Krooninen sairaus

tiivistelmä

P73, yksi jäsen kasvaimen p53 perhe, osakkeita erittäin rakenteellinen ja toiminnallinen samankaltaisuus p53. Kuten p53 transkriptionaalisesti aktiivinen TAp73 voi välittää soluvastetta kemoterapeuttisten aineiden ihmisen syöpäsoluja jopa säätelemällä ilmauksia sen proapoptoottisten kohdegeenien kuten PUMA, Bax, NOXA. Täällä esitetty uusi molekyylimekanismiksi TAp73 välittämää apoptoosia vasteena sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja, ja se oli riippumatta p53 asemasta. Olemme havainneet, että TAp73 toimi aktivaattori c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) signalointireitin jopa-ekspressiota sääteleviä tavoitteensa kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurion-indusoituvan proteiinin GADD45 alfa (GADD45α) ja sen jälkeen aktivoimalla mitogen- aktivoitu proteiinikinaasi kinaasi-4 (MKK4: n). Esto JNK aktiivisuuden tietyn estäjän tai Sirna (siRNA) merkitsevästi kumottu TAp73 välittämää indusoiman apoptoosin sisplatiinia. Lisäksi esto GADD45α siRNA inaktivoituu MKK4 /JNK toimintaa ja myös estetty TAp73 välittämää apoptoosin induktion sisplatiinia. Tutkimuksemme ovat osoittaneet, että TAp73 aktivoi JNK-apoptoottisen signalointireitin vastauksena sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Zhang P, Liu SS, Ngan HYS (2012) TAp73-välitteistä aktivointiin C-Jun N- terminaalisia Kinase Parantaa Cellular Kemosensitiivisyys sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 7 (8): e42985. doi: 10,1371 /journal.pone.0042985

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2012; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2012; Julkaistu: 10 elokuu 2012

Copyright: © Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli rahoittavat yhdessä Wong Check Hän hyväntekeväisyysyhdistykseksi ja tutkimusrahasto osastolta Naistensairaala, University of Hong Kong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

P73, uutta jäsentä kasvaimen p53 perhe, on samanlainen kuin p53 sekä rakenteellisesti että toiminnallisesti [1], [2]. P73-geeni koodaa yli 20 proteiini-isoformit johtuu käyttö eri promoottorien ja vaihtoehtoisesti transkription jälkeisen liittämiseen. Kopioinnin suhteen aktiivisia TAp73 isoformeja, jotka sisältävät täyden N-terminaalista transaktivaatiodomeenin, voi sitoutua spesifisesti p53 reagoiva elementit ja transaktivoi joitakin p53 kohdegeenien, ja myöhemmin aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, kun taas DNp73 isoformit, joissa typistetyn N-terminaalista transactivation domain, toimii hallitseva-negatiivinen estäjä sekä TAp73 ja p53 [1], [3], [4]. Mielenkiintoista on, TAp73 on myös välittäjänä solujen herkkyyttä kemoterapeuttisten aineiden ihmisen syöpäsoluja [1], [4] – [7]. Monet pro-apoptoottiset geenit, kuten PUMA, Bax ja NOXA, toimivat aktivaattoreina mitokondriaalisen apoptoottisen reitin, ja on p73 reagoiva elementtejä niiden promoottori ja voi olla jopa-säätelee p73 apoptoosin vastauksena kemoterapeuttisten. Lisäksi p73-välitteinen säätely ylöspäin kuoleman reseptori CD95, välittäjänä ulkoista apoptoottisen reitin, myötävaikuttaa myös p73-välitteisen apoptoosin syöpäsoluissa stressin ärsykkeille [8]. Silti, toisin kuin p53, molekyylimekanismeja syyllistämättä in p73-välitteisen solu- apoptoosin vielä ole ymmärretty. Ymmärtäminen tarkka taustalla molekyylitason mekanismit ovat hyödyllisiä kohdistaminen p73 niin hyvä ehdokas geenin syöpähoitoa.

JNK kuuluu superperheen mitogeeniaktivoidut proteiini (MAP) kinaasien. JNK proteiinikinaasien sisältävät JNK1, JNK2 ja JNK3. Jnk1 ja JNK2 ovat kaikkialle havaittavissa. JNK3 rajoittuu pääasiassa aivojen, sydämen ja kiveksissä [9]. JNK signalointireitin vastauksia erilaisiin stressin ärsykkeille kautta transduktion alkupään MAPKKK lukien MEKKs, ja sittemmin aktivointi JNK jonka fosforyloitiin Thr ja Tyr sivustoja JNK suoran ylävirran kinaasien MKK4 /MKK7. Aktivointi JNK fosforyloi ja aktivoi alavirran transkriptiotekijä c-Jun ja muut transkriptiotekijät [9], [10]. JNK-signalointireitin toimii keskeisenä positiivinen modulaattori solujen apoptoottisen vasteen korostaa ärsykkeille [9] – [11]. Lisäksi, JNK-signalointireitin vaikuttaa kriittisesti sisplatiini-riippuvaista apoptoosia syöpäsoluissa [12] – [15].

Tässä tutkimuksessa tavoitteena oli tutkia vaikutusta TAp73 (TAp73α) on soluvastetta sisplatiinin munasarjasyöpäsoluja ja taustalla molekyylitason mekanismeja. Olimme kiinnostuneita siitä TAp73 olisi mitään säätelevä rooli muissa apoptoottisia reittejä, kuten JNK signalointireitin, kun sisplatiinihoitoon.

Tulokset

TAp73α lisää solujen herkkyyttä sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja

roolin tutkimiseksi TAp73 munasarjan syöpäsolujen vasteena sisplatiinin, ihmisen sisplatiini-resistenttejä munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 (null-p53) ja OVCA433 (villityypin p53) transfektoitiin stabiilisti plasmidilla pEGFP -TAp73α (kuvio 1A). Vaikutus TAp73α solu- vaste sisplatiinia arvioitiin molemmat XTT solunelinkykyisyysmääritys ja klonogeeniset määritys. Kuten kuviossa 1B ja 1C, TAp73α huomattavasti solujen herkkyyttä sisplatiinin sekä null-p53 SKOV3 ja villityyppisen p53 OVCA433 soluja, verrattuna vektorin valvontaa. Tällainen vaikutus havaittiin sekä lyhyen aikavälin (XTT-määritys) ja pitkän aikavälin (by klonogeeniset määritys) luviljelymäärityksistä. Lisäksi solun indusoiman apoptoosin sisplatiinin myös kasvoi yli-ilmentyminen TAp73α, mistä on osoituksena TUNEL-määritys ja pilkotaan PARP ilmentymisen analyysi (kuvio 2A ja 2B). Nämä tulokset osoittivat, että TAp73 edistää solujen herkkyys sisplatiinin kautta induktion apoptoosin, ja tällainen TAp73 tehtävänä oli p53-riippumaton, koska vaikutukset olivat samanlaiset sekä villityypin p53 ja nolla-p53-soluja.

( A) GFP-TAp73α yli-ilmentävät stabiileja klooneja SKOV3 (C8, C24 ja C28) ja OVCA433 (C1, C7 ja C12) solut varmistettiin western blot -analyysillä. (B ja C) Molemmat XTT elinkyvyn ja klonogeenisten määritys osoitti merkittävästi vähentynyt soluproliferaation TAp73α-yli-ilmennetään soluissa SKOV3 ja OVCA433 verrattuna tyhjän vektorin kontrolleihin (V) vasteena sisplatiinin hoitoon. Solujen prosenttiosuus /pesäkkeiden elossa sisplatiinia suhteessa solua /pesäkkeitä lääkkeettömässä väliaine ohjaus mitattiin. Tiedot esitettiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (*: p 0,05; **: p 0,01).

(A) TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8, C24 ja C28 ja OVCA433 C1, C7 ja C12) ja tyhjän vektorin valvonta (V) SKOV3 ja OVCA433 käsiteltiin 4 ug /ml sisplatiinia 48 tunnin ajan. Apoptoottisia soluja arvioitiin TUNEL määrityksessä. Yli 500 solua laskettiin kullekin ryhmälle, esitetyt tulokset olivat suhteellisen apoptoottisten solujen solujen kokonaismäärästä ja vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin (**: p 0,01). (B) TAp73α-yli-ilmennetään soluissa ja tyhjän vektorin valvonta käsiteltiin eri annoksilla (ilmoitettu) sisplatiinia 24 h, ja lohkaisu PARP havaittiin Western blot -analyysillä.

TAp73α välittää aktivoinnin JNK: n signalointireitin

Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että JNK: n aktivaatiota vaikuttaa kriittisesti sisplatiinin indusoiman apoptoosin [12] – [15]. Meillä on siis oletettu, että TAp73α-välitteistä apoptoosia vasteena sisplatiinin saattaa toimia kautta JNK: n aktivaatiota signalointireitin. Vaikutus TAp73α on JNK: n aktivaatiota signaalit on ensiksi analysoitiin mittaamalla fosforylaation taso JNK (p-JNK) ja sen substraatti c-Jun (p-c-Jun) in TAp73α-yliekspressoitu soluja. Kuten kuviossa 3A on esitetty, sekä p-JNK ja p-c-Jun oli ilmeisesti koholla TAp73α-yli-ilmennetään soluissa, verrattuna kontrollisoluihin. Lisääntyminen p-JNK ja p-c-Jun lisättiin edelleen täydennetty näissä soluissa vasteena sisplatiinin, vain hieman enemmän p-JNK ja p-c-Jun havaittiin kontrollisoluihin. Aika ja annoksesta riippuvaa kokeet osoittivat, että sisplatiinin aiheuttama JNK aktivointi tapahtui niinkin aikaisin kuin 6 tuntia, ja jopa 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin 4 ug /ml sisplatiinia, ja tehokas sisplatiinin annostus JNK aktivointi oli niinkin alhainen kuten 2 ug /ml 12 h hoito TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8, OVCA433 C1, kuvio 3B). Lisäksi JNK: n aktivaatiota oli riippuvainen transaktivointikyky toimintaa TAp73α kuten p-JNK taso ei muuttunut soluissa stabiilisti yli-ilmentävät DNp73α (kuvio 3C ja 3D), joka on katkaistun isomuodon p73 ilman transaktivaation aktiivisuutta. Voit tarkistaa, onko vaikutus TAp73α yli-ilmentymisen edistämiseksi solujen herkkyys oli spesifinen sisplatiinin, myös suoritetaan samanlainen kokeiluja hoidossa Taxol, joka on myös ensilinjan syöpälääkettä käytetään munasarjasyövän hoitoon. Olemme havainneet, että taksoli ei voi aktivoida JNK-reitin TAp73 yli-ilmentyvät munasarjasyöpäsoluja, vaikka TAp73α voi parantaa solun herkkyyttä vastauksena Taxol (kuvio S1).

(A) lisäys p-JNK ja pc -Jun havaittiin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8, C24 ja C28 ja OVCA433 C1, C7 ja C12) ja edelleen parannettu upon sisplatiinihoitoon (4 ug /ml 24 h), verrattuna kontrolleihin (P: vanhempien solut ; V: tyhjä vektorisäätö). (B) TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) altistettiin 4 ug /ml sisplatiinia eri aikoja tai eri annoksille sisplatiinia 12 tuntia. P-JNK tason mitattiin western blot-analyysi. (C) DNp73α (GFP-DNp73α) oli yli-ilmentynyt SKOV3 (D2) ja OVCA433 (D18) soluja. (D) Ei JNK aktivointi havaittu DNp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 D2 ja OVCA433 D18).

esto JNK aktiivisuuden vaimentaa TAp73α välittämää apoptoosia vasteena sisplatiinin

lisäksi tutkia, TAp73α-välitteisen aktivaation JNK osaltaan apoptoosin vasteena sisplatiinin, joka on spesifinen estäjä JNK-kinaasiaktiivisuutta, SP600125, on käytetty. Käsittelyn jälkeen 20 uM SP600125 8 tuntia, p-JNK tasoa alennetaan enintään 60% on TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1, kuvio 4A). Lisäksi esto JNK aktivaation SP600125 vähentää merkittävästi solun indusoiman apoptoosin sisplatiinin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa, mistä on osoituksena TUNEL-määritys ja pilkotaan PARP ilmentymisen analyysi (kuvio 4B ja 4C).

(A) TAp73α- ilmentynyt solujen (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) käsiteltiin 20 uM SP600125 eri aikoja (ilmoitettu). Fosforylointireaktio tasot JNK ja c-Jun mitattiin. (B ja C) TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) ja tyhjän vektorin kontrolleihin (V) käsiteltiin 20 uM SP600125 tai DMSO: ta ja sitten sisplatiinin kanssa. Solu apoptoosin arvioitiin TUNEL määrityksellä (virhepalkkeja ilmoitettu keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta; *: p 0,05) ja pilkkominen PARP analyysi. Esto JNK heikennettyä TAp73α välittämää apoptoosia vasteena sisplatiinin. (D) TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) käsiteltiin JNK siRNA: ita (Si-JNK) tai sekoitettua kontrollipeptidiä siRNA (Control). Aktivointien JNK ja c-Jun olivat poissa päälle sisplatiinihoitoon, ja liittyy lyhensi apoptoosia (E ja F).

aktivointi JNK-reitin TAp73α sekaantuneet sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin oli osoittaa myös havainto, että hiljaisuus JNK1 ja -2 in TAp73α-yli-ilmennetään soluissa merkittävästi estänyt sisplatiinin indusoiman solukuoleman. Kuten kuviossa 4D, hoito siRNA: t vastaan ​​JNK1- -2 syöpäsoluissa (SKOV3 C8; OVCA433 C1) ilmeisesti alassäädetty JNK1 /2: n ilmentymisen verrattuna salattu siRNA valvontaa ja hoitoa myöhemmin tukahdutti fosforylaation tasoja JNK ja sen alustan c-kesäkuu Osoituksena TUNEL-määritys ja pilkotaan PARP ilmentymisen analyysi, sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8; OVCA433 C1) oli merkittävästi heikennetty JNK hiljentäminen käsittely (kuvio 4E ja 4F). Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että JNK: n aktivaatiota-reitin TAp73α osaltaan TAp73α-välitteistä apoptoosia in munasarjasyöpäsoluja vasteena sisplatiinin.

TAp73α-välitteinen säätely ylöspäin GADD45α vastaa JNK: n aktivaatiota signalointireitin

GADD45α on tunnistettu sitovan kumppanin ja aktivaattori JNK ylävirtaan kinaasin MEKK4 /MTK1, ja sen sitoutuminen MEKK4 /MTK1 voi aktivoida alavirtaan geenin MKK4 ja JNK [17], [18]. Toisaalta, GADD45α on hyvin määritelty tavoite geeni p73 [19], [20]. Niinpä hypoteesi, että GADD45α voi olla rooli aktivointi JNK-signalointireitin välittämän TAp73. Vaikutus TAp73 on GADD45α ilmentyminen arvioitiin aluksi. Kuten on esitetty kuviossa 5A ja 5B, ilmaus GADD45α oli säädelty sekä mRNA: ta ja proteiinia tasot TAp73α-yliekspressoitu soluja. Vastauksena sisplatiini, TAp73α-välitteinen säätely ylöspäin GADD45α proteiinin entisestään (kuvio 5B). Kuten GADD45α voi suoraan vuorovaikutuksessa MEKK4 /MTK1 aktivoimaan sen alustaan ​​MKK4 kinaasin [17], [18], me sitten mitataan fosforylaation taso MKK4 in TAp73α-yliekspressoitu soluissa. Kuten kuviossa 5B on esitetty, lisäys fosforyloidun MKK4 havaittiin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa, ja edelleen parantaa vasteena sisplatiinin hoitoon. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TAp73α välitteisen aktivaation JNK-signalointireitin mahdollisesti säätely ylöspäin sen kohdegeenin GADD45α ja myöhemmän aktivoinnin MKK4, ylävirran osan JNK-signalointireitin.

(A) lisäys GADD45α mRNA: n ekspression in TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8, C24 ja C28 ja OVCA433 C1, C7 ja C12). (B) lisäys GADD45α proteiinin ilmentymisen ja MKK4 fosforylaation tason TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8, C24 ja C28 ja OVCA433 C1, C7 ja C12). (C) GADD45α pudotettiin vuonna TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) mukaan siRNA (Si1-GADD45α ja Si2-GADD45α) hoitoon. Aktivointi MKK4, JNK ja c-Jun oli pienentynyt, vaikka alla sisplatiinihoitoon.

varmistamiseksi edelleen näitä havaintoja, pari siRNA: iden vastaan ​​GADD45α (Si1-GADD45α ja Si2-GADD45α) oli käytetään tilapäisesti pudotus GADD45α ilmaisua. Fosforylointireaktio tasot MKK4, JNK ja c-Jun vähennettiin siis heti alas-säätely GADD45α edes vastauksena sisplatiinihoitoon (kuvio 5C). Näin ollen, olemme vahvistaneet, että TAp73α-välitteinen säätely ylöspäin GADD45α oli vastuussa aktivoinnista JNK signalointireitin munasarjan syöpäsolujen.

GADD45α vastaa TAp73α-välitteistä apoptoosia

määrittämiseksi onko hiljaisuus GADD45α on vaikutusta sisplatiinin indusoiman apoptoosin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa, soluja käsiteltiin GADD45α siRNA: t ja apoptoosia mitattiin. Kuten kuviossa 6 on esitetty, sisplatiinin indusoiman apoptoosin dramaattisesti vähentynyt GADD45α-vaimennettu TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8; OVCA433 C1). Nämä havainnot ehdottivat, että TAp73α-välitteinen ylös-säätely GADD45α oli vastuussa aktivoinnista JNK-signalointireitin ja solujen apoptoosin munasarjasyöpäsoluja.

Solun apoptoosin vähentynyt TAp73α-yli-ilmennetään soluissa (SKOV3 C8 ja OVCA433 C1) vastauksena sisplatiinin jälkeen GADD45α siRNA hoidon. Solun apoptoosi mitattiin (A) TUNEL-määritys (virhepylväät osoittavat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta; *: p 0,05; **: p 0,01) ja (B) pilkkominen PARP määrityksessä.

keskustelu

tässä tutkimuksessa osoitimme, että ensimmäistä kertaa, tietojemme mukaan TAp73 osittain välittämää solujen apoptoosin vasteena sisplatiinin aktivoitumisen kautta JNK signalointireitin in munasarjasyöpäsoluja. Huomasimme, että vastauksena sisplatiinin, TAp73α aktivoitu JNK signalointireitin kautta säätely ylöspäin sen loppupäässä geenistä GADD45α, ja vastaus oli TAp73 riippuvia ja p53-riippumatonta.

Perustettu näyttö on osoittanut, että kopioinnin suhteen aktiivisia TAp73 parannettu solujen herkkyyttä kemoterapeuttisten huumeiden sisplatiinin ihmisen syöpäsoluissa [5] – [7], [21]. Lisäksi tuoreessa raportissa on osoittanut, että TAp73 ilmaisun munasarjasyöpiä oli paljon suurempi reagoiva syövissä verrattuna jumiutua syöpiin [22]. Tutkimuksemme vahvisti, että TAp73 teki parantavat solujen herkkyyttä sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja. Vaikka TAp73 on toiminnallisesti samanlainen kuin p53, p53: n ilmentyminen on osoitettu olevan tarpeen TAp73-välitteistä apoptoosia mukaisesti DNA-vaurioita stimulaatio [23]. Toisaalta, joissakin tutkimuksissa ehdotettu, että p73-välitteinen kemosensitiivisyys on riippumaton p53-ilmentymistä joissakin syöpäsoluissa [5], [24]. Meidän esillä olevassa tutkimuksessa, TAp73α-välitteistä apoptoosia havaittiin p53-null SKOV3- soluissa, mikä osoittaa, että TAp73-välitteistä apoptoosia oli p53-riippumaton, ainakin meidän solumallissa, korostaa entisestään itsenäinen rooli p73 keskuudessa perheen jäsenten DNA-vaurioita vaste.

JNK solukuolemareittiin toimii tärkeänä säätelijänä solujen apoptoosin vasteena erilaisiin stressin ärsykkeille ja itse on keskeinen rooli apoptoottisia reittejä, mukaan lukien ulkoisen (kuolemareseptorien) [11] ja luontainen (mitokondrion ) väyliä [11], [25]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sisplatiini-välitteisen JNK-signalointireitin syöpäsoluissa osaltaan kriittisesti sisplatiini-riippuvaista apoptoosia [12] – [15]. Up-regulation Fas L ilmaisun johtui aktivointi JNK ja sen alustan c-Jun oli keskeinen rooli sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja [15]. Tuloksemme osoittivat, että JNK ja sen alustan c-Jun aktivoitiin TAp73α yli-ilmentynyt solujen, ja lisättiin vielä vastauksena sisplatiinihoitoon. Vastustamisesta JNK aktivaation JNK estäjän tai JNK siRNA näissä soluissa kumottu TAp73α välittämän apoptoosin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että säätely ylöspäin JNK toiminta osaltaan TAp73-välitteisen apoptoosin induktio munasarjasyöpäsoluja vasteena sisplatiinin. Tämä oli ensimmäinen kerta osoittaa, että TAp73 toimi ylävirran aktivaattori JNK-reitin aktivoida JNK signaaleja aiheuttaa apoptoosin.

edelleen tutkia taustalla mekanismeja, joilla TAp73 sääteli JNK fosforylaation taso, P73 kohdegeenin GADD45α oli tietoinen. GADD45α on hyvin määritelty alavirtaan geenin TAp73 ja p53 [19], [20] ja se voidaan saada aikaan DNA: n vaurioita aineita, ja sillä on tärkeä rooli apoptoosin [26]. Mielenkiintoista on, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että JNK: n aktivaatiota apoptoottisen reitin mukaan GADD45α läheisesti osallisena GADD45α-välitteisen apoptoosin [27], [28]. GADD45α suoraan vuorovaikutuksessa MEKK4 /MTK1 aktivoida alustan MKK4 kinaasin, ja näin ollen säätää ylös JNK aktivointi, tapahtuma, joka on osallisena apoptoosin [17], [18]. Tutkimuksemme ovat osoittaneet, että ilmaukset sekä GADD45α ja aktiivinen MKK4 olivat säädellään ylöspäin TAp73α-yli-ilmennetään soluissa, ja tämä vaikutus oli vielä täydennettiin sisplatiinin jälkeen altistuksen. Toisaalta, kun GADD45α on vaiennettu, aktivointien MKK4, JNK ja c-Jun poistettiin, jopa hoitoon sisplatiini, ja TAp73α-välitteinen sisplatiinin indusoiman apoptoosin myös merkittävästi estetty. Nämä tulokset osoittivat, että TAp73 pystyi aktivoimaan JNK apoptoottisen reitin jopa säätelevä GADD45α ilmentymistä munasarjasyöpäsoluja vastauksena sisplatiinia.

Mielenkiintoista, edellinen raportti on ehdottanut välisen ylikuulumisen JNK-reitin ja p73, ja ehdotti, että JNK oli tärkeä säätelijä p73-välitteisen apoptoosin vasteena sisplatiinin [13]. He osoittivat, että p73 oli alustan JNK-kinaasin. JNK fosforyloitua P73 tietyissä auttaakseen parantaa p73 transkription aktiivisuutta ja p73-välitteisen apoptoosin syöpäsoluissa läsnäollessa sisplatiinia. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen TAp73 aktivoitua JNK-aktiivisuus munasarjan syöpäsolujen vasteena sisplatiinin. TAp73 toimi ylävirran aktivaattori JNK apoptoottisen reitin kautta säätely ylöspäin GADD45α, ja myöhemmin aktivoitumisen MKK4 (kuvio 7). Siten tuloksemme tarjosi uuden kulmassa rajat puhua välillä p73 ja JNK väylän apoptoosia vastausta.

DNA-vaurioita agentti, sisplatiini aiheuttaa TAp73 keskittymisen ja myöhemmin säätely ylöspäin sen proapoptoottisten kohdegeenien indusoimaan apoptoosin. Samalla up-regulation of TAp73 kohdegeenin, GADD45α aktivoi JNK apoptoottisen reitin kautta sen vuorovaikutus MEKK4 /MTK1 apoptoosin.

Yhdessä tuloksemme tukevat selvästi uuden polun TAp73-välitteisen solu- herkkyys sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja. Olemme osoittaneet, että TAp73α indusoi apoptoottisen vasteen kautta aktivointi GADD45α-MKK4-JNK solukuoleman kaskadin ja tarjotaan uutta skenaariota varten ylikuulumisen välillä p73 ja JNK apoptoottista reitin alla jännityksiä. Tämä TAp73 riippuvainen ja p53-riippumattoman soluvastetta olisi tärkeä rooli DNA-vaurioita vaste munasarjasyöpäsoluja, kuten p53: n funktiona oli puutteellinen useimmissa syöpäsoluissa. Parempi ymmärrys taustalla olevien mekanismien TAp73 välittämää apoptoottisen vasteen on arvokas kohdentamisessa p73 terapeuttiseksi kandidaattigeeni.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 (null p53) ja OVCA433 (villityyppinen p53) olivat lahja professori Tsao, Department of Anatomy, University of Hong Kong, jossa SKOV3 saatiin ATCC, Manassas, VA [29], ja OVCA433 perustettiin ja kuvattu aiemmin [30]. Ne pidettiin Minimum Essential Medium (MEM) (Invitrogen Corporation, Grand Island, YN), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen), ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

cis-Diamineplatinum (II) dikloridia (sisplatiini, CDDP) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), ja JNK-spesifisen inhibiittorin SP600215 (Calbiochem, San Diego, CA) liuotettiin milli- Q-vettä ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) (Sigma), vastaavasti, ja sen jälkeen säilytettiin -20 ° C: ssa. Nämä laimennettiin edelleen viljelyalustaan ​​ennen solujen käsittelyä. DMSO: ssa laimennettiin pelkästään väliainetta kontrollina.

Plasmidit, siRNA ja transfektio

pEGFP-TAp73α ja pEGFP-DNp73α plasmidit konstruoitiin PCR-monistamalla koko pitkä koodaava alue TAp73α ja DNp73α on cDNA munasarjasyöpä soluja. Ja PCR-tuotteet digestoitiin ja kloonattiin sitten kehyksessä osaksi pEGFP ekspressiovektoriin (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). Vakaan kloonit, pEGFP-TAp73α ja pEGFP-DNp73α transfektantit valittiin G418: aa (Invitrogen) ja 14 päivää, ja sitten yksittäistä pesäkettä poimittiin ja varmistettiin Western blot -analyysillä. SiRNA: t vastaan ​​JNK ja GADD45α ja sekoitettu siRNA (negatiivinen kontrolli) (Applied Biosystems Life Technologies, Foster City, CA) transfektoitiin soluihin 20 nM lopullinen pitoisuus. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) käytettiin transfektion mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

RT-PCR

Kokonais-RNA solujen uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen), ja cDNA syntetisoitiin High kapasiteetti RNA-to-cDNA Master Mix kit (Applied Biosystems). Spesifisten alukkeiden (GGAGGAAGTGCTCAGCAAAG ja TCCCGGCAAAAACA AATAAG) käytettiin monistamaan ihmisen GADD45α cDNA.

Western blot-analyysi

Solut kerättiin 0,05% trypsiini /EDTA: a (Invitrogen) ja proteiinit uutettiin käyttäen perinteisiä RIPA lyysipuskuria [16]. Vastaiset vasta-GFP, JNK ja GADD45α ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet MKK4, PARP ja c-Jun ja aktiivisten muotojen JNK, c-Jun (ser63) ja MKK4 saatiin Cell Signaling Technologies (Beverly, MA).

Solujen elinkelpoisuus analyysi

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin XTT (2,3-bis [2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli] -2H -tetrazolium-5-karboksanilidi sisäinen suola) kit II (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaiselle levylle ja sisplatiinia (4 ug /ml) seuraavana päivänä. Solujen elinkelpoisuus mitattiin yhden päivän kuluttua hoidon neljän peräkkäisen päivän ajan.

klonogeeninen määritys

pesäkkeitä muodostavien solujen kykyä mitattiin klonogeenisten määrityksessä. Solut maljattiin kolmena rinnakkaisena alustassa, joka sisälsi sisplatiinia (0,15 ug /ml) tai lääkeaineen-väliaineessa pitoisuutena 500 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle. 48 tunnin kuluttua inkubaation, kaikki nämä solujen annettiin kasvaa lääkeaineen-väliaineessa 10-12 päivä. Elossa pesäkkeet kiinnitettiin 75% etanolilla ja sitten värjättiin 1% Giemsa (Merck, Damstadt, Saksa). Pesäkkeitä, jotka sisälsivät yli 50 solua laskettiin.

apoptoosimäärityksessä

apoptoottisia soluja tutkittiin TUNEL määritys (In situ Cell Death Detection Kit, Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut siirrostettiin coverslip yksi päivä ennen 4 ug /ml sisplatiinia hoitoa 48 tuntia. Kiinnityksen jälkeen ja permeabilisation, solut värjättiin TUNEL reaktioseokseen, ja vastavärjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) (Sigma).

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. SPSS 16.0 ohjelmistot (SPSS) käytettiin analyysiin. Studentin t-testiä käytettiin arvioimaan ero ryhmien välillä. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

TAp73α parannettu solujen herkkyys Taxol kautta, mutta ei JNK-reitin. (A) XTT elinkelpoisuuden määrityksessä osoitti TAp73α-yli-ilmennetään soluissa SKOV3 ja OVCA433 olivat herkempiä Taxol hoitoon verrattuna tyhjän vektorin kontrolleihin (V). (B) jälkeen sisplatiinia tai paklitakselia hoitoa 24 tuntia, fosforylaatiota taso JNK ei korotettu SKOV3- ja OVCA433 soluja käsiteltiin Taxol, jopa TAp73α yli-ilmentyminen soluissa (C: kontrolli; D: sisplatiini: T50 ja T500: 50 ng /ml ja 500 ng /ml Taxol).

doi: 10,1371 /journal.pone.0042985.s001

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Prof. SW Tsao , Department of Anatomy, University of Hong Kong tarjoamiseksi munasarjasyövän solulinjoissa OVCA433 ja SKOV3.