, tai SN-38 /L-PGDS-komplekseja annoksella 1,0, 2,0 tai 2,8 mg /kg /d annettiin suonensisäisesti kerran joka toinen päivä 2 viikkoa. *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna PBS. (B) Paino muutos hiirillä kunkin hoidon jälkeen. *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna PBS. Virhepalkit SN-38 /L-PGDS kompleksin saaneessa ryhmässä annoksella 2,8 mg /kg /d ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE 4 riippumattoman kokeen; ja kuin muut, keskiarvona ± SE 6 itsenäisen kokeen.

arviointi suoliston myrkyllisyys SN-38 /L-PGDS kompleksin

On hyvin tunnettua, että yksi tärkeimmistä kliinisiä sivuvaikutuksia CPT-11 on vaikea ripuli [24, 25]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että anto CPT-11 indusoi suolen mukosiitin ominaista menetys crypt arkkitehtuurin ja tulehduksellisten sytokiinien [26, 27]. Niinpä tutkittava histopatologinen analyysi ja mittaus ekspressiotasot eri tulehduksellisten sytokiinien ohutsuolessa ovatko nämä sivuvaikutuksia CPT-11 näkyivät SN-38 /L-PGDS kompleksi (kuvio 5). Hiiret intravenoosisesti SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 2,8 mg /kg /d käyttämällä samaa annoksen ohjelma, jota käytetään kasvun inhibitiotesti ei havaittu ripulia. Histologinen huomautukset suolen limakalvon osoitti säilyttäminen Villi ja crypt arkkitehtuuri, joka oli samanlainen kuin PBS-saaneessa ryhmässä (kuvio 5A), mikä osoittaa, että SN-38 /L-PGDS kompleksi ei indusoinut suoliston vaurioita. Lisäksi ekspressiotasot interleukiini-6 (IL-6) ja interleukiini-1β (IL-1β) suolistossa, että hiirillä, joille annettiin SN-38 /L-PGDS kompleksit olivat muuttumattomina verrattuna, että hiirillä, joille annettiin PBS ( 1,3- ja 1,0-kertaiseksi, kuvio 5B). Toisaalta, suolistossa, että hiirillä, joille annettiin lipopolysakkaridi, positiivisena kontrollina, ylös-säätely IL-6 ja IL-1β havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Täten nämä tulokset osoittivat, että hallinto SN-38 /L-PGDS kompleksi ei havaittu sivuvaikutuksia, kuten suolen mukosiitti.

(A) histologia sykkyräsuolen limakalvon. Inset näyttää Villi arkkitehtuuria. Mittakaava edustaa 100 um. Vasemmassa paneelissa näkyy sykkyräsuolen limakalvon hiirille annettiin SN-38 /L-PGDS kompleksit; ja oikea, kuin hiirillä, joille annettiin PBS: ää. Sykkyräsuolen limakalvon molemmissa ryhmissä oli lähes sama. (B) ekspressio tasoille inflammatoristen sytokiinien sykkyräsuolen limakalvon. Kukin pylväs esittää keskimääräistä ± SD (

n

= 3).

Arviointi immunogeenisten teho ihmisen L-PGDS

Lopuksi arvioidaan, että onko ihmisen L-PGDS oli immunogeeninen tai hiiriä (Kuva 6). Ruumiinlämpö OVA-herkillä hiirillä jälkeen laskimoon annetun OVA nopeasti laski. Tämä lasku kehon lämpötila ei ole palautunut jopa 60 minuutin kuluttua annosta. Toisaalta, kehon lämpötila ihmisen L-PGDS-herkillä hiirillä laskimoon annon jälkeen ihmisen L-PGDS ei laskenut. Nämä tulokset paljastivat, että L-PGDS ei aiheuttanut anafylaksian vasteita hiirissä.

Muuta ruumiinlämpöä hiirillä. Hiiriä herkistetty OVA tai L-PGDS, ja sitten altistettiin OVA (○) tai L-PGDS (●). Ruumiinlämpö mitattiin 60 min. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SE 6 itsenäisen kokeen.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme mahdollisuutta käytetään ihmisen L-PGDS uutena lääkkeenantovälineeseen SN-38, joka on huonosti veteen liukeneva syöpälääke. Liukoisuusmittaukset paljasti, että pitoisuus SN-38 on merkittävästi parantunut, kun läsnä on L-PGDS. Lisäksi tulokset

in vitro

kasvun inhibitiotesti paljasti, että SN-38 /L-PGDS kompleksi osoitti voimakkaan antituumorivaikutuksen ja että kompleksi formulaatio ei vaikuttanut lääkkeen tehoon SN-38 . Lisäksi havainnot

in vivo

kokeet paljastivat, että laskimonsisäisesti SN-38 /L-PGDS kompleksit johti voimakas antituumorivaikutus ilman tyypillisiä sivuvaikutuksia SN-38, kuten suoliston mukosiitti. Nämä tulokset osoittivat, että kompleksi formulaatio käyttäen ihmisen L-PGDS tekee nyt mahdolliseksi käyttää SN-38: syövän hoitoon.

SN-38 on tehokas syövän vastainen aktiivisuus eri syöpäsolulinjoissa, kuten paksusuolen ja peräsuolen, keuhkojen, haiman, ja munasarjasyövän solujen [21, 22], mutta se ei ole käytetty kliinisesti, koska sen huonosta liukoisuudesta veteen ja farmaseuttisesti hyväksyttävien liuottimien, kuten etanolin. Vaikka CPT-11, joka on vesiliukoinen aihiolääke SN-38, on vaihtoehtoisesti käytetään hoitoon kolorektaalisyövän, metabolinen vaihtokurssi on alle 10% ja riippuu geneettisen vaihtelun suhteen karboksyyliesteraasin aktiivisuus [28, 29]. Siksi hallinnon korkea annos CPT-11 on tarpeen, jotta saavutetaan odotettua terapeuttista vaikutusta (kuvio 4A) [30]. Kuitenkin toistuvan annostelun suuri määrä CPT-11 on rajoitettu johtuen vakavia sivuvaikutuksia. Annosta rajoittava toksisuus CPT-11 anto on hyvin tunnettua johtaa suolen mukosiitin ominaista vaikea ripuli [24, 25]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että laskimoon SN-38 /L-PGDS komplekseja pienellä annoksella osoitti voimakas antituumorivaikutus verrattuna, että CPT-11 (kuvio 4A). Lisäksi, histologinen analyysi paljasti, että suolen limakalvon käsiteltyjen hiirien SN-38 /L-PGDS komplekseja annoksella 2,8 mg /kg /vrk ei näytä lyhentää nukka tai menetys crypt arkkitehtuuria (kuvio 5A), joka on yksi merkki suoliston mukosiitti. Lisäksi mRNA-tasot tulehduksellisten sytokiinien, kuten IL-6 ja IL-1β suolistossa hiirillä, joille annettiin SN-38 /L-PGDS kompleksit olivat samanlaisia ​​kuin hiiriä, joihin injektoitiin PBS: ää (kuvio 5B). Niinpä osoitettiin, että suoran käytön SN-38 kompleksina L-PGDS osoitti antituumorivaikutus ilman herättäen ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten suolen mukosiitti.

Toistaiseksi erilaisia ​​lähestymistapoja liuottamiseksi sn 38 on raportoitu mm käyttämällä makromolekyyliyhdisteet aihiolääkkeet ja nanolääketieteen muotoiluja kuten liposomit ja polymeeriset misellit [18]. Nämä menetelmät moniarvoista ja monimutkaisia ​​reaktioita; ja myrkyllisten orgaanisten liuottimien vaaditaan. Esimerkiksi EZN-2208, vesiliukoista makromolekylaarisen aihiolääke SN-38, valmistetaan monimutkaisia ​​vaiheita, kuten yön yli, reaktio [31]. Kloriinin-core tähden muotoinen segmenttikopolymeeri misellin, joka on nano-kokoinen valolle herkistävän aineen, joka kykenee kapseloimiseksi SN-38, valmistettiin käyttäen lyofilisoimalla-nesteytys menetelmällä [32]. Kuitenkin tämä lyofilisointi prosessi on aikaa vievää; ja lisäksi tämä menetelmä vaatii käytön orgaanisessa liuottimessa, kuten dimetyylisulfoksidissa. Siten myrkyllisyys jäljellä orgaanisia liuottimia pitäisi huolestuttaa. Meidän tapauksessa, kuitenkin, muotoilua SN-38 /L-PGDS komplekseja voidaan saavuttaa yksinkertaisella reaktiolla, eli vain sekoittamalla SN-38 jousitus L-PGDS ratkaisun ilman orgaanista liuotinta. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että kiinteä suun kautta nautittava formulaatio on huonosti veteen liukeneva lääkeaine /L-PGDS kompleksi voidaan helposti saavuttaa käyttämällä spray-kuivaus tekniikkaa [33]. Siksi lääkekoostumukselle käyttäen L-PGDS on suuri etu kannalta valmisteluaika ja turvallisuutta.