Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmissa työssä olemme dokumentoineet tumaansiirtymiseen endoteelin NOS (eNOS) ja sen osallistuminen kombinatorisista komplekseja estrogeenireseptorin beta (ER) ja hypoksian indusoima tekijä (HIFs), jotka määräävät lokalisoitu chromatin remodeling vastauksena estrogeenin (E2) ja hypoksia ärsykkeitä, jolloin transkription säätelyyn liittyvien geenien haitallisia ennusteeseen eturauhassyövän (PCA). Tutkia roolia ydinvoiman eNOS hankinnassa aggressiivinen fenotyypin PCA, suoritimme chip Sekvensointi on chromatin liittyvä eNOS soluista peräisin primäärikasvain huono tulos ja metastaattisen LNCaP. Huomasimme, että: 1. eNOS-sitoutuneen alueet (piikit) ovat levinneet laajalti ympäri genomin kattava useiden transkriptiotekijöiden sitoutumiskohtia, kuten estrogeenia Response Elements. 2. E2 lisäsi huiput, mikä osoittaa hormoniriippuvaiset eNOS uudelleen lokalisointi. 3. Peak jakelu oli samanlainen /ilman E2 on ≈ 55% heistä extragenic DNA-alueet ja kiehtova osallistuminen 5 ”domain useiden Mirs vapautettiin PCA. Lukuisat mahdollisesti novel Enos kohdistetut geenit on tunnistettu mikä viittaa siihen, että eNOS osallistuu säätelyyn suurten geenin sarjaa. Rinnakkainen toteaminen downregulation klusterin Mirs, kuten miR-34a, PCA soluissa liittyy huono tulos johti meidät paljastaa molekyylitason yhteydestä eNOS ja SIRT1, epigeneettisestä säätelijä ikääntymisen ja tuumorigeenisyystesti, säätelee negatiivisesti miR-34a ja vuorostaan ​​aktivoivat enos. E2 voimistaa miR-34a downregulation mikä parantaa SIRT1 ilmaus, joka kuvaa uusi eNOS /SIRT1 vuorovaikutus hienosäätää E2-aktivoitu ER signalointi, ja viittaa siihen, että eNOS voi olla tärkeä rooli aggressiivinen PCa.

Citation: Nanni S, Aiello A, Re A, GUFFANTI A, Benvenuti V Colussi C, et al. (2013) estrogeeniriippuvainen dynaaminen profiili Enos-DNA Associations in Eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (5): e62522. doi: 10,1371 /journal.pone.0062522

Editor: Costanza Emanueli, University of Bristol, Iso-Britannia

vastaanotettu: 20 joulukuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2013; Julkaistu: 03 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Nanni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Associazione Italiana Ricerca sul Cancro AFA; Italian opetusministeriö, University and Research Grants: PRIN 2008NY72SJ ja FIRB RBFR087JMZ AFA ja FIRB RBFR10URHP jotta S.N. V.B. on vastaanottajan FIRC (Federazione Italiana Ricerca sul Cancro) Fellowship. A. A. tuetaan rahoituksella Susan G. Komen varten Cure Foundation. C.G. tutkimus tukee LOEWE Center for Cell ja Gene Therapy, Goethe University, Frankfurt (DE). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut: toinen kirjoittaja AG on Genomnia srl ​​työntekijän ja Fe on konsultti Genomnia srl. Co-kirjoittajat CG mainos MCC ovat PLoS One toimitusneuvosto jäsenet. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Typpioksidi (NO) ja sen synthases saavuttaneet julkkis keskuudessa onkologit koska todisteita usein vapauttaminen NO-tuotannon useissa kasvaimissa, mukaan lukien eturauhassyöpä (PCA, [1], [2], [3], ja löytämisen keskeinen rooli endoteelin NOS (eNOS) kasvaimen huolto ja etenemiseen [1 ], [3], [4]. Meidän ennen kokeellisia tuloksia on saatu osoitus fysiopatologiset rooli eNOS kolmen solun yhteyksissä: normaali ihmisen endoteelisoluja (HUVEC) ennen ja jälkeen hoidon 17β-estradioli (E2), epiteeli- soluviljelmiä PCA eksplanttien kasvatettu pohjapinta kunnossa tai E2, ja eturauhasen kudosnäytteitä PCA potilaista. Konfokaalimikroskopia ja immunohistokemia ovat dokumentoineet erityisesti eNOS tumaansiirtymiseen kaikissa tutkittavissa malleissa [1], [5] ja toimitti seuraavat todisteet: (i) enos-NO ”ydinvoiman” signalointi on keskeinen väylän endoteelisolujen vastauksena angiogeenisten ärsykkeiden ja hankintaan aggressiivisemman fenotyypin PCa; ja (ii) olemassaolo ja toiminnallista roolia ratkaiseva kombinatorisista komplekseja kromatiinin, eNOS /ERa nimenomaisesti osallistu ylläpitoon verisuonten homeostaasin [6], [7] ja eNOS /ER, Enos /HIF-1α tai eNOS /HIF-2α erityisesti liittyvät haitalliset kliininen tulos PCa [1]. Kasvaimen mallissa nämä kompleksit määrittää paikallisia remodeling kromatiinin vastauksena estrogeenin ja hypoksia ärsykkeitä, mikä transkription säätelyyn prognoosi- kohdegeenien [1]. Olipa eNOS ja sen kumppanit ovat läsnä tähdistö koordinaatiokomplekseilla tai muodossa makro-monitekijäinen kompleksi vielä arvioitava.

Viime vuosina merkittävä tehtävä ihmisen syövän aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden on on osoitettu myös dysregulaatio MikroRNA (MIRS) [8], [9]. Miten ilmaisua prognoosi- kohdegeenien säädellään yhteydessä PCa on parhaillaan tutkittavana vaikka useita raportteja [10], [11], [12], [13], [14] ovat määrittäneet klusterit erittäin tärkeitä eturauhassyövän. Tässä olemme laajentaneet tämän näkökohdan dokumentoimalla merkittävä downregulation klusterin Mirs, yksinomaan PCA soluissa olevan haitallisia kliiniseen tulokseen (G1 solut). Tämä klusteri koostuu miR-34a, ensimmäinen miR tunnistettu säätelijänä SIRT1 deasetylaasin [15] kriittisesti epigeneettisellä ohjaimen ikääntymisen ja tuumorigeenisyystesti [16].

Huomattavaa eNOS ja NO on myös mukana ikääntyminen, asiaa tarkkailua, sillä ikääntyminen pidetään itsenäinen riskitekijä useissa patologisissa tiloissa. Ikääntymisen aikana, eNOS usein vapautettu ja tavallista NO biosynteesiä muuttuu vapaiden radikaalien tuotantoa. Tämä vaikutus edistää DNA-vaurioita ja perimän epävakaisuuden luoda suotuisat maaperää syövän kehittymisen. Itse eNOS on äskettäin liittynyt ylläpitoon haimasyövän [4] ja etenemisen PCa [1], joka on yksi yleisin syöpä vanhuksilla. Mielenkiintoista, rooli eNOS vanhenemisprosessin aikana on tiukasti sidoksissa toiminnan SIRT1. Fysiologisissa olosuhteissa, SIRT1 aktivoi Enos deasetyloinnilla. Ikääntyminen, huonontamalla SIRT1 funktio määrittää alennettua glukoosi metabolisen tehokkuutta sekä vähentää tuotannon asianomaisen NO tasoilla, siten heikentäen solunsisäiseen ympäristöön.

Nämä tilat yhdessä meidän alkuperäinen havainto, että NO polku edustaa ”

primum movens

”transkriptionaalisen edistämisohjelma hankinta aggressiivisen fenotyypin PCA soluissa, ja että ydinvoima translokaatiota eNOS vaikuttaa merkittävästi chromatin remontin tietyn osajoukon PCa prognostisten geenien [17], on saanut meidät tutkia täysimääräisesti tämän avaimen signalointi molekyyli isännäksi geeni etenemistä eturauhassyöpää. Tavoitteemme ja haaste oli paljastaa toiminta eNOS on genominlaajuisten mittakaavassa siru-sekvensointi lähestymistapa, toivoa paljastamalla yleinen mekanismi liittyy läsnäolo ydinvoiman eNOS eturauhasen kasvaimia. Tässä esittelemme kokeellista näyttöä, joka määrittelee molekyyli piiri, joka edistää aggressiivinen ja metastaattisen PCa ja voidaan moduloida eNOS tai SIRT1 estäjien mahdollisia vaikutuksia nykyiseen hoitoja PCA.

Methods

Hormonit ja inhibiittorit

17β-estradioli (E2 Sigma), NG-nitro-L-arginiini-metyyliesteri (L-NAME, Alexis), TSA (Sigma-Aldrich), MS275, MC1568, sirtinol, resveratrol olivat ystävällinen lahja Antonello Mai (Rooma, Italia).

Vasta

anti-ERa (HC-20 [Santa Cruz Biotechnology], anti-ER (L-20 [Santa Cruz Biotechnology], anti- eNOS (eNOS /NOS Tyyppi III [BD Biosciences] Abcam, Cambridge, Iso-Britannia ja Cell Signaling, MA, USA), anti-HDAC1 (Abcam, Cambridge, Iso-Britannia ja Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HDAC4 (Abcam, Cambridge, Iso-Britannia ja Santa Cruz, CA, USA), anti-HDAC5 (Abcam, Cambridge, UK) anti -SIRT1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-5-metyylisytidiinin (Eurogentec, Seraing, Belgia), anti-α-aktiini (Sigma-Aldrich), ja anti- HSP70 (StressGen Biotechnologies, San Diego, CA).

Cell Culture

HUVEC ja LNCaP-soluja viljeltiin, kuten on kuvattu [1], [5]. Ensisijainen eturauhassyövän viljelmiä saatiin tuoreeltaan irrotetut eturauhassyöpään yksilöitä tulee hyväksyä institutionaalisten eettisen komitean kuvatulla [17]. Kuolemattomiksi PCa-solut saatiin transduktio hTERT ja SV40: n suuren T-antigeenin, kuten on kuvattu [1]. Kliiniset tiedot osallistuneista potilaista tässä tutkimuksessa on jo raportoitu muualla [17]. Tulos potilaiden (selviytymisen, etäpesäke, paikallisia ja /tai biokemiallisten uusiutuminen) seurasi joulukuuhun 2012 mennessä (seurantajakso, heinäkuu 2002 joulukuuhun 2012). Huono ennuste ryhmä (G1) potilaista PCA määriteltiin läsnäolo biokemiallisten /paikallisen uusiutumisen, etäpesäke, tai taudin aiheuttaman kuolleisuuden, ja hyvä ennuste ryhmä (G2) on määritellyt täydellinen remissio leikkaus yksin. Johdetut solulinjat potilailla on osoitettu vastaavasti G1 (C1IM, C11IM, C13IM, C19IM, C27IM, C43IM, C45IM) tai G2 (C14IM, C24IM, C25IM, C35IM, C38IM, C39IM, C40IM, C41IM) fenotyypit.

transfektoinneilla, Cell uutteet ja Western Blot

Transient transfektiot suoritettiin Jet Pei ™ tekniikka (Poly Plus transfektio). eNOS, joka koodaa S1177A oli lahja C. M. Laskuri (Duke University Medical Center, Durham, USA) [4]. Yhteensä uutteet Co-IP immunosaostus saatiin USA Buffer (Tris-HCl 50 mM, pH = 7,5; EDTA 5 mM, NaCl 250 mM; Triton 0,1%; NaF 50 mM), ydin- ja sytoplasman jakeet saatiin aikaisemmin kuvatulla [18 ].

Hoidot

Soluja käsiteltiin 10

-7 M E2, 5 mM L-NAME, 500 nM TSA, 500 nM MS275, 10 uM MC1568, 10 uM sirtinol, 25 uM resveratroli, yksin tai yhdistelmänä aikoina osoitettu kuvassa legendoja. Vähintään 72 tuntia ennen kokeellista käyttöä, solut kytketään jota on täydennetty hormoni-riistää seerumin [19].

sirut ja Re-siruja

siru ja uudelleen ChIP määritykset viljellyistä solut suoritettiin kuten on kuvattu [1] käyttäen spesifisiä vasta-aineita ER, eNOS, SIRT1, HDAC1, HDAC 3, HDAC 4. Negatiiviset kontrollit olivat vasta-aineen puuttuessa (Noab) tai normaalia IgG. Analyysi metylaation käyttäen vasta-ainetta anti-5-metyylisytidiini suoritettiin, kuten on kuvattu [5]. DNA-fragmentit otettiin talteen ja analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä, kuten on kuvattu [1]. Alukkeet esitetty täydentävien osiossa.

siru-sekvensointi, hake suoritettiin kuten on kuvattu [1], [6] muutoksin. Lyhyesti, kromatiinin liuokset valmistettiin sonikoimalla käyttämällä Bioruptor UCD-200 (Diagenode), jolloin saatiin DNA-fragmentit välillä 150-500 emäsparin pituus. Pre-clearing kromatiinin liuosta suoritettiin proteiini-G-agaroosin (Pierce) ja talteenotto immuuni- komplekseja proteiini G kyllästettiin BSA: n lopullinen konsentraatio 1 ug /ul. Immunosaostettiin ja tulo DNA-näytteet liuotettiin kahdesti tislattuun H

2O. Validointi DNA ennen sekvensointia suoritettiin qPCR käyttämällä spesifisiä alukkeita hTERT ja pS2 promoottorit (ks Supplemental kohta).

Kirjasto valmistelu, siru-sekvensointi ja bioinformatiikka- Analysis

NGS kirjasto valmistelu ja Solid sekvensointi suoritettiin Genomnia. DNA-näytteet 50 ul Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 jauhettiin käyttäen Covaris ™ S2 System, seuraavilla asetuksilla: käyttömäärä 10%, voimakkuus 5%, sykliä /räjähtää 200, kiertoaika 60 s , jaksojen lukumäärä 3. DNA koko leikkaamisen jälkeen, tarkistetaan Bioanalyzer, oli 25-400 nt jonka huippu noin 140 nt. Leikatut DNA (50 ng) oli lopussa korjattu ja liitettiin pika -ligaatiokittiä (New England Biolabs) ja 27 pmol multiplex P1 adapterin ja 27 pmol yhdestä (erilaiset kullekin ligaatiota) ja viivakoodilla multiplex P2 kaksijuosteista adapterit (Solid ™ fragmentti Library Oligos Kit, Applied Biosystems pn 4401151). Näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, puhdistettiin käyttämällä Agencourt® AMPure® Kit, ja nick-translaatio suoritettiin ei-liitettiin 3′-päihin. Lopuksi kirjaston molekyylit monistettiin PCR: llä 15-17 sykliä ja puhdistettiin käyttämällä Agencourt® AMPure® Kit kuten edellä on kuvattu. Näytteet kvantifioitiin käyttäen Qubit dsDNA HS tai BR sarjat ja tarkistaa Bioanalyzer (Agilent Technology) käyttäen DNA 1000 siru. Saada sitova ja klonaalisen monistuksen kirjaston fragmenttien pinnalla sekvensointi helmiä, 8 yhdistetään DNA-kirjastoja lisättiin emulsioon PCR-reaktio suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems). Sen jälkeen vahvistus, emulsio katkesi butanolilla, helmiä rikastettiin mallin positiivinen helmiä, 3′-pää laajennettu ja kiinnitetty kovalenttisesti yhdelle sekvensointi dia, ja sekvensoitiin tavallisilla asetuksia kiinteän järjestelmän versio 3.5 tuottaa 50 nukleotidin pitkä lukee.

kartoitus Sequencing Data

kartoitus Väriavaruuden sekvensointi lukee vertailutasoon genomin (UCSC Homo sapiens hg19 maasta UCSC) suoritettiin Lifetech Lifescope 2.5.1 bioinformatiikan ohjelmistopaketti, kun ” priori ”virheenkorjauksen kanssa SAET menettelyä. Tuloksena linjaus tiedostot (pareittain Input ja Experiment) in standard.bam muodossa analysoitiin huippu soittamalla suoraan MACS ohjelmistoversion 1.4.1 [20]. Lisäksi the.bam linjauksia muunnettiin the.bed muotoon kanssa bamToBed bedtools hyödyllisyys ja käytetään huippu soittamalla kanssa Sicer analysointiohjelmisto [21], jotta voidaan ottaa huomioon heterogeeninen luonne DNA – proteiini vuorovaikutusten, jotka voivat sisältää melko pitkä alueet vuorovaikutuksen. Kaikki risteykset välillä MACS ja Sicer vuode tiedostoja ja genominlaajuisten toimintoja suoritettiin bedTools v2.17.0 ohjelmistopaketti (https://code.google.com/p/bedtools/).

Peak Identification

valmisteleva data analyysi sekvensointi ja kartoitus tuloksia, että MACS huippu laatu, suhteellisen huomautusta ja lisäksi huippu kutsuvan suoritettiin kaupallisen Integromics SeqSolve bioinformatiikan ohjelmistopaketti. Korrelaatio MACS ja Sicer huiput (koe

versus

Input), joiden tiedetään NCBI RefSeq geenin rakenne ja merkintä suoritettiin talon Genomnia Perl-skriptit tai kanssa ChIPpeakAnno Bioconductor kirjasto, versio 2.10 [22]. Ero huippu-analyysi suoritettiin SICER-df.sh rutiinia Sicer ohjelmiston kanssa tai Bioconductor DiffBind kirjaston [23], täydentää talon Genomnia Perl-skriptit. Poistaminen avoin kromatiinin (vääriä positiivisia) alueilla tehtiin käyttämällä ”Kattava kokoelma signaali artefakti mustan listan alueista ihmisen genomin”, Anshul Kundaje, ftp://encodeftp.cse.ucsc.edu/users/akundaje/rawdata/blacklists/hg19 /). Tilastollinen testi liittyy sekvenssin piirteitä (arviointi TSS ja piikin pituus keskiarvo erot) arvioitiin Welch Kaksi otoksen t-testiä R-versiossa 2.15.1 tilastokieltä. Sequence sidottu tilastolliset analyysit, mukaan lukien ydin tag tiheys laskelmat, tehtiin sopivan tilastollisen rutiineja ja kirjastot R version 2.15.1 tilastokieltä (https://www.r-project.org/). Lyhyen lukea sekvenointitulosten ja siihen liittyvä koe tiedot on talletettu EBI ArrayExpress tietokanta (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) hakunumerolla E-MTAB-1204.

SIRT Activity

entsymaattinen aktiivisuus arvioitiin HDAC iinianalyysikitissä (Upstate) valmistajan ohjeen mukaisesti käyttämällä 40micrograms koko uutteet.

konfokaalimikroskopialla

konfokaali-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [1]. Näyte analysoitiin Zeiss LSM510 Meta konfokaalimikroskoopilla kanssa 63x suurennus. Jokaista näytettä 10 itsenäistä kentät analysoitiin ja edustavat kuvat näytetään. Rinnakkaispaikantumisen maski saatiin LSM510 ohjelmisto tuottaa kuvia, jotka sisältävät yksinomaan colocalized alueilla.

Exiqon mikrosirut ja data-analyysin

Kokonais-RNA puhdistus, mukaan lukien miRNA, suoritettiin käyttäen miRNeasy Kit (QIAGEN) ja näytteet varastoitiin välittömästi -80 ° C: ssa. RNA kvantifiointi ja eheyttä arvioitiin käyttäen Nanodrop ja Agilent 2100 Bioanalyzer. Vain näytteitä RNA eheyden numero (RIN) 8,0 otettiin analyysiä varten. Yhteensä 500 ng RNA: ta näytettä ja viite leimattiin Hy3 ™ ja Hy5 ™ fluoresoiva leima, vastaavasti, käyttäen miRCURY ™ LNA Array teho -leimauskitillä (Exiqon, Tanska) noudattaen valmistajan kuvaamia. Hy3 ™ -merkattua näytteitä ja Hy5 ™ -merkattua viitteenä RNA-näytettä sekoitettiin pareittain ja hybridisoitui miRCURY ™ LNA Array versio 5

th Generation (Exiqon, Tanska), joka sisältää sieppauskoettimien suunnattu kaikille miRNA ihmisille , hiiren tai rotan rekisteröity miRBASE versiossa 16.0 Sanger Institute. Hybridisaatio suoritettiin mukaisesti miRCURY ™ LNA array käsikirja käyttäen Tecan HS4800 hybridisaatio station (Tecan, Itävalta). Hybridisaation jälkeen mikrosiru diat skannattiin ja varastoitava otsonia ympäristössä (otsoni tason alapuolella 2,0 ppb) estääkseen mahdollisia valkaisu fluoresoivan väriaineita. MiRCURY ™ LNA array mikrosirujen Levyt skannattu käyttäen Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) ja kuva-analyysi suoritettiin käyttäen ImaGene 9.0 ohjelmisto (BioDiscovery, Inc., USA). Määrälliset signaalit Taustakorjatun (Normexp offset-arvon 10 [24] ja normalisoitu käyttämällä yleisiä Lowess (paikallisesti painotettu scatterplot tasoittava) regressio algoritmi. Differential ilmaus miRNA ryhmien välillä suoritettiin käyttäen t-testiä yksisuuntaisen jonka jälkeen

p

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. kaikkiaan 52 Mirs käytettiin tuottamaan lämpökarttana jossa punainen ja vihreä väri osoittaa korkea ja matala ilme vastaavasti. kaksisuuntainen valvottu klusterointi analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiot ja Wardin kriteereitä sidoksen sääntö. C27IM solulinja hybridisoitiin kahdesti korrelaatio = 0,92. mikrosirut tiedot on talletettu Curie tietokantaan https://microarrays.curie.fr/, kirjautuminen käyttäjätunnus ja salasana ovat saatavilla pyynnöstä .

Kypsät miRNA ja pri-miR Detection

Käänteinen transkriptio suoritettiin valmistajan protokollan TaqMan menetelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolme kertaa kahtena ABI Prism 7500 tai 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Suhteellinen määrä kunkin kypsä miR tai pri-miR mitattiin kertainen muutos käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä (RNU6B tai RNU19 ja β-aktiini tai GAPDH toimi endogeeninen kontrolli, vastaavasti).

Tilastot

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Prism 2,01 tilasto-ohjelmalla (GraphPad). Eroja aineryhmän arvioitiin 2-tailed U-testi ja 1-pyrstö Studentin t-testiä. 95%: n luottamusväli (P 0,05) pidettiin merkittävänä. Tiedot edustettuina rasiakuvaajien kartat (laatikot osoittavat mediaanit ja ylemmän ja alemman kvartiileihin tietojen ja viikset osoittavat minimi- ja maksimiarvot), keskiarvo ± SEM tai taitteeseen induktion (+/- käsittely), kuten kuviossa legendoja.

tulokset

genominlaajuiset profiili enos sitovan Events eturauhassyöpäsoluissa

aiemmin dokumentoitu, että eturauhasen syöpäsolujen eNOS siirtyy tumaan vastauksena estrogeenin, prosessi inhiboi anti-estrogeenit [5]. Tässä näytämme konfokaalimikroskopiaa että tämä estrogeeniriippuvainen uudelleen lokalisointi on myös tehokkaasti estää L-NAME, estäjä eNOS (kuva S1). Tämä havainto tukee voimakkaasti kausaalista suhdetta eNOS toimintaa, NO-tuotantoa ja estrogeenin signalointi.

Avoimet kysymykset

i.

Miten eNOS rooli eturauhassyövän perusolosuhteissa tai vastauksena estrogeenit ja sitä kautta on estrogeeniriippuvainen transkription ohjelma liittyy eturauhassyöpään aggressiivinen fenotyyppi ?, ja

ii.

Onko ydinvoiman eNOS toiminto liittyy molekyylien vuorovaikutus proteiinien mahdollisuus muuttaa kromatiinirakenteeseen ja muuttavat transcriptome estrogeenin reagoiva eturauhasen syöpäsolujen? Näiden kysymysten kromatiinin immuunisaostuksissa kytketty massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät (chip kohdat) suoritettiin ennen ja jälkeen hoidon 17β-estradioli (E2, 10

-7M) kahdessa solulinjoissa:

i

. C27IM peräisin olevat solut ensisijainen eturauhassyövän aggressiivisen fenotyyppi ja hyvin ominaista immunofenotyypin, sytogeneettinen markkereita, kasvu ja pesäkkeiden muodostumista, geenimonistuksen, mRNA geeni ja miR profile [1], [17], ja

ii

. LNCaP-solut, ihmisen eturauhasen solulinja, joka on johdettu imusolmuke etäpesäke [25], mikä edustaa ”metastaattinen” fenotyyppi. Säilytetty reagointikykyä näiden solujen sukupuolen steroidihormonien, sekä androgeenien ja estrogeenien [19], [26], tekee niistä optimaalinen ohjaus hormonin reagoiva primaarikasvaimen aggressiivinen, mutta ei vielä metastaattinen.

Tavoitteena Tutkimuksemme oli tunnistaa, eturauhasen mikroympäristössä, ensisijainen transkription tavoitteet E2 liittyvää signalointia enos. Olemme keskittyneet lyhyen hormonihoito (45 min) perusteella aiempien tutkimusten meille ja muille, että selvästi tätä ajoitusta optimaaliseksi seuraavien ensisijaisen ja välittömät vaikutukset E2-riippuvaista transkriptiota, ennen aktivointia tavoitepisteistä [1 ], [6], [19], [27], [28].

enos chip kohdat tehtiin ja enos liittyvä DNA-alueet (piikit) tunnistettiin käyttäen kahta algoritmeja, MACS 1.4.1 ( Linux-versio tai sisällytetty kaupallisten ohjelmistojen SeqSolve ™ päässä Integromics) ja Sicer v1.1, minimoida huippu soittajan harhaa ja harkitsemaan ”laajennettu” luonne vuorovaikutuksen eNOS /ER komplekseja kromatiinin [20], [21] . Differential analyysi kutsutaan piikkien tai laajennettu alueista (saaret) suoritettiin myös kahta menetelmää, jossa verrataan ja leikkaa tuloksia, samoista syistä (katso Menetelmät ja [22], [23], [29], [30]).

määrä sekvensointi lukee ja enos sitova tapahtumia kunkin solulinjan, hoitamaton tai altistunut E2

, on esitetty taulukossa S1. Molemmissa olosuhteissa, eNOS-DNA: ta sisältävää piikkiä havaittiin laajalti jakautuneena genomin konservoituneita hyperdensity alueilla, kuten on esitetty päällekkäin ihmisen kromosomiin ideograms sekä solulinjoissa (kuvio S2). Tämä malli, joka muistuttaa genomisen jakelun ERE sivustoja kuvanneet Carroll

et al.

[31], tukee aiempia havaintoja olemassaolosta eNOS /ER kompleksit [1], [5], [6] .

Havaitsimme MACSilla huippu puhelu analyysin C27IM ja LNCaP, vastaavasti 12034 ja 2344 enos liittyvät huiput ennen E2 hoitoa, ja 57802 ja 34560 sen jälkeen (taulukko S2). Huomattavaa on, että poiston avoimen kromatiinin alueita, joiden tiedetään tuottaa vääriä positiivisia siru-seq kokeita (ns ”ultra-high signaali artefakti alueet”) jäljellä olennaisesti muuttumattomana tuloksia eli huippu numero: 11694 ja 2333 hoitamattomien C27IM ja LNCaP ja 57616 tai 34451 in C27IM ja LNCaP päälle E2 hoito (taulukko S2 ja kuva 1A) (katso menetelmät ja [32].

A) Venn kaavio vyöhykkeillä eNOS-rekrytointi puuttuessa ( NT) tai läsnä ollessa estradioli (E2). Määrää erillisiä genomista Enos-rekrytointi huiput tunnistetaan chip Seq in C27IM_NT ja C27IM_E2 (vasemmalla), LNCaP_NT ja LNCaP_E2 (oikealla) käyttäen MACS analyysi (FDR 0,1 ja P-arvo p 1e-5). Päällekkäisyyksiä huippuja NT ja E2condition määritettiin käyttäen kynnys 1 nt. B) Pituus jakelu eNOS piikkien C27 IM_NT, C27 IM_ E2 (vasemmalla) ja LNCaP NT, LNCaP E2 (oikealla). Tiedot esitetään päällekkäin rasiakuvaajien piikin pituuksilla E2 käsitelty (musta) tai käsittelemätön (harmaa). Musta viiva on E2 huiput keskipituus, harmaa viiva on NT huiput keskipituus. p 2.2e-16 NT vs E2. C) Piirakkakuvio eNOS-huippujen jakelun intra /extragenic alueet (vasen) tai etäisyyden TSS (oikealla). Numerot prosentteina edustavat min-max-arvot kussakin luokassa. D) Venn-kaavio MACS-piikkien C27IM_E2 ja LNCaP_E2. Päällekkäisyyttä eNOS piikkien määritettiin käyttäen kynnys 1 nt. E) Validation kvantitatiivisen PCR chip-Seq Enos-huiput. eNOS sitoutuminen seurattiin 9 genomialuetta, spesifisyys arvioitiin ”tyhjän” alue (alue ilman Enos piikit) kromosomi 5. Data edustaa keskiarvoa +/- SEM 3 riippumattoman kokeen. * P 0,05 eNOS_E2 vs eNOS_NT.

selvää, kun estrogeenihoito huippujen määrä kasvoi huomattavasti (4,8- ja 14-kertaisesti C27IM ja LNCaP-solut, vastaavasti), joka osoittaa tietyn hormoniriippuvaisen enos uudelleen lokalisointi pitkin genomin. Kvantitatiivinen sekvenssi vertailu Enos liittyvien huiput ennen ja jälkeen E2 hoidon paljastaneet päällekkäiset piikit kahden olosuhteissa (6805 yleinen huippuja C27IM ja 1368 LNCaP-soluissa (kuvio 1A). Vastaava päällekkäisyyden 5190 ja 1630 geenien C27IM ja LNCaP vastaavasti havaittiin myös enos-huiput liittyvät lähimpään geenin selityksin NCBI RefSeq tietokantaan sisällytetty UCSC Genome Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) (tuloksia ei ole esitetty). Peittävä huiput (ja liittyvät geenit), jolloin ne ovat osa-sarja eNOS-sidottu alueita, jotka eivät ole herkkiä estradiolihoito, mikä viittaa eNOS vuorovaikutus proteiinien muiden kuin ER.

toinen pää, suurin osa huiput ovat herkkiä E2, jolloin induktio

de-novo

eNOS genomin sitova (50811 huiput C27IM ja 33083 LNCaP) tai irtoaminen (4889 huiput C27IM ja 965 LNCaP ). Kiinnostaa, molemmissa tapauksissa, useita eNOS MACS huippuja aiheuttama estradioli olemassa

per

geeniä. E2-käsitellyt solut useimmat eNOS kohdegeenien sidottiin kerran tai kahdesti, noin 5% oli sidottu 3 kertaa, ja noin 9% sidottiin 4 tai useamman kerran (taulukko S3). Lisäksi E2 stimulaatio muuttunut jakelun eNOS kuten on osoitettu merkittävästi lisääntynyt piikin pituus jälkeen E2 hoidon viittaa DNA-eNOS /ER monimutkainen vakauttaminen seuraava hormonihoito (taulukko S2 ja kuvio 1 B).

Distribution eNOS-huiput suhteessa lähimpään TSS saadaan käyttämällä Kernel tag tiheys analyysi paljasti, että

i.

niiden taajuus keskittyy TSS ja pienentää molemmin puolin selvä epäsymmetria kohti en sisäinen alueilla (kuvio S3A) ja

ii

. E2 hoito laajensi maailmanlaajuista kattamalla alueella huiput C27IM ja, vähemmässä määrin, LNCaP-soluissa, kuten on esitetty käyttämällä 10.000 emäsparin ikkuna, vaikka huiput osoittivat merkittävää rikastumista noin TSS seuraavat E2 ärsyke (Fig. S3B).

Merkillistä, globaali huippu jakelu selityksin genomialuetta oli samankaltainen molemmissa koeolosuhteissa (+/- E2), lievästi esiintyvyys (53-58%) huippuja lokalisoitu extragenic alueilla, ja loput geeninsisäiset alueilla, erityisesti sisällä introneja (kuvio 1 C). Kuten kuviossa 1D, oli huomattavaa päällekkäisyyttä huippujen aiheuttama E2 C27IM ja LNCaP.

Korrelaatio sivustojen määrä tunnistaa MACS ja Sicer sekä C27IM ja LNCaP havaittu merkittäviä konkordanssin (katso Methods ), edelleen vahvistaneet sen tulokset siru määrityksen kuvassa S4. Esimerkiksi hTERT, estrogeenin kohdegeenin, jossa on useita tunnettuja eres [1], [19], [33], [34] näyttää MACS huiput ja E2-lisääntyi Sicer saaret vastaten sivustoja hyvin tunnettu chip qPCR (Kuva S4A ); pS2 (TFF1), klassisen estrogeeni kohdegeenin osoittaa E2-lisääntyi Sicer johdettua saaria sivustoja monistettiin chip qPCR (kuva S4b); GSTP1 geeni vaiennetaan ER-eNOS monimutkainen ligandin poissa ollessa [5] osoittaa, MACS piikkejä vastaten sivustojen monistettiin chip qPCR, yksinomaan stimuloitumattomassa kunnossa (kuva S4C).

Lisäksi matriisi pairwise korrelaatio kuvaa DNA käyttöasteen perusteella MACS piikin soittaja pisteet ja koordinaatit (kuva S5a) sekä hierarkkinen klusterianalyysin sitoutumisaffiniteetin (heatmap) osoittaa affiniteetit erilaisesti sidottu sivustoja laskettu lukea count data ja MACS huippu koordinaatit (kuva S5B) paljasti, että sitoutumiskohtiin ryhmittyneet ensimmäisenä vastauksena E2, ja sitten mukaan solutyypistä. Kaikkiaan 692 E2 vs NT erilaisesti edustaa huiput (FDR 0,05) havaittiin, näistä 287 positiivisen kertainen muutos ja loput negatiivinen.

Lisäksi meidän validoitu eNOS ChIP-Seq data rikastamiseen havaittu upon estradiolihoito. E2 vaikutusta seurattiin C27IM soluissa, käsittelemättä (NT) tai E2-käsitelty, käyttäen anti-eNOS-vasta-aineen ja ChIP-qPCR kahdeksan geenin promoottorit aiemmin tunnistettu tai johdettu microRNA profiilin analyysi (kuvio 1 E ja kuvio 2A alla) [1] . Tuloksemme osoittavat merkittävä korrelaatio läsnä eNOS-piikit, kuten nousemassa chip Seq data kimppuunsa estrogeenihoito (kuva S4 ja

tuloksia ei esitetty

), ja estrogeenista johtuvaa rekrytointi eNOS päälle sama genomialuetta arvioituna perinteinen chip qPCR. Rikastusta normalisoitiin vasta-aineen puuttuessa (Noab), tai jotka eivät liity vasta-aineen (Ab IgG). Erityisyys Siru-Seq varmistettiin käyttäen alukkeita monistamaan genomista aluetta sisällä kromosomin 5 puuttuvat eNOS huippuja ja samanaikaisesti osoittaa puuttuminen eNOS rekrytointi klassisen chip qPCR.

A) Valvottu klusterin analyysi MikroRNA profilointi (Exiqon array) kahden potilasryhmille määriteltyjen toistumisen tila (hyvä vai huono prognoosi). B) Validation kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ero miRNA tasojen G1 (Bad ennustetta n = 7) ja G2 (Good ennustetta n = 8) ryhmiä, * p 0,05 G1 vs G2. C) Differential alkutuotantotason transkriptien (PRI-miR) in G1 (n = 7) ja G2 (n = 8), * p 0,05 G1 vs G2. Tiedot edustettuina rasiakuvaaja on logaritmi mittakaavassa.

Cluster analyysi miRNA kuvio PCA soluissa.

Koska tavoitteena on erottaa tappavien ja ei-tappavien eturauhassyöpä ja lopulta parantaa