Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eksosomit ovat pieniä solunulkoinen membraanivesikkeleihin of endosyyttisissä alkuperää vapauttaa paljon soluja, joita voitaisiin useimmissa kehon nesteistä. Päätoiminnot eksosomeiksi ovat matkapuhelinjärjestelmä ja solujen jätteiden puhdistamiseen. Tämä tutkimus suoritettiin määrittämään osallistumista eksosomeiksi säätelyssä herkkyyden keuhkosyövän A549 sisplatiiniin (DDP). Kun DDP lisättiin A549-soluja, eksosomeiksi eritys vahvistui. Lisäksi erittyvän eksosomeiksi muihin A549-solujen määrä nousi vastus näiden A549 solujen DDP. Altistettaessa A549 ja DDP ekspressiotasot useiden miRNA ja mRNA: t kuulemma liittyy DDP herkkyys merkittävästi muuttunut eksosomeiksi; nämä muutokset voivat välittää vastus A549 solujen DDP. Eksosomeiksi vapautuu A549-soluja aikana DDP määrä pieneni herkkyyttä muiden A549-solut ja DDP, joka voi välittää miRNA ja mRNA: iden vaihtoon eksosomeiksi kautta solu-solu-viestintä. Vaikka yksityiskohtainen resistenssimekanismi jää epäselväksi, uskoimme esto eksosomeiksi muodostumisen ja vapautumisen saattavat aiheuttaa uusi strategia keuhkosyövän hoitoon tulevaisuudessa.

Citation: Xiao X, Yu S, Li S, Wu J Ma R, Cao H, et al. (2014) Eksosomit: Laskua herkkyys keuhkosyöpään A549-solujen Cisplatin. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10,1371 /journal.pone.0089534

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 lokakuu 2013; Hyväksytty: 22 tammikuu 2014; Julkaistu: 21 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Xiao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81372396) ja kuusi Talent Peak of Human asioiden Hall Jiangsun maakunnassa (nro 40). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvän kuolleisuuden sana ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän caner (NSCLC) on yleisin keuhkosyövän. Potilaat, joilla on tällainen aggressiivinen kasvain on huono viiden vuoden eloonjäämisaste alle 20%, mikä on todennäköisesti syynä etäpesäkkeitä aikaan diagnoosin. Vaikka useat tavoite lääkkeet, kuten erlotinibi ja setuksimabi voisivat nostaa yleistä eloonjäämistä NSCLC potilaiden, platina-doublet kemoterapiaa edelleen tärkein hoito potilailla, joilla on pitkälle edennyt NSCLC.

Platinum (DDP) on DNA-vaurioittava aine, joka voisi tulla kasvainsolut ja aiheuttaa akvatoitumista ja hydrolyysin muodostaa reaktiivisia platinayhdisteistä [1]. Aquated DDP yleensä tunnistaa DNA: n ensisijainen kohde ja vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa, mikä johtaa muodostumista säikeiden- ja /tai juosteensisäiseen siltoja [2]. DNA-vaurioita vastaus (DDR) järjestelmän ja monipuolinen signalointireittien aktivoituvat [3], ja ekspressiotasot RNA: t voidaan vaikuttaa vastaavasti [4]. Monet potilaat näyttää joko synnynnäinen välinpitämättömästi lääkkeen tai DDP-välinpitämättömyys toistuvia sairauden jälkeen alkuvaiheessa hoidon. Useita mekanismeja osallistuvat herkkyyttä säätelyyn kasvainsolujen DDP; Näiden mekanismien kuuluvat kertymiseen solun ja ulosvirtaus DDP [5], DNA korjaus kyky, sietokyky korjaamatta DNA vaurioita [6], ja sääntelyä useiden geenien [7].

Eksosomit ovat pieniä solunulkoinen kalvovesikkeleiden, joka voisi erittää monia erilaisia ​​kasvainsoluja ja on useimmissa kehon nesteen [8], [9]. Riippumatta alkuperästä, eksosomeiksi on samanlainen proteiinin koostumuksia, jotka voidaan luokitella kolmeen pääryhmään: aito lautta proteiineja, solun tukirangan kuten proteiineja ja lämpösokkiproteiinit [10]. Sisäiset vesikkelit muodostuvat sisäänpäin heräämään solujen tunnetaan monivesikkelisten endosomeihin (MVE). Fuusio MVE solukalvon kanssa johtaa vapauttaa sisäisen rakkulat tunnetaan eksosomeiksi [11]. Eksosomit voisi matkustaa ympäröivien solujen tai kaukana kudoksiin näyttää toimintoja, kuten immuunijärjestelmän stimulaatio, immunosuppressiota [12], induktio leviämisen ja toleranssi [13] – [15], geneettisen materiaalin [10] ja jätehuolto [16]. Eksosomit sisältävät huomattavan määrän RNA ja voitaisiin siirtää yhdestä solusta toiseen [10], mikä osaltaan lisääntymistä ja etäpesäkkeiden ja syövän kehityksen [13], [14], [17], [18]. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan osallistuminen eksosomeiksi säätelyssä herkkyys keuhkosyöpään solujen DDP edelleen tuntematon.

Kun altistuu DDP, kasvainsolut yleensä sopeutumaan microenvironment ja sopeutua stimulaatiota. Koska eksosomeiksi raportoidaan osallistuvan solujen viestintä, me arveltu mahdollisesta osallisuudesta eksosomeiksi säätelyssä A549 soluvasteita DDP. Erityisesti, eksosomeiksi vapautuu A549-soluja aikana DDP altistus voi muuttaa herkkyys ympäröivän solujen DDP. Lisäksi, exosomal RNA: t voidaan siirtää yhdestä solusta toiseen [10]. Sinänsä meidän pitäisi että jotkut miRNA ja mRNA: t kuulemma liittyy DDP resistenssi voisi siirtyä yhdestä solusta toiseen sovellukseen eksosomeiksi. MiR-21, miR-98, miR-133b, miR-138, miR-181a ja miR-200C [19] – [24] kerrottiin liittyvän DDP herkkyys sääntelyä, kun taas ERCC1, BRCA1 ja RRM1 [25] – [27 ] liittyivät DDP vastarintaa. Testata hypoteeseja, nämä miRNA ja mRNA: t valittiin alustavasti tutkia niiden osallistumista prosessiin DDP vastarintaa.

Tulokset

karakterisointi Eksosomit Julkaisija A549 Cells

varmistetaan onnistunut eristäminen eksosomeiksi, kerätyt eksosomeiksi havaittiin TEM (transmissioelektronimikroskoopilla) ja analysoitiin Western blot (kuvio 1A). Mikrovesikkeliin klusterit näytteillä ympäri rakkulat mittaus 30-100 nm halkaisijaltaan (kuviot 1 B, 1 C). Kuvio 1D esittää ilmentymisen CD63, joka on tetraspanin perheenjäsen, joka paikantuu exosomal sisäinen rakkulat, dual bändi eksosomeiksi ja vaaleana bändi soluissa.

(A) eksosomi eristäminen menetelmää käytettiin tässä tutkimuksessa. (B, C) läpäisevällä elektronimikroskoopilla kuvan eksosomeiksi. Eksosomit ovat pieniä vesikkeleitä mittaamalla 30nm 100 nm halkaisijaltaan. (D) Western blot of CD63 ja β-aktiini in eksosomeiksi ja soluissa.

Cellular vaikutus A549-solujen Sisplatiini

annosvasteyhteys arviointi suoritettiin tässä tutkimuksessa. Keskittymä on 3 ug /ml DDP valittiin meidän protokollaa, koska tämä annos aiheutti kuoleman noin 50% A549-solut (kuviot 2A, 2B). Testaamiseksi vaikutuksen DDP vapauttamisesta eksosomeiksi, eksosomeiksi kvantitoitiin BCA; proteiini Standardikäyrä on esitetty kuviossa 2C. Kuten kuviossa 2D on esitetty, määrä eksosomeiksi vapauttaa jokaisen solun aikana DDP altistus oli korkeampi kuin tavanomaisissa olosuhteissa, mikä osoittaa merkittävää kasvua eksosomeiksi vapauttaa A549-solut altistettaessa DDP.

(A) annos-vaste-suhde elinkelpoisuutta A549-solut (%) ja pitoisuus sisplatiinin (1-10 ug /ml) 48 tuntia. (B) mikroskooppinen kuva A549 käsitelty 0 ja 3 ug /ml sisplatiinia. Kuvat saatiin suurennoksella 100 x. (C, D) määrä eksosomeiksi määritetään kautta BCA standardikäyrän ja parannettu eritys eksosomeiksi normalisoituna solujen määrä altistuksen jälkeen A549-solujen sisplatiinia. (E) Differential ekspressiotasot kuuden miRNA soluissa altistuksen jälkeen A549-solujen sisplatiinia. (F) Differential ekspressiotasot kahden miRNA in eksosomeiksi altistuksen jälkeen A549-solujen sisplatiinia. (G) Taita-ilmentymisen muutosten miR-21 ja miR-133b in eksosomeiksi ovat korkeammat kuin soluissa. Palkit osoittavat keskiarvoja ± SD kolme toistoa. * Osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolliryhmiin.

Voit selvittää eksosomeiksi voisi sukkulaliikenteestä, ilmaisuja kuudesta miRNA Tässä asiakirjassa esitetään havaittiin soluissa ja eksosomeiksi. Kaikki kuusi miRNA voitiin havaita soluissa, kun taas vain miR-21 ja 133b voitiin havaita eksosomeiksi (Ct-arvo on neljä muuta miRNA yli 40). Testata vaikutuksen DDP on ekspressiotasot miRNA soluissa ja eksosomeiksi ekspressiotasot näiden kuuden miRNA havaittiin soluissa ja eksosomeiksi altistettaessa A549-solut ja DDP. Kuten kuvioissa 2E ja 2F, ilmentymistasojen miR-21, miR-133b, miR-98, miR-181 lisääntynyt soluissa, kun taas ilmaisuja miR-21 ja 133b kasvoi eksosomeiksi. Fold-ilmentymisen muutosten miR-21 ja miR-133b in eksosomeiksi olivat myös korkeampia kuin soluissa (kuvio 2G).

Eksosomit Vähennä herkkyys A549-solujen DDP

Määritä eksosomeiksi oton A549-soluja, eksosomeiksi leimattiin DiD ja co-inkuboitiin A549-solut: ssa 3 h, jonka jälkeen fluoresenssimikroskopiaa suoritettiin. Kuten kuviossa 3B on esitetty, eksosomeiksi voi imeytyä ympäröivissä soluissa. Sen määrittämiseksi, ovatko eksosomeiksi voi vaikuttaa herkkyys A549 ja DDP, eksosomeiksi vapauttaa A549 normaaliolosuhteissa ja alle DDP kunnossa kerättiin ja lisättiin soluihin. Kuten kuvioissa 3A ja 3C, eksosomeiksi vapauttaa A549 soluja DDP altistus voi vähentää herkkyyttä muiden A549 solujen DDP, kun taas eksosomeiksi vapauttaa A549 normaalioloissa oli vähän vaikutusta herkkyyttä A549 solujen DDP. Koska eksosomeiksi vapauttaa A549 normaalioloissa ei vaikuttanut herkkyyttä ympäröivien solujen DDP, valitsimme tutkia toimintaa eksosomeiksi vapauttaa A549 soluja DDP altistuminen vain.

(A) esikäsittely A549-soluja jossa eksosomeiksi vapautuva sisplatiinia (3 ug /ml) altistuminen vähentää herkkyyttä solujen sisplatiinin noin 20% verrattuna ilman esikäsittelyä 48 tuntia. (B) otto eksosomeiksi (punainen) A549-solujen inkubaation jälkeen 3 h visualisoitiin mikroskopialla. Mitta-asteikko: 50 um. (C) mikroskooppinen kuva A549-solut viljellään neljä edellytystä [ohjaus, eksosomeiksi, DDP (3 ug /ml), eksosomeiksi + DDP] 48 tuntia. Kuvat saatiin suurennoksella 100 x. * (A) osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolliryhmiin.

Eksosomit Vaikuta ekspressiotasot Cellular miRNA ja mRNA: t

Voit testata mahdollista vaihtelussa ilmauksia miRNA ja mRNA: iden soluissa seurauksena eksosomeiksi vapauttaa A549-soluja aikana DDP altistuminen, ekspressiotasot näiden miRNA ja mRNA: t havaittiin sen jälkeen, kun solut altistettiin eksosomeiksi. Kuten kuviossa 4A on esitetty, ilmentymisen taso miR-21 kasvoivat ja ekspressiotasot miR-98, 133b, 138, 181a, ja 200c vähentynyt. Kuvio 4B esittää ekspression lisääntymisen tasot ERCC1, BRCA1, ja RRM1. Lisäksi, kuten on esitetty kuvioissa 4C ja 4D, kun A549-soluja käsiteltiin DDP, suhteellinen fold-muutoksia näiden miRNA ja mRNA: t soluista esikäsitelty eksosomeiksi vaihteli suhteellisen taitettavan havaitut muutokset soluissa viljelty normaaleissa olosuhteissa.

Expression tasoja (A) miRNA ja (B) mRNA: t normaaleissa olosuhteissa ja ilman eksosomi esikäsittelyä. Fold-ilmentymisen muutosten (C) miRNA ja (D) mRNA: t alle sisplatiinin kanssa ja ilman eksosomi esikäsittelyä. Palkit osoittavat keskiarvoja ± SD kolme toistoa. * Osoittaa p 0,05 verrattuna kontrolliryhmiin.

Keskustelu

parhaan tietomme, meidän tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa eksosomeiksi osallistumista säätelyssä herkkyys keuhkosyövän A549 solujen DDP. Huomasimme, että altistuminen A549 solujen DDP voi aiheuttaa solujen vapauttaa enemmän eksosomeiksi kuin normaalioloissa ja että vuorovaikutus näiden eksosomeiksi muiden A549-soluja voitaisiin lisätä vastustusta näiden A549 solujen DDP. Tutkimuksemme ensimmäinen osoittaa, että kun A549-soluja altistetaan DDP ekspressiotasot useiden miRNA ja mRNA: t kuulemma liittyy DDP herkkyys muutos huomattavasti eksosomeiksi ja että nämä muutokset todennäköisesti välittävät DDP vastus A549-solut.

Kun altistuvat DDP, syöpäsolut sopeutua ympäristön muutoksiin hengissä. DNA-vaurioita vastaus (DDR) järjestelmä ja monipuolinen signalointireitteihin indusoidaan sitten. Jotkut solut voivat korjata vahinkoja ja läpi solusyklin tarkastuspisteitä, kun taas muut solut eivät pysty korjaamaan vauriot ja näin tehdään solukuolema tai solun vanhenemista. Kuten kuviossa 2A on esitetty, noin puolet soluista kuoli altistettaessa A549-solut 3 ug /ml DDP, kun taas sisältö, ja solun prosesseja eloonjääneiden solujen muutettiin transkriptionaalisella tasolla. Kuten kuviossa 2E, ilmentymisen tasojen miR-21, miR-133b, miR-98 ja miR-181 havaittu tässä asiakirjassa vaihteli. RNA sisällön eksosomeiksi kuulemma eroavat RNA luovuttajan soluja [10], ja ero ilmaisuja exosomal miRNA riippuu sekä alkuperän solujen ja ympäristölle. Kuvio 2G osoittaa, että alle DDP hoitoa, ero ekspressiotasot miRNA sisään eksosomeiksi erosivat soluissa. Ja kuten on esitetty kuviossa 2E ja 2F, solu miRNA ilmaisuja olivat erilaiset exosomal miRNA ilmaisuja. Lisäksi ekspressiotasot miRNA vaihteli soluissa kasvatettu erilaisissa olosuhteissa, mikä osoittaa, että miRNA sisällön eksosomeiksi voidaan säädellä mukaan biologisesta tilasta solujen.

aikana DDP altistuksen eksosomeiksi vapauttaa jokaisen elossa solu lisätä ja jotkut DDP viedään näiden eksosomeiksi [16]. Exosomal miRNA sitten välittämä solu-to-solujen viestintää [10]. Kuva 3B, 4A ja 4B osoittavat, että eksosomeiksi kuljettavat viestejä voidaan imeytymiskertoimeksi ympäröimällä solut ja solun sisältö muutetaan vastaavasti. Nämä viestit voivat sisältää tietoja uhkaavan vaaran, ja sisältöä eksosomeiksi riippuu aina valittiin olosuhteet, joissa eksosomeiksi vapautetaan. Kun soluja käsiteltiin toisen vaiheen DDP, transkription tasot vaikuttaa. Kuten kuviossa 4C, ja 4D solut esikäsitellään eksosomeiksi osoitti hiukan valmisteluja toisen syklin DDP hoidon ja transkription tasoja indusoituu soluissa erosivat.

Kun altistuu DDP, A549-soluja stimuloitiin ja ilmentymistaso Mir-21 kasvoi. Koska ilmentymisen taso miR-21 eksosomeiksi lisääntyi huomattavasti ja eksosomeiksi voitaisiin imeytymiskertoimeksi mukaan ympäröiviin soluihin, me päätellä, että eksosomeiksi voisi välittää enemmän miR-21 muihin soluihin. Itse asiassa, kasvu ilmentymistason miR-21 muissa soluissa havaittiin, mikä viittaa siihen, että ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentyminen miR-21 [19] vähentää herkkyyttä keuhkosyövän solujen DDP. Kun altistuu DDP kerran, soluja sai toisen stimulaation ja vastasi vähemmän voimakkaasti. Ilmentymistasojen miR-21 kasvoi, mutta ei niin huomattavasti kuin ensimmäinen muutos. Ilmaisu taso miR-133b myös lisääntynyt jälkeen A549-soluja käsiteltiin DDP. Eksosomit välittävä miR-133b voidaan imeytymiskertoimeksi ympäröimällä solujen ja vaikuttaa transkription tasoa muihin soluihin. Mitä tulee runsas ulkoisen miR-133b voisi välittää soluihin, ilmaus miR-133b soluissa voidaan syöttää takaisin laskevan. Vaimentua ilmentyminen miR-133b [28] on osoitettu vähentävän herkkyyttä keuhkosyövän solujen DDP. Sen jälkeen toinen sykli DDP hoidon soluja huono ilmaus miR-133b vastasi ja ilmentymistason miR-133b ilmeisesti lisääntyi.

Monet tutkijat ovat esittäneet erilaisia ​​näkemyksiä toiminta eksosomeiksi vaikuttamassa soluvasteita stimulaatio, ja nämä toiminnot eksosomeiksi ovat aina riippuvaisia ​​tyypistä stimulaatiota. Maria Eldh et ai. väittää, että eksosomeiksi vaikuttaa siihen, vastaanottajan solujen ulkoisen jännityksen ärsyke välittämällä RNA: t yhdestä solusta toiseen [29]. Claire Corcoran et al. havaitsivat, että eksosomeiksi osittain edistävät solujen viestintä, johtaen välittämisessä dosetakselia vastustuskykyä akkuparit [15]. Tutkimuksemme osoittivat edelleen eksosomi osallistumista säätelyssä herkkyyttä A549-solujen DDP aikana DDP altistuksen ja että tämä vaikutus on todennäköisesti säätelee eksosomeiksi. Kuitenkin useat puutteet ja puutteita on tässä työssä, sekä yksityiskohtainen mekanismi DDP vastus lisätutkimusta meidän ensi tutkimuksessa.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että eksosomeiksi vapautuu A549-solut altistettiin DDP voisi kommunikoida muiden solujen kanssa ja vaikuttaa vastus näiden solujen DDP. Vaikka yksityiskohtainen mekanismi jää epäselväksi, uskomme, että esto eksosomi muodostumisen ja vapautumisen saattavat aiheuttaa uusia tulevaisuuden strategiaa Keuhkosyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Solut hyvin tunnettu ihmisen keuhkon adenokarsinoomassa A549 (Shanghai Cellular Research Institute, Kiina) pidettiin RPMI-1640-alustassa (Nanjing Kaiji Biology, Kiina), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (naudan sikiön seerumia, Hyclone Laboratories, USA ) 37 ° C: ssa ja alle 5% CO

2. Solut siirrostettiin 96-kuoppaiselle levylle solutiheyteen 6 x 10

3 solua /kuoppa, ja annos-vaste-arviointi DDP A549-soluihin suoritettiin käyttäen solu laskenta kit-8 (CCK-8; Dojindo , Kumamoto, Japani).

eristäminen ja karakterisointi Eksosomit Julkaisija A549 Cells

vaikutuksen vähentämiseksi eksosomeiksi vuonna FBS, FBS oli tyhjentynyt eksosomeiksi ultrasentrifugoimalla 200000 x g: llä 4 ° C 16 h (Beckman 70 Ti-roottori). Sen jälkeen kun solujen kiinnittyä yön yli, kasvualusta korvattiin RPMI-1640-väliaineessa ja 10% eksosomi-köyhdytettyä FBS: ää. 48 tunnin kuluttua elatusaine kerättiin kerätä eksosomeiksi. Eksosomeiksi eristäminen (kuvio 1A) suoritettiin käyttäen Beckman -ultrasentrifugissa (70 Ti roottori) ja ExoQuick-TC eksosomi saostusliuosta (System Biosciences, Mountain View, CA, USA).

Eksosomit liuotetaan 200 ui fosfaatittomia puskuroitua suolaliuosta (PBS) kvantitoitiin käyttämällä tehostettua BCA-proteiinin iinianalyysikitissä (Beyotime Biotechnology, Kiina). Morfologia ja hiukkaskoko eksosomeiksi liuotetaan PBS: ään oli tunnusomaista kautta transmissioelektronimikroskoopilla (TEM, JEM-2100, JEOL, Tokio, Japani). Solun kokonais ja exosomal proteiinit vastaavasti uutettiin soluista ja eksosomeiksi käyttäen SDS-liuotuspuskuria (250 nM Tris-HCI, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiinit (10 mg /ml), erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Vasta-aineita käytetään immunoblottauksella mukana CD63 (System Biosciences, Mountain View, CA, USA) ja β-aktiini (Sigma-Aldrich). Parannettua kemiluminesenssin liuosta (ECL kit, Pierce), proteiinijuovat havaittiin käyttäen Molecular Kuva ChemiDoc XRS + (Bio-Rad).

otto Eksosomit ja elinkykyyn analyysi

eksosomi Pelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml: ssa phosphatebuttered suolaliuosta (PBS), joka sisälsi 5 ug /ml DiD (Biotium, USA) 30 minuutin ajan. Uudelleen suspendoitu liuos sentrifugoitiin 200.000 x g 2 h, ja PBS-suspendoitiin pelletit lisättiin A549-soluihin. Fluoresenssikuvantamiseen myöhemmin suoritettiin konfokaalimikroskopiaa.

vaikutuksen arvioimiseksi eksosomeiksi herkkyyteen solujen DDP, 6 x 10

3 solua /kuoppa siirrostettiin 96-kuoppalevyn RPMI- 1640, joka sisälsi 10% eksosomi-köyhdytettyä FBS. 24 tunnin kuluttua, eksosomeiksi vapautuu A549-soluja normaaleissa ja DDP-käsitelty olosuhteissa lisättiin vastaavien solujen suhteessa 5: 1 (eksosomeiksi kerättiin 5 ml supernatanttia lisättiin soluihin viljeltiin 1 ml: ssa viljelyalustaa) ja 3 h. Sama tilavuus PBS: ää ilman eksosomeiksi lisättiin soluihin, joita käytetään kontrolliryhmään. Sytotoksisuuden määritykset, 3 ug /ml DDP pantiin kuoppiin 48 tuntia ja kaikista solujen elinkykyisyys arvioitiin käyttämällä solun laskenta kit-8 (CCK-8).

RNA: n eristäminen ja analyysi

Exosomal RNA: t eristettiin käyttämällä Mirvana microRNA eristyspakkausta (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ja eluoitiin 100 ui lämmitetty eluutioliuoksella mukaan valmistajan protokollaa. Cellular RNA: t saatiin käyttämällä Trizol® uuttamalla menetelmää (Invitrogen, Paisley, UK) ja eluoitiin 30 ul DDH

2O.

miRNA oli varsi-silmukka käänteiskopioitua (RT) kanssa miRNA käänteistranskriptiota kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RT-PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen TaqMan-miRNA määritystä (Applied Biosystems). Geeni-spesifinen koetin mix (miR-21, 000397; miR-98, 000577; miR-133b, 002247; miR-138, 002284; miR-181, 000480; miR-200c, 002300) käytettiin tässä tutkimuksessa. U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina TaqMan miRNA määrityksessä havaitsemaan ilmentymistason miRNA soluissa; synteettiset ei-ihmisen miRNA [

Caenorbabditis elegans

miR-39 miRNA (cel-miR-39); Takara Bio Inc., Tokio, Japani] oli terästetty vuonna normalisoida eksosomi tilavuus alkaessa RNA: n eristämistä.

Custom TaqMan Low Density RT-PCR array (Confinder Bio., Kiina) levitettiin havaitsemaan mRNA ilmaisun, ja GAPDH valittiin sisäisen valvonnan. Analyysi geenin ilmentyminen suoritettiin käyttäen ABI Prism 7900 Sequence D sisäisen tunnistusjärjestelmän ohjelmisto (Applied Biosystems).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testaukset, kun verrataan kahta ryhmää (PASW Statistics 18,0), ja p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.