Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Expression tasot

miR-146b-5p

ja

-3p

MikroRNA ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) liittyvät taudin uusiutumista leikkauksen jälkeen. Tämän ymmärtämiseksi vaikutus

miR-146b

yliekspressio tutkittiin A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja.

Methods

A549-soluja, suunniteltu kanssa lentiviruksia yli-ilmentymisen ihmisen

pre-miR-146b

esiaste microRNA, tutkittiin leviämisen, pesäkkeiden muodostumista muovin pintaan ja pehmeässä agarissa, muuttoliike ja invasiivisuus soluviljelmässä ja in vivo hiirillä, kemosensitiivisyys sisplatiinin ja doksorubisiini, ja globaali geeniekspression .

miR-146b

ilmaisuja arvioitiin mikropaloitelluista strooman ja epiteelin ihmisen NSCLC kasvaimia. Association of

miR-146b-5p

ja

-3p

ilmaisun varhaisessa vaiheessa NSCLC uusiutui analysoitiin.

Keskeiset havainnot

A549

pre-miR-146b

-overexpressors oli 3-8-kertaisesti korkeampi sekä

miR-146b

MikroRNA kuin kontrollisolut. Yliekspressio ei vaikuttanut solujen lisääntymisen, kemosensitiivisyys, muuttoliike tai invasiivisuus; vaikutti vain 0,3% mRNA transcriptome; ja vähensi kyky muodostaa pesäkkeitä in vitro 25%. Ihmisen NSCLC kasvaimia, ilmentyminen sekä

miR-146b

MikroRNA oli 7-10 kertaa suurempi strooman kuin syöpä- epiteeli, ja korkeammat

miR-146b-5p

mutta pienempi

-3

p tasot olivat ennustavia toistumisen.

Johtopäätökset

Vain minimaalinen vaikutus

pre-miR-146b

ilmentymisen vaikutus pahanlaatuisen fenotyypin nähtiin A549 solut. Tämä saattaa johtua siitä vastakkaisten vaikutusten

miR-146b-5p

ja

-3p

yliekspressio ehdottivat ristiriitaisia ​​toistumisen-ennustearvojen kahden MikroRNA, tai siksi

asennuspalveli- 146b

ilmaisun muutoksia ei-syöpä strooman ja ei syöpä epithelia kasvaimista ovat vastuussa ennustetekijöiden arvon

miR-146b

.

Citation: Patnaik SK, Kannisto E, Mallick R , Yendamuri S (2011) yli-ilmentäminen Lung Cancer-Prognostiset

miR-146b

MikroRNA on minimi ja kielteinen vaikutus maligni fenotyyppi A549 Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (7): e22379. doi: 10,1371 /journal.pone.0022379

Editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 05 toukokuu 2011; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 18 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Patnaik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kesäharjoittelusta palkinnon American Association of Thoracic Surgery RM, ja palkintoja Buswell Foundation, Cancer ja Leukemia Group B, ja Torakaaliikirurgia Foundation for Research ja koulutus SY. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA ovat ultrashort ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät solujen prosessit niiden sekvenssi-spesifinen vaikutus vakauteen ja kääntäminen useiden RNA: iden (mRNA: t). Tutkimukset viime vuodet ovat osoittaneet, että on tärkeää näiden epigeneettiset säätelymolekyyleja syöpäbiologiassa [1] sekä niiden hyödyllisyys biomarkkereina tautitiloja [2]. Olemme aiemmin määrällisesti ilmentymistä MikroRNA 77 ihmisen vaiheessa I ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvaimet tunnistaa MikroRNA joiden arvot liittyvät taudin uusiutumista seuraavien poistettu kirurgisella [3]. Expression of

miR-146b

MikroRNA,

miR-146b-5p

ja

miR-146b-3p

, kasvaimissa vaihteli merkitsevästi tapaukset oli toistuminen ja ne että ei, jossa keskimääräinen

miR-146b-5p

korkeampi mutta keskimääräinen

miR-146b-3p

pienemmäksi entisessä ryhmässä. Lisäksi sisäinen rajat vahvistukset,

miR-146b-3p

todettiin usein ainesosana kuuden mikroRNA tukivektorikoneet luokittelijoiden, joka voisi ennustaa toistuminen joiden keskimääräinen tarkkuus 69%. Korkeampi ilmentymä

miR-146b-5p

ihmisen kasvaimissa todettiin myös olevan yhteydessä huonoon eloonjäämiseen vaiheessa I-III NSCLC tutkimuksessa, joka keskittyi levyepiteelisyövän lajike taudin ei ollut tutkittu

miR-146b-3p

[4]. Sitä paitsi keuhkosyöpä, korkeamman tason

miR-146b-5p

kasvaimissa liittyy myös entistä pahanlaatuinen sairaus ihmisen papillaarinen kilpirauhassyövän [5].

Ihmisillä sekä

miR-146b-5p

ja

-3p

MikroRNA ovat tuotteita samaan

MIR146B

geeni, joka sijaitsee kromosomissa 10 asemassa q24.32. Kuten useimmat paria 5p ja 3p MikroRNA, kaksi

miR-146b

MikroRNA syntyvät vastakkaisten juosteiden (5 ’ja 3’ käsivarret) ja kaksijuosteisen varren alueella esiaste mikroRNA,

pre-miR-146b

, joka puolestaan ​​on peräisin ensisijaisesti

MIR146B

RNA-kopion [6]. Ilmaus

miR-146b-5p

näyttää olevan kaikkialla ihmisen kudoksissa, vaikka korkeammat tasot nähdään keuhkojen, kateenkorva ja perna [7]. Pienet RNA kloonaus ja syvä sekvensointi tutkimukset osoittavat, että määrä

miR-146b-3p

soluissa on paljon pienempi kuin

miR-146b-5p

[8], [9]. Tällaisella erolla nähnyt monta 5p ja 3p microRNA paria, jotka muodostavat suurimman osan MikroRNA. Tämän lohkon bias uskotaan olevan seurausta termodynaamisen vaikutuksia microRNA käsittelyä sanelee microRNA sekvenssit [10], [11], samoin kuin tasojen kohde-mRNA: iden solu- ympäristöön [12], [13]. Vaikka yksi 5p ja 3p MikroRNA voi olla paljon vähemmän yleisiä kuin muut (ja usein kutsutaan ”microRNA *” lajit), sillä voi olla merkittävä vaikutus solun tilaan [14], [15]. On huomattava, että luonteeltaan juosteen bias voi vaihdella spatiotemporally. Esimerkiksi

miR-202 Twitter /

miR-202 *

ilmaus suhde muuttuu -0,5 kohteeseen ~0.9 aikana naisten gonadogenesis kanan alkioiden [16], ja hiiri

asennuspalveli- 194-5p

on läsnä korkeammalla tasolla kuin

miR-194-3p

munuais- ja vatsassa, mutta alemmalla tasolla keuhkojen ja kohtu [17].

Useat tutkimukset ovat tutkineet rooli

miR-146b

MikroRNA syövän katosta-linjat. Tutkimuksessa, U373 ihmisen glioblastoomasolua, invasiivisuus ja muuttoliike väheni yli-ilmentyminen MikroRNA ja kasvoi niiden Knockdown käyttämällä antisense-oligonukleotidien, ja kohdentaminen selostukset

MMP16

matriksimetalloproteinaasi geenin

miR -146b-5p

identifioitiin [18]. In vitro muuttoliike ja hyökkäys toisen ihmisen glioblastoomasolulinjan-line, U87-MG, on myös osoitettu vähenevän

miR-146b-5p

yliekspressio [19]. MicroRNA osoitettiin kohdistaa selostukset

EGFR

koodaavan geenin epidermaalisen kasvutekijän reseptori.

EGFR

-targeting mukaan

miR-146b-5p

on myös esitetty MDA-MB-231 ihmisen rintasyöpäsoluilla [20]. Kuten glioblastooma tutkimuksissa

pre-miR-146b

yli-ilmentyminen soluissa vähensi thier muuttoliike ja invasiivisuus [20]. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa tutkimuksessa, joka ehdotti myös rooli

miR-146b-5p

in negatiivisesti säännellään tumatekijä-kB (NF-kB) reitin [21]. Tällaisia ​​funktionaalisia tutkimuksia ei ole tehty keuhkojen syöpäsoluja. Ymmärtää yhdistys

miR-146b

MikroRNA keuhkosyöpä ennuste, pyrimme tutkimaan vaikutuksia yli-ilmentävät

pre-miR-146b

edeltäjä microRNA on pahanlaatuinen fenotyyppi A549 keuhkoadenokarsinooma cell-line.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki tutkimus esitetään tässä hyväksyi Institutional Review Board of Roswell Park Cancer Institute (RPCI). Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksynnän jälkeen RPCI n Institute Animal Care ja käyttö komitea alle protokollaa numero 1132M.

Soluviljely

A549 ihmisen keuhko- adenokarsinooma ja BEAS-2B normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen-linjat olivat saatu ATCC® (Manassas, VA). TLA-HEK293T- ™, ihmisen sikiön munuaisen solulinjaan peräisin 293T solulinja, saatiin Open Biosystems® (Huntsville, AL). A549 ja TLA-HEK293T ™ soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 90%: n kosteudessa ja 5% CO

2 Dulbeccon Modified Eagle Medium (+ DMEM; Mediatech®, Manassas, VA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (PAA Laboratories ®, Pasching, Itävalta) on Steri-Cult ™ inkubaattoriin (Thermo Fisher Scientific®, Waltham, MA). LHC-9-alustassa (Invitrogen®, Carlsbad, CA) käytettiin BEAS-2B-soluja. Solulinjoja syntyy tässä tutkimuksessa viljeltiin, kun läsnä oli 2 ug /ml puromysiiniä (Roche®, Indianapolis, IN). Solut kerättiin käyttämällä 0,05% trypsiiniä 0,25 mM etyleenidiamiinia-tetraetikkahappoa (Invitrogen®). Soluja ei viljeltiin yli kuusi viikkoa, ja samanaikaisesti viljeltiin ja samoin-ikäinen soluja käytettiin verrattaessa solulinjoja. Huolto viljelmiä semi-yhtymäkohta käytettiin määrittää kokeiluja. Valtikkaa ™ elektroninen vasta (Millipore®, Billerica, MA) tai kertakäyttöisiä hemasytometriä dioja (Incyto®, Dusseldorf, Saksa) käytettiin mittaamaan solujen tiheydet resuspendoituneen soluissa.

Pysyvästi transdusoimattomien cell -Lines

Täydentävät, yksijuosteiset DNA-oligonukleotidit, joissa ihmisen

pre-miR-146b

sekvenssin (miRBase [22] hakunumero MI0003129) ja restriktioentsyymin paikan ulokkeet saatiin Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). Oligonukleotidit saatiin myös muunnelma, missä järjestyksessä segmenteillä

miR-146b-5p

ja

-3p

MikroRNA vaihdettiin. Hehkutuksen jälkeen tuottaa kaksijuosteista DNA: ta, oligonukleotidit ligatoitiin

Xho

I- ja

Ei

I (Invitrogen®) -digested pLemiR ™ -vektoriin (Open Biosystems®). TOP10 ™ toimivaltainen

E. coli

(Invitrogen®) olivat lämpöä transformoitiin ligaation tuotteet. Plasmidi-DNA valmistettiin viljelmistä valitun yksittäisen kloonien kittiä käyttäen toimittaa Qiagen® (Valencia, CA). Identity Plasmidien varmistettiin sekvensoimalla DNA at ydin laitokseen Roswell Park Cancer Institute Buffalo, NY (RPCI). Suunniteltu Lentiviruksiin valmistettiin transfektoimalla plasmidit TLA-HEK293T ™ soluissa käyttäen reagensseja ja protokollia mukana Trans-Lentivirusvektorikonstruktit GIPZ ™ pakkausjärjestelmä (Open Biosystems®). A549-solut transdusoitiin virusten 48 tuntia ja sitten suoritettiin valinta vastaan ​​2 ug /ml puromysiiniä noin kaksi viikkoa tuottaa solulinjoja A549 /vec, A549 /146b, ja A549 /v146b, käyttäen virukset tyhjällä pLemiR ™ vektori, tai vektori, jossa on luonnollinen tai muunnos

pre-miR-146b

järjestyksessä, vastaavasti.

Virtaussytometria

virtaussytometria tuoreeltaan talteen otettuja soluja värjättiin 1 ug /ml,

7

amino-aktinomysiini D elinkelpoisuuden väriaine (Sigma®, St. Louis, MO) suoritettiin FACSCalibur kone (BD Biosciences®, San Jose, CA). Tulevaisuuteen ja puoli-hajonta, ja fluoresenssia FL2 ja FL4 kanavia kirjattiin 10000 tapahtumia, ja FL2 fluoresenssin arvot piirrettiin jälkeen gating ulos kuolleita soluja kanssa CellQuest- ™ Pro -ohjelmiston (versio 5; BD Biosciences®).

Soluproliferaatiomääritys

soluproliferaatiomääritykset suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8-määritys (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies®, Rockville, MD), joka käyttää biopelkistys on

2

-(

2

-methoxy-

4

-nitrophenyl)-

3

-(

4

-nitrophenyl)-

5

-(

2

,

4

-disulfophenyl)-2H tetratsolium natrium (WST-8) meripihkanväriseen formatsaaniksi mitata solujen elinkykyä. Lyhyesti, 100 ui solujen 2-4×10

4 /ml solut maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille. Eri ajankohtina neljän seuraavan päivän ajan, elatusaine neljänä kuopissa korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 5% CCK-8-reagenssia, ja tunnin kuluttua, absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin Multiskan Plus (MTX Lab Systems® , Vienna, VA) lukulaite. Absorbanssiarvot korjattiin vähentämällä näiden Verrokkikuoppien, että ei ollut soluja.

Drug herkkyys määrityksessä

Solut kasvatettiin 50% -60% konfluenssiin 96-kuoppaisille viljelylevyille in viitenä, kun elatusaine korvattiin joka sisälsi 0,5-2,0 ug /ml joko doksorubisiinihydrokloridia (Enzo Life Sciences®, Farmingdale, NY) tai sisplatiinin (Calbiochem®, San Diego, CA) tai ei. Kahden päivän viljelyn Solujen elinkelpoisuus mitattiin, kuten on kuvattu solulisäkasvumääritykselle.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksissä

kiinnittynyt pesäkemuodostusta määrityksissä, 200 solua maljattiin per 35 mm viljelymaljalle kolmena kappaleena ja viljeltiin keskisuurten vaihtuu joka 4-5 päivää. Jälkeen 10-14 päivä, maljat värjättiin 0,2% metyleenisineä 40% metanolia 30 minuutin ajan. Pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa, lautasen ensin päällystettiin 1,5 ml: ssa alustaa, joka sisälsi 0,7% agaria (Sigma®) ennen solujen, 2 ml: ssa elatusainetta, joka sisälsi 0,35% agaria, lisättiin 150 solua /malja. Polymeroinnin jälkeen aga- noin 15 minuutissa, 2 ml alustaa lisättiin. Soluja viljeltiin 6-7 viikkoa väliaineen vaihto joka 4-5 päivää, ja sen jälkeen värjättiin 2 mg /ml tiatsolyylisininen liumbromidi (Sigma®) 4-8 tuntia soluviljelmässä hautomo. Stained astiat skannattiin on Perfection V700 (Epson®, Long Beach, CA), ja vähintään alueen kuvia, jotka vastaavat 3778 tai 199 um

2, vastaavasti kiinnittyneet ja pehmeä agar pesäkekokeissa, käytettiin tunnistamaan pesäkkeitä kvantifioinnin avulla ImageJ ™ ohjelmistoa (versio 10.2, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD).

In vitro haavan paranemista määritys

Kuuden kuoppaviljelylevyillä oli merkitty ristikko kuvio ulkopinnalle niiden pohjat. Sitten solut maljattiin kolmena suurella tiheydellä saavuttaa 100% konfluenssiin päivää myöhemmin, kun noin 2 cm pitkä ja 0,5 mm leveä haava tehtiin vetämällä muovinen 10 ui pipetin-kärki pitkin suoraa reunaa, joilla on kohtalainen ja johdonmukainen paine raapia yksisolukerrosta. Elatusaine korvattiin sitten. Solut kuvattiin välittömästi ja kun päivä kulttuurin 50X suurennus samoista kohdista pitkin naarmuja.

TranswellTM ™ maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Kaksikymmentäneljä-hyvin TranswellTM ™ levyjä polykarbonaatti kalvo ja 8 um huokoskoko saatiin Corning (Corning, NY). Semi-konfluentteja soluja, jotka oli paastolla 16-20 tuntia viljelemällä seerumittomassa + DMEM-alustassa kerättiin 10 cm: n viljelyastioihin, pestiin kahdesti fosfaatilla puskuroitu suolaliuos (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4 ja 1,76 mM KH

2PO

4 pH 7,4), ja suspendoitiin uudelleen seerumittomassa + DMEM väliaineessa 2-3 x 10

5 solua /ml. Solut maljattiin kolmena kappaleena 0,1 ml + DMEM per Transwell ™, ja pohja, jotka sisälsivät 0,6 ml + DMEM 15% naudan sikiön seerumia. Sama tilavuus Solususpensiot samanaikaisesti maljattiin kolmena kappaleena kuoppiin 24-kuoppaisille viljelylevyille epäsuorasti arvioimalla solutiheys mittaamalla solujen elinkyky 8-16 tuntia, kuten on kuvattu solujen lisääntymisen määrityksessä. Invaasiolle määrityksiä, Transwell ™ kalvot esipäällystetty joko Cultrex ™ PathClear ™ tyvikalvon valmistettu uute hiiren Engelbreth-Holm-parvi kasvainsoluja, tai kollageeni I: kolonokkalestikala (Trevigen®, Gaithersburg, MD). Päällystäminen toteutettiin kerrostamalla 50 ui proteiinien 1,5 mg /ml ja 50 ug /ml, vastaavasti, seerumittomassa + DMEM-alustassa, ja kun kerrosten kuivua alle 90%: n kosteudessa 37 ° C: ssa 1 tunti ja 16- 24 tuntia, vastaavasti. Kuivatut kerrokset huuhdeltiin kolme kertaa seerumittomalla + DMEM-alustassa, ennen kuin solut maljattiin. Kun 8 tai 16-20 tuntia, vastaavasti, muutolle tai invaasio määrityksissä, yläpinnat Transwell ™ kalvot pyyhittiin vanupuikkoja poistaa ei-siirretyn soluissa. Vuonna migraatiokokeessa, jäljellä oleviin soluihin kalvot kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun-formaliini ja värjättiin yön yli 0,2% w /v kristalliviolettia (Sigma®) 2% etanolia. Perusteellisen pesun jälkeen vedellä poista rekisteröimätön väriaine, 300 ui 10%: ista etikkahappoa lisättiin kuhunkin Transwell ™ purkaa sidottu väriaine ravistamalla kuoppiin 100 kierrosta /minuutti 20 minuutin ajan. Uutteet analysoitiin absorbanssi 595 nm: ssä käyttäen 10% etikkahappoa referenssinä. Invaasiossa määrityksissä, punainen fluoresenssi kuvaa solujen Transwell ™ kalvot hankittiin 50x suurennuksella kolmessa eri kentässä-näkemyksiä. Absorbanssi lukemat tai keskimääräinen lukumäärä solua kohti kentän normalisoitiin käyttäen solujen elinkelpoisuuden mittauksia solujen, jotka oli samanaikaisesti päällystetty erillisissä kulttuureissa.

Keuhkojen kasvaimen muodostumisen määritys

Tämä työ hyväksyttiin eri institutionaalisten valiokuntia RPCI. Solut kasvatetaan noin 70% konfluenssiin kerättiin trypsinaatiolla kolme minuuttia, pestiin PBS: llä, ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään + DMEM 5 x 10

6 solua /ml. Asiantuntija teknikko käytettiin 1 ml-ruisku 27 G neula pistää 0,2 ml soluja häntälaskimoon immuunivajausta, naisten 6-10 viikon ikäisiä hiiriä CB-

Igh

–

1

b Twitter /lcrTac-

Prkdc

SCID Twitter /Ros rasitusta. Hiiriä seurattiin kahdesti viikossa hengityksen sekä huonovointisuutta ja näkyviä ulkonäkö syöpä vaurio tai kasvun, ja lopetettiin 12 viikon jälkeen, vaikka yksikään hiirillä oli jonkin näistä oireista tai merkkejä. Keuhkot poistettiin, pestiin PBS: llä, vahvistettu päivässä 10% neutraalipuskuroituun-formaliini, ja punnittiin sen jälkeen taputtelemalla pois ylimääräinen neste talouspaperilla.

Laser capture mikrodissektion (LCM) B

Tämä työ hyväksyttiin institutionaalinen tarkastelun aluksella RPCI, ja suoritetaan valvonnassa patologina patologian osaston of RPCI kudoksista 12 tapausta vaiheen I NSCLC, jotka oli käsitelty instituutissa. Formaliini-, parafiiniin upotettujen, 6-8 pm paksu kudos-profiilit, joissa on vähintään 70% kasvainkudoksessa varmennettuna histologinen tutkimus patologi käytettiin. Tissue-osat sijoitettiin objektilaseille päällystetty polyeteeninaftalaatti- kalvo (Leica®, Wetzlar, Saksa) ja kuivattiin yön yli huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen de-paraffinization ksyleenillä seurasi vähittäinen nesteytys yön yli käyttäen arvostellaan alkoholeja, levyt värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, ja kuivattiin ilmassa yön yli. LCM suoritettiin koskevasta LMD6000 järjestelmä (Leica®) 200x suurennos laser teho, nopeus ja näytteen-tasapainoasetukset 80, 2 ja 11, tässä järjestyksessä. Kasvain sisältävien alueiden osat tunnistettiin muuttuneen solumorfologian syöpä epiteelisolujen. Stroomakasvaimet ja syövän epiteelin komponentteja näiden alueiden otettiin microdissected ja kerättiin erillisiin 0,5 ml: n putkissa. Kunkin komponentin alueet 1-12 x 10

6 um

2 (noin 0,5-7 x 10

4 solu-osat) kerättiin. Sidekudosmateriaali-to-epiteelin alan suhde vaihteli noin 0,6 1.

eristäminen RNA

silikakolonneissa, reagensseja ja menetelmiä varustettu Purelink ™ RNA (Invitrogen®), tai High Pure ™ microRNA (Roche®) ja FFPE RNA (Norgen Biotek®, Thorold, Kanada) sarjat, vastaavasti, käytettiin eristämään yhteensä 2-5 x 10

6 viljeltyjä soluja tai proteinaasi K-käsiteltyjen mikropaloitelluista soluissa. Nukleiinihappo pitoisuus valmisteissa arvioitiin absorbanssista spektrofoto- Ultrospec II (LKB Biochrom®, Cambridge, UK) tai NanoDrop ™ 1000 (Thermo Fisher Scientific®) välineitä. Fluorimetrisellä määritys käyttäen Quant-iT ™ RiboGreen (Invitrogen®) käytettiin määrittämään nukleiinihappojen valmisteissa alkaen mikropaloitelluista soluista. Kokonais-RNA ihmisen MCF-7 rintasyöpä ja ML-2 ihmisen akuutti myelooinen leukemia solut ystävällisesti vastaavasti tutkimusryhmät drakmaa. Gokul Das ja Eunice Wang RPCI.

Semi-kvantifiointiin MikroRNA käänteiskopioinnilla-PCR (RT-PCR) B

Semi-määrällinen ihmisen MikroRNA

let-7a

miR-30a-5p

,

miR-146b-5p

ja

miR-146b-3p

, ja pieni nucleolar RNA

RNU6B

oli tehdään RT-PCR-pohjainen TaqMan ™ MicroRNA määritykset (Applied Biosystems®, Foster City, CA, määrityksessä tunnukset 377, 417, 1097, 2361 ja 1093, vastaavasti). Lyhyesti, RNA-oligonukleotidi, ja reagenssit on varustettu TaqMan ™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems®) käytettiin kääntää puhtaaksi 10 ng kokonais-RNA: ta soluista, tai 5 ui 0,5-2000 FM synteettisten kypsä MikroRNA

miR-146b-5p

ja

-3p

5 ’fosfaattia ja 3’ hydroksyyli terminii saatu Invitrogen®. CDNA: ta käytettiin templaattina 40 syklin PCR-reaktiot on 7900HT reaaliaikainen PCR-laite (Applied Biosystems®). Kutakin reaktiota varten määrällisen sykli (C

q

) arvo noin kääntäen verrannollinen log

2 arvoa analyytin konsentraation RNA, saatiin SDS ™ -ohjelmiston (Applied Biosystems® ; versio 2.3). Keskimääräinen C

q

arvot kolmena PCR-reaktioiden käytettiin analyysiin. Tarvittaessa C

q

arvot MikroRNA normalisoitiin vähentämällä arvo pienille nucleolar

RNU6B

RNA.

geeniekspressioanalyysissä käyttäen BeadChip ™ teknologia

Yhteensä-RNA, joka on eristetty A549 /vec ja A549 /146b solujen kahdessa kokeessa biologisen päällekkäisyyksiä, annettiin jaettuun geeniekspression laitokseen RPCI analyysejä varten. Absorbanssi spektrofotometrisesti ja elektroforeesin NanoDrop ™ 1000 ja Bioanalyzer ™ 2100 (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), vastaavasti, osoittivat, että RNA-valmisteiden oli 260 nm /280 nm absorbanssi suhdeluvut 1,9-2,0 alueella, 260 nm /230 nm absorbanssi suhteet 1,8, ja RNA eheys numerot 7. Illumina® TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion®, Autin, TX) käytettiin muuntamaan 500 ng RNA: n cDNA: n, joka sitten transkriptoidaan in vitro tuottaa biotiini-leimattu RNA. Hybridisaatio reagenssit sekoitettiin 750 ng: n leimatun RNA, ja seosta hybridisoitiin yli yön 58 ° C: ssa HumanRef-8 v3.0 Expression BeadChips ™ array (Illumina®, San Diego, CA), joka on koettimina 24526 selityksin ihmisen transkriptien . Sen jälkeen pesu ja värjäys Cy3 väriaine-leimattu streptavidiini, BeadChips ™ oli kuvattu käyttäen BeadArray Reader (Illumina®). Tiedot hankittiin kanssa GenomeStudio ™ -ohjelmiston (versio 2010.1, Illumina®), ja sitten käsitellään tausta-korjaus, varianssi-vakauttava muunnos, ja sitten vankka kiilat-normalisointi välillä paneelit käyttäen Lumi Bioconductor paketin (versio 1.14) R-kielelle (versio 2.11.1) oletusasetuksilla. Raa’at ja käsitellyt tiedot löytyvät NCBI Gene Expression Omnibus arkiston hakunumerolla GSE29496. Hyvä laatu tietojen vahvistettiin tutkia eri näkökohtia tietojen suosittelema Illumina®. Multi-testaus kanssa pariksi t-testin kanssa moderoitu t tilastoja ja Benjamini-Hochberg korjaus vääriä löytö korko tehtiin käsiteltyjen tietojen avulla Limma Bioconductor paketin (versio 3.4.5).

Muut

EOS 450D digitaalikamera (Canon®, Lake Success, NY) ja Axio ™ Observer mikroskooppi (Zeiss®, Maple Grove, MN) käytettiin mikrovalokuvaus. Jollei toisin mainita, kemikaalit hankitaan Sigma® tai Thermo Fisher Scientific®. RNA sekundaarinen rakenne ennustus käyttämällä mfold [23] oletusasetuksilla suoritettiin netissä https://mfold.rna.albany.edu. Tilastolliset analyysit ja käyrä tehtiin Prism ™ -ohjelmiston (versio 5.0c, GraphPad Software®, La Jolla, CA). Kaikki t testit olivat kaksisuuntaisia, oletetaan vastaavan varianssiin ja käytettiin 0,05 cut-off päättääkseen merkityksen.

Tulokset

Generation A549 solulinjojen yliekspressoivia

miR-146b

MikroRNA

vaikutuksen tutkimiseksi

miR-146b

yli-ilmentyminen keuhko- syöpäsoluja, ihmisen A549 keuhkoadenokarsinooma solut suunniteltu yli-ilmentää ihmisen

pre-miR-146b

esiaste microRNA. PLemiR ™ lentivirusvektorin, joka kantaa geeniä puromysiiniresistenssille, modifioitiin insertoimalla DNA pre-microRNA sekvenssin 3′-alueen geenin, joka koodaa TurboRFP punaisen fluoresoivan proteiinin ja ohjaa konstitutiivisesti aktiivinen (CMV ) promoottori. Sen jälkeen transduktion Lentiviruksiin, ja puromysiiniselektion, vakaa solupopulaatio nimeltään A549 /146b luotiin. A549 /VEC solulinjassa luotiin käyttäen pLemiR ™ vektori ilman inserttiä. A549 /v146b soluja on luotu käyttäen vektorin muunnos ihmisen

pre-miR-146b

järjestyksessä. Vuonna variantti, nukleiinihapposegmentit vastaa

miR-146b-5p

ja –

3p

microRNA sekvenssit vaihdettiin (kuvio 1A) ajatus, että vaihtelu saattaa aiheuttaa suhteellisen korkeampi ilmentyminen

miR-146b-3p

, koska muun ihmisen MikroRNA, ne syntyvät 5p käsivarret ennalta MikroRNA yleensä ilmaista enemmän kuin niillä, 3p varret [11]. Mfold [23] RNA-taitto algoritmi ennustaa, että aromeja

pre-miR-146b

, variantti ennalta microRNA liian on varsi-silmukka muotoon (kuvio 1A), jossa AG–31,9 kcal /mol joka on 5,2 kcal /mol enemmän kuin luonnon pre-microRNA.

. Vakain mfold-ennusti sekundäärirakenteiden ihmisen

pre-miR-146b

ja muunnos ennalta microRNA tarkasteltu tässä tutkimuksessa. 5′- ja 3′-päät, nukleotidiasemat, ja segmentit vastaavat kypsyä

miR-146b-5p

ja

-3p

sekvenssit (

5p

ja

3p

) on osoitettu.

B

. Histogrammit punaisen fluoresenssin määrä määritettiin virtaussytometrialla A549 ja A549-johdettuja solulinjoja stabiilisti transdusoitu lentivirukset, joissa konstruktien suunniteltu humaani

pre-miR-146b

(

A549 /146b

) tai sen muunnos esitetty

(

A549 /v146b

), tai ei (

A549 /vec

).

C

. Vertailu

miR-146b-5p

ja

-3p

tasot (

5p

ja

3p

), normalisoitu kuin

RNU6B

pieni nucleolar RNA, että A549-johdetut solulinjat, kuten arvioitiin käyttäen käänteistranskriptio ja sen jälkeen PCR: llä (RT-PCR). Keinot ja niiden keskivirhe mittauksia kolmesta eri kokeista esitetään.

D

. Standard käyriä suhdetta kvantifiointiin sykli (

C

q

) arvo ja pitoisuus RNA

miR-146b-5p

ja

-3p

(

5p

ja

3p

) RT-PCR-määrityksissä synteettisten

miR-146b-5p

ja

-3p

RNA, vastaavasti. Log

2 mittakaavassa käytetään X-akselilla.

E

. Semi-määrällinen suhteelliset määrät

miR-146b-5p

ja

-3p

RNA 293T, BEAS-2B, MCF-7, ja ML-2 (keinoin, yksi kokeista ), ja kolme A549 johdettuja solulinjoja, (keinot ja niiden keskivirhe mittaukset kolmessa eri kokeissa) on esitetty.

vahva ja stabiili ilmentyminen pre-microRNA-laakeri TurboRFP geenin in 90% soluista kunkin kennon-line vahvistettiin fluoresenssin virtaussytometrialla (kuvio 1B ja tietoja ei ole esitetty). Useita RNA-valmisteet määritettiin

miR-146b-5p

ja

-3p

kypsä MikroRNA RT-PCR: llä. Yli-ilmentyminen

miR-146b

MikroRNA havaittiin molemmissa A549 /146b ja A549 /v146b solulinjoja (kuvio 1 C). Verrattuna A549 /vec,

miR-146b-5p

ja

-3p

ilmaisua, normalisoitu 45 pohja-pitkä, siivous pieni nucleolar RNA-geeniä

RNU6B

, olivat vastaavasti keskimäärin 4.9- ja 6.6-kertainen A549 /146b soluja. A549 /v146b, niin ne olivat vastaavasti keskimäärin 2.6- ja 6.5-kertainen, mikä viittaa variantti ennalta microRNA ilmaiseman se jalostettiin kypsä

miR-146b-5p

ja

-3p

MikroRNA. Tarkemmin määrällisesti vaikutusta variaatio suhde määriä

miR-146b-5p

ja

-3p

soluissa, synteettiset

miR-146b-5p

ja

-3p

RNA: ta käytetään tuottamaan standardikäyrät tutkia suhdetta RT-PCR-mittaukset (C

q

arvot) ja RNA: n määrät. Vaikka määritykset sekä MikroRNA oli samanlaisia ​​RT-PCR kinetiikka, jossa kukin log

2 yksikköä muutos RNA panos tuottaa noin yksikön muutos C

q

arvo laimennusvälillä 12 log

2 yksikköä, herkkyys

miR-146b-5p

määritys oli korkeampi noin 3,6 C

q

yksikköä (kuvio 1 D). Siksi

miR-146b-3p

C

q

arvot korjattiin vähentämällä 3,6, jotta voidaan verrata määriä

miR-146b-5p

ja

-3p

RNA: t. Kaikissa kolmessa A549 peräisin oleva solu-linjat,

miR-146b-5p

microRNA oli läsnä määränä, joka oli noin 4-6 kertaa suurempi kuin

-3p

microRNA (kuvio 1 E). Vaihtelu edeltävässä microRNA sekvenssin havaittiin olevan merkittävää vaikutusta suhde määriä

miR-146b-5p

ja

-3p

että A549 /v146b soluja verrattuna A549 /146b soluja. Tutkiminen RNA ihmisen 293T sikiön munuaisen, BEAS-2B normaali keuhkoputken, MCF-7 rintasyöpä, ja ML-2 akuutti myelooinen leukemia soluja, osoitti, että näissä solulinjojen myös

miR-146b-5p

on läsnä 4-22-kertainen mooliylimäärä kuin

-3

p (kuvio 1 E). Siten kypsä microRNA syntyvät 5p juosteesta

pre-miR-146b

näyttää olevan paljon yleisempiä kuin yksi päässä 3p lohkon, ehdottivat muut tutkimukset [8], [9]. Expression of miR-146b-5p 293T, BEAS-2B, MCF-7 ja ML-2-soluissa oli 23.8-, 0.7-, 0.6- ja 2.8-kertainen, että A549 /vec.

yli-ilmentyminen

miR-146b

MikroRNA on vain vähäinen vaikutus A549 fenotyyppi

A549 peräisin oleva solu-linjoja tutkittiin tunnistamaan vaikutus

miR-146b

yliekspressio on A549-soluja. Solujen elinkelpoisuuden mittausta ajan ehdotti, että verrattuna A549-vec, sekä A549 /146b ja A549 /v146b lisääntyivät samalla solu-viljelmässä (kuvio 2A). Lisääntynyt

miR-146b

tasot eivät näytä vaikuttavan herkkyyttä solujen sisplatiinia tai doksorubisiinia lääkeaineen pitoisuudet vaihtelevat 0,5-2 ug /ml, vaikka lääkkeet olivat selvästi sytotoksinen soluille korkein pitoisuus (kuvio 2B). Molemmat ovat syöpälääkkeet, joita käytetään hoitoon NSCLC. Kuitenkin yli-ilmentyminen mikroRNA, sekä A549 /146b ja A549 /v146b solut muodostivat vain 80% ja 65%, vastaavasti, kuten monet pesäkkeiden A549 /vec teki yksittäisistä soluista kiinnittynyt soluviljelmässä muovisen pinnan kudoksen kulttuuri levyt (t-testi P-arvot 0,04 ja 0,01, vastaavasti).