Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) omaavat korkean kasvaimeen aloittamista kapasiteettia ja on raportoitu olevan vastustuskykyisiä terapeuttisia. Päinvastoin, terapia-resistenttejä syöpäsoluja näyttävät ilmeisen CSC fenotyyppejä ja ominaisuuksia. On yleisesti oletettu, että lääkeresistenttiä syöpäsolujen voivat kaikki olla CSCS vaikka yleisyyttä tämä oletus ei tunneta. Täällä me kroonisesti käsitelty DU145 eturauhassyövän solut etoposidin, paklitakselin ja jotkut kokeelliset lääkkeet (ts staurosporiinille ja 2 paklitakselin analogit), joka johti populaatioita huumeiden sietävien solujen (DTC). Yllättäen nämä verosopimusten istutettuna joko ihon alle tai ortotooppisesti NOD /SCID-hiiriin, osoittivat paljon pienempi kasvainten muodostumiseen tai olivat jopa ei-tuumorigeenisiä. Drug sietävä DLD1 koolonsyöpäsoluihin valitaan samanlainen krooninen selektioprotokollaa näytetään myös vähensi kasvainten muodostumiseen taas huumeiden sietävä UC14 virtsarakon syövän solut osoittivat joko lisääntynyt tai vähentynyt kasvaimeen uudistava kapasiteettia. Drug sietävä DU145 solut osoittivat alhainen proliferatiivinen ja klonogeeniset potentiaalia ja olivat käytännössä vailla CD44

+ soluja. Prospective knockdovvn CD44 in DU145 soluissa esti solujen lisääntymistä ja kasvaimen uudistumista, kun taas palauttaminen CD44 ilmentymisen huumeiden sietävä DU145 solujen lisääntynyt solujen lisääntymistä ja osittain lisääntynyt kasvainten muodostumiseen. Mielenkiintoista, huumeiden sietävä DU145 solut osoittivat sekä lisäykset ja vähennykset monessa ”stemness” geenejä. Lopuksi näyttöä siitä, että krooninen lääkealtistuksen syntyy verosopimusten kautta epigeneettisellä mekanismeja käsittäen molekyylejä, kuten CD44 ja KDM5A. Tuloksemme siis käy ilmi, että 1) kaikki vikakoodit ovat väistämättä CSCS; 2) tavanomainen kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten taksolin ja etoposidin voi suoraan kohdistaa CD44

+ kasvaimen aloittamista solujen; ja 3) vikakoodit syntyy kautta kroonisten huumeiden valinta liittyy epigenetic mekanismeja.

Citation: Yan H, Chen X, Zhang Q, Qin J, Li H, Liu C, et al. (2011) Drug sietävä Syöpäsolut Näytä vähensi kasvainten-aloitus Kapasiteetti: kuluminen CD44

+ Solut ja Todisteita Epigeneettiset mekanismit. PLoS ONE 6 (9): e24397. doi: 10,1371 /journal.pone.0024397

Editor: Amit Singh, University of Dayton, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 08 elokuu 2011; Julkaistu: 15 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat National Institutes of Health (NIH) R01-ES015888, NIH 1R21CA 150009, Department of Defense, W81XWH-08-1-0472, Department of Defense, W81XWH-11-1-0331, Elsa Pardee Foundation, MDACC Center for Cancer epigenetiikka. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolu (CSC) käsite, joka kasvaimet sisältävät varsi kaltaisia ​​syöpäsoluja, ehdotettiin vuosikymmeniä sitten ja äskettäin elvytettiin selittää solujen heterogeenisuus kasvain. Yksi tärkeimmistä määrittelyperusteisiin CSCS on niiden lisääntynyt kyky uudistua transplantable kasvaimia, jotka histologisesti kerrata fenotyyppinen heterogeenisyys vanhempien kasvaimen [1]. Sinänsä CSCS kutsutaan usein kasvaimen aloittamista soluihin. CSCS ensin tunnistettu leukemia ja, vuodesta 2003, on raportoitu monia ihmisen kiinteiden kasvainten kuten gliooman [2], Ewingin sarkooma [3], ja rinta- [4], [5], paksusuolen [6] – [ ,,,0],12], haima [13], [14], maksa [15] – [17], vatsa [18], keuhko [19], [20], pään ja kaulan [21], munuaisen [22], ja munasarja [ ,,,0],23], [24].

Asennus näyttöä siitä, että CSCS voi olla enemmän resistenttejä syövän hoito, kuten on esitetty leukemiasolujen [25] ja multippeli myelooma [26] kantasoluja. CD133

+ CSCS kasvu sädehoidon ja edistää glioblastoma radioresistance kautta etuoikeutettu aktivointi DNA-vaurioita tarkistuspisteen vasteen ja kasvu DNA korjaus kapasiteetti [27]. CD44

+ CD24

lo /- rintojen CSCS rikastuvat syöpäpotilaista, jotka ovat saaneet adjuvanttihoitoa [28] ja kestävät paremmin jotkut kemoterapeuttiset lääkkeet [29]. Hiirimalleissa nisäkasvaimia, CSCS on myös osoitettu olevan refraktorinen sisplatiinihoitoon [30]. Lisäksi solunsalpaajaresistentti koolonkarsinoomasoluissa näkyviin CSC fenotyypit [31] ja CD133

+ maksan CSCS ovat solunsalpaajaresistentti johtuvat etuoikeutettu aktivointi Akt-reitin [32]. Nämä uudet havainnot korostavat mahdollisia osallistumista CSCS terapiassa vastustuskyky ja taudin uusiutumisen. On oletettu, että lääkeresistenttiä syöpäsoluja voidaan kaikki rikastettu CSCS vaikka yleinen sovellettavuus Tämän oletuksen edelleen testaamatta.

immunohistokemiallinen värjäys [33], [34], klonogeeniset määritykset [35], [36 ], samoin kuin kasvaimen siirron kokeet [37] – [41] ovat osoittaneet, että ihmisen eturauhassyöpä (PCa) sisältää myös varsi-kaltaisia ​​soluja. Meidän systemaattisia tutkimuksia ksenograftimalleissa osoittavat PCa solut ovat heterogeeninen suhteessa niiden kasvaimeen aloittamista kapasiteetin kanssa CD44

+ solupopulaation kätkeminen sekä lepotilassa CSCS ja nopeasti lisääntyvän kasvaimen esiasteita [38], [42]. Pieni osa CD44

+ PCa solut ovat hitaasti pyöräily, voivat ilmeisesti tehdään itseuudistumisen, mieluiten ilmaista ”stemness” geenejä, ja niillä korkea tuumorigeenisemmiksi ja metastaattisen potentiaalin. CSCS voidaan edelleen rikastaa käyttäen CD44

+ α2β1

hi merkki profile [39] ja PCa solujen holoclones, jossa useimmat solut ovat CD44

+ α2β1

hi, sisältävät itseuudistuvien kasvaimen aloittamista solujen [41]. Viimeaikaiset työ osoittaa, että Nanog, olennaista itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden ES-solujen, rikastuu CD44

+ PCa solupopulaation ja toiminnallisesti tarvitaan kasvainten kehittymiseen [43]. Itse asiassa, indusoituva Nanog ilmaisu riittää antaa CSC fenotyyppiset ja toiminnalliset ominaisuudet sekä edistää kastraatio kestävät PCa kehitys [44]. Keskeinen vastaamattomat kysymys on, varsi kaltaisia ​​PCa solut voivat käyttäytyä kuten jotkut muut CSCS kestääkin terapeuttisia tai vaihtoehtoisesti joko lääkehoitoa rikastaisi PCa-aloittamisen soluissa. Me raportoimme tässä odottamattomia löydöksiä, että jotkut huumeiden sietävä syöpäsolut ovat vähemmän tuumorigeenisia tai jopa ei-tuumorigeenisiä. Yllättäen lääke sietävä DU145 PCa soluviljelmissä ovat vailla CD44

+ soluja, jotka ainakin osittain selittää niiden vähensi kasvainten muodostumiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Animal liittyviä tutkimukset ovat hyväksyneet MD Anderson Cancer Center Institutional IACUC komitea (ACUF 08-05-08132). Kaikki muut tutkimukset esitellään tässä olivat tutkinnan aloitti ja ei vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

Solut, reagenssit, ja eläimet

DU145, PC3, ja UC14 solut hankittiin ATCC ja viljeltiin RPMI, joka sisälsi 7% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 200 U /ml penisilliiniä (Gibco). DLD1-solut saatiin ATCC: stä ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 7% FBS antibiooteilla. Etoposidi (VP16) ja paklitakselin hankittiin Sigmalta. Doksorubisiini (Dox) ja staurosporiinille (STS) ostettiin Biomol. WP1102 ja WP1103 oli kaksi syntetisoituneeseen paklitakselin analogien substituutioita 2′-OH (jota Priebe ryhmä; tiedot julkaistaan ​​muualla). Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään nykyisessä tutkimuksessa olivat: kanin mAb CD44 (Abcam) ja Western-blottauksella (1:1,000), hiiren mAb CD44 (BD Pharmingen) ja immunovärjäyksellä (1:500), hiiren mAb ABCG2 (Abcam; 1: 500), kanin pAb Bcl-2 (Santa Cruz, 1:500), hiiren mAb: t p21 ja p27 (Santa Cruz, 1:1,1000 molemmille), kanin pAb jotta hTERT (Santa Cruz, 1:100), kani mAb GAPDH (Cell Signaling, 1:2,000) ja mAb ß-aktiini (Cell Signaling, 1:1,000). Toissijainen vasta ostettiin GE Healthcare ja ECL Plus reagenssit olivat PerkinElmer Inc. NOD /SCID-hiiriä perin hankittiin Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ja Kasvatuslaitoksessa perustettu eläinpalvelussa ja ylläpidetään standardiolosuhteissa mukaan vakiintuneiden ohjeiden.

perustaminen huumeiden sietävien solujen (DTC) ja määrittäminen IC

50-arvot

DU145, DLD1, ja UC14 solut perin alttiina erilaisille huumeita, neljänä kaivoihin kello konsentraatioalueella, eli 0, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 0,1 uM, 0,5 uM, 1 uM, 2 uM, 4 uM, ja 10 uM. Lääkeaineet täydennettiin joka 3 päivä ja soluja käsiteltiin jatkuvasti 2 viikkoa. Solujen eloonjääminen ja kuolema seurasi tiiviisti alla ylösalaisin faasikontrastimikroskoopissa. Lopussa 2 viikon hoidon ”optimaalinen” lääkeainepitoisuudet määritettiin sen perusteella, että huumeet osoitti merkittävää estävää vaikutusta solun laajentamiseen, mutta ei täysin tappaa koko väestön (~90% solun tappaminen). Koko koe toistettiin kerran. Nämä kokeet johtivat määrittämiseksi optimaalinen pitoisuuksien (ilmoitettu Text). Sen jälkeen, syöpäsolut olivat jatkuvasti viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi optimaalisen pitoisuuden lääkkeiden vähintään 3 kuukautta vahvistaa DTC, joka nimettiin DU145-VP16-solut, DU145-paklitakseli-solut, niin edelleen ja niin edelleen. Vikakoodit viljeltiin rutiininomaisesti sisältävä väliaine optimaalinen pitoisuuksia eri lääkkeillä.

määrittämiseksi puolet maksimaalisesta pitoisuudet inhibition (eli IC

50) vanhempien syöpäsolujen ja DTC, 2,5- 3,0 × 10

5 solua maljattiin neljänä 24-kuoppalevyillä. Yön yli viljelyn jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla alustavan valinnan lääkeaineen tai ei-valitsemalla lääkeaineiden (tutkia mahdollisia ristiresistenssiä) 24-48 tuntia. Lopussa hoidon, elinkelpoisten solujen määrä laskettiin käyttäen trypaanisinistä määrityksiä ja GraphPad prisma 5,0 ohjelmistoa käytettiin analysoimaan tietoja ja laskea IC

50-arvot.

Clonal ja BrdU määrityksissä, immunofluoresenssimenetelmällä, ja immunoblottauksella

Basic menettelyt näitä kokeita on kuvattu aikaisemmissa julkaisuissa [37] – [39], [43] – [45]. Kokonaismäärän määrittämiseksi solujen määrä, 5000 solua maljattiin kolmena tai neljänä kappaleena 12-kuoppalevyille ja viljeltiin 10 päivää, ja tuoretta väliainetta syötetään joka 3 päivä. Lopussa, elävien solujen määrä laskettiin käyttämällä trypaanisinistä. BrdU-määritykset, solut maljattiin kolmena rinnakkaisena lasipeitinlevyille (10000 solua /peitelevy) yön yli ja sitten pulssitettiin 10 uM BrdU: ssa 4 tuntia. Lopussa, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, joka sisälsi 5% sakkaroosia 10 minuuttia. Soluja inkuboitiin 20 minuutin ajan 1% Triton-100, ja sitten denaturoitu, neutraloitiin, tukossa, ja inkuboitiin monoklonaalisen anti-BrdU-vasta-ainetta (1:100) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja sen jälkeen vuohen anti-hiiri-IgG-Alexa Fluor 594 (30 min 37 ° C: ssa). Yhteensä 500-1000 solut laskettiin per peitinlasi ja kaksi peitinlasit laskettiin jokaisen solutyypin prosenttiosuuden määrittämiseksi lisääntyvien (eli BrdU

+) soluista.

klonaalisen analyysiä, 100-soluja maljattiin kolmena kappaleena 6-kuoppalevyille ja viljeltiin 10 päivää tuoreella kasvualustalla, syötettiin joka 3 päivä. Lopussa, sekä holoclones ja meroclones [41] laskettiin ja tulokset esitettiin kloonauksen tehokkuutta. Paraclones sisälsi suuria ja senescent solujen [41] ja oli yleensä 20 soluja ja siksi ei määrällisesti. Immunofluoresenssi CD44 suoritettiin, kuten on kuvattu [38], [45]. Western blotting. vanhempien DU145 ja eri huumeiden sietäviä DU145 solut kerättiin valmistamiseksi kokosolulysaatissa Länsi blotting analyysi molekyylien osoitettu kuviossa paneelit. Joissakin kokeissa, DU145-VP16-soluja käsiteltiin ensin eri pitoisuuksilla trikostatiini A (TSA) tai 5′-atsa-deoksisytidiini (atsa) 72 h.

perustaminen GFP-merkityn lääkeaineen sietävä DU145-soluja

Lyhyesti, 293FT pakkaus solut [43] transfektoitiin pLL3.7-GFP lentivirusvektorilla [43] yhdessä pakkauksessa plasmideilla käyttäen Lipofectamine. Virus sisältävä väliaine kerättiin 48-72 tuntia myöhemmin, sentrifugoitiin 3000 rpm, läpi 0,45 um: n suodattimen jätteiden poistamiseksi ja lopulta ultrasentrifugoitiin (20000 rpm x 2 h ajan 4 ° C: ssa). Drug sietävä DU145 Sitten solut infektoitiin viruksella MOI (infektio) on 20-25.

ihonalainen (sc) ja potilaalle tehdä kasvain kokeita

Basic menettelyjä on kuvattu aikaisemmin [37 ] – [39], [41], [43], [46]. Lyhyesti, vanhempien ja huumeiden sietäviä DU145 (ja muut) solujen eri numeroa injektoitiin 50% Matrigel s.c. kylkiin NOD /SCID-hiirissä. Kun suurin kasvain (t) mihinkään ryhmään tulee irtisanoa IACUC asetuksissa tai kasvain eläimistä tuli kuolemaisillaan, kaikki eläimet, jotka tapettiin ja kasvaimet korjattu. Sillä ortotooppinen implantaatio, eläimet nukutettiin ja soluja injektoitiin 20 ui keskipitkän Matrigel-seokseen (01:01) osaksi selän eturauhasen. Kun kasvaintaakkaa tuli ilmeiseksi (tunnustelemalla), koe lopetettiin, eläimet tapettiin ja primaarikasvainten yhdessä useiden elinten (ts keuhko, maksa, perna, haima, munuaiset, jne) leikeltiin ja tutkittiin mikro- ja macrometastasis (ts GFP

+ pesäkkeitä) alla Nikon epifluoresenssilla mikrodissektion mikroskoopilla.

CD44 pudotus kokeita

shRNA välittämää knockdown suoritettiin äskettäin kuvattu [43], [46]. Lyhyesti, 293FT pakkaus solut transfektoitiin joko pGIPz CD44-shRNA lentivirusvektori tai pGIPz-NS kontrollivektorilla. Viruksen sisältävä elatusaine kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen, sentrifugoitiin 3000 rpm, suodatettiin 0,45 um: n ruiskun suodattimen, ja lopuksi ultrasentrifugoitiin (20000 rpm x 2 h ajan 4 ° C: ssa). Viruksen Pelletti liuotetaan nesteeseen ja OPTI-MEM ja käytettiin infektoimaan HT1080 fibrosarkoomasoluissa määrittää virustiitteri. Sitten DU145-solut infektoitiin pGIPz-NS tai pGIPz-CD44shRNA viruksilla MOI 20, ja 24-48 tuntia myöhemmin, käytettiin joko in vitro karakterisointien tai in vivo kasvaimen kokeissa.

CD44 yliekspressio kokeita

perus- retrovirus-menettely on aiemmin kuvattu [45]. Lyhyesti, retrovirusvektorit, mukaan lukien kontrollivektori pBabe-GFP: n ja pBabe-CD44 (Addgene, Cambridge, MA) transfektoitiin Ampho-Phoenix 293-soluja (ATCC). 48-72 h transfektion jälkeen, jotka sisältävät viruksia ja viljelyalusta kerättiin, sentrifugoitiin 3000 rpm, suodatettiin 0,45 um: n ruiskun suodattimen, ja lopuksi ultrasentrifugoitiin (22000 rpm x 2 h ajan 4 ° C: ssa). Viruksen Pelletti liuotetaan nesteeseen ja OPTI-MEM ja käytettiin infektoimaan huumeiden sietävä DU145 solujen 24-48 h, jotka sitten käyttää sekä in vitro ja in vivo kokeissa.

terapeuttinen hoito potilaalle tehdä PC3 kasvaimet paklitakselilla

peruskäytäntö terapeuttisten kokeiden kuvattiin vastikään [46]. Lyhyesti, PC3-GFP-soluja istutettiin selän eturauhasen (DP) mies NOD /SCID-hiirten (500000 solua /DP; n = 10). Kolme viikkoa myöhemmin, 5 eläintä per ryhmä injektoitiin suonensisäisesti, 15 mg /kg kehon painoa paklitakselin tai ajoneuvon hallinnan (PBS). Injektiot toistettiin joka viikko kaksi viikkoa (eli yhteensä 3 injektiota) ja eläimet lopetettiin 49 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen. DP kasvaimet leikattiin pois, kuvaamisen, ja punnitaan taas useiden elinten, mukaan lukien keuhkojen, haiman, imusolmukkeen, maksan, ja aivot tutkittiin etäispesäkkeiden on mikro- epifluoresenssimikroskoopilla [46].

Analyysi ”stemness” geeniekspressioprofiilien kvantitatiivisen käänteistranskriptaasi – polymeraasiketjureaktio (qPCR) B

peruskäytäntö qPCR analyysi kuvattiin vastikään [44], [46]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin DU145 ja DU145-VP16-soluissa käyttäen RNeasy RNA-puhdistuskittiä (Qiagen, Valencia, CA). ABI High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ja satunnaisia ​​heksameerejä käytettiin cDNA-synteesi. qPCR suoritettiin MD- Anderson Science-Park Molecular Biology Core Facility käyttäen ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Tiedoston Builder 3.1-ohjelmisto (Applied Biosystems) käytettiin PCR-alukkeiden suunnitteluun ja koettimia. Ihmisen geeni-aluketta paria käytettiin ilmaisua profilointiin jonka SYBR® Green menetelmällä. Kokeellinen Ct (syklin kynnys) kalibroitiin että 18S valvonnan tuotteen. Kaikki monistukset suoritettiin kolmena kappaleena. DDCt menetelmää käytettiin määrän määrittämiseksi geenituotteen suhteessa, että ilmaistu vanhempien DU145-soluissa (1-kertainen, 100%).

Tilastolliset analyysit

GraphPad prisma 5,0 ohjelmisto ja F- testiä käytettiin vertaamaan IC

50-arvot. Parittomia

t

-testi käytettiin vertaamaan eroja solujen määrä, BrdU

+% soluista, kloonaustehokkuuden CD44

+% soluista, ja kasvainten painot. Fisherin testiä käytettiin vertaamaan esiintyvyys ja latenssi.

Tulokset

Krooninen subletaalit lääkehoitoa johti lääkkeen sietävä syöpäsolujen

Kliinisesti monet syöpäpotilaat hoidetaan usein kroonisesti anti-syöpähoitojen. Paras esimerkki ehkä on KML (KML) potilailla, jotka on otettava imatinibi (Gleevec) yhtäjaksoisesti vuoden ajan [47]. Lisäksi metronomisella kemoterapia – eräänlaista Chemo hallinnon ominaista usein, usein päivittäin, laajennettu antaminen pieninä annoksina tavanomaisten chemodrugs ilman merkittäviä katkoksia [48], on nousemassa vakiona terapeuttinen hoito-ohjelma moniin syöpiin. Perustuu olettamuksiin, että CSCS voi olla erityinen etu elossa terapeuttisten ja todennäköisesti soluja, jotka välittävät lääkeresistenssi, testasimme onko syöpäsoluja, jotka ovat selvinneet CHRONIC lääkehoitoa saattaa kaikilla on CSC ominaisuuksia. Ensin käsitellään DU145 eturauhassyöpä (PCa) soluja, joilla on kahdessa kliinisessä lääkkeitä, eli etoposidi (VP16) ja paklitakselin (Taxol) sekä kolme koe-lääkkeet, staurosporiini (STS), joka on irrallisia proteiinikinaasi-inhibiittorin, ja kaksi uutta syntetisoitua paklitakselin analogit joita kutsutaan WP1102 ja WP1103 (selvitä esitetä muualla). Menetelmät kuvatulla tavalla, ensin käsitelty DU145 solut nämä viisi huumeita välillä 10 pitoisuuksien 2 viikkoa määrittää ”optimaalinen” subletaalit pitoisuuksilla, joilla huumeet merkitsevästi esti kasvainsolujen laajeneminen mutta eivät tappaneet koko väestöä. Käyttämällä tätä krooninen hoitokäytäntö että ”jäljittelee” metronomisella hoito klinikalla, päätimme optimaalinen pitoisuudet, vuonna DU145 soluissa, ja VP16, paklitakselin, STS, WP1102, ja WP1103 klo 1.25 uM, 50 nM, 7 nM, 5 nM, ja 25 nM, vastaavasti. DU145-soluja viljeltiin sen jälkeen jatkuvasti, keskipitkällä sisälsi optimaalista pitoisuuksia lääkkeitä ~ 3 kuukautta. Tuloksena lääkeaineen sietävien solujen (DTC) linjat nimettiin DU145-VP16, DU145-paklitakseli, DU145-STS, DU145-WP1102, ja DU145-WP1103 soluissa, vastaavasti.

Voit selvittää huumeiden sietävä DU145 solut olivat todella suvaitsevaisia ​​alkuperäisen valinnan lääkkeitä, käsittelimme vanhempien ja huumeiden sietäviä DU145 solujen side-by-side vastaavaan viisi huumeita. Kuten on esitetty kuviossa. 1, huumeiden sietävä DU145 solut olivat yleensä kestävämpi kuin vanhempien DU145 solujen valintaan huumeita. Siten DU145-VP16-soluja 10 kertaa sitkeämpiä kuin DU145 solut VP16 (IC

50-arvot ovat 0,78 uM DU145 ja 9,17 uM DU145-VP16 solut). DU145-Paklitakseli solut olivat noin 7 kertaa enemmän resistenttejä paklitakselia kuin DU145-solut (Fig. 1, A ja C). Samoin, DU145-WP1103 solut olivat lähes 30 kertaa enemmän resistenttejä WP1103 kuin DU145-solut (Fig. 1 B-C). Lopuksi DU145-STS ja DU145-WP1102 solut olivat noin 1,5 ja 3 kertaa enemmän vastustuskykyisiä STS ja WP1102 vastaavasti kuin valitsematta DU145 soluja (Kuva. 1 B-C). Näin ollen ero lääkeresistenssin keskuudessa vakiintunut vikakoodit sijoittui DU145-WP1103 DU145-VP16 DU145-Paklitakseli DU145-STS≈Du145-WP1102.

A-B. Vanhempien DU145 ja huumeiden sietäviä DU145 solulinjat valitaan kahdessa kliinisessä lääkkeiden (A) tai kolme kokeellista lääkkeet (B) altistettiin, side-by-side, vastaaviin valinta lääkkeet (esim DU145-VP16 solujen VP16 ja Du145- paklitakseli soluja paklitakseli) pitoisuuksina (muuntuu logaritmi) osoitti. Y-akseli edustaa solun kasvun esto (%). C. taulukkomuotoinen esityksiä IC

50-arvot (katso Materiaalit menetelmät) ja vastaavat 95%: n luottamusväli (luottamusväli) ja DU145 solujen ja huumeiden sietävien DU145 solujen vastauksena viisi huumeiden ilmoitettu. Arvot laskettiin saadut tiedot A ja B.

Sen jälkeen, olemme alttiina DU145-VP16 soluja kolme ei-valitsemalla lääkkeitä, eli paklitakseli, STS, ja doksorubisiini (Dox). Kuten on esitetty kuviossa. 2, DU145-VP16 solut olivat enemmän resistenttejä (kuin vanhempien DU145 solut) paklitakselille (~ 4-kertainen), STS (1,5-kertainen), ja Dox (13-kertainen), mikä viittaa siihen, että DTC olivat myös ristiresistenttejä muiden valitsemalla huumeita.

DU145-VP16 soluja hoidettiin paklitakselilla (A), STS (B), ja doksorubisiini (Dox; C) pitoisuuksilla [log] ilmoitettu. Tulokset esitetään inhibitio-% ja IC

50 (D) määritettiin kuten kuviossa 1.

Käyttäen samanlaisia ​​strategioita, myös huumetukipalveluihin sietävää DLD1 paksusuoli (Fig. 3) ja UC14 virtsarakon (ei esitetty) syöpäsoluja. Vuonna DLD1 soluja, optimaalinen pitoisuudet VP16, paklitakseli, WP1102, ja WP1003 oli määritetty olevan 2,5 uM, 100 nM, 120 nM ja 100 nM, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 3, vakiintunutta DLD1-VP16, DLD1-paklitakseli, DLD1-WP1102, ja DLD1-WP1103 solut olivat resistenttejä vastaaviin valitsemalla huumeita. Lisäksi DLD1-VP16 solut osoittivat myös ristiresistenssiä paklitakselia ja Dox (Fig. 3B). Drug sietävä UC14 solut olivat yhtä vastustuskykyisiä valinnan lääkkeet (eli paklitakseli, STS, VP16, Dox, WP1102, ja WP1103), kuin vanhempien UC14-soluissa (ei esitetty).

Vanhempien ja huumeisiin suvaitsevainen DLD1 solulinjat valitaan optimaaliset pitoisuudet (katso teksti) VF16, paklitakselin, WP1102, ja WP1103, altistettiin, side-by-side, vastaaviin valintaan huumeita pitoisuuksina (muuntuu logaritmi) merkitty (A). Y-akseli edustaa solun kasvun esto (%). B. taulukkomuotoinen esityksiä IC

50-arvot ja vastaavat 95%: n luottamusväli (luottamus välein) vanhempien DLD1 solujen ja huumeiden sietävien DLD1 linjat vastauksena sekä valinta ja ei-valitsemalla huumeita.

Drug sietävä DU145 solut olivat yllättäen vähemmän tuumorigeenisemmiksi kuin vanhempien DU145 solujen

arveltu, että verosopimukset saattavat hallussaan CSC ominaisuuksia ja olla tuumorigeenisemmiksi in vivo. Suureksi yllätykseksemme, kaikki lääke sietävä DU145 soluja ihon alle (sc) ruiskutetaan NOD /SCID osoittivat paljon pienempi kasvaimen aloittamista kapasiteettia verrattuna sama määrä vanhempien DU145 soluja, mikä osoitti kasvain-aloittamisen taajuus (TIF) on ~ 1/175 (taulukko 1). Injektio määrä kasvaa vanhempien DU145 soluja, odotetusti, vähentänyt latenssi (taulukko 1). Sen sijaan, DU145-VP16-solut osoittivat TIF on ~ 1/62000, ja on 100000 solua injektoitiin kasvaimen latenssi oli yli kaksi kertaa niin kauan kuin sama määrä DU145-soluja (taulukko 1). Itse asiassa sekä DU145-Paklitakseli ja DU145-WP1103 soluja ei-tuumorigeenisiä jopa 10000 (ja DU145-WP1103) ja 100000 (ja DU145-paklitakseli) soluja istutettiin (taulukko 1). Jopa DU145-STS ja DU145-WP1102 soluja, jotka olivat pienimmät IC

50 eroja (Fig. 1 B-C), vähensi kasvainten esiintymistiheys kanssa TIF on 1/971 ja 1/45787, vastaavasti, ja pienemmät kasvaimet olivat myös havaittu (taulukko 1).

Voit selvittää kasvaimen istutuksen sivustosta saattaa olla vaikutusta tasauspyörästön tuumorigeenisyyteen havaittu, loimme GFP-tagged DU145 vanhempien ja huumeiden sietäviä DU145 solujen ja istutetaan yhtä paljon (ts , 500000) solujen ortotooppisesti selän eturauhasen (DP) on mies NOD /SCID-hiiriin. Kun koe lopetettiin 75 päivää kasvaimen solun injektiot, me havaitsimme, että DU145-VP16 ja DU145-STS-soluissa tuotettu pienempi kasvaimia kuin vanhempien DU145-solut (Fig. 4A). Itse asiassa sekä DU145-Paklitakseli ja DU145-WP1103 soluja ei-tuumorigeenisiä DP kasvaimen palautuminen malli (Fig. 4A). Merkittävää on, vanhempien DU145-solut metastasized monissa elimissä, mukaan lukien imusolmukkeiden, munuais-, haima-, maksa-, keuhko-, ja perna kun taas lääkeaineen sietävä DU145-soluja ei ollut ilmeistä, etäpesäke tahansa näiden elinten (Fig. 4B-C; tuloksia ei ole esitetty).

. GFP-merkitty vanhempien tai huumeiden sietävä DU145 soluja istutettiin (500000 solua /injektio), 50% Matrigel, DP NOD /SCID-hiirissä. Kaikki eläimet lopetettiin 75 päivää implantaation. Näkyy ovat kasvaimen esiintymistiheys ja kasvainten painot (keskiarvo ± S.D; tilastoja ei sovelleta johtuen suhteellisen vähän eläimiä). B-C. Edustavia kasvain ja urut otetut kuvat kasvain eläin DU145 (B) ja DU145-VP16 (C) ryhmä, vastaavasti. Kaikki kuvat hankittiin käyttäen Nikon microdissecting epifluoresenssimikroskooppia 0,75 × ja kehystetty alue B (keuhkoissa GFP kuva) edustaa laajentumista osoittavat GFP

+ paikkoja keuhkoissa.

Huume- suvaitsevainen DLD1 solut osoittivat myös vähensi kasvainten muodostumiseen taas huumeiden sietävä UC14 solut osoittivat lääkkeen riippuvia muutoksia kasvaimeen aloittamista kapasiteetin

Voit selvittää alennetun tuumorigeenisyyteen liittyy lääkeresistenttiä solujen rajoittaa vain DU145 soluihin, me samalla pistetään, sc, yhä useammat vanhempien DLD1 ja neljä huumeisiin sietävä DLD1 solulinjojen kohdalla NOD /SCID-hiiriin. Kuten taulukosta S1, huumeiden sietävä DLD1 solujen käyttöön, vaikka näytetään samanlainen kasvaimen esiintymistiheys, regeneroitu huomattavasti pienempiä kasvaimia verrattuna vanhempien DLD1 soluihin samaan soluun numeroita.

suorittaa samanlaisia ​​rajoittavan laimennuksen kasvain kokeiluja 6 huumeiden valittu UC14-soluissa (taulukko S2). Toisin kuin huumeiden sietävä DU145 ja DLD1 soluja, jotka yhtenäisesti osoittaneet pienentää Tuumorigeenisuustutkimuksissa, 4 6 lääkkeen sietävä UC14 soluissa (taulukko S2; varjostama ruskea) osoitti parannettu kasvaimeen uusiutumiskyky verrattuna sama määrä vanhempien UC14 soluja. Kiinnostavaa kyllä, kaksi huumeiden sietävä UC14 solulinjoja myös regeneroida paljon pienempiä kasvaimia kuin saman määrän vanhempien UC14 soluja (taulukko S2; varjosti vaaleanpunainen). Nämä tulokset osoittavat, että lääke sietävä UC14 solut ovat joko enemmän tai vähemmän tuumorigeenisia kuin vanhempien soluja, riippuen alustavan valinnan huumeita.

Drug sietävä DU145 solut olivat vähemmän proliferatiivinen ja näytti alhainen kloonaustehokkuuden

Koska se oli melko odottamatonta, että jotkut huumeiden sietävä syöpäsolut oli vähentynyt kasvaimeen uudistava kapasiteetti, me myöhemmin keskittyneet huumeiden sietävien DU145 solujen yrittää paljastamaan mahdollisia mekanismeja. Olemme johdonmukaisesti havaittu, että useimmat huumeiden sietävien DU145 solut näyttivät lisääntyä hitaammin verrattuna DU145 soluihin. Itse asiassa prospektiivisessa 10 päivän kokeilu mitataan elävien solujen määrä, havaitsimme, että kaikki lääke sietävien DU145 soluihin, paitsi DU145-WP1102 soluja, osoitti paljon pienempi päätepisteen elävien solujen määrä (Kuva. 5A), mikä viittaa siihen, että verosopimukset olivat vähemmän proliferatiivinen ja /tai herkempiä solukuolemaa. Sitten suoritettiin BrdU kokeita suoraan solujen proliferaation mittaamiseen. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, huumeiden sietävä DU145 solut osoittivat alempi proliferatiivinen indeksit (ts% BrdU

+ solut). Mielenkiintoista, jopa DU145-WP1102 soluista osoitti alempaa proliferatiivinen indeksi (kuvio. 5B), vaikka nämä viljelmät osoittivat samanlaisia ​​yhteensä elävien solujen numeroita vanhempien DU145 soluihin (Fig. 5A). Muista, että DU145-WP1102 soluissa näytetään myös suhteellisesti vähemmän väheneminen kasvaimen aloittamista kapasiteettia verrattuna muihin huumeisiin sietävä DU145 soluissa (taulukko 1). On mahdollista, että DU145-WP1102 solut lisääntyivät vähemmän, mutta oli myös vähemmän spontaaneja solukuoleman, mikä johtaa vastaavien päätepisteenä elävien solujen määrä (Kuva. 5A) ja vähäisempää pienenemistä kasvainten muodostumiseen (taulukko 1). Todellakin, me jatkuvasti havaittu, että DU145-WP1102 solut, kroonisesti valittu 5 nM WP1102 yhdiste, osoitti vähemmän kelluva ja apoptoottisten solujen dosviljelypulloihin verrattuna DU145-WP1103 soluja (ei kuvassa), joka oli kroonisesti valittu 25 nM WP1103 yhdistettä. Lopuksi, havaitsimme, että kaikki lääke sietävien DU145 solujen osoitettiin alempi kloonaustehokkuudet kuin vanhempien DU145 solut (Fig. 5C).

. Kvantifiointi määrä eläviä soluja. Parent ja huumeiden sietäviä DU145 solut levytettiin, neljänä, 12-kuoppalevyillä (5000 solua /kuoppa) ja elävät solut kvantitoitiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä 10 päivää postitse pinnoitus. B. kvantitointi% BrdU

+ soluja (katso Materiaalit Methods). C. määritys kloonaustehokkuuden. Parent ja huumeiden sietäviä DU145 solut levytettiin, neljänä, 6-kuoppalevyille (100 solua /kuoppa) tuoreella elatusaineella täydennettiin joka 3. päivä. Lukumäärät holoclones ja meroclones määritettiin 10 päivää postitse pinnoitus. Kaikkiaan tiedot, edustavat keskimäärää ± SD ja tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Student

t

-testi (*, P 0,05; **, P 0,01).

yhdenmukainen alentunut solujen lisääntymistä, huumeiden sietävä DU145 solut osoittivat kohonneet kaksi sykliiniriippuvainen estäjät, p21 ja p27, erityisesti DU145-Paklitakseli ja DU145-WP1103 soluja (Fig. 6A), kahdessa solulinjassa että niistä puuttuivat kokonaan kasvainten muodostumiseen (Pöytä 1). P27-tasot kohonneet myös kaikissa kolmessa muiden huumeisiin sietävä DU145 solulinjoissa (Fig. 6A). Kiehtovan, merkittävästi lisääntynyt p27-proteiinin nauhan DU145-Paklitakseli ja DU145-WP1103 vaeltaneet solut hieman nopeammin kuin proteiinin muissa solulinjoissa (Fig. 6A). Jatkotutkimuksissa selventää tämän mahdollisesti mielenkiintoinen havainto. Toisin kuin p21 ja p27, Bcl-2, anti-apoptoottisen proteiinin, osoitti vähemmän, vaikkakin dramaattinen pienenee jälleen, että kaksi ei-tuumorigeenisiä DU145 riviä, eli DU145-paklitakseli ja DU145-WP1103 (Fig. 6A).

. Kokosolulysaatti solusta eri ilmoitettu käytettiin Western blotting p21, p27, Bcl-2, ja hTERT ja blotti uudelleenseulottiin ja β-aktiini. NS, ei-spesifinen. B. Western blotting of CD44 ja ABCG2. Blotti uudelleenseulottiin varten β-aktiinin ja GAPDH. CD. DU145 ja huumeiden sietäviä DU145 solut maljattiin lasipeitinlevyille ja värjättiin CD44 käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta. Esitetyt tulokset edustavat kuvia (C) ja määrällisesti CD44

+ soluissa (D; keskiarvo ± SD, *, P 0,01).

Drug sietävä DU145 kulttuureissa oli vähentynyt määrä, tai puuttui, CD44

+ solujen

Useat todisteet viittaavat siihen, että alentunut kasvaimeen uudistava kapasiteettia huumeiden sietävä DU145 soluja voi käsittää lisäksi vaarantua proliferaatiopotentiaali ehkä välittyy lisääntynyt p21 ja p27, lääkkeen aiheuttama vikoja kasvaimen aloittamista soluihin. CD.