Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) on ehdotettu olevan tärkeä rooli säädellä kasvainten etenemisen ja invaasio. Ilmaisulla Mir-339-5p peräsuolen syövän ja sen vaikutuksia ei tunneta. Täällä me raportoimme että miR-339-5p on tuumorisuppressorina säätelemällä ilmentymistä PRL-1. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että vaimentua miR-339-5p tasojen peräsuolen syövän kudoksissa ja erittäin invasiivisia CRC solulinjoissa. Lisäksi parantaa ilmentymistä miR-339-5p esti CRC solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasiota in vitro ja esti tuumorin kasvua in vivo. Sitten seulotaan ja tunnistaneet uuden miR-339-5p tavoite, fosfataasit regeneroimaan maksa-1 1 (PRL-1), ja se vahvistettiin edelleen lusiferaasianalyysissä. Yliekspressio miR-339-5p myös vähentää ilmentymistä PRL-1-mRNA: n ja proteiinin. Alennettu PRL-1-ekspressio liittyy alhainen ilmentyminen fosforyloitua-solunulkoisen signaalin regulatedkinase1 /2 (p-ERK1 /2). Käänteisesti vähentäminen miR-339-5p estäjät stimuloiduissa soluissa nämä fenotyypit. Lopuksi todettakoon, että tulokset osoittavat, että miR-339-5p toimii tuumorisuppressorina ja on tärkeä rooli kasvun estämisessä ja etäpesäkkeiden CRC solujen kohdistamalla PRL-1 ja säätelemällä p-ERK1 /2 .Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-339- 5p voi olla käyttökelpoinen uutena potentiaalinen terapeuttinen kohde CRC.

Citation: Zhou C, Liu G, Wang L, Lu Y, Yuan L, Zheng L, et al. (2013) MiR-339-5p Säätelee Growth, Colony muodostaminen ja metastaasin peräsuolen syövän solut by Targeting PRL-1. PLoS ONE 8 (5): e63142. doi: 10,1371 /journal.pone.0063142

Editor: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2012 Hyväksytty: 29 maaliskuu 2013; Julkaistu: toukokuu 16, 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukevat National Natural Science Foundation of China (nro 30871156, nro 81272758), Science and Technology Project Guangdong (2009B030803041), ja Natural Science Foundation of Guangdong (nro 8151051501000057). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä authers ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä karsinoomien kaikkialla maailmassa. Joka vuosi yli 1 miljoonaa ihmistä kehittää peräsuolen syövän ja taudin aiheuttamaan kuolleisuuteen on lähes 33% kehittyneissä maissa [1]. Useiden vuosikymmenten ajan syvyys syövän etenemisen ja muuttoliike on tunnustettu merkittävä ennustettaessa CRC potilailla [2]. Eteneminen tämän taudin läpi monia vuosikymmeniä ja edellyttää monivaiheista geneettisiä tapahtumia [3]. Molekyylimekanismeja taustalla prosessi voi vieläkään dokumentoida [4]. Kun kehittyneiden genomista tekniikkaa, äskettäin löydetty luokan ei-koodaavan pieni RNA, kutsutaan miRNA, ovat herättäneet valtavaa kiinnostusta paksusuolen syövän tutkimukseen [5].

MikroRNA (miRNA) ovat 20-22 nukleotidin lyhyitä yksijuosteisia ei-koodaavaa RNA: t, jotka säätelevät eri solun prosesseja transkription jälkeisellä tasolla [6]. MiRNA on vaikutusta kriittisiin geeni valvontaan solujen kehitystä, erilaistumista, lisääntymistä, apoptoosin ja aineenvaihdunta [7] – [9]. Nopeasti kehittyvien todisteet ovat osoittaneet mahdollisia rooleja miRNA synnyssä ja etenemisessä syövän [10]. Differential ilmentyminen miRNA välillä kasvainkudoksen ja normaalin kudoksen eri syöpätyypeissä on ehdottanut miRNA voi toimia onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [11] – [12]. Esimerkiksi ensimmäinen syöpään liittyvien kohdegeeni miR-21 edistää solujen muuttoliikettä ja invaasiota kohdistamalla PTEN ihmisen hepatosellulaarinen syöpä ja TPM1 rintasyövässä [13], [14]. Toisaalta, menetys miR-143 havaitaan virtsarakon syövän, kun taas tehostettu ilmentyminen miR-143 aiheuttama kasvun hidastuminen virtsarakon syövän soluihin downregulation Erk5 ilmentymisen translaation tasolla [15]. Viime aikoina on kehittyneiden miRNA sarja analyysi geeniekspression (Mirage), kriittinen miRNA ilmaisu maisema peräsuolen syöpä on hyvin dokumentoitu [16]. Yliekspressoitu miRNA kuten miR-20, miR-21, miR-17-5p, miR-181 b ja miR-200c on liitetty paksusuolen adenoomien ja karsinoomien [17], [18]. Alhaisempi miRNA lukien miR-34a, miR-126, miR-143, miR-145, ja miR-133b on myös vahvistettu kolorektaalisyövissä [19] – [22]. Äskettäin microRNA taulukot verrata microRNA profiileja CRC kudosnäytteistä varhaisten ja ei-varhainen uusiutuminen potilaista ilmoitti, että alas-säätely miR-339-5p ilmentyminen liittyi huonoon ennusteeseen kliinisen potilaiden paksusuolen syövän vaihe II [23]. Kuitenkin vasta nyt, toiminnallinen näyttöä miR-339-5p paksusuolen syöpä ei ole hyvin dokumentoitu ja niiden roolit ja peräsuolen syövän etenemisessä on edelleen epäselvä.

Tässä tutkimuksessa, arvioimme rooli miR-339 -5p ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja. Olemme tutkineet ekspressiotaso miR-339-5p ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa ja terveisiin kudoksiin, ja testattiin sen vaikutukset solujen kasvuun, solusyklin jakautuminen, ja pesäkkeiden muodostuminen ja invaasio kapasiteetin in vitro. Me annettiin miR-339-5p esiaste hiiren paksusuolen syövän ksenograftimallissa ja edelleen osoittanut, että se voisi tukahduttaa paksusuolen kasvaimen kasvua in vivo. Lisäksi tarjoamme oleva mekanismi, joka miR-339-5p voi estää ihmisen CRC lisääntymistä ja invasiivisuuden kohdistamalla PRL-1 onkogeeni. PRL-1 tunnistettiin perheenjäsen koostuu kolmesta läheisesti liittyvien molekyylien (PRL-1, PRL-2, ja PRL-3), jotka muodostavat uuden luokan proteiinia tyro-sini fosfataasi (PTP). PRL: t ovat pienin PTP, joilla molekyyli- massat 20-22 kDa ja joka koostuu pääasiassa katalyyttisen domeenin. Merkittäviä todisteita solulinjasta ja hiiren tutkimukset viittaavat siihen, että nämä geenit edistävät kasvainten muodostumista, invaasio, ja etäpesäkkeiden [24], [25]. Nämä tulokset osoittavat, että miR-339-5p voi toimia tuumorisuppressori, säätelemällä ylläpito ja etenemisen syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Näytteet peräsuolen syöpäkudoksessa ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen limakalvon 30 potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syövän kerättiin tuoreesta kirurgisista näytteistä, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa lisäanalyyseihin saakka. Kaikki kudokset oli histologisesti vahvistettu olevan adenokarsinooma. Patologinen todentaminen ja luokittelu tehtiin perustuu järjestelmään International Union syöpää vastaan. Tutkimus protokolla hyväksyttiin eettisen komitean Nanfang Hospital ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta käyttöön kudoksiin.

Soluviljely

Ihmisen alkion munuaisen 293FT soluja ja kuusi ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 ja LOVO kanssa eri metastaattinen kyvyt hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco-BRL, Invitrogen, Paisley, UK). Solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO 2.

rakentaminen pre-miR-339 yli-ilmentävät konstruktit ja vakaiden kloonin

pLVTHM vektoriin, joka sisältää destabilized vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) variantti (pidetty meidän lab) käytettiin miR-339-5p over-ilmaisun järjestelmä. DNA, joka koodaa pre-miR-339 PCR-monistettiin ihmisen genomisesta DNA: sta käyttämällä eteenpäin-alukkeita (5 ’CGACGCGTCGCGCCATTGCCACGGCACCAT) ja reverse-alukkeita (5’ CCATCGATGGGGCAGAAGACCCACGCATACGAGT), pilkottiin

Mlul

ja

Clal

ja ligatoitiin pLVTHM. Konstruktit varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla. Lentivirus muodostettiin co transfektoimalla edellä konstruktin pakkaamisen

plasmidit psPAX

2 ja pMD2.G käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) osaksi HEK293FT soluihin. 48 tunnin kuluttua viljelyn supernatantti kerättiin ja pakastettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. SW620-soluja transdusoitiin vektori supernatantti ja myöhemmin FACS-lajiteltu vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP). Vahvistus vakaa plasmidien transfektoimiseksi saatiin käyttäen microRNA qRT-PCR-määritystä.

MicroRNA jäljittelee, siRNA lyhytaikaista transfektiota

MicroRNA jäljittelevät, miR-339-5p estäjän ja negatiivisen kontrollin hankittiin alkaen GenePharma (Shanghai, Kiina). Solut maljattiin 50% konfluenssiin ja transfektoitiin 200 nM microRNA jäljittelevät tai miR-339-5p estäjä (5’CGUGAGCUCCUGGAGGACAGGGA-3 ’) tai inhibiittori-negatiivinen kontrolli (5’CAGUACUUUGUGUAGUACAA-3′ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaisesti valmistajan protokollan. 24 tai 48 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin lisäkokeita varten. MicroRNA matkivat oli HSA-miR-339-5p jäljittelee, sense-5’-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG- 3 ’ja anti-sense 5’UGAGCUCCUGGAGGACAGGGAUU-3’ ja negatiivinen kontrolli, sense 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’ja anti-sense 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’.

RNA ja SYBR green kvantitatiivinen PCR analyysi

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol-reagenssia (Takara, Dalian, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. havaitsemiseksi miR-339-5p ilmaisu, varsi-silmukka käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT -PCR) suoritettiin käyttäen All-in-OneTM miRNA kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) Detection Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 mg kokonais-RNA, joka sisältää pieniä RNA uutettiin kudosnäytteistä ensimmäisen polyadenyloituina poly (A)-polymeraasilla ja sitten käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen seosta, jossa oligo-dT-adapteria pakkauksessa. Kypsät miR-339-5p ilmentymistä soluissa ja kudoksissa havaittiin käyttäen Hiuspinni-se TM miRNA qPCR kit (GeneCopoeia, Rockville, MD). Expression of U6 käytettiin endogeenista ohjaus. PCR-reaktio monistamiseen miR-339-5p suoritettiin 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 20 sekuntia, 60 ° C: ssa 20 sekuntia ja 72 ° C 10 sek. PRL-1 mRNA tunnistus, käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen käänteistranskriptaasia System (Takara, Dalian, Kiina). PRL-1 ilmentyminen mitattiin SYBR green qPCR määritystä (Takara, Dalian, Kiina). Aluke PRL-1-sekvenssit olivat: (eteenpäin) 5’GACCTGGATGGGGTAAACCT3 ”ja (reverse) 5 ’TGTGACTTCCACAGGAGCTG3”, pohjamaalin GAPDH sekvenssit olivat: (eteenpäin) 5’ACCCACTCCTCCACCTTTG3 ”ja (reverse) 5’ CACCACCCTGTTGCTGTAG3 ’. SYBR PCR suoritettiin ABI PRISM 7500 Fast Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Tiedot käsiteltiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmällä.

CCK-8 soluproleferaatiomäärityksessä

Solulisääntyminen mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japani). Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun on transfektoitu miR-339-5p estäjän tai sen ohjaus miRNA, HCT116-solut ympättiin 1 x 10

3 per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle. Solulisäkasvumääritykselle suoritettiin päivinä 1, 2, 3 ja 4. 10 ui CCK-8-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan sitten levyä inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Ennen päätepisteen inkuboinnin, absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen Vmax mikrolevyspektrofotometrillä (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Vaikka SW620 ympättiin 96-kuoppalevyille 3 x 10

3cells kuoppaa kohti, ja sama koe suoritettiin päivinä 1, 2, 3, 4, 5, 6 ja 7. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin 3 kertaa itsenäisesti. Tiedot esitettiin graafisesti keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta.

Cell-syklin analyysi

1 x 10

6-solut kerättiin ja kiinnitettiin yön yli 4 ° C: ssa 70% etanolia. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä, DNA värjättiin Cell Cycle Detection Kit (KeyGen, Nanjin, Kiina). Näytteet kvantitoitiin virtaussytometrillä (Becton Dickinson, NJ, USA) ja tulokset analysoitiin Modfit LT-ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME, USA) valmistajan ohjeiden ..

Plate klooni muodostumisen määritys

kukin kuoppa 6-kuoppaiselle viljelylevylle ympättiin 2 x 10

2-solujen ja kukin ryhmä sisälsi kolme kuoppiin. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 14 päivää, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin Giemsa-liuoksella. Pesäkkeiden lukumäärä sisältävien ≥50 solut laskettiin mikroskoopilla kaavalla: levy klooni muodostuminen hyötysuhde = (pesäkkeiden lukumäärä /määrä kennoja ympätty) x 100%.

Solun invaasio ja migraatiokokeessa

soluinvaasiota ja muuttoliike kykyä arvioitiin käyttämällä siirtokuoppaan inserttejä 8 um huokosia (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Sillä invaasiomääritys, 2 x 10

5 solut seerumivapaassa väliaineessa lisättiin kuhunkin ylempään osastoon kammion esipäällystetty matrigeelin matriisi (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). 600 ui 10% FBS: ia lisättiin Hyväksytty alempaan kammioon. Soluryhmäkohtaisesti maljattiin 3 rinnakkaiskoekuopissa. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, invasiivinen solut poistettiin ylemmältä pinnalta transwell kalvon vanupuikolla, ja soluja, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi ja kiinni alemman kalvon pinnan kiinnitettiin metanolilla, värjättiin Giemsa ja valokuvattiin alle mikroskooppi. Sillä migraatiokokeessa, menettelyt olivat samanlaisia, paitsi että 2 x 10

5 solua laitettiin alkuun kammioon ilman matrigeeliä matriisi esipäällystää. Lopuksi solut alemman osaston kammion jotka olivat tunkeutuneet sen pohjapinta membraanin laskettiin valomikroskoopilla 5 random visuaalinen kentät (x 200).

Protein eristäminen ja western blotting

proteiinin ilmentymisen analyysit, vakio western blottings tehtiin. Viljellyt tai transfektoidut solut pestiin kahdesti kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja hajotettiin jäällä RIPA-puskurissa 1% PMSF (KeyGen, Nanjin, Kiina). Proteiini lysaatit erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin PVDF-kalvoille ja blokattiin 0,1% Tween 20 ja 5% rasvatonta maitoa proteiinia Tris Buffer Saline. Proteiinit koetettiin kanin anti-PRL-1 monoklonaalinen vasta-aine (1:800, Proteintech Corporation, USA) ja kanin anti-ERK1 /2, Phospho-Erk1 /2 (p-ERK1 /2) monoklonaalinen vasta-aine (1:1000, Bioworld Corporation, USA), kanin anti-β-tubuliinia-vasta-ainetta (1:2000, Epitomics Corporation, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Membraani pestiin ja visualisoitiin piparjuuren peroksidaasiin (HRP) – konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti. Signaalit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (KeyGen, Nanjin, Kiina).

lusiferaasireporttiterilla määritys

ennustaminen miR-339-5p sitoutumiskohdat suoritettiin käyttäen TargetScan ohjelmisto (http: //www. targetscan.org). Fragmentti 3’UTR PRL-1 sisältävä otaksuttu miR-339-5p sitoutumiskohdan monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: wt-PRL-1 (forward) 5′-CCGGCTCGAGATCTCCCACATTCATACC 3 ’, paino–PRL-1 (taaksepäin) 5 ’TAAGCGGCCGCTTCATTAGCAGAAACCC 3’ ja lisätään

Xol I

ja

Notl

restriktiokohdat, heti alavirtaan lusiferaasin geenin psiCHECK ™ -2-vektoriin (Promega, Madison, WI) psiCHECK -2 konstruktio, joka sisältää 3’UTR PRL-1, jossa on mutantti siemen jono miR-339-5p myös tuotettu käyttäen alukkeita: mut-PRL-1 (forward) 5 ’GTCAAAGGGGCCTGAGAAAAGAATG 3’, mut-PRL-1 (reverse ) 5 ’TAAGTTGCACCTCAGAGTGCAAACA 3’. Kaikki konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla. HEK-293FT solut ja HCT116-solut ympättiin 48-kuoppaisille levyille (2 x 10

3 elinkykyistä solua per kuoppa). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut transfektoitiin psiCHECK ™ -2-PRL-1 3’UTR ja psiCHECK ™ -2-mut-PRL-1 3’UTR yhdessä oligonukleotidista (lopullinen pitoisuus 80 nM) tai matkivat (80 nM) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasivaikutusta kullekin transfektoitujen hyvin. Kaikki transfektion kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin 3 kertaa itsenäisesti.

In vivo kasvaimen kasvun määrityksessä

4-6 viikkoa vanhoja kateenkorvattomia nude-hiiriä (Southern Medical Experimental Animal Center, kohden) käytettiin kasvaimen istutuksen. Kaikki eläinkokeet tiukasti kiinni asetuksissa varten hallinnon asioiden osalta Experimental Animals, Kiinan kansallinen ohjenuorana eläinkoetta, myönnetty vuonna 1988. Kaikki toimenpiteet, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoito Tässä tutkimuksessa hyväksyttiin ja suoritettiin Southern Medical University Institutional animal Care ja Käytä komitea (Luvan numero: SCXK GUANGDONG 2011-0015). Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kaksi kertaa kylmällä seerumittomalla alustalla ja suspendoitiin uudelleen 200 ul: lla seerumia. Arvioida syövän kasvua in vivo, 2 x 10

6 SW620 /pLVTHM-pre-miR339 ja SW620 /pLVTHM-NC solut itsenäisesti ihonalaisesti selkään 2 nude-hiirissä. Sen jälkeen kasvaimia havaittiin, hiiren painoa ja kasvaimen koko mitattiin 5 päivän välein. Kasvaimen koko mitattiin paksuus kuin pituus x leveys

2 x 1/2. Kasvaimen keskimääräinen tilavuus ± SD jokaisen ryhmän laskettiin. Kaikki hiiret tapettiin 20 päivän kuluttua implantaatiosta. Hakkuut kasvaimia oli kuvattu välittömästi eläinten lopettamisen jälkeen. Sitten nämä muodostettu tuumorit poistettiin, ja kasvaimen kudokset analysoitiin H 0,05 (

*).

Tulokset

MiR-339-5p on vaimentua ihmisen paksusuolen syövän kudosten ja solujen linjat

tutkia ekspressiokuviota miR-339-5p, tutkimme miR-339-5p mRNA: n ekspression 20 paksusuolensyöpä kudokset ja niiden parin yhteensopivat vierekkäisten normaalin paksusuolen kudoksiin käyttämällä reaaliaikaisia ​​kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) . Kuten esitetään (kuvio 1A), miR-339-5p usein vaimentua ainakin kaksinkertaiseksi CRC kudoksissa (80%) verrattuna, että pariksi viereisen ei-syöpäkudoksissa. Lisäksi olemme havainneet ilmaus miR-339-5p kuudessa ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja (eli HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 ja LOVO) reaaliaikaisella kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) ja löytyi että on olemassa eroja tasojen miR-339-5p mRNA myös olemassa oleviin kuudesta ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Tärkeää on, miR-339-5p säädeltiin vähentävästi syöpäsolulinjoissa SW620 ja LOVO, joilla on korkeampi metastaattinen abilitity verrattuna HCT116, HT29, LS174T, SW480 alempi solulinja (kuvio 1 B).

(A) Expression tasot miR-339-5p tutkittiin qRT-PCR 30 paksusuolensyöpä kudokset ja niiden parin yhteensopivat vierekkäisten normaalin paksusuolen kudoksiin. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ja normalisoitu U6 (* P 0,05). T: tuumorikudoksia; N: vieressä normaaleissa kudoksissa. (B) Expression tasot kypsän miR-339-5p havaittiin qRT-PCR kuudessa ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja. Suhteellinen ilmentyminen miR-339-5p normalisoitiin endogeeninen kontrolli U6. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Suhteellinen miR-339-5p ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjoissa oli paljon pienempi kuin kolme ei-syöpä paksusuolen kudoksiin (N1, N2 ja N3). (* P 0,05).

vaikutus miR-339-5p paksusuolen syövän solun kasvu, muuttoliike ja invaasiota in vitro

vaikutuksen arvioimiseksi miR-339-5p solun kasvuun, olemme perustaneet SW620 vakaa klooni palauttaa ilmentymisen ennalta miR-339 SW620 syöpäsoluissa, joissa oli alhainen endogeeninen miR-339-5p ilmentymistä (kuvio S1). Ja testasimme soluproliferaatiota korko, solusyklin jakelun ja pesäkkeiden muodostumista. Käyttämällä qRT-PCR: ää, olemme havainneet, että ekspressiotasot miR-339-5p oli kasvanut noin 30 taittuu SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 verrattuna SW620 /pLVTHM-NC-solut (kuvio 2A). Kuten on esitetty kuviossa. 2B, tulokset CCK8 määrityksen näytetään, että yli-ilmentyminen miR-339-5p esti solujen proliferaatiota SW620 paksusuolen syöpäsolu. Lisäksi pesäkemuodostusta arvioimiseksi suoritettiin pitkän aikavälin vaikutuksia miR-339-5p solun kasvuun. Kuten kuviossa 2C on esitetty, SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 solut muodostivat paljon vähemmän pesäkkeitä kuin SW620 /pLVTHM-NC-soluja. Tilastollinen analyysi osoitti, että lisäys miR-339-5p tukahdutti pesäkkeiden muodostumista SW620-solujen 34,5% (kuvio 2C). Olemme ehdottaneet, että alennettu proliferaatiota miR-339-5p yliekspressoivassa paksusuolen syöpäsoluissa voi liittyä muuttuneisiin solusyklin etenemisen. Analyysi solusyklin jakelu osoitti, että miR-339-5p yliekspressoivia SW620-soluja arreted G1 vaiheessa, mikä vastaavasti vähentää prosenttiosuuden S vaiheiden (kuvio 2D). Tutkia, miR-339-5p säätelee CRC solumigraatioon ja invaasiota, teimme siirtokuoppaan määritys onko miR-339-5p oli mukana liikkumista koolonkarsinooman syöpäsoluja. Kuten kuviossa 2E, SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 solut osoittivat heikentynyt muuttavien ja invasiivisen kyvyn (vähennetty 49,6% ja 36,5%, vastaavasti, P 0,05). Kääntäen, kun transfektoitu miR-339-5p estäjä, miR-339-5p ekspressiotasot mitattiin HCT 116-soluissa (kuvio 3A). Lisääntynyt leviämisen ominaisuuksia HCT116 transfektoitu miR-339-5p estäjän havaittiin myös CCK-8 määrityksessä. Ja näiden transfektoitujen solujen esitetty lisääntynyt proliferatiivinen ominaisuuksia verrattuna negatiiviseen kontrolliin (kuvio 3B). Lisäksi solusyklin analyysit ovat osoittaneet väheneminen soluja G1 vaiheessa ja vastaava kasvu solujen määrä S ja G2-vaiheissa (kuvio 3C). Vastaavasti määrä vaeltavia ja invasiivisen HCT116-solut transfektoitu miR-339-5p estäjän oli enemmän kuin ohjaus- estäjä, joka osoittaa edistänyt muuttoliike ja invaasion HCT116-solujen 72% ja 55% (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittivat, että miR-339-5p voi ohjata koolonkarsinoomasoluissa lisääntymistä ja paksusuolen syöpä solujen liikkuvuutta.

(A) ilmentyminen miR-339-5p oli analyysi SW620-soluissa tartunnan PLVTHM-NC tai pLVTHM -LIITTYMISTÄ miR-339 by qRT-PCR (* P 0,05). (B) elinvoimaisuus infektoitujen solujen PLVTHM-NC tai pLVTHM-pre-miR-339 havaittiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. Arvoihin ilmoitettuina ajankohtina toimitettiin kuin absorbanssien keskiarvo SD viisi kaivoja (* P 0,05). (C) vaikutus miR-339-5p solusyklin of SW620-solujen. Solujen prosenttiosuus G1, S ja G2 vaiheet näkyy vasemmassa paneelissa. Ja tilastollinen analyysi näkyy myös oikeassa paneelissa. (D) Pesäkkeet muodostuvat PLVTHM-NC tai pLVTHM-pre-miR-339 tartunnan SW620-soluja esitetään 2 viikon kuluttua pinnoitus. Oikea paneeli osoitti määrällisesti suhteellisen pesäkkeenmuodostusta PLVTHM-NC versus pLVTHM-pre-miR-339-infektoiduissa soluissa. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolminkertaisista kokeista (* P 0,05). (E) TranswellTM määrityksessä käytettiin arvioimaan maahanmuuttoa ja invaasion SW620-solujen tartunnan PLVTHM-NC tai pLVTHM-pre-miR-339. Edustavia siirtolaisuutta (ylhäällä) tai invasiivisia (alhaalla) solujen kalvo (vasemmalla) (Alkuperäinen suurennus: × 200). Keskimäärin invasiivisia tai muuttoliikkeen solujen määrä per kenttä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± standardi (* P 0,05).

(EN) expresson Mir-339-5p oli analyysi HCT116 transfektoiduissa soluissa miR-339-5p estäjän tai negatiivinen valvonta qRT-PCR. (* P 0,05). (B) elinvoimaisuus transfektoitujen solujen miR-339-5p inhibiittori tai negatiivinen kontrolli havaittiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. Arvoihin ilmoitettuina ajankohtina toimitettiin kuin absorbanssien keskiarvo SD viisi kaivoja (* P 0,05). (C) vaikutus miR-339-5p solusyklin of HCT116-solujen. Solujen prosenttiosuus G1, S ja G2 vaiheet näkyy vasemmassa paneelissa. Ja tilastollinen analyysi näkyy myös oikeassa paneelissa. (D) TranswellTM määrityksessä käytettiin arvioimaan maahanmuuttoa ja invaasion HCT116 transfektoitujen solujen miR-339-5p estäjän tai negatiivinen kontrolli. Edustavia siirtolaisuutta (ylhäällä) tai invasiivisia (alhaalla) solujen kalvo (Alkuperäinen suurennus: × 200). Keskimäärin invasiivisia tai muuttoliikkeen solujen määrä per kenttä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± standardi (* P 0,05).

PRL-1 on toiminnallinen kohde miR-339-5p CRC soluissa

miRNA tavoitteet ennustettu saatiin miRBase Targets, TargetScan Release 5.0 ja PicTar, risteyksessä kolme paikkaa suositteli, että PRL-1 oli alavirtaan kohteena miR-339-5p. Varmistamiseksi edelleen mahdollisia suhdetta miR-339-5p ja alavirran geenin PRL-1, me edelleen havainneet PRL-1 ekspressiotaso ensisijainen CRC tuumorikudoksissa samalla näytteiden edellisessä kokeilun qRT-PCR (Kuva S2). Tuloksemme osoittivat, että supistuu hieman PRL-1 ilmentymisen kudoksissa näytteissä nontumorous paksusuolen. Ekspressio PRL-1 määritettiin edelleen koolonin syöpäsolulinjoissa HCT116, HT29, LS174T, SW480, SW620 ja LOVO (kuvio 1 B). Mielenkiintoista, löysimme vastapäätä korrelaatiota miR-339-5p ja PRL-1 (mRNA tasoilla) paksusuolen syöpä soluja. Jotta kengät eivät vahvista potentiaali tukahduttava vaikutus miR-339-5p on PRL-1 ilmentymisen, transfektoimme valmiiksi miR-339 SW620 soluihin. Tulos osoitti, että miR-339-5p tukahdutetaan PRL-1-mRNA ja proteiini ilmaisun SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 soluja verrattuna SW620 /pLVTHM-NC-solujen (P 0,05) (kuvio 4B, Fig. 4C). Joka koostuu tulokseen, sekä mRNA: n ja proteiinin tasot PRL-1 oli säädelty havaittiin HCT116-soluissa, jotka on transfektoitu miR-339-5p estäjä kontrolliin verrattuna inhibiittorin (P 0,05) (kuvio 4B, kuviossa 4C). Selventää, miR-339-5p suoraan vuorovaikutuksessa 3′-UTR alue kohdegeenien (PRL-1) suoritimme lusiferaasireportterilla määrityksiä. Olemme havainneet, että miR-339-5p tavoitteena sekvenssi nt739-745 PRL-1 3′-UTR. Reportteri plasmidi ohjaa SV promoottori, mukaan lukien 519 nt-villityypin-3′-UTR PRL-1 kloonattiin. Sitten kloonattu toiseen reportterikonstruktio jossa konservoituneet kohdistaminen alueen miR-339-5p sisällä nt739-745 nimenomaisesti mutatoitunut. Me cotransfect miR-339-5p matkii ja lusiferaasireportterista, jotka sisälsivät villityypin (kuvio 4D) tai mutantti (kuvio 4D) PRL-1 3′-UTR. Lusiferaasiaktiivisuudeksi dramaattisesti pieneni noin 50%, kun läsnä on miR-339-5p verrattuna sen negatiivisen miRNA ohjaus (kuvio 4E). Sen sijaan, miR-339-5p ei muuttanut aktiivisuutta mutantti PRL-1 lusiferaasireportteri (kuvio 4E), joka osoittaa miR-339-5p erityisesti toimia villityypin PRL-1 3′-UTR. Olemme myös havainneet, että esto miR-339-5p voimistunut PRL-1 ilmentymisen ja paransi p-Erk1 /2 tasoa. Kun taas palauttaminen ilmentymisen miR-339-5p voi estää ilmentymisen PRL-1 ja p-Erk1 /2 (kuvio 5).

(A) Expression tasot PRL-1 havaittiin qRT-PCR: llä kuudessa ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja. Suhteellinen ekspressio PRL-1 normalisoitiin endogeeninen kontrolli GAPDH. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena (* P 0,05). (B): n ekspressio PRL-1 oli analyysin SW620-soluissa tartunnan PLVTHM-NC tai pLVTHM-pre-miR-339 by qRT-PCR: llä (* P 0,05) (vasemmalla). Ekspressio PRL-1 oli analyysin HCT116-soluissa, jotka on transfektoitu miR-339-5p estäjän tai negatiivinen kontrolli, jonka qRT-PCR: llä (* P 0,05) (oikealla). (C) ilmentyminen tasot PRL-1 havaittiin käyttäen Western blot. (D) kaaviokuva emäksen kuoret välillä miR-339-5p ja 3’UTR PRL-1. Korvaaminen seitsemän peräkkäistä emästä (GTCAAAG on ACAGGGA) on 3’UTR PRL-1 mutantti reportteri-konstrukti on myös esitetty. (E) analyysi lusiferaasiaktiivisuus. 293-solut ja HCT116-solut kotransfektoitiin psiCHECK ™ -2 lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää joko villityypin tai mutantti-PRL-1 3′-UTR (merkitty WT tai MUT X-akseli), ja joko miR-339-5p jäljittelee tai NC matkii. Lusiferaasin aktiivisuus määritettiin 48 h transfektion jälkeen. Renilla lusiferaasi kunkin näytteen aktiivisuus normalisoitiin Firefly lusiferaasiaktiivisuus. Y-akseli edustaa suhteellista lusiferaasiaktiivisuus. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* P 0,05).

(A) proteiini tasot Erk1 /2 ja fosfori-Erk1 /2 havaittiin Western Blot transfektion jälkeen 48 h. β-tublin käytettiin lastaus ohjaus.

MiR-339-5p inhiboi kasvaimen kasvua in vivo

edelleen tutkia roolia miR-339-5p kasvaimen kasvua vivo, SW620 /pLVTHM-pre-miR-339-soluja tai SW620-/pLVTHM solua injektoitiin ihonalaisesti tyhjä nude-hiirten, vastaavasti, nude-hiiriin. Kasvaimen kasvu SW620 /pLVTHM-pre-miR-339-solut oli hitaampaa kuin SW620 /pLVTHM soluja (kuva 6A). 3 viikkoa injektion jälkeen. SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 solut muodostivat pienempiä kasvaimia kuin SW620 /pLVTHM-NC-solujen in vivo ja niiden keskimääräinen tilavuus oli ~36.9% kontrolliryhmän päivänä 20 (P 0,05) (kuvio 6B, kuvio 6C). Edustaja valokuvia H 0,05). (B) Koko kehon ulkoinen kuvia SW620 /pLVTHM -NC ja SW620 /pLVTHM-pre-miR-339-solut hiirten ja syöpiä saatiin 20 päivän kuluttua injektion. (C) ihonalainen kasvain regenerointi alkaen SW620 /pLVTHM-NC ja SW620 /pLVTHM-pre-miR-339 soluja. (D) edustaja valokuvat H & E-värjäys ensisijainen syövän kudosten näkyvät (suurennos, × 200).

Keskustelu

Kertyvät tutkimukset ovat paljastaneet MikroRNA voisi vaikuttaa kasvaimen kasvua, invaasio , angiogeneesi ja metastaasi hematologisissa malignances ja kiinteiden kasvainten kuten peräsuolen syöpä. Tuoreessa tutkimuksessa on raportoitu, että miR-339-5p voi olla poikkeuksellisen alassäädetty paksusuolen syövän kudosta käyttämällä uusia microRNA seulonta työkaluja.