Krooninen sairaus

tiivistelmä

Akt /proteiinikinaasi B on keskeinen komponentti alavirtaan fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) reitin, joiden toiminta säätelee tasapaino solun selviytymisen ja apoptoosin. Fosforylaatiota Akt tapahtuu kaksi keskeistä sivustoja joko Thr308 sivuston aktivointi silmukka tai Ser473 sivuston hydrofobisessa motiivi. Fosforyloitu muoto Akt (Pakt) aktivoidaan edistämään solujen selviytymistä. Mekanismit Pakt defosforylaatiosta ja miten signaalin transduktion Akt-reitin lopetetaan ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet uuden proteiinifosfataasi CSTP1 (täydellinen s transaktivoituun proteiini 1), joka on vuorovaikutuksessa ja defosforyloi Akt nimenomaan Ser473 sivustolla

in vivo

ja

in vitro

, estää solusyklin etenemistä ja edistää solujen apoptoosin. Vaikutukset CSTP1 solun eloonjäämiseen ja solusyklin kumottiin ehtyminen fosfataasin domeenin CSTP1 tai ekspressiota konstitutiivisesti aktiivisen muodon Akt (S473D), mikä viittaa siihen, Ser473 päällä Akt ensisijaisena solun kohde CSTP1. Expression profile analyysi osoitti, että CSTP1 ilmentyminen on selektiivisesti säädellä vähentävästi ei-invasiivinen virtsarakkosyövän kudosten ja yli-ilmentyminen CSTP1 tukahdutti kasvaimien koko nude-hiirissä. Kaplan-Meier käyrät paljasti, että vähentynyt ilmentyminen CSTP1 sekaantuneet vähensi merkitsevästi uusiutumista elinaika potilailla kärsi ei-invasiivisia virtsarakon syöpiä.

Citation: Zhuo DX, Zhang XW, Jin B, Zhang Z, Xie BS, Wu CL, et ai. (2013) CSTP1, uuden proteiinin fosfataasi, Blocks Cell Cycle, Edistää solukuoleman, ja esti syövän kasvu Virtsarakon syövän suoraan defosforyloimaan Akt at Ser473 Site. PLoS ONE 8 (6): e65679. doi: 10,1371 /journal.pone.0065679

Editor: Ferenc Gallyas, University of Pecs Medical School, Unkari

vastaanotettu 11 joulukuuta 2012 mennessä; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2013; Julkaistu: 17 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhuo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science Foundation of China myöntää 81272827 ja 30971627. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on toiseksi yleisin pahanlaatuinen kasvain urogenitaaliseen, jossa 350000 äskettäin diagnosoitu tapauksissa ja yli 145000 kuolemantapausta vuosittain maailmanlaajuisesti [1]. Koska pitkäaikainen Surveillances potilaista on tarpeen, yhdessä mahdollisen kasvaimen uusiutumista ja muita komplikaatioita, hoitoja virtsarakon syöpien yleensä maksaa paljon rahaa. Mukaan eroja kliinisen kehityksen, patologian ja molekyylitason muutos profiilit, virtsarakon syöpien luokitellaan kahteen tyyppiin syöpäkasvainten: ei-lihas invasiivisia pinnallinen, papillaarinen karsinoomat ja lihasten invasiivisia karsinoomia [2]. Ei-lihas invasiivisia pinnallinen, papillaarinen karsinoomat ovat yleensä pieniä hengenvaarallisia, mutta korkea ilmaantuvuus ja korkea uusiutumisen, kun taas lihaksen invasiivisia karsinoomia aiheuttavat usein etäinen etäpesäke ja nopea kuolemia [3].

Useita signalointi reitit ovat sekaantunut taudin alkamisen ja etenemisen virtsarakon syöpien, mukaan lukien mutaatiot PI3K /Akt ja Ras /MAPK kasvaimia synnyttävän path tavalla komponentteja ja muutoksia on tuumorisuppressorien, kuten p53 ja Rb. On yhä enemmän näyttöä siitä, että muutokset näissä koulutusjakson komponentteja ei ainoastaan ​​liittynyt aloittamiseen virtsarakon syöpien, mutta myös vahvasti korreloivat sairauden uusiutumisen, etenemistä ja eloonjäämistä. Esimerkiksi voitto toiminta mutaatioiden Ras, FGFR3, PIK3CA usein sekaantuneet kuin lihas invasiivisia pinnallinen, papillaarinen karsinoomat, kun taas lakkaa toimimasta korjauksilla p53 ja RB-geenejä löytyy useammin aggressiivinen, lihasten invasiivisia karsinoomia [4] – [6].

fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) reitti säätelee tasapaino solun eloonjäämistä ja apoptoosia, ja tämä tasapaino on usein häiriintynyt monissa eri ihmisen syövissä, mukaan lukien ihmisen urothelial virtsarakon syöpien [2 ]. Akt on keskeinen alavirran osa PI3K reitin, joka voidaan aktivoida peräkkäin fosforylaation kaksi kohdetta konservoitunut AGC-kinaasiryhmän [7]. Esimerkiksi ylävirran kinaasi PDK-1 voi fosforyloida Thr308 sivuston aktivointi silmukka Akt1 [8], [9], joka laukaisee autofosforylaatiota Akt1 sen C-päätteen Ser473 [10], ja siten täysin aktivoi Akt1. Akt signalointi voi lopettaa kaksi mekanismia: poisto Aktiivisen lipidin toinen messenger joka katalysoi lipidien fosfataasin PTEN (fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa kymmenen) [11], ja defosforyloimalla aktivoitua Akt. Akt voidaan myös suoraan defosforyloitiin PP2A-tyyppinen fosfataasien [12] tai muun proteiinin fosfataasin kuten PHLPP1 (PH domain leusiinirikkaita toista proteiinifosfataasi 1) ja PHLPP2 [13], [14].

Täällä kerroimme uuden proteiinin fosfataasi, kutsutaan täydellinen s transaktivoituun proteiini 1 (CSTP1) [15], jonka ilmentyminen vähentää selektiivisesti ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpiä. Jotta edelleen ymmärtää merkityksen CSTP1 virtsarakon syövän synnyn, tässä tutkimuksessa, menemme syvällisesti i. vaikutukset CSTP1 virtsarakon syöpään solusyklin, apoptoosin ja kasvaimen muodostumisen in vivo ja alleviivattu molekyylitason mekanismeja; ii. molekyylitason mekanismeja, joilla CSTP1 kykenee sen biologinen funktio; iii. merkitys vähentynyt ilmentyminen CSTP1 toistumista ja ennusteen ei-invasiivisia virtsarakon syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi eettisten komiteoiden of Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala (Luvan numero: 2008 [96]), ja kirjallinen suostumus saatiin kuhunkin aiheeseen. Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of Health Science Center Pekingin yliopiston. Protokolla hyväksyi eettinen komitea eläinkokeiden of Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala (Luvan numero: J201112).

Potilaat

kahdeksankymmentäkuusi virtsarakon syöpä potilaista, jotka vasta diagnosoitu instituutissa of Urology, Pekingin yliopiston otettiin tässä tutkimuksessa. Heistä 62 tapausta oli ei-invasiivisia virtsarakon syöpien ja tehtiin urut säilyttävää transuretraalisen poiston jälkeen rakkokasvaimista (TURBT). Keskipitkän ikä (± SD) on 62 potilasta oli 65,3 ± 11,5 vuotta vanha (40 miestä ja 22 naista).

Cell Culture

RT4, SV-HUC1, EJ, ja T24-solujen viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Hela ja 293T-soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 U /ml penisilliiniä. Sf9-soluja pidettiin Sf-900 II SF alustassa, joka sisälsi penisilliiniä /streptomysiiniä loppupitoisuudessa (50 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä), 27 ° C: ssa.

Real Time PCR

kokonais-RNA uutettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript TMIII ensimmäisen juosteen sarjat (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. CSTP1_RT ja GAPDH_RT alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. Ero ilmentyminen CSTP1 mRNA laskettiin käyttämällä 2-ACt, jonka ovat kuvanneet Schmittgen [16].

Animal Experiment

Kuudesta 8 viikkoa vanhat naaraspuoliset nude-hiirten kanssa BALB /c-taustalla hankittiin Peking University. 5 x 106 EJ-soluista-ilmentävät CSTP1 tai CSTP1 ΔPP2Ac ja ohjaus solut injektoitiin subkutaanisesti hiiriin. Kasvaimien koko mitattiin kerran viikossa, jossa on paksuus, ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa π /6 x pituus x leveys2. Jokainen piste on keskiarvo ± S.D. Eri eläinten mittauksissa (n = 6).

Vasta-aineen valmistus

Anti-CSTP1 polyklonaalinen vasta-aine valmistetaan immunisoimalla kani kanssa 20-meerinen peptidi, IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA, ja antiseerumin puhdistettiin affiniteettikromatografialla .

plasmidin muodostaminen

koodausalue CSTP1 saatiin normaalissa virtsarakossa endoteelisolujen cDNA käyttämällä alukkeita CSTP1_MYC_F ja CSTP1_MYC_R, ja kloonattiin pcDNA3.1 myc /hänen C vektori tuottaa yhdistelmä-DNA-plasmidi pcDNA3 0,1 myc /hänen C -CSTP1. Kaikki alukkeet käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. tuottaa GFP fuusio- konstruktin koko koodaava alue CSTP1 monistettiin käyttäen alukkeita CSTP1_GFP_F ja CSTP1_GFP_R, ja subkloonattiin pEGFP-N1 ekspressiovektorin pEGFP-CSTP1. Lentivirus ekspressioplasmidin pZsG-CSTP1 konstruoitiin insertoimalla PCR-tuote monistettiin CSTP1_ZsG_F ja CSTP1_ZsG_R osaksi pZsG plasmidiin. pZsG-CSTP1 ΔPP2Ac saatiin käyttäen alukkeita CSTP1ΔPP2Ac_F ja CSTP1ΔPP2Ac_R ja tuotteet ligoitiin uudelleen T4-DNA-ligaasia. Koodaava alue Akt1 monistettiin alukkeilla Akt_Tag_F ja Akt_Tag_R ja kloonattiin pCMV Tag-2B-plasmidin. Rakentamiseen Akt (S473D) phosphomimetic mutantti, villityypin Akt1 kloonattiin ensin pZsG plasmidiin käyttämällä PCR (alukkeet Akt_ZsG_F ja Akt_ZsG_R on esitetty taulukossa 1). Pistemutaatio Akt1 (Ser473), joka muuntaa Ser Asp synnytettiin käyttäen QuikChange kohdennetun mutageneesin kittiä (Stratagene, La Jolla, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita seuraavilla alukkeilla (Akt_Mut_F ja Akt_Mut_R, taulukko 1). Bakteeri-ilmentymistä CSTP1 proteiinin, CSTP1 cDNA kloonattiin pET-42a-vektorin alukkeita (CSTP1_pET_F ja CSTP1_ pET_R, taulukko 1).

RNA Interference

Ihmisen CSTP1 siRNA kohdesekvenssien (CSTP1_siRNA_target taulukko 1) ovat suhteessa ensimmäisen nukleotidin aloituskodonin ihmisen CSTP1 koodaavan sekvenssin. Ei-sukua oleva, salattu siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina (CSTP1_siRNA_neg, taulukko 1). SiRNA syntetisoitiin Shanghai Genechem Co., Ltd, Kiina. CSTP1 pudotus suoritettiin transfektoimalla siRNA osaksi MCF-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Northern blot -analyysi

Kokonais-RNA uutettiin kasvaimen solulinjoja käyttämällä TRIzol valtionhoitaja (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentä mikrogrammaa kokonais-RNA-näytteet denaturoitiin, fraktioitiin koon mukaan elektroforeesilla 1,2% agaroosi-formaldehydi- geelit, ja siirrettiin magna nylon siirto kalvo (Osmonics Inc. Minnetonka, MN, USA). Havaitsemiseksi endogeenisen CSTP1 mRNA, ORF CSTP1 leikattiin pcDNA3.1 myc /hänen C-CSTP1 plasmidi, merkitty [α-32P] dCTP: llä käyttämällä Prime-a-Gene Labeling System (Promega, Madison, WI, USA) . Sisäinen valvonta GAPDH saatiin PCR-menetelmällä käyttäen alukkeita (GAPDH_NB_F ja GAPDH_NB_R, taulukko 1) ja leimattiin kuten edellä. Hybridisaatio suoritettiin ExpressHyb- hybridisaatioliuoksessa (Clontech, Mountain View CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

In vitro fosfataasimääritys

293T-solut transfektoitiin pcDNA3.1 myc /hänen C-CSTP1 plasmidi käyttämällä kalsiumfosfaatti transfektiolla menetelmällä. 48 tunnin kuluttua solut hajotettiin fosfataasi varastoinnin puskuriin. Fuusioproteiini CSTP1-His puhdistettiin EZview Red HIS-Select HC Nickel Affinity Gel (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA). Proteiineja käytettiin fosfataasimääritys käyttäen seriini /treoniini fosfataasimääritys System (Promega, Madison, WI, USA) valmis- tajan ohjeiden mukaisesti.

Sen tutkimiseksi, onko puhdistettiin CSTP1 voi defosforyloida Akt, CSTP1 ilmaistiin GST fuusioproteiinina BL21 (DE3) bakteeri- ja puhdistettiin glutationi-Sepharose. Defosforyloitumista Reaktiot suoritettiin, kuten on kuvattu Tianyan Gao [13].

Baculovirus vector Construction, Virus Packaging

saamiseksi His-merkittyjen Akt1, täyspitkän koodittavan alueen Akt1 kloonattiin ensin pcDNA3.1Myc /His C-plasmidista PCR: llä alukkeilla Akt_His_F ja Akt_His_R (taulukko 1), sen jälkeen, Akt1-His koodaava sekvenssi valmistettiin PCR-menetelmällä käyttäen alukkeita Akt_Bac_F ja Akt_Bac_R (taulukko 1), jossa pcDNA3.1Myc /His C-Akt1 plasmidin mallina. Tuote alikloonattiin BamHI ja Xhol pFastBacTM bakuloviruksen shuttle-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Rekombinantti pFastBacTM luovuttaja Plasmidi transformoidaan DH10BacTM täytäntöönpanolle osaksi bakmidi. Valkoiset pesäkkeet sisältävät yhdistelmä-bakmidi valittiin eristää rekombinantteja bakmidi DNA. Tuottaa viruspartikkelin, Sf9-solut 6-kuoppaisilla levyillä, jotka on transfektoitu yhdistelmä-CSTP1 bacmid-DNA: CellfectinTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Viisi päivää myöhemmin väliaine kerättiin ja supernatantti varattu P1 virusliemi.

virtaussytometria-analyysi

apoptoosimäärityksessä, soluja käsiteltiin 10

-8 mol /l gemsitabiini tai 2 ug /ml sisplatiinia vastaavasti. 48 tuntia myöhemmin solut saadaan ja kaksinkertainen värjättiin anneksiini V-FITC ja PI (KEYGEN, Nanjing, Kiina). Solujen apoptoosi analysoitiin virtaussytometrialla (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

solusyklin analyysi, soluja viljeltiin standardi RPMI1640 10% FBS: ää ja noin 40% confluencey, ja viljeltiin 2 mM tymidiiniä 19 tuntia. Solut köyhdytettyä tymidiiniä, ja niitä inkuboitiin 9 tuntia, kunnes 2 mM tymidiiniä lisättiin toisen kerran, ja soluja viljeltiin vielä 16 tuntia. Poistamisen jälkeen tymidiinin uudelleen, tymidiinin synkronoitu soluja viljeltiin täydellisessä elatusaineessa ja kerätään eri aikoina solusyklin analyysi. Yleisesti, solut pestiin kahdesti PBS-liuosta ja kiinteä jäähdytetty 70% alkoholia -20 ° C: ssa 24 tuntia. Solusedimentti kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kahdesti PBS-liuosta, inkuboitiin 20 ul: lla RNaasi A: ta (20 mg /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa, ja värjättiin 25 ug /ml PI: ssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solusyklin jakautuminen arvioitiin sitten käyttäen virtaussytometrialla (BD Biosciences, USA).

immunohistokemia Analyysi

neljä mikrometriä osastoja formaliinilla kiinnitetyt paraffiiniin upotetut kudokset kiinnitettiin poly-L-lysiini -päällystettyihin dioja ja sitten parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin läpi alkoholin tislattua vettä. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun paine kypsennyksen levyt 10 mM EDTA (pH 8,0) 3 minuutin leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kaniinin anti-CSTP1-vasta-aine (1:200). Ensisijainen vasta-aineet havaittiin käyttämällä kaksivaiheista EnVision System (Dako, Tanska). Positiiviset ja negatiiviset immunohistokemia kontrollit rutiininomaisesti. Negatiivisia kontrolleja ensisijainen vasta-aine korvattiin ei-immuuni kanin seerumi vahvistamaan spesifisyyden.

Evaluation of CSTP1 värjäytyminen pääasiallisesti mukaisesti pisteytyksen perusteita kuvattu aiemmin [17]. Immuunihistokemialliset kvantitatiivinen viittaus asteikko vaihtelee 0-3 riippui intensiteetti CSTP1 proteiinin ilmentymisen. Suhteellinen määrä syöpäsolujen värjätty positiivisesti CSTP1 (0-100%) yhdessä luokitus värjäytymisen intensiteettiä, johti värjäys pisteet välillä 0 100.

Tilastollinen analyysi

Toistuva elinaika arvioitiin Kaplan-Meier käyrät. Erot ryhmien välillä arvioitiin log rank-testi. Tautivapaan elinajan määriteltiin välisenä leikkaus ja havaitsemisen alkuperäisen paikallisen uusiutumisen. Kaikki Analyysin suoritti tilastollista ohjelmistoa SPSS 12.0 ja P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

CSTP1 mRNA ilmentäminen Normaali ja kasvainten sissa ja solulinjoissa

CSTP1

geeni ensin tunnistaa Bai GQ vuonna 2005 [15], joka oli transactived täydellisellä S-proteiinin hepatiitti B-viruksen, ja meidän pitäisi se voi liittyä ihmisen syövissä. Ensin tutkitaan

CSTP1

mRNA: n ekspression taso useita erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien maksa, haima, vatsa, paksusuolen, virtsarakon ja munuaisten syövät. Yllätykseksemme

CSTP1

mRNA väheni merkittävästi (40% ~90%) 80% (8 10) virtsarakon syöpä kudoksiin verrattuna pariksi viereisen ei-syöpä kudoksiin, kun taas ilmaus

CSTP1

mRNA: maksa, haima, vatsa, paksusuolen ja munuaissyövän kudoksia ei muuttunut merkittävästi (Fig. 1A). Sitten määritetään ilmentymistason CSTP1 mRNA Northern blot virtsarakon syövän solulinjoissa ja SV-HUC1, ei-transformoituja urothelial soluja. Tulokset Northern blot esitetty kohtalainen ilmentymistason

CSTP1

mRNA SV-HUC1 soluja, mutta RT4, EJ ja T24 virtsarakon syövän solut,

CSTP1

mRNA tuskin voidaan havaita (kuvio. 1B). Lisäksi kaksi microarray aineisto saatu Oncomine paljasti myös, että CSTP1 mRNA ilmaisu vähentynyt virtsarakon syöpiä, jossa p-arvot 0,005 (ylös) ja 2.62E-4 (alas) vastaavasti (Fig. 1 C).

(A) Reaaliaikainen PCR-analyysi

CSTP1

mRNA-tasoja on kuusi erilaista ihmisen syövän kudoksissa.

CSTP1

mRNA selektiivisesti alassäädetty virtsarakon syövän kudoksissa verrattuna viereiseen ei-syöpä kudoksiin. (B) Northern blot -analyysi CSTP1 mRNA virtsarakon syövän solulinjoissa.

CSTP1

mRNA ilmentyi kohtuullisella tasolla SV-HUC1 soluja, mutta voitiin tuskin havaita RT4, EJ ja T24 virtsarakon syövän solulinjoissa, GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) CSTP1 mRNA: n ilmentymisen analyysi Oncomine. Vähentynyt CSTP1 mRNA: n ekspression virtsarakon syöpiä kaksi aineisto, jossa p-arvot 0,005 (ylös) ja 2.62E-4 (alas) vastaavasti. (1, virtsarakon limakalvo, 2, soluttautuminen virtsarakon urothelial karsinooma, 3, pinnallinen virtsarakon syöpä ).

karakterisointi CSTP1

Bioinformatics analyysi osoitti, että CSTP1 mRNA on 6156 emäsparin pituinen, joka koodaa proteiinia, 314 aminohappoa (kuvio. 2A). Ennustettu molekyylimassa tämä proteiini on 36 kDa teoreettinen isoelektrinen piste on 5,99. Vastaava geeni kartoitettiin kromosomiin 16p13.12, joka koostuu neljästä eksonia ja kolme intronia. Sekvenssianalyysi ennustetun proteiinin osoitti, että CSTP1 proteiini sisältää PP2Ac (proteiini fosfataasi 2A kennosto) aminohaposta 50-250 (Fig. 2B). Fylogeneettinen analyysi osoitti, että CSTP1 geeni on konservoitunut simpanssi, koira, lehmä, hiiren, rotan, kanan, seeprakala, ja P. falciparum (Fig. 2C).

(A) nukleotidisekvenssi

CSTP1

avoimen lukukehyksen ja johdettu aminohapposekvenssi. Nukleotidisekvenssi on esitetty 5 ’: sta 3’ suuntaan. Ennustettu aminohapposekvenssi on esitetty nukleotidisekvenssin alla. Aminohappotähteet, jotka vastaavat phosphorase 2A kennosto domeeni (PP2Ac) ovat punaisin kirjaimin. (B) bioinformatiikan analyysi osoitti, että CSTP1 proteiini sisälsi konservoituneen PP2Ac verkkotunnuksen välillä 50-250 aminohappoa. (C) fylogeneettinen analyysi osoitti, että CSTP1 proteiini konservoitunut simpanssi, koira, lehmä, hiiren, rotan, kanan, seeprakala, ja P. falciparum. (D) Western blot analyysi CSTP1 ilmentymisen HeLa-soluissa. HeLa-solut transfektoitiin pCDNA3.1 Myc /His C-CSTP1 plasmidi, 48 tuntia myöhemmin, taso CSTP1-Myc-fuusioproteiini testattiin anti-Myc-vasta-ainetta. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (E) CSTP1 muotoutuneet PP2B kaltaista proteiinia fosfataasiaktiivisuus

in vitro

. 293T-solut transfektoitiin pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1, 48 h myöhemmin, CSTP1-His-fuusioproteiini puhdistettiin varten fosfataasianalyysi. Vapautumista Pi määritettiin, kun läsnä oli 1 mM EGTA: ta, 50 mM MgCI

2, 5 mM NiCI

2 ja 250 ug /ml kalmoduliini. 200 nM trifluoroperazine tai 0,5 umoolia okadahapon lisättiin myös kumota fosfataasiaktiivisuutta PP2B tai PP2A.

Seuraavaksi vahvisti ennustettu molekyylipaino CSTP1 proteiinia. PcDNA3.1Myc /His C-CSTP1 transfektoitiin HeLa-soluja ja CSTP1-Myc-fuusioproteiini määritettiin western blot anti-Myc-vasta-ainetta. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, rekombinantti plasmidi ilmaistaan ​​proteiinia, jolla on odotettu molekyylipaino on 36 kDa.

Lopuksi määritetään, onko CSTP1 proteiini näkyy seriini /treoniini fosfataasin aktiivisuutta in vitro. 293T-solut transfektoitiin pcDNA3.1myc /hänen C-CSTP1 plasmidit ja CSTP1-His-fuusioproteiinia puhdistettiin varten fosfataasianalyysi. Entsymaattinen aktiivisuus määritettiin mittaamalla vapautumista Pi kaupallisesta synteettisen peptidisubstraatin, joka sisältää fosfotreoniini jäännös [RRA (pT) VA]. Kuten on esitetty kuviossa. 2E, CSTP1 proteiini katalysoivat Pi vapautui RRA (pT) VA peptidien lisäksi PP2B erityisiä estäjä, trifluoroperazine melkein kumosi fosfataasiaktiivisuus, kun taas PP2A spesifinen estäjä okadahappo ei vaikuttanut CSTP1 toimintaa.

solunosasijaintia CSTP1

perehtyä biologisen toiminnan CSTP1 proteiinia, ensin analysoidaan sen solunosasijaintia. GFP-merkitty CSTP1 ekspressioplasmidit transfektoitiin HeLa-soluja, ja fluoresenssi visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Solut, jotka on transfektoitu pEGFP tyhjällä vektorilla näytetään diffuusi fluoresenssia subsellulaaristen solujen, kun taas CSTP1-GFP pääasiassa lokalisoitu sytoplasmaan (Fig. 3), viittaa siihen, että CSTP1 voidaan käyttää sen toimintoa lokalisointi solun sytoplasmaan.

Hela-solut transfektoitiin pEGFPN1 ja pEGFPN1-CSTP1 plasmidia, 48 tuntia myöhemmin, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja visualisoitiin fluoresenssin konfokaalimikroskopialla. 4, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi värjäys käytetään osoittamaan solun tumaan. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen.

CSTP1 Yli-ilmentyminen vaimentaa virtsarakon syövän Cell Proliferation ja Colony Formation, mutta ei Invasion

Koska havainto, että CSTP1 mRNA väheni virtsarakon syöpä kudoksia, me olettaa, että CSTP1 voi toimia tuumorisuppressori virtsarakon syövät. Tutkia roolia CSTP1 solujen toiminnassa, ensin analysoidaan vaikutus CSTP1 ilmentymisen vaikutus solujen lisääntymisen. CSTP1 stabiilisti yli-ilmennetään EJ virtsarakon syövän solujen kautta lentiviraalinen infektiota ja proliferaatiota arvioitiin MTT-menetelmällä. Yliekspressio CSTP1 inhiboivat EJ-solujen 50% sen jälkeen, kun 5-päivän ”kulttuuri (Fig. 4A), kun taas väheneminen PP2Ac verkkotunnuksen heikensi kasvun estymistä kyky CSTP1 on EJ-solujen 80% (Fig. 4A) . Yhdenmukainen tulosten kanssa MTT-määrityksellä, yliekspressio CSTP1 vähensi pesäkkeenmuodostusta kapasiteetti EJ-soluja, ja ehtyminen PP2Ac verkkotunnuksen pelastettiin pesäkkeen muodostumista kyky EJ-solut (Fig. 4B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa virtsarakon syövän solulinja T24 (tuloksia ei ole esitetty).

(A) EJ-solut transdusoitiin lentivirukset yli-ilmentäviä CSTP1 (Lv-CSTP1), The PP2Ac domian poistetaan CSTP1 (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac ), tai lenti-vektorisäätö (Lv-ctr). Soluproliferaatiota havaittiin MTT-määrityksellä. Data kussakin aikapisteessä edustaa keskiarvoja ± SD 8 näytettä. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) Transdusoidut EJ-soluja viljeltiin 14 päivää, ja pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja lasketaan alaan a × 40 objektiivilinssin. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiiriä huomattavan tukahdutettiin seuraavan CSTP1 yli-ilmentymisen. Data kussakin aikapisteessä on keskiarvo ± SD, n = 6 (D) jaosto määritykset suoritettiin transdusoiduilla EJ-soluja. Tulokset osoittivat, että CSTP1 ei ole mitään vaikutusta solujen invaasiota. Tiedot näytetään oli keskimääräinen lukumäärä tunkeutumaan solujen (x 100 kenttä) ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. **, P 0,01.

roolin tutkimiseksi CSTP1 in vivo, loimme ihmisen virtsarakon ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä injektoimalla ohjaus EJ solujen tai EJ soluista jotka ilmentävät pysyvästi joko villityypin CSTP1 tai CSTP1 ΔPP2Ac. Kasvu istutettu kasvaimia mitattiin hiirillä (n = 6 kussakin ryhmässä) aikana 8 viikkoa. Tulokset osoittivat, että, kateenkorvattomissa hiirissä vastaanottaa EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1, kasvaimen kasvu oli merkittävästi tukahdutti (-50%), mutta joilta puuttuu kateenkorva hiirillä, jotka saivat EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1 ΔPP2Ac, kasvaimen kasvua melkein ei muuttuvat verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 4C). Kuitenkin CSTP1 yliekspressio ei ollut vaikutusta EJ soluinvaasiota määritettynä transwell määritykset (Fig. 4D).

CSTP1 vaikutus solusyklin ja apoptoosi

tutkia vaikutuksen CSTP1 solusyklin , lentivirus transdusoidut EJ-solut synkronoidaan G0 /G1-vaiheessa kaksi kierrosta tymidiinin hoidon ja solukierron analysoitiin FACS 0 h, 2 h, 4 h, ja 8 h kuluttua päästämällä G0 /G1-vaiheessa lisäämällä täydellisen välineellä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, yliekspressio CSTP1 significantlly viivästynyt etenemistä solusyklin. Kontrolliin verrattuna, solut, jotka yli-ilmentävät CSTP1 osoitti alhaisempi solujen S-vaiheessa 2 h ja 4 h kuluttua päästämällä G0 /G1 vaiheeseen. Lisäksi alhaisempi G2 /M-faasin soluja 8 tuntia sen jälkeen vapautettu solusyklin esto havaittiin myös CSTP1 yli-ilmentäviä soluja, kun taas solut, jotka yli-ilmentävät CSTP1 ΔPP2Ac ei näytä viivästynyt solusyklin etenemisen. Vaikutusten vahvistamiseksi endogeenisen CSTP1 solusyklin, CSTP1 proteiini tippuu alas siRNA transfektiolla SV-HUC1 soluja, jotka osoittivat kohtalaista CSTP1 ilmentymistä (Fig. 1 B). CSTP1 proteiini oli tehokkaasti alas-säätelee erityinen siRNA transfektiolla (Fig. 5B), ja alennetun ilmentymistä CSTP1 edistää solujen lisääntymistä nostamalla solujen prosenttiosuus S-vaiheessa (Fig. 5C).

(A) EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1 (Lv-CSTP1), CSTP1 ΔPP2Ac (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac) ja valvonta-soluja käsiteltiin kaksi kierrosta 2 mM tymidiiniä. Solusykleihin analysoitiin FACS jälkeen päästämällä G0 /G1 vaihe ilmoitetuilla ajankohtana. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) immunoblottauksen CSTP1 uutteissa SV-HUC1cells 48 h transfektion jälkeen ohjaus siRNA (Mock) tai siRNA varten CSTP1 (CSTP1 siRNA). (C) Solusyklianalyysiä SV-HUC1 solujen transfektion jälkeen ohjaus siRNA tai siRNA varten CSTP1. *, P 0,05. Tulokset olivat edustavat kolmea riippumatonta koetta.

Jotta voidaan tutkia roolia CSTP1 solujen apoptoosin, EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1 tai CSTP1Δ PP2Ac ja ohjaus soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa tai ilman gemsitabiini ja sisplatiini, kaksi yleisesti käytetty kemoterapiaa huumeita virtsarakon syövän hoidossa. FACS-tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen CSTP1 yksin vain hieman indusoi EJ-soluja apoptoosin, mutta kun soluja käsiteltiin kemoterapialääkkeet, lisääntynyt kuolleisuus havaittiin CSTP1 yli-ilmentäviä soluja, ja ehtyminen PP2Ac verkkotunnuksen heikennettyjen tämän kuoleman edistämällä kykyä CSTP1 dramaattisesti (Fig. 6).

EJ-solut stabiilisti yli-ilmentävät CSTP1 tai CSTP1 ΔPP2Ac ja ohjaus soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa tai ilman gemsitabiinin (10

-8 mol /l) ja sisplatiinia ( 2 ug /ml), 48 tuntia myöhemmin, solut kahden värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI, solun apoptoosi analysoitiin FACS: lla. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen. **, P 0,01.

CSTP1 Vuorovaikutus on ja defosforyloi Pakt at Ser473 Site

tutkia alleviivattua -mekanismit koholla apoptoosin ja myöhäisempi solusyklin virtsarakon syövän solujen välittämää by CSTP1 pyrimme löytämään signalointipolkujen alavirtaan CSTP1 yli-ilmentymisen. Signalointireittejä, jotka yleensä liittyvät syövän, solu- kierron säätely tai solujen lisääntymiseen tutkittiin CSTP1 yli-ilmentäviä EJ-soluihin analyysin lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Cignal Reporter Assay Kit. Tulokset osoittavat, että FOXO tekijä oli vankempi transkriptionaalista aktiivisuutta CSTP1 yli-ilmentäviä soluja (kuvio. 7A). Kasvu FOXO aktiivisuuden osoitettiin edelleen vähentäminen fosforyloitumisaste FOXO3A on Thr32 päällä sen jälkeen, kun CSTP1 yli-ilmentymisen (Fig. 7B). Koska Akt kinaasi on ensisijainen negatiivinen säätelijä ylävirtaan FOXO tekijä, meidän pitäisi että Akt kinaasiaktiivisuutta voisi laski CSTP1 yli-ilmentäviä soluja. Vahvista Tämän hypoteesin fosforyloidun Akt on Thr308 tai Ser473-sivuston, joka edustaa aktivaatiotilasta Akt, ei havaittu. Western blot tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen CSTP1 laski tasolle fosforyloidun Akt at Ser473 päällä, mutta taso fosforyloidun Akt at Thr308 oli muuttumaton (kuvio. 7B). Koska CSTP1 on vaimentua virtsarakon syövän kudoksissa, joten kysyimme, onko menetys CSTP1 ilmentymisen urothelial soluissa voi johtaa aktivoinnin Akt-kinaasin ja inaktivoitumista FOXO tekijä. Yhdenmukainen CSTP1 yliekspressio määritystä knockdovvn CSTP1 SV-HUC1 lisäsi fosforylaation taso Akt at Ser473 päällä ja FOXO3A klo Thr32 päällä (Fig. 7C). Tutkimiseksi edelleen vaikutuksen CSTP1 ilmentymisen vaikutus aktiivisuuteen Akt, tutkimme myös muita neljä tunnettua proteiineja, jotka riippuvainen Akt Fosforylaatioon GSK3α, GSK3p, p70S6K, ja TSC2. Yllätykseksemme CSTP1 yli-ilmentyminen ei vaikuta fosforylaation asemaan GSK3α, GSK3p, p70S6K, ja TSC2 (Fig. 7B).

(A) EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1 ja valvonta-solut transfektoitiin sarja cignal raportoitu plasmidi, 48 tuntia myöhemmin, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen lusiferaasimäärityssysteamiä luminometrillä. lusiferaasi-pohjainen toimittaja signaali normalisoidaan ilmaus yhtäaikaa transfektoidun Renillan lusiferaasin ohjaus plasmidi. (B) Western blot analyysi fosforylaation tasojen FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6K ja TSC2 in EJ-solut yli-ilmentävät CSTP1. Fosforyloitumaton FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6K ja TSC2 proteiinit havaitaan sisäisen valvonnan. (C) Western blot analyysi fosforylaation tasojen FOXO3A ja Akt jälkeen kaatamalla of CSTP1 SV-HUC1 soluja. (D) CSTP1 vuorovaikutuksessa Akt 293T-soluissa. 293T-solut kotransfektoitiin pcDNA3.1-CSTP1 ja Flag-Akt ilmentävien plasmidien, vuorovaikutus CSTP1 ja Akt analysoitiin yhteistyössä ip kokeilla anti-Flag (up paneeli) tai anti-CSTP1 vasta-aine (matala paneeli). (E) defosforylaatio Akt mukaan puhdistettua CSTP1

in vitro

. Pure His-Akt inkuboitiin GST-merkitty CSTP1 tai GST-merkitty CSTP1ΔPP2Ac että fosfataasipuskurilla. Jos negatiivinen kontrolli, CSTP1 proteiini jätettiin pois reaktioseoksesta (Ctr). (F) EJ solut yli-ilmentynyt CSTP1 (Lv-CSTP1) tai CSTP1 (Lv-CSTP1) plus fosfori jäljittelevä S473D rakentaa Akt (ca-Akt) by lentivirus solukierron analysoitiin FACS. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Seuraavaksi testasimme jos CSTP1 voisi sitoutua suoraan ja defosforyloida fosforyloituja Akt at Ser473. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.