Krooninen sairaus

tiivistelmä

laadukas NMR ratkaisu rakenne on esitetty proteiinin hMcl-1 (171-327), joka käsittää tähteet 171-327 ihmisen anti-apoptoottista proteiinia Mcl-1 (hMcl-1) . Koska tämä rakenne sisältää kolme Bcl-2 homologia (BH) sekvenssimotiiveja, jotka osallistuvat muodostaa sitoutumiskohdan estäjiä hMcl-1, sen katsotaan olevan ratkaiseva rakenne-pohjainen suunnittelu uusien syöpälääkkeiden estää Mcl1 liittyviä anti-apoptoottisen reitin. Vaikka koordinaatit NMR ratkaisun rakenne vastaavan konstruktin hiiren homologin (mMcl-1) on julkisesti saatavilla, myös rakenne on ensimmäinen atomiresoluutiolla rakenne raportoitu ”apo muodossa” ihmisen proteiinia. Vertailu kahden rakenteen paljastaa, että hMcl-1 (171-327) osoittaa jonkin verran laajempi ligandi /estäjä n sitovan uran sekä eri varauksen jakauma BH3: n sitovan uran. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että saatavuus ihmisen rakenne on äärimmäisen tärkeää tukea tulevaisuuden suunnittelun syöpälääkkeiden.

Citation: Liu G, Poppe L, Aoki K, Yamane H, Lewis J, Szyperski T (2014 ) Korkealaatuinen NMR rakenne Ihmisen anti-apoptoottinen proteiini Domain Mcl-1 (171-327) Cancer Drug Design. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10,1371 /journal.pone.0096521

Editor: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, Lontoo, Iso-Britannia

vastaanotettu: 17 joulukuu 2013; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2014; Julkaistu: 02 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, HY ja JL ovat työntekijöitä Amgen Inc. ja Amgen Inc. ollut merkitystä tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus oli rahoittamia Amgen Inc., mutta ei ole kilpailevia edun mukaista, että voivat painottaa tämän työn. Tämä kuuluminen ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

toimintahäiriö solun apoptoosin [1] on tärkeä tunnusmerkki syöpä. Apoptoosin säätelyyn riippuu perheen Bcl-2-proteiinien, jotka sisältävät yhden tai useamman Bcl-2-homologia (BH) sekvenssimotiiveja. Perustuen niiden toiminta ja samankaltaisuutta niiden BH jaksoryhmittymät nämä proteiinit voidaan jakaa kolmeen luokkaan [2], [3]: (i) multi-domain proapoptoottisten proteiineja, kuten Bax ja Bak, (ii) anti -apoptotic (eli pro-eloonjääminen) proteiinit, kuten Mcl-1, Bcl-1, Bcl-x

L, Bcl-w ja Bfl-1 /A1, jotka kaikki omaavat samanlaisen arkkitehtuurin Bax ja Bak, ja (iii) useita pro-apoptoottisia proteiineja, jotka käsittävät vain yhden BH3 sekvenssimotiivin, kuten Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, HRK, BMF, ja nbk /Bik ( ’BH3-only ”proteiinit). BH3: een, motiivi luokan (iii) proteiinien muodostaa amfipaattisen α-heliksin, joka on spesifisesti vuorovaikutuksessa hydrofobinen tasku on muodostettu sekä pro-apoptoottinen luokka (i), ja anti-apoptoottiset luokka (ii) proteiinien osallistuminen niiden BH-motiiveja [ ,,,0],2], [3]. Inhibition tuloksena proteiini-proteiini-kompleksin muodostumisen on lupaava strategia syövän hoitoon. Esimerkiksi pieni molekyyli Bcl-2-antagonisti ABT-737 [4] estää anti-apoptoottiset luokka (ii) proteiinien Bcl-x

L, Bcl-w ja Bcl-1, ja yhdisteen [5], joka voi olla suun kautta on tällä hetkellä kliinisissä kokeissa.

antiapoptoottista, pro-selviytyminen 350-tähteen proteiini Mcl-1 ( ’myeloidisolun leukemia-1’) [2] on ensisijaisesti ankkuroitu ulomman mitokondrion kalvon C-pään transmembraaninen domeeni ja sisältää kolme BH järjestyksessä verkkotunnuksia: BH3 (tähteet 209-223), BH1 (252-272) ja BH2 (tähteet 304-319) [2]. Mcl-1 estää kuoleman reseptori-indusoitua apoptoosia selektiivisesti sitoutumaan katkaistu Bid (tBid) [6], ja voidaan eristää endogeenisen Bak estää Bak-välitteistä solukuolemaa. Lisäksi Mcl-1 on vuorovaikutuksessa useiden BH3 vain proteiineja (Bim, Bid ja Puma, Noxa ja Bak). Siten Mcl-1 näyttelee varhainen rooli vastauksena signaaleja ohjata joko solujen eloonjäämistä tai solukuolemaan [2] ja sen on osoitettu olevan säädelty lukuisissa pahanlaatuisia kasvaimia. Lähestyy kumoamisesta Mcl-1: n anti-aptototic toiminto joko vähentämällä runsaasti tai inaktivoimalla sen toiminnallinen BH3 sitovan uran näytä lupaavilta syövän hoitoon [2], [4], [6], [7]. Tässä esittelemme laadukkaan NMR ratkaisu rakennetta polypeptidisegmentti 171-327 ihmisen Mcl-1 (hMcl-1), joka käsittää kolme BH kuviot katsotaan ratkaisevia rakenne perustuu lääkkeiden kehittämisen kannalta.

Tulokset ja keskustelu

laadukas NMR rakenne hMcl-1 (171-327) saatiin (taulukko 1) ja koordinaatit talletettiin ATE [8] (liittymistä koodi 2mhs). Rakenne käsittää seitsemän α-heliksiä α1-α7 (tähteet 173-191, 204-235, 240-253, 262-280, 284-301, 303-308 ja 311-319), joka on järjestetty muodostamaan ominaisuus ”Bcl-2 core ”rakenne [9] (kuvio 1). Heeliksien ovat paikallisesti ja globaalisti hyvin määritelty, kun taas C-pään (tähteet 320-327) ja silmukat yhdistävät vastaavasti helikseille α1 ja α2, helikseille α3 ja α4 sekä helikseille α4 ja α5 ovat joustavasti huonokuntoinen. Keskeinen Helix α4 ympäröi kuuden muun helices, jossa α1, α2, α3 ja α5 pakattu noin puolella ja α6 ja α7 pakattu vastaan ​​N-päästään. Helices α2, α3, α4 ja α7 osallistua muodostettaessa BH3 sitovan uran. Sähköstaattinen proteiinin pinnalla potentiaali on positiivinen molemmissa päissä BH3: n sitovan uran (koska läsnä Arg 233, Lys 234, Arg 248 ja Arg 263) ja negatiivisen sivussa heliksin α3 puolella (johtuen Asp 256) (kuvio 2). Tämä osoittaa, että varauksen jakautuminen BH3 sitovaan uurteeseen hMcl-1 (171-327) eroaa selvästi muista anti-apoptoottiset proteiinit [10].

(A) Selkäranka 20 Cyana konformeerit, jotka edustavat liuos rakenne hMcl-1 (171-327) sen jälkeen, kun päällekkäisyys selkäranka N, C

α ja C-atomia, että α-heliksejä minimaalinen rmsd. Kolme BH jaksoryhmittymät ovat värillisiä vihreänä (BH3), punainen (BH1) ja sinisen (BH2), tässä järjestyksessä. (B) Ribbon piirros alimman energian conformer of hMcl-1 (171-327). α-heliksejä α1-α7 leimataan ja erivärinen, ja N- ja C-päät on merkitty ”

N ’

” ja ”

C’

”. Luvut on luotu käyttäen ohjelmien MOLMOL [36] ja PYMOL [37].

(A) Ihmisen hMcl-1 (171-327), että suunta on esitetty kuviossa 1 (vasemmalla) ja kiertämisen jälkeen 180 ° pystyakselin (oikealla). Pinta värit (sininen positiivisesti varautunut, punainen negatiivisesti varautuneiden) osoitti sähköstaattinen potentiaali lasketaan PYMOL [37] ja sen oletusarvo tyhjiö sähköstatiikan protokollaa. (B) Sama kuin (A), mutta hiiren mMcl-1 (152-308).

myös meidän hMcl-1 (171-327) rakenne, kaksikymmentä atomiresoluutiolla sisältäviä rakenteita eri Mcl-1 konstrukteja hetkellä talletettu ATE. Sen lisäksi, että kaksi ”apo” proteiinit hMcl-1 (171-327) ja hiiren mMcl-1 (152-308) [10] [ATE liittymisen koodi 1wsx, 89% sekvenssi-identtisyys ihmisen proteiinin], rakenteita yhdeksäntoista proteiini-ligandi-kompleksit saostettiin (taulukko 2) [9], [11] – [18]. On selvää, että suuri määrä käytettävissä rakenteiden heijastaa jäljellä kiinnostusta Mcl-1 tavoitteeksi varten uusien syöpälääkkeiden. Superpositio α-helices paljastaa, odotetusti, lähellä rakenteellinen samankaltaisuus kaikille Mcl-1-proteiinien rakenteita (kuva 3): root mean square poikkeama (rmsd) arvot vaihtelevat 1,05-1,54 Å suhteessa hMcl1-1 (171-327 ) (taulukko 2). Kuitenkin verrattaessa kahta apo-proteiinin rakenteiden hMcl-1 (171-327) ja mMcl-1 (152-308) kanssa monimutkaisia ​​rakenteita osoittaa, että sitova tasku on levennetty, kun kompleksin muodostumista (taulukko 2): etäisyydet C

α-atomeihin tähteiden His 224 kierteessä α2 (His 205 mMcl-1) ja His 252 (His 233 mMcl-1): n C-päähän kierteen α3 ovat vastaavasti -16 Å ja ~ 14 Å in hMcl-1 (171-327) ja mMcl-1 (152-308), ja ~18-21 Å komplekseja.

(A) Rakenteet hMcl-1 (171-327) (vihreä) ja mMcl-1 (152-308) (syaani, ATE liittyminen koodi 1wsx) jälkeen päällekkäisyys selkäranka N, C

α ja C atomien α-helices minimaalinen rmsd. (B) Ribbon piirustus (zoomata (A)), jotka osoittavat erilaisia ​​sitovia uran leveyden ihmisen (vihreä) ja hiiren (syaani) proteiinia. Väliset etäisyydet Ca-atomeihin tähteiden His 224 kierteessä α2 (His 205 mMcl-1) ja His 252 (His 233 mMcl-1): n C-päähän kierteen α3 korostetaan: -16 Å in hMcl- 1 (171-327) ja -14 Å mMcl-1 (152-308) (C) päällekkäin asetettuna, kuten (A) hMcl-1 (171-327) (vihreä) ja mMcl-1 (152-308) (syaani , 1wsx), ja kuuden valitun Mcl-1 monimutkaisia ​​rakenteita (katso myös taulukko 2): ihmisen Mcl-1 kompleksoitu Bim BH3 (magenta, 2nla); kimeerisiä rotta-ihmisen rMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleksoitu hiiren mNoxaB BH3 (keltainen, 2rod); Hiiren mMcl-1 (152-308) kompleksoitu hiiren NoxaA BH3 (vaaleanpunainen, 2roc); Hiiren mMcl-1 (152-308) kompleksoitu hiiren Puma BH3 (harmaa, 2jm6); Hiiren mMcl-1 (152-308) kompleksoitu hiiren NoxaB BH3 (violetti, 2rod); kimeerisiä rotta-ihmisen mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleksoitu ihmisen Bim BH3 (oranssi, 2nl9); kimeerisiä rotta-ihmisen mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleksoitu ihmisen Bim BH3 (L62A, F68A) (vaaleanvihreä, 3d7v) kantavassa lukuja valmisteltiin ohjelmien MOLMOL [36] ja PYMOL [37].

se, että ihmisen apo-proteiinin osoittaa jonkin verran leveämpi n sitovan uran kuin hiiren homologi (taulukko 2) voi olla, ainakin osittain, katsoa johtuvan sivuketju Leu 246 ihmisen proteiinia, joka ei ole haudattu niin syvään kuin vastaava Phe sivuketjun hiiren proteiinia. Lisäksi, kun verrataan ihmisen ja hiiren proteiinin, eroja on havaittu, että maksu jakaumat on BH3-sitovaan uurteeseen (kuvio 2): ihmisen proteiini on negatiivisesti varautunut puolella heliksin α3, kun vastaava pinta hiiren proteiinille on positiivisesti varautuneita. Tämä ero johtuu Ser 255 vastaa Lys 236 hiiren proteiinia. Huomattavan, hMcl-1 (171-327) on rakenteellisesti samanlainen kuin hMcl1 (171-327) -hBim BH3 kompleksi (kuvio 3) kuin apo mMcl-1 (152-308) (taulukko 2).

yhdessä rakenteellisia vertailut osoittavat, että siitä huolimatta, että 89% sekvenssi-identiteetti ihmisen ja hiiren välillä proteiinia, saatavuus ihmisen hMcl-1 (171-327) rakenne voidaan odottaa olevan erittäin tärkeää tukea tulevaa suunnittelua syöpälääkkeet.

Materiaalit ja menetelmät

NMR Näytteiden esikäsittely

Alustavat tutkimukset osoittivat, että hMcl-1 (171-327) (UniProtKB /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) ei ole stabiili liuoksessa. Kuitenkin mutantti Cys 286 → Ser on stabiili useita viikkoja pitoisuuksina ~0.7 mM, ja molemmat villityypin ja mutantti sitoa Bim-BH3 peptidi samalla affiniteetilla (K

d ~ 60 pM) Biacore määrityksessä . Näin ollen meidän ratkaistu NMR rakenne hMcl-1 (171-327) Cys 286 → Ser kutsutaan hMcl-1 (171-327) tässä julkaisussa.

hMcl-1 (171-327) oli kloonattu, ilmaisi, uudelleenlaskostettu ja puhdistetaan seuraava standardiprotokollat ​​tuottaa tasaisesti

13C,

15N-leimatun proteiinin näytteen [19]. Lyhyesti, geeni kloonattiin pET21d (Novagen) johdannainen, jolloin saatiin plasmidi pSR482-21.1. Saatu rakenne sisältää seitsemän nonnative tähteen C-terminaalisen pään (LHHHHHH) proteiinin puhdistamisen helpottamiseksi.

Escherichia coli

BL21 (DE3) pMGK soluja, kodonin parannettu kanta, transformoitiin pMcl1-21.1, ja viljeltiin MJ9 minimaalialustalla [20], joka sisälsi (

15NH

4)

2SO

4 ja

U

–

13C-glukoosia ainoana typen ja hiilen lähteitä. Double-pestyt inkluusiokappaleet sisältävät hMcl-1 (171-327) liuotettiin 8 M puskuroidussa guanidiinihydrokloridi (VWR), joka sisälsi 5 mM DTT: tä, laimennettiin hitaasti yhdeksään tilavuuteen 20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5 M urea, 10% glyserolia, pH 7,4, ja laskostaa uudelleen 72 tunnin ajan 4 ° C: ssa. hMcl-1 (171-327) puhdistettiin käyttäen Talon affiniteetti hartsia (Clontech) laitettiin HiTrap SP High Performance -pylvääseen (GE Healthcare). Lopullinen saanto puhdistettua

U

–

13C,

15N-proteiinia ( 98% homogeeninen SDS-PAGE; 20,3 kDa MALDI-TOF-massaspektrometrialla) oli -25 mg /l. Lisäksi

U

–

15N ja 5% biosynteettisesti suunnattu fractionally

13C-merkittyä näytteen [21] kertyi stereo-erityisiä luovutus iso- metyyliryhmiä. NMR näytteet valmistettiin 0,7 mM proteiinipitoisuus. Isotrooppinen yleinen rotaatio korrelaatio aika ~ 10 ns oli päätellä

15N spinrelaksaatioaikoja osoittaa, että hMcl-1 (171-327) on monomeerinen liuoksessa.

NMR-spektroskopia

NMR spektrit rekisteröitiin 25 ° C: ssa. Viisi G-matriisi Fourier-muunnoksen (GFT) NMR-kokeet [22], [23] ja samanaikainen 3D

15N /

13C

alifaattisia /

13C

aromaattinen-ratkaistu NOESY [24] , [25] spektri (sekoitusaika 60 ms, mittausaika: 48 tuntia) hankittiin Varian INOVA 750 MHz spektrometri varustettu tavallista anturia. 2D vakio-aika [

13C,

1 H] -HSQC spektri (18 tuntia) kirjattiin 5% biosynteettisesti suunnattu fractionally

13C-merkittyä näytettä Varian INOVA 600 MHz spektrometri varustettu kryogeenisen koetin kuten on kuvattu [21], [26]. Spectra käsiteltiin ja analysoitiin käyttämällä ohjelmia NMRPipe [27] ja XEASY [28].

Sequence erityisiä selkäranka (H

N, H

α, N, C

α) ja H

β /C

β resonanssitulokset saatiin käyttämällä (4,3) D HNNC

αβC

α (63 tuntia) /(4,3) DC

αβC

α (CO) NHN (62 tuntia), ja (4,3) DH

αβC

αβ (CO) NHN (69 tuntia) [23] sekä ohjelman AUTOASSIGN [29]. Lisää reuna-sivuketju kemialliset siirtymät määrättiin alifaattisilla (4,3) D HCCH (87 tuntia) [23] ja 3D

15N /

13C

alifaattisia /

13C

aromaattisia ratkaistu [

1H,

1 H] -NOESY [24], [25]. Kaiken toimeksiantoja saatiin 96% selkäranka ja

1 H

β /

13C

β resonanssia ja 93% sivuketjun resonanssia, jotka ovat siirrettävissä kanssa NMR-kokeet edellä luetellut (poislukien N-terminaalista NH

3

+, Pro

15N,

13C ’edellisen prolyyliryhmien, Lys NH

3

+, Arg NH

2, OH, sivuketjun

13C ’ja aromaattinen

13C

γ). Lisäksi 100% /100% Val ja Leu isopropyyli ryhmiä ei-degeneroitunut protonin kemialliset siirtymät olivat stereo-erikseen osoitettu (taulukko 1). Kemialliset siirtymät talletettiin BioMagResBank [30] (liittymistä koodi 19654).

1 H-

1 H ylä- päässä raja rajoituksia rakenne laskelmat saatiin NOESY (taulukko 1). Lisäksi selkäranka diedrikulma rajoitteet olivat peräisin kemialliset siirtymät käyttäen ohjelmaa TALOS [31] jäämien sijaitsee hyvin määritellyn toissijainen rakenne elementtejä (taulukko 1). Ohjelmat Cyana [32], [33] ja AUTOSTRUCTURE [34] käytettiin rinnakkain antaa pitkän kantaman NOE [24]. Lopullinen rakenne laskelmat tehtiin käyttäen Cyana seurasi nimenomaisen vesihauteessa hienostuneisuus käyttäen ohjelmaa CNS [35].

Kiitokset

Kiitämme tohtori Janet Cheetham arvokkaasta ehdotus harkita C286S mutantti of hMcl-1 (171-327), NMR-rakenne määrittämiseen.