Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) luettelointi lupaa olla tärkeä kliinisen lopputuloksen ennustajana joukolle syöpiä. Perustettu CTC luettelointi käsittää pääosin luottaa Affiniteettisieppausreaktiot solun pinnan antigeenejä, ja on arvosteltu aliarviointiin CTC numeroiden vuoksi antigeenistä bias. Kehittyvät CTC kaapata strategioita tyypillisesti erottavat nämä solut perustuen niille oletettu biomekaaniset ominaisuudet, joita usein validoitu käyttäen viljeltyjä syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa kehitimme työkalu tutkia morfologisten ominaisuuksien CTC potilaista, joilla kastraatiotason kestävä eturauhassyövän ja viljellyt syöpäsolujen selvittääkseen, onko jälkimmäinen on sopiva malli entisen. Olemme eristäneet molemmat CTC ja viljellyt syöpäsolut kokoverestä käyttäen CellSearch® ja tarkasteltiin eri cytomorphological ominaisuudet. Toisin viljeltyjen syöpäsolujen, CTC rikastetaan CellSearch® järjestelmän havaittiin olevan huomattavasti pienempiä, suuremman ydin-sytoplasmisen suhde, ja pitkänomainen muoto. Nämä CTC myös havaittu olevan huomattavasti enemmän vaihtelua kuin viljellyt syöpäsolut ydin–sytoplasman suhde ja muoto profiilin.

Citation: Park S, Ang RR, Duffy SP, Bazov J, Chi KN, musta PC, et al. (2014) Morfologiset erot Kiertävä syöpäsolujen eturauhassyöpäpotilaalla ja viljellyissä syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (1): e85264. doi: 10,1371 /journal.pone.0085264

Editor: David T. Eddington, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2013; Hyväksytty 25 marraskuuta 2013 Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Kanadan, Kanadan Institutes of Health Research, eturauhassyöpä Kanada, Vancouver eturauhasen keskuksen translaatiotutkimuksen aloite Nopeutettu Discovery ja kehitys, Engineers-in-Scrubs koulutusohjelma UBC, Terry Fox Research Institute , ja palkinnon Movember Global Action Plan (GAP) Eturauhassyöpä biomarkkereiden Initiative. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat vahvistavat, että toinen kirjoittaja Peter Black on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) ovat sekaantuneet mahdollisina siemeniä syövän etäpesäkkeiden ja ovat siksi suuri merkitys tutkimukseen, sairauksien hoidossa, ja lääkekehityksen [1] – [3]. Vakiintuneita menetelmiä syömällä näitä soluja, kuten Veridex CellSearch® järjestelmän (Raritan, NJ, USA), luottaa Affiniteettisieppausreaktiot epiteelin solun pinta-antigeeni, EpCAM, minkä jälkeen fluoresenssin merkintöjä solunsisäisen sytokeratiini (CK) [4] – [ ,,,0],6]. Vaikka CTC tunnistaminen ja luettelointi, joka perustuu epiteelin biologisten merkkiaineiden ilmentymisen, voidaan käyttää ennustamaan huono kliiniseen tulokseen [7] – [10] Tämä strategia voi olla altis aliarviointiin CTC määrän takia epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon [11] – [ ,,,0],14], huono ilmentyminen nämä tekijät joissakin kasvaintyypeissä [14], tai ilmentymisen muutosten näiden tekijöiden kemoterapian jälkeen [15]. Nämä rajoitukset voivat olla erityisen tärkeää, kun otetaan huomioon, että ulkonäkö mesenkymaalisten CTC liittyy taudin etenemiseen [16] ja sisällyttämällä lisäarviointiperusteita CTC tunnistaminen voi olla arvokas lisä perinteisiin CellSearch® CTC luettelointia.

Lisäksi niiden ilmentyminen kasvaimen antigeenien, se on yleisesti hyväksytty, että CTC on erilaiset biomekaaniset ominaisuudet, mukaan lukien suuremman koon kuin leukosyytit, suurempi ydinvoiman sytoplasman (N: C) suhde, sekä erilliset ydin- morfologia [17]. Lukuisia strategioita on kehitetty rikastamiseksi CTC perusteella näitä ominaisuuksia [18]. CTC on eristetty käyttäen heysgradienttisentrifugoinnilla [19] tai koon, käyttämällä mikrohuokoinen suodatus [20] – [22]. Viime aikoina mikrofluidinen teknologiat ovat saavuttaneet erinomaisen CTC talteenottotehokkuutta ja rikastukseen lähestymistapoja kuten hydrodynaaminen kromatografia [23] – [28], mikrofluidinen suodatus [29] – [31], ja dielektroforeesin [32] – [35]. Kehittäminen näiden teknologioiden tyypillisesti käytetään viljeltyjä syöpäsoluja kuin morfologinen mallina kliinisen CTC. Kuitenkin, kun taas syöpäsoluissa, ja joissakin CTC on yhteisiä biofysikaalisten ominaisuuksien [17], CTC voi esiintyä erillisenä morfologiset ominaisuudet, riippuen siitä, minkä tyyppistä peräisin kasvaimeen [36]. Vaihtoehtoinen strategia olisi sisällyttää biomekaaniset luonnehdinta kanssa vakiintuneemmat antigeenipohjainen CellSearch® CTC luettelointia strategiaa.

kehitti ohjelman analysoida cytomorphological ominaisuuksia syöpäsoluja. Käytimme tätä työkalua tutkia sekä potilaan CTC ja malli tasyöpäsolulinja morfologia, seuraavien CellSearch® rikastamiseen. Nämä tulokset antavat tärkeää tietoa apuna CTC yksilöinti yhdistetyn antigeenin ja biomekaaniset perusteet [36] sekä valitsemalla sopivat mallit optimoimiseksi biomekaaniset CTC rikastamiseen.

Materiaalit ja menetelmät

verinäyte Collection

verinäytteet terveiltä luovuttajilta ja Metastasoivassa kastraatiotason resistenttejä eturauhassyöpä (CRPC) saatiin kirjallinen lupa ja kerätään protokollia hyväksymä UBC Clinical eettinen Review board (http: //tutkimus. ubc.ca/ethics/clinical-research-ethics-board). CRPC potilaiden mukana tässä tutkimuksessa olivat ikä, 53-83 vuotta, ja PSA-arvot, +21,1-2200 ug /L (taulukko S1). Verinäytteet molemmissa tapauksissa kerätään ja tallennetaan CellSave® Vacutainer putkilla (Becton Dickinson, Raritan, NJ).

eristäminen ja leimaus CTC tekijänä CellSearch

CTC eristäminen ja luettelointi tehtiin käyttämällä CellSearch® järjestelmä kuten aikaisemmin on kuvattu [4], [5], [37]. Lyhyesti, otettiin verinäytteet 10 ml: CellSave Vacutainer putkilla (Becton Dickinson), joka sisältää omaa antikoagulanttia ja säilöntäaine. Näytteitä pidettiin huoneenlämmössä ja käsitellään 48 tunnin keräämisen jälkeen. CellSearch® järjestelmä tallentaa EpCAM ilmentävien solujen käyttäen vasta-päällystettyjä magneettisia helmiä ja sitten tarrat nämä solut fluoresoivat väriaineet, kuten DAPI, CD45, ja sytokeratiineja, jotta voidaan erottaa mahdollisia CTC leukosyyteistä. Sen jälkeen immunomagneettisia talteenotto ja fluoresenssivärjäyksellä, kuvia ehdokas CTC saadaan brightfield ja kolme fluoresenssikanavan (DAPI, CD45, ja sytokeratiineja). Otetut kuvat segmentoidaan useaksi pienemmäksi kuvia, joista kukin sisältää yhden solun ja koota uudelleen paneelin ohjelmisto. Lopuksi sertifioitu teknikko positiivisesti tunnistaa CTC tarkistamalla koon, muodon, ja fluoresenssin voimakkuus kunkin ehdokkaan solun.

Soluviljely ja käsittely

Ihmisen eturauhassyöpä solulinjojen LNCaP (ATCC: CRL-1740), DU145 (ATCC: HTB-81), ja C4-2 (ATCC: CRL-1595) kasvatettiin viljelmässä käyttäen RPMI-1640-alustassa (HyClone, Logan, UT) ja 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C 5% CO

2. PC3 (ATCC: CRL-1435) solujen viljeltiin samalla, mutta käyttäen DMEM (HyClone, Logan, UT) väliaine sijaan. Viljellyt syövän solut oli lisätty 7,5 ml verta terveen luovuttajalta CellSave® Vacutainer putkiin ja käsitellään 48 tunnin kuluessa samalla kun potilas yksilö.

Kuvankäsittely

tutkia morfologian CTC ja viljellyt syöpäsolut, me viedään kuvat yksittäisten solujen CellSearch® järjestelmään ja analysoidaan ne käyttämällä ohjelmisto kehitimme avulla LabView (kuva S1, National Instruments, Austin, TX). Kuvat olivat neliömatriiseja joiden koot vaihtelevat 80-200 pikseliä ja alustettu Portable Network Graphics (PNG) tiedostot 8 bittinen mono tai 24 bittinen väri komposiitit (kuva S1). Jotta laskettu alue pikseliä, että kuvat ovat aluksi työstää käyttäen klusterin kynnysarvovalvonta havaita kirkkaita kohteita vastaamaan automaattisen valotuksen suorittaa CellSearch® (kuva 1A). Hiukkaset pikseleitä kosketuksessa reunan kuvakehyksen poistettiin käyttäen rajan hylkääminen hiukkassuodatin poistaa soluihin epätäydellisesti rajaamalla kuvat (kuva S1). Multi-hiukkasten kuvia myös eliminoitu vedenjakaja segmentointia. Roskat partikkelit poistettiin käyttäen kahta-toistojen on 3 x 3 eroosiota hiukkassuodatin. Solujen ja ydinvoiman koko määritettiin laskemalla edellä kynnyksen pikselien sytokeratiinia ja DAPI kanava vastaavasti. Tulokset solun ja ydin- koon laskenta oli suodatetaan solujen kanssa epätodennäköistä ydin- koot, jotka määrittelemme ydinvoiman ala on yli 95% solun alueella. Nämä käsittelyvaiheet hylättiin 209 ulos 732 kuvia tai 28,5% kokonaismäärästä. Suurin osa hylätään sisältämien kuvien solufragmenteissa tai huonolaatuisia kuvia (kuva S2).

Labview ohjelmisto toimii toimintojen sarja suurten vaihtelevassa mages aineistoja tarjoamia CellSearch® järjestelmän. Kaksi rinnakkaista suodatus ja mittauksia, kuten laskemista alue pikseliä (A) ja arvioimalla parhaiten sopivan ellipsin (B) suoritetaan optimaalisen suorituskyvyn ja tulosten.

epäkeskisyys Cell Shape Measurement

analysoimiseksi epäkeskisyys solun muoto, ellipsin sovitettiin ääriviivat solun. Katsaus arvioida parhaiten sopivan ellipsin käyttäen LabView ohjelmistoa esitetään kuviossa 1B. Toteamisen tehostamiseksi solun ääriviivat, kuvat olivat varjoainetehosteisiin ennen automaattista kynnystys. Kolme iteraatiota 3 x 3 eroosion suodatin, sekä yhden Venytys suodattimen suoritettiin tasoittaa reunat hiukkasia. Asennus suoritettiin binary kuvaa käyttäen ääriviivat jäljittämisestä tapa etsiä pisimmän ellipsin kehän sisällä kuva (kuva S1). Asennuksen jälkeen ellipsin tulokset olivat visuaalisesti toiminnanharjoittaja vahvistanut. Kvantifioimiseksi epäkeskisyys solun muodon, laskimme elongaatiotekijä (EF), joka määritellään suhde suurten ja pienten akselit parhaiten sopivan ellipsin.

Koko Measurement kalibrointi

kalibroida koko mittauksia CellSearch® kuvia, me mitataan erikseen koko viljeltyjen syöpäsolujen suspensiossa käyttämällä CEDEX XS kuvattavan-pohjainen solujen analysaattori (Roche, Saksa). Kasvanut viljellyt syöpäsolut trypsinoidaan ja suspendoidaan uudelleen elatusaineeseen. Solujen määrä arvioitiin käyttäen 1:01 laimennusta solususpensiota trypaanisinistä (Gibco, Grand Island, NY). 10 ui solususpensiota ladataan Smart Slide (Roche, Saksa), ja sitten lukea mitata solun halkaisija. Muunnoskerroin pikselien mikrometreihin voidaan määrittää käyttäen seuraavaa yhtälöä,

koko CTC potilasnäytteistä arvioitiin tuotteiden muuntokerroin ja alueen CTC mitattuna CellSearch® kuvia.

Nuclear sytoplasmiset ratio mittaus

ydin- sytoplasman suhde määritellään suhde ydin- alueen (A

N) sytoplasmista (A

C) alueella, missä A

C katsotaan alueeksi solun ilman

N.

näytteiden valinta

CTC analysoitu tässä tutkimuksessa saatiin lähtötason verinäytteistä suostumuksensa potilaiden diagnosoitu metastaattinen kastraatio kestävä eturauhassyövän jotka olivat kemoterapia-naiivi ja otettiin kiinni satunnaistetussa vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa uusi agentti [38]. Keräsimme kaikki kuvat osoittavat DAPI + CK + CD45- tapahtumia, jotka tunnistettiin CellSearch® varten mukana 83 otettu tutkimukseen. Todennäköisyyden perusteella, että pieni osa näistä tapahtumista edustaa laillinen CTC me rajoitettu analyysimme 19 potilasta, joilla oli 40 DAPI + CK + CD45- tapahtumia. Kolme näistä potilaista edelleen suljettu pois, koska alhainen kuvien laatua. CTC luettelointi oli itsenäisesti määritettiin loput 16 potilasta, jonka CellSearch® valtuuttama teknikko ja laskee vaihteli 11-106 CTC /7,5 ml, joiden mediaani 41,5 CTC /7,5 ml. Kun jätetään sopimattomat kuvat (kuva S2), koska niitä ei voida tulkita meidän ohjelmisto, yhteensä 523 CTC eturauhassyöpään potilaista analysoitiin yhdessä 800 viljeltyjen syöpäsolujen neljästä eturauhassyövän solulinjoissa.

tulokset ja keskustelu

Solun koko

Analysoidaan kuvia solujen käsiteltiin käyttämällä CellSearch® järjestelmää ja kalibroitu standardin mikroskoopilla, huomasimme huomattavan suuria eroja eturauhassyövän CTC ja viljellyt syöpäsolujen (kuvio 2 ). Erityisesti, keskimääräinen halkaisija CTC vangiksi CellSearch®, keskuudessa 16 potilasta, on hieman yli puoli, että viljeltyjen syöpäsolujen, jossa 7,97 ± 1,81 um ja CTC ja 13,38 ± 2,54 um viljeltyjen syöpäsolujen (p 0,001), vastaavasti . Vaikka Coumans ja työtovereiden [21] palveluksessa mikrohuokoisesta suodatus strategia rikastumista sekä syöpäsolun linjat ja potilaasta johdettujen CTC, ne tunnettu biomekaaniset ominaisuudet saman EpCAM

+ CK

+ CD45

– CTC väestön esitetty tässä tutkimuksessa. Niiden analyysi kertoi, että eturauhasen CTC olivat pienempiä kuin rinta- tai kolorektaalisyövän, he kuitenkin arvioitu, että eturauhassyövän CTC olivat -25% suurempi kuin nykyinen raportti. Vaikka tämä ristiriita voi edustaa solujen stressiä määrätty näytteen käsittely Immunocapture nykyisessä tutkimuksessa, ja Micropore suodatus, entisessä, tämä ero voi myös ovat aiheutuneet erilaisia ​​strategioita käytetään mittaamaan solun kokoa. Coumans käytettiin Coulter pipetin koon kalibrointi, joka oli epätarkempi kuin kuva-analyysi pienille pituusskaala ( 10 pm) kokoarvioita. Lisäksi meidän arvio solun halkaisija on yhdenmukainen pieni keskimääräinen soluvolyymiä raportoineet Ligthart ja työtovereiden [36], sekä toinen tuore tutkimus osoittaa LNCaP koko solun alueella on 1,6 kertaa suurempi kuin EpCAM

+ CK

+ CD45

– eturauhassyövän CTC [39]. On myös mielenkiintoista huomata, että optimaalinen huokoskoko käytetty aiemmissa tutkimuksissa suodatukseen perustuvan kaapata CTC oli 8 um, joka on sama kuin meidän arvioitu solujen halkaisija 7,97 um [21], [22], [29], [40] . Micropore suodatus strategiat ovat raportoitu jopa 90% CTC talteenotto [40], mutta on suhteellisen huono näytteen puhtauden [41] kantavassa samankaltaisuus kooltaan CRPC CTC tutkittu tässä tutkimuksessa ja valkosoluja, tämä voi edustaa olennainen rajoitus suodatuksen perustuvia strategioita . Tämä rajoitus voidaan mahdollisesti voittaa virikkeellistämisstrategioita jotka yhdistävät CTC rikastaminen perustuu yhdistelmään solukoko ja muovattavuuden [29] – [31].

keskimääräinen halkaisija CTC (7,97 pm) oli huomattavasti pienempi kuin viljellyt syöpäsolut (13,38 gm) (p 0,001).

Pidimme myös mahdollisuutta meidän potilaiden valintakriteerejä (CTC count 40) on saattanut vääristää suuremman määrän pienempiä CTC. Kun valittu potilaat olivat kemoterapia-negatiivinen, he olisivat osallistuneet eri hoitomuotojen ja edustaisi potilaiden loppuvaiheissa tauti. Johtuen nämä tai muita ainutlaatuisia fysiologisia rasituksia sisäpuolella potilaan kohortin, varovaisuutta tulee noudattaa yleistäen nämä tulokset kaikille CRPC CTC. Emme kuitenkaan havaittu mitään korrelaatiota CTC solukoko ja solujen määrä (taulukko S1 ja kuvio S3), jotka muuten viittaa siihen, että taudin vakavuus vaikuttaa solun kokoa. Mielenkiintoista, kun taas muut tutkimukset ovat korkea heterogeenisyys CTC solukoko [21], [36], [42], [43], meidän koko arvio perustuu mikroskooppinen analyysi osoitti, että potilaiden välinen vaihtelu keskiarvon solun koko oli melko pieni, jotka vaihtelevat 7,05 um 8,94 um mediaani 8,04 mikrometriä. Lisäksi nykyisin hyväksytty kriteeri, jota CellSearch® järjestelmä vahvistaa CTC on, että niiden koon tulee olla suurempi kuin ympäröivät valkosoluja [17]. Kuitenkin tämä koko määritelmä pitkälti määritellään perustuen CTC johdettu rintasyövän [44] – [47], joiden keskimääräinen solun halkaisija 13,1 pm [21]. Havaintomme että CTC potilaista, joilla CRPC ovat huomattavasti pienempiä (~8 pm) viittaa siihen, että nämä tavanomaiset kriteerit CTC tunnistamista voi aliarvioida todellista CTC määrä.

Vastaavasti meidän havainto, että eturauhassyövän EpCAM

+ CTC ovat jatkuvasti pienemmät kuin viljellyt syöpäsolut mahdollisesti tärkeä syntymässä merkkivapaalla CTC virikkeellistämisstrategioita. Ensinnäkin, rikastaminen CTC koon perusteella yksinään voi olla rajoitettu tehoa pyyntiin pienempien CTC löytyy CRPC potilaille, koska ne eivät ole yhtä selvästi discriminable potilaasta leukosyyteistä. Kun taas suuremmat syöpäsolut käytetään tyypillisesti tehokkuuden osoittamiseksi näiden tekniikoiden, kuten HELA ( 20 um), LNCaP (18 pm), MCF-7 ( 15 um), MDA-231 (15 um) [21 ], [48], [49], viljeltiin syöpäsolut, kuten L1210 hiiren lymfooma-soluja (10 um), jolla on pienempi halkaisija, voi edustaa paremmin malleja CTC rikastamiseen [31], [50], [51]. Toiseksi panos nucleoplasm soluun jäykkyys on 10 kertaa suurempi kuin sytoplasmassa [52]; CTC virikkeellistämisstrategioita että talteenotto CTC koon perusteella ja muodonmuutoksenkestoa voi osoittautua parempia kuin tuollainen koon perusteella yksin.

Cell Shape

käyttö viljeltyjen syöpäsolujen piikkeinä vereen terveistä luovuttajien voi mallintaa erottaminen näiden solujen hematologiseen soluja, jotka eroavat solukoko mutta yhteinen esikäsittelyssä näiden solujen trypsiinillä, niiden erottaminen toisistaan ​​kudosviljelypulloista, tai näytteen käsittely käyttämällä CellSearch Affiniteettisieppausreaktiot strategia voi myös vaikuttaa huomattavasti solun muoto. Kautta vertailu trypsinoitiin viljeltyjä soluja ja CRPC CTC jälkeen CellSearch® CTC rikastamiseen, me arvioitava, ovatko kyseiset viljellyt solut ovat sopivia malleja potilaasta johdettujen CTC. Toisin kuin viljellyt solut, jotka olivat yleisesti ottaen muodoltaan pyöreä, CTC esillä merkittävää muodon vaihtelu on monia soluja, joilla on enemmän pitkänomainen muotoinen (kuva 3). Kvantitoimme epäkeskisyys solun muodon käyttämällä venymän (EF), joka on määritelty suhde suurten ja pienten akselit parhaan sovituksen ellipsin. Kuten on esitetty kuviossa 4A, CTC oli huomattavasti enemmän pitkänomainen kuin viljellyt syöpäsolut, joiden keskimääräinen mediaani EF 1,27 verrattuna 1,17 viljeltyjen syöpäsolujen (p 0,05). Tämä havainto on yhdenmukainen muiden tutkimusten, jotka raportoivat merkittävistä pleomorhpism joukossa CTC [21], [36], [42], [43]. Yksi mahdollinen syy monimuotoisuuden solujen morfologia on apoptoottisia tapahtumia liittyy CTC levittämiseen [53]. Kuitenkin cytomorphological havaitut muutokset CTC voi edustaa toiminnallisia muutoksia, jotka liittyvät vuorovaikutukset CTC ja endoteelin tai solujen pidentymisen verisuonitauteihin liittyvän liikenteen [54], [55]. Mielenkiintoista, cytomorphological poikkeavuus CTC on heikkoihin kliinistä tulosta metastaattisen rintasyövän, peräsuolen ja eturauhasen syöpä. [36].

CTC oli huomattavasti pienempi kuin viljellyt syöpäsolut (A-D). Viljellyt syöpäsolut olivat pääosin pyöreä säännöllisesti solujen ja ydinvoiman muotoja. Tuma tyypillisesti keskitetty ja ympäröivät sytokeratiinia (E-L). CTC näytteillä erittäin vaihteleva muodot, kuten pyöreä (E), ovaali (F), pitkänomainen (G-J), ja klusterit (L). Non-pyöreä ja multi-nukleoitumaan soluja havaitaan joskus (G-K). Keltainen Mittakaavapalkki on 5 pm pitkä.

V: Pidennys tekijä (EF) on CTC eturauhassyöpään potilaista verrattuna viljeltyjen syöpäsolujen. Mediaani EF CTC oli yleensä suurempi merkittäviä yksilöiden välisiä ja potilaiden välillä. B: Nuclear soluliman (N /C) suhteet CTC eturauhassyöpään potilaista verrattuna viljeltyjen syöpäsolujen. Mediaani ylä- ja alakvartiilit esitetään jokaisesta näytteestä. Mediaani N /C-suhde CTC oli yleensä suurempi merkittäviä yksilöiden välisiä ja potilaiden välillä.

Nuclear Sytoplasmiset Ratio

ydin- sytoplasman suhde (N /C) määritellään suhteena näennäinen ydin- alueen ja ilmeinen solun alueen ydin vähennetty. Verrattuna viljellyt syöpäsolut, CTC odotetaan olevan suurempia N /C, koska niiden pienemmän solukoko ja todennäköisesti suurempi ydinvoiman koko johtuu mahdollisten kromosomipoikkeavuuksien. Löysimme mediaani N /C kaikille viljellyt syöpäsolut olevan 1,12, kun keskiarvo mediaani N /C-suhde päässä CTC potilaiden, rikastaa CellSearch® järjestelmä on 1,43. Tämä havainto korostaa entisestään potentiaalisen tehon muodonmuutoksenkeston-pohjainen CTC rikastamiseen, kuten nucleoplasm edistää 10-kertaisesti enemmän soluun jäykkyys kuin ei sytoplasmaan [52]. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 4B, CTC osoitti merkitsevästi enemmän N /C vaihtelua kuin viljellyt syöpäsolut. Ottaen huomioon, että N /C-suhde on CTC korreloi huonon ennusteen tulos [36], voidaan spekuloitu, että tässä heterogeeniseen populaatioon, on solualapopulaatioiden enemmän metastaattista potentiaalia. Jos näin on, niin ehkä enemmän kyseisen toimenpiteen tautinsa on määrä tietyn ala- populaation CTC eikä lasken kaikki CTC käytettynä nykyisin [9], [56].

Cell Kutistuminen

Yksi liittyneistä mittaamalla solun kokoa käyttäen CellSearch® järjestelmä on myös tallentamalla solun näytteitä CellSave® putkien muuttaa solun koon ja tumassa. Tutkia, vertasimme viljellyt syöpäsolut piikkeinä vereen terveiltä luovuttajilta käsitellä heti samalla solut käsitellään 48 tunnin varastoinnin jälkeen. Solun halkaisija havaittiin vähenevän ~6%, kun taas ydin halkaisijan havaittiin vähenevän -10% 0-48 tuntia (kuvio 5). Tämä tulos antaa arvion vaihtelua mitatun solumorfologian parametrit aiheutuvat näytteen säilytysaika, mutta ei voi selittää huomattavia eroja morfologian CTC ja viljeltyjen syöpäsolujen tai vaihtelu löytyi kussakin CTC näytteessä.

V: halkaisija viljeltyjen syöpäsolujen laski ~6% keskimäärin. B: n ydinalan halkaisija viljeltyjen syöpäsolujen laski -10% keskimäärin.

Johtopäätös

Yhteenvetona CTC eristettiin kastraatiotason kestävästä eturauhassyöpäpotilaille käyttäen CellSearch® järjestelmää olivat pienempiä, pitkänomainen muoto, ja sillä oli suurempi N /C verrattuna viljellyt syöpäsolut. CTC osoittivat myös merkitsevästi suurempaa vaihtelua muodon ja N /C. Kun järjestelmä vain kaappaa EpCAM-korkea soluja, CTC kuvia CellSearch® luettelointi on laajalti saatavilla ja tämä analyyttinen strategiaa voitaisiin soveltaa tunnistaa ominaisia ​​morfologisia piirteitä CellSearch® rikastettua CTC. Morfologiset erot viljellyt solulinjat ja CTC on otettava huomioon suunnittelussa ja testauksessa laitteita, jotka eristää CTC in tarra-vapaa muoti perustuva cytomorphological kriteereihin.

tukeminen Information

Kuva S1.

Screen-laukaus LabView® kehittämä ohjelma analysoida kuvia saatu CellSearch® järjestelmään. Ohjelma hankkii kuvia kunkin CTC ehdokasta. Valittu kuva (korostettu keltaisella) analysoidaan mitata alue pikseliä. Ellipsillä on asennettu tämän kuvan ja päällysti päälle alkuperäisen kuvan tarkistamiseen. Parametrit välikuva käsittelyvaiheiden sekä tilastot koko kokoelman näkyvät myös.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085264.s001

(DOCX) B Kuva S2.

Hylätty kuvia solufragmenteissa CTC tunnistaminen. Nämä kuvat solufragmenteissa yleisesti ilmestyi aikana kuva-analyysin ja ei sisälly CTC count tai solun koon mittaukset. Tyypillisiä CTC fragmentteja ovat ydin osittain katettu sytokeratiini-, tai ydin täysin erillään sytokeratiinia. Nämä fragmentit todennäköisesti peräisin CTC apoptoosin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085264.s002

(DOCX) B Kuva S3.

Solun koko vs. CTC count. Ei näyttänyt olevan mitään korrelaatiota CTC solukoko ja solumäärä varten CTC tunnistaa CellSearch mistä Metastasoivassa kastraatiotason kestävä eturauhassyöpää. Solukoko vaihteli 6,9 um 8,95 m; kun CTC count vaihteli 11 106.

doi: 10,1371 /journal.pone.0085264.s003

(DOCX) B Taulukko S1.

Potilastiedot yhteenveto. Kaikki potilaat diagnosoitiin metastaattinen kastraatio resistenttejä eturauhassyöpä (mCRPC). Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota PSA ja koko CTC.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085264.s004

(DOCX)