Krooninen sairaus

tiivistelmä

Raportoimme solun mekaanisia muutoksia vastauksena muutoksiin ilmentymisen ihmisen ekvilibratiivisen nukleosidikuljettajan-1 (hENT1), joka on yleisin ja laajalti solukalvon nukleosidikuljettajan ihmisen soluissa ja /tai kudosten . Modulaatio hENT1 ekspressiotason muuttanut jäykkyys haimasyövän Capan-1 ja Panc 03,27 soluja, jotka analysoitiin atomivoimamikroskopialla (AFM) ja korreloi mikrofluidilaitetta alustalle. HENT1 pudotus indusoi vähentämistä solujen jäykkyys sekä solujen jopa 70%. Lisäksi cellular fenotyyppisiä muutoksia, kuten solun morfologia, muuttoliike, ja ilmentymistaso epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) markkereita havaittiin jälkeen hENT1 knockdown. Solut tukahdutetaan hENT1 tuli pitkänomainen, muuttivat nopeammin, ja oli vähentänyt E-kadheriinin ja kohonnut N-kadheriinin verrattuna vanhempien soluja, jotka ovat yhdenmukaisia ​​epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Ne cellular fenotyyppisiä muutoksia läheisesti korreloi muutoksiin solun jäykkyys. Tämä tutkimus viittaa siihen, että hENT1 ilmaisun taso vaikuttaa solujen fenotyypin ja solujen elastinen käyttäytyminen voi olla fyysinen biomarkkeri määrällisesti hENT1 ilmaisun ja fenotyyppisiä muutos. Lisäksi solu mekaniikka voi olla kriittinen väline havaita taudin etenemistä ja hoitovaste.

Citation: Lee Y, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Kirui DK, Hussain F, et ai. (2014) Human ekvilibratiivisen nukleosidikuljettajan Transporter-1 Knockdown Tunes Cellular Mechanics epiteelin-mesenkymaalitransitioon in haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10,1371 /journal.pone.0107973

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2014; Hyväksytty: 16 elokuu 2014; Julkaistu: 14 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitollisena myöntävät rahoitusta tukea seuraavista lähteistä: puolustusministeriön myöntää W81XWH-09-1-0212 ja W81XWH-12-1- 0414, National Institute of Health myöntää U54CA143837 ja U54CA151668 The CPRIT avustusta RP121071 päässä Texasin osavaltiossa, ja Ernest Cockrell Jr. Distinguished Endaumentin puheenjohtaja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman (PDAC) on yksi kaikkein vaarallisin ihmisen syöpien, jossa on erittäin huono ennuste [1]. PDAC on alhainen eloonjäämisaste jälkeenkään täydellinen resektio kasvain, joka on ainoa mahdollisuus parantaa. Valitettavasti useimmat kasvaimet ovat leikkaushoitoon ja metastasoitunut. Siten kemoterapian ja /tai sädehoidon ovat ainoat vaihtoehdot [2], [3]. Gemsitabiini (2 ’, 2’-difluorodeoxycytidine) on yksi tehokas syövän vastaisten aineiden haimasyövän [1]. Se on sytotoksinen pyrimidiini deoksinukleosidin analoginen että kulkeutuu soluosastoon kautta ensisijaisen liikenteen proteiini, ihmisen ekvilibratiivisen nukleosidikuljettajan-1 (hENT1), ja lopulta estää DNA: n replikaatiota. HENT1 ilmentymistaso haiman syöpäsoluissa on aiemmin korreloi terapeuttista tehoa, jolloin solut korkeammat hENT1 ilme osoitettiin paremmin vastaamaan gemsitabiinia. Lisäksi solutasolla tutkimukset ovat myös osoittaneet, että haimasyövän soluja matalalla hENT1 ilme kestävät hyvin gemsitabiinin [4]. Lisäksi kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että hENT1 ilmaisu vaikuttavat potilaista reagoi hoitoon, jossa potilaille, joiden kasvain ilmaisi alhainen hENT1 biomarkkereiden reagoineet huonosti Gemsitabiinihoidon [3], [5].

Haimasyöpä solut, jotka hankkivat gemsitabiini-vastus on ominaista epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi ja osoittaa selvästi morfologisia muutoksia epiteelisolujen karan-muotoinen ja lisäämällä solujen liikkuvuuden [6], [7]. EMT on biologinen prosessi, joka polarisoitunut epiteelisolujen siirtyvänsä mesenkymaalisten kaltainen fenotyyppi läpi useita biokemiallisia muutoksia. Tämä fenotyypin siirtymä on tunnusomaista menetys solu-solu-adheesion ja dynaamisen rakenteen muutokset solun tukirangan, jotka aiheuttavat solujen irtoamisen epiteelin ja saada kyky siirtyä kaukaisiin kohtiin [8], [9]. Näin ollen tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että modulaatio hENT1 ekspressiotasoja haiman syöpäsoluissa voi muuttaa niiden fysiologiset ominaisuudet, koska se voi aiheuttaa fenotyypin muutos estämällä gemsitabiini ottoa. Sen lisäksi biokemiallisia menetelmiä tunnistaa solun fysiologisia muutoksia, ymmärrys solun mekaniikka voi tarjota uusia biologisia oivalluksia. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että mekaaniset ominaisuudet solujen saadaan tärkeää tietoa ymmärtää eri biofysikaalisten käyttäytymismalleja, jotka sisältävät solun muoto, liikkuvuuteen ja soluadheesion jotka tuottavat biokemiallisten signaaleja, jotka ovat kriittisiä biologisia vasteita [10]. Mekaaniset allekirjoitukset solut voivat olla tärkeä väline eri näkökohtia: (1) tunnistaminen syöpäsolujen normaaleista soluista perustuen heidän suhteellisen alhainen jäykkyys [11]; (2) ennakointia metastaattinen potentiaali syöpäsolujen kuten solujen jäykkyys kääntäen korreloi muuttoliike ja invaasiota [12] – [14]; (3) tunnustaminen fenotyyppinen työvuorojen liittyvän muutoksen solunsisäisten rakenne ja liikkuvuus syöpäsoluissa mittaamalla kasvaa tai pienenee kimmokerroin [11], [15] – [18]. Vaikka ei ole suoraa näyttöä siitä, että hENT1 liittyy fenotyyppisiä tapahtumiin haimasyöpäsoluissa, voimme spekuloida, että hENT1 ilmaisu voivat muuttaa solun biofysikaalisten käyttäytymisen perusteella tiivis korrelaatio hENT1 ilmaisun ja gemsitabiinin herkkyys. Solu fenotyypin siirtymä gemsitabiini resistentit solut perustettu viljelemällä soluja sarjatuotannossa lisääntyvä keskittyminen gemsitabiinin tukee myös hypoteesia.

Tässä tutkimuksessa kahdella eri menetelmällä, AFM ja mikrofluidinen alustan, käytettiin arvioitaessa miten modulaatioon hENT1 ilmentymistaso vaikutteita jäykkyydestä haiman syöpäsoluja. Sitten mukana morfologisten muutosten, solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä, solu liikkuvuus, ja muutokset ekspressiotasot EMT merkkiaineiden tutkia solujen fenotyyppisen shift leimasi (kuvio 1). Yhdessä meidän tuloksia hENT1 ekspressiotaso ja solujen jäykkyys korreloivat erittäin hyvin mekanistinen korjauksilla solunsisäisen solun tukirangan rakennetta, solu liikkuvuus, ja viittaavat siihen, että solujen elastiset ominaisuudet voidaan arvioida hENT1 ilmaisun tasolla sekä fenotyypin muutos.

hENT1 knockdown saa aikaan muutoksia solujen mekaniikan kautta EMT mukana muutokset E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen tasoja, solun morfologiassa, ja liikkuvuuteen haiman syöpäsoluja. Edelleen, hENT1 knockdown indusoi vähentää solujen jäykkyys osoitetaan edustava voima erottaminen käyrät saatu Pancin 03,27 soluista (ylempi kuvaaja emosolu, toinen kuvaajan hENT1 pudotus solu) käyttäen AFM.

materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kaikki solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). AsPC-1, BxPC-3, MIA Paca 2, ja Panc-1-soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagles Medium (DMEM, Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, ATLAS Biologicals, Fort Collins , CO), Capan-1 DMEM 20% FBS, ja Panc 03,27 RPMI 1640 (Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA), jossa 15% FBS ja ihmisen yhdistelmä-insuliini (10 yksikköä /ml, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), kun läsnä on 5% CO

2 37 ° C: ssa.

hENT1 pudotus siRNA transfektion

soluja viljeltiin 6 cm: Soluviljelymaljassa tiheydellä 5 × 10

5 solua /malja. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja käsiteltiin INTERFERin (Polyplus transfektio ™), joka sisältää siRNA vastaan ​​hENT1 (SMARTpool: ON-TARGET plus SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) tai negatiivinen siRNA (Äänenvaimennin negatiivinen kontrolli nro 1 siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, NY), jonka pitoisuus on 50 nM Opti-MEM (Invitrogen, Grand Island, NY). 24 tunnin kuluttua transfektiosta solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 3 päivää.

Western blotting -analyysi

Solut lyysattiin RIPA Pierce puskurilla (Thermo Scientific, Waltham, MA), jossa proteaasi-inhibiittori cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Solulysaateista (10 ug) kanssa latauspuskuria (LDS näytepuskuriin ei-pelkistävät, Thermo Scientific, Waltham, MA), kuumennettiin 5 min ajan 95 ° C: ssa. Solulysaateista ja proteiinin tikkaat (Xpert 2 Esivärjätyt Protein Marker, GenDEPOT) ladattiin polyakryyliamidigeeleillä (Kaikki kD Mini- PROTEAN tgx Precast Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-rad, Hercules, CA) . Blotit blokattiin blokkauspuskurilla, TBST: llä (20 mM TRIS, pH 7,6 /150 mM NaCl /0,05% Tween 20), joka sisälsi 5% maitoa yksi tunti. Blotteja inkuboitiin yön yli TBST ja 5% maitoa, joka sisältää primaaristen vasta-aineiden tietyissä suhteissa: anti-hENT1-vasta-aine (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-E-kadheriini-vasta-ainetta (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-N-kadheriinin-vasta-ainetta (1:500, Abcam, Cambridge, MA); sytokeratiini 18 (1:1000, Cell signalointi teknologia, Danvers, MA); Lamin A /C (1:1000, Cell signalointi teknologia, Danvers, MA); anti-GAPDH-vasta-ainetta (1:2000, Cell signalointi tekniikka, Danvers, MA). Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, blotteja inkuboitiin TBST ja 5% maitoa, joka sisältää sekundaarisia vasta-aineita, anti-hiiri-IgG, HRP-kytketty vasta-aine (1:5000, Cell signalointi tekniikka, Danvers, MA) tai anti-kani-IgG, HRP linkatun vasta-ainetta (1:5000, Cell signalointi tekniikka, Danvers, MA), tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten blotit asetettiin sekoitus Pierce ECL Western blotting alustan (Thermo Scientific, Waltham, MA) ja Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, MI), ja proteiinit havaittiin.

Immunofluoresenssikoe

haimasyöpä-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, jotka sisältävät steriloitu, kollageeni I (Invitrogen, Grand Island, NY) pinnoitettu peitelaseille (22 x 22 mm, Corning) tiheyteen 2 x 10

5 solua /kuoppa. Solut valmistettiin kolmeen ryhmään: 1) kontrolli (ilman hoitoa); 2) ryntäily (transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA); ja 3) hENT1 knockdown. Soluja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (Affymetrix, Santa Clara, CA) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten läpäiseviksi 2% Triton X-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 10 minuutin ajan. Seuraavat estää 2% naudan seerumin albumiinia (Calbiochem) 1 tunnin ajan, soluja inkuboitiin yön yli anti-vinkuliinin-vasta-aine (1:200, Abcam, Cambridge, MA), anti-E-kadheriini (1:200), anti- N-cadhrein (1:100), anti-cytoketarin 18 (1:200), tai anti-Lamin A /C (1:200) 4 ° C: ssa varovasti ravistellen. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä 10 minuutin ajan ja inkuboitiin Alexa 488 tai 594-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita tunnin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, ja F-aktiini värjäys, soluja inkuboitiin Alexa Fluor 488 falloidiinia (1:250, Invitrogen, Grand Island, NY) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten tumat värjättiin Hoechst 33342 (Molecular probes, Life Technologies, Grand Island, NY) 10 minuutin ajan. Solut seurattiin konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (CLSM, Olympus FluoView FV1000).

AFM mittaukset

Cellular jäykkyyttä mitattiin voima-käyrä tekniikka on Bioscopen (Bruker Corporation, Billerica, MA). Soluja viljeltiin 6 cm Soluviljelymaljassa ja kaikki mittaukset suoritettiin elatusaineessa 37 ° C: ssa. AFM oli varustettu käänteinen valomikroskoopilla (Olympus IX81) niin, että solut seurataan jatkuvasti. Minimoida Soluvaurion piidioksidi mikropartikkelien (halkaisija: 5 um) modifioitu piinitridin ulokkeet (Novascan Technologies, Inc., Ames, IA) ja arvioitu keväällä jatkuvasti arvot ~0.06 N /m työskenteli kaikissa AFM kokeilujen. Tarkka jousivakio arvo mitattiin lämpö viritysmenetelmällä. Koettimet sijoitettu solujen ytimet proximities optisessa valvonnan, ja voima käyrät hankittiin näytetiheydellä 1 Hz. Kimmokerroin, E, laskettiin saatiin voima käyrät perustuvat Hertz mallin (yhtälö. 1) käyttämällä Nanoscope analyysi ohjelmaa Bruker Corporation. (1) jossa F = voima, E = kimmokerroin, ν = suppeumaluku (ν = 0,5, tässä tutkimuksessa), R = säde kovuuskärjen (R = 2500 nm, tässä tutkimuksessa), ja δ = sisennys syvyyttä.

Jos haluat saada kimmokerroin kaksi erillistä koetta suoritettiin ja voima käyrät vähintään 50 solut kerättiin kussakin kokeessa.

MS-sirujen suunnittelu ja valmistus

Piikiekot (4 tuuman) päässä Corning Inc. SU-8 2015 valonkestävistä, ja SU-8 kehittäjä MicroChem Corp. ja polydimetyylisiloksaania (PDMS RTV615) alkaen Momentive Performance Materials Inc käytettiin. Mikrosiru kuvio suunniteltiin AutoCAD (Autodesk Inc.) ja tulostaa jopa 10 um resoluutio kromi naamarit by Photo Science Inc. photomask kuvio ensin käännetty mikrorakenne on 4-in piikiekkojen käyttäen SU-8 2015 fotoresistin, joka on painevalumuotti PDMS materiaaleja. Lyhyesti, muotti valmistettiin spin pinnoite SU-8 2015 valonkestävistä piikiekolle ja silloitus UV 180 sekuntia. Myöhemmin suunniteltu malli kehitettiin käyttämällä SU-8 kehittäjä (MICROCHEM Corp.) ja puhdistetaan isopropyylialkoholilla ja typpikaasua. Reiät suulta lävistettiin käyttäen neuloja. PDMS kerros puhdistaa huuhtelemalla isopropyylialkoholilla ja deionisoitua vettä, ja kuivattiin typpikaasulla. Hoidon jälkeen happiplasmalla, PDMS kerros sidottu välittömästi 75 x 50 mm: n lasilevyllä. Lopuksi liimattu laitteen leivottiin 2 tuntia 80 ° C: ssa.

On-chip solujen erottaminen

Kanavat MS-siru ja Tygon putki kytketty siruun syötössä kostutettiin PBS ja pidettiin sitten 0,5% BSA: ta PBS: ssä 1 tunnin ajan. BSA lohkojen pinta ja edelleen estää ei-spesifinen adheesio solujen PDMS. Kalvot valvonta- ja hENT1 pudotus solut värjättiin käyttämällä Alexa Fluor 594 tai 488-konjugoidun vehnä kioagglutiniini (Invitrogen, Grand Island, NY), vastaavasti. Solu seos yhtä suurina määrinä lopulliseksi tiheys 1 x 10

5 solua /ml. Keskeytetty solut levitetään sitten MS-siru kautta Tygon putkeen. Kokeen aikana, puristettu typpikaasua sovellettu solususpensio paineessa ~ 10 psi (69 x 10

3 Pa). Tyypillinen erottaminen kesti -15 minuuttia, ja keskimääräinen virtausnopeus säädettiin 1-2 ml /h. Solut levitetään MS-siru oli kuvattu fluoresenssimikroskopialla (IX81, Olympus). Solujen määrä pidettyjen siru erottamisen jälkeen laskettiin Image J.

In vitro

naarmu määritys

tyhjästä Testi suoritettiin joko natiivi solut (kontrolli) tai transfektoitu solut (ryntäily ja siRNA vastaan ​​hENT1) tutkia vaikutusta hENT1 knockdown on solujen vaeltamiseen. Capan-1 tai Pancin 03,27 solut ympättiin 24-kuoppalevylle. Kun solut ovat noin 50-60% konfluentteja, solut pestiin PBS: llä ja transfektoitiin sitten INTERFERin sisältävät siRNA vastaan ​​hENT1 tai negatiivinen siRNA, jonka pitoisuus on 50 nM Opti-MEM. 6 tunnin kuluttua transfektiosta solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 2 päivää. Naarmu solun yksikerroksista luotiin käyttäen pipetillä kärjestä. Sitten levyt pestiin ja korvataan halutulla välineellä. Aikaviivekytkin mikroskooppi (Evos FL Auto Imaging System, Life Technologies), jossa kammio (95% ilma ja 5% CO

2) ja lämpötilan valvonta (37 ° C) käytettiin hankkimisesta kuvia saman alan automaattisesti 18 tuntia. Kuvat hankitut analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä Image J.

Tilastollinen

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Tilastollinen merkitsevyys tunnistettiin kaksisuuntainen ANOVA-analyysillä käyttäen GraphPad Prism 5.0. AP arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset ja keskustelu

Tutkiakseen korrelaatio hENT1 ekspressiotaso ja solujen mekaniikka, kahdenlaisia ​​haimasyövän solulinjoissa, Capan-1 ja Pancin 03,27 suhteellisen korkeammat hENT1 lauseke (kuva S1 File S1), valittiin. SiRNA transfektio, hENT1 vaimentua solut määritettiin (kuvio 2). Sitten mitataan muutoksia solujen mekaniikka kahdella eri menetelmällä, AFM ja mikrofluidistiikkaan erottaminen. AFM toimenpiteet elastiset ominaisuudet elävien solujen suoran mekaanisen vuorovaikutuksen koetin ja solun pinnan. Cell jäykkyys vaikuttaa laajuus ulokkeen taipuma kun vuorovaikutus pinnan kanssa tarttuvien solujen [19]. Elävä solu sisennys indusoi muodonmuutos solun osastojen jotka sisältävät kalvo, solun tukirankojen, tuma, ja erilaiset soluelimiin. Siten elastiset ominaisuudet solujen johtuvat yhteenlaskettu vaikutus muotoaan lukuisia solun komponentteja. Käytimme piidioksidi mikrohiukkasten (halkaisija: 5 um) modifioitu ulokkeen (kuva S2 File S1) vähentää solumembraanivaurioita kosketuksen aikana ja vääristää aineisto eri tavalla kuin terävä kärki. Optimoida sisennys voima, me kohdistetun voiman jopa 10 nN kuten kuvassa S2 File S1. Jatkuva Youngin Panc 03,27 solujen on saatu aikaan syvennys voimat jopa 200 pN, mikä osoittaa, mittausta solun jäykkyys käyttäen AFM on voimassa vain pieniä muodonmuutoksia elävien solujen. Molemmat solulinjat kehittyi samaan tapaan samoissa sisennyksen voima, eli 100 pN. Ohjaus- soluja ja soluja transfektoitiin negatiivisen siRNA olivat merkittävästi jäykempiä kuin hENT1 knockdown-soluja (kuvio 2 ja kuvio S3 File S1). Solujen keskimääräinen jäykkyys sekä kontrolli- soluja on 2,95 ± 1,55 kPa (Capan-1) ja 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03,27); kuitenkin, että hENT1 pudotus soluista osoitti merkittävästi vähentynyt Youngin moduli, jossa arvot 1,50 ± 0,63 kPa (Capan-1) ja 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03,27).

(A) Western blot -analyysit hENT1 (55 kDa ) ja GAPDH (37 kDa) in Capan-1 (vasemmalla) ja Pancin 03,27 soluja (oikealla) ilman hoitoa (ctrl) tai hoidon jälkeen negatiivisen siRNA (scrl) tai hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (B) Bar histogrammit osoittavat Youngin moduuli ohjaus, negatiivinen siRNA transfektoitu, ja hENT1 pudotus soluja. (N.S.: tilastollisesti merkitsevä).

Koska AFM rajoittuu paikallismittausyksikköä solun mekaniikka, me arvioitiin myös solujen muodonkestävyyskokeita käyttäen mikrofluidinen erotusmenetelmä [20] vahvistavan AFM havaintoja. Mekaaninen erottaminen siru (MS-siru, kuvio 3A) suunniteltiin keinotekoisella microbarriers yhdistettynä hydrodynaaminen voima erillinen muotoaan muuttava jäykistä soluista [21]. Sen osoittamiseksi, kapasiteetin MS-sirun erillisiä soluja, joka perustuu muovattavuuden, testasimme seoksen erottamiseksi, joka sisältää kaksi eri soluissa: ohjaus- ja hENT1 pudotus. Kalvo valvonta- ja hENT1 pudotus solut värjättiin käyttämällä Alexa Fluor 594 ja 488 konjugoitu vehnänalkioita agglutinin (WGA), tässä järjestyksessä. Kuten kuviossa S4 File S1, vaikutus WGA solun jäykkyys on vähäinen. Osuus kahdessa solulinjassa vaihteli pituudelta siru. Kuten kuviossa 3D ja 3G, halkaisijat sekä solujen valvontaa ja hENT1 pudotus, olivat samanlaiset. Solu seos yhtä suurina määrinä tiheydellä 1 x 10

5 solua /ml ruiskutettiin MS-siru ja virtasi 15 minuuttia. Erot viestit array tässä suunniteltu MS-siru alueella 22 2 pm. Kanavat välttää este, joka esiintyy toistuvia paneelit virkaa, jotka säätelevät ja tasaamaan hydrodynaamisen paineen koko siru. Oletuksena on, että ei ole fyysistä kontaktia välillä PDMS pilarin ja solujen koska PDMS on päällystetty BSA. Leikkausjännitys on tärkein tekijä vuorovaikutuksessa solujen. Kun raon koko post paneelit on suurempi kuin solun halkaisija, paine voima (F

p, 10 psi tässä tutkimuksessa) on ainoa voima soluissa. Jos solu halkaisija on sama tai suurempi kuin aukon koko, kitkavoima (F

f) vastustaa puristusta (kuvio 3B). Jos solut ovat jäykempiä, ne työntävät kovemmin jälkeisestä paneelit, ja sitten F

f on merkittävästi lisääntynyt. Kuvio 3C esittää Pancin 03,27 soluja loukkuun MS-chip kuvantaa fluoresenssimikroskopialla; punainen fluoresenssi osoittaa säätökennoja ja vihreän fluoresenssin osoittaa hENT1 knockdown soluja. Sisääntulossa, yhtä suuri määrä punaista ohjaus Panc 03,27 (tai Capan-1-solut) ja vihreä hENT1 pudotus Panc 03,27 (tai Capan-1) soluja havaittiin (kuvio 3C ja 3E-I). Tällä alueella, kanavat olivat paljon laajempi, että halkaisija solujen, mikä ei ole merkittävää erottaminen joustava ja jäykkä soluja. Johtuen pienemmän halkaisijan Capan-1-solut (keskihalkaisija: 15 pm), erotus saavutettiin 8 um rako koko post taulukot. Mutta, jos Panc 03,27 solujen (keskimääräinen halkaisija: 19 um), suuret erottaminen tapahtuu 12 um. Näissä solulinjoissa, solujen kontrolliryhmässä oli johdonmukaisesti loukkuun, kun hENT1 pudotus solujen läpi aukkojen useammin. Nämä kokeet osoittavat kokonaistehokkuutta erottaminen kaksi eri fenotyyppejä samanlaisia ​​halkaisijaltaan MS-siru. Täten voimme päätellä molemmat ohjaus solut ovat suhteellisen jäykempi kuin hENT1 pudotus soluja, ja nämä tulokset ovat yhtäpitäviä AFM havaintojen.

(A) valokuva (vasemmalla) mikrofluidisten erottaminen chip (MS-chip) visualisoitu punainen väriaine sisällä ja edustava pyyhkäisyelektronimikroskooppisesti (oikealla) kuva kentältä array (halkaisija pilari: 35 pm, korkeus pilari: 30 pm). (B) Helotaustanäkymä kuva ja järjestelmä solujen virtaa MS-siru, kun solu halkaisija on pienempi kuin pilari aukon koossa (punainen nuoli osoittaa soluja). Tässä oletetaan, että kitka johtuu ainoastaan ​​leikkausjännitys (F

p: puristusvoima vasten käytetyn paineen (10 psi tässä tutkimuksessa), F

f: kitkavoiman). (C) fluoresenssi kuvaa yhden kanavien joukossa kahdeksan osoittaa säilytetään Panc 03,27 solut MS-sirun erottamisen jälkeen Panc 03,27-ctrl (punainen fluoresenssi) ja Panc 03,27-hENT1 pudotus (vihreä fluoresenssi). Edustavia suurennettuna konfokaali mikroskooppisia kuvia MS sirun (aukon koko 12 pm 6 pm) esittävät tehokkuuden erottaminen aukkojen läpi. Kokojakauma soluja (D: Capan-1, G: Panc 03,27 solut). Tilastollinen analyysi solujen (E: Capan-1, H: Panc 03,27) ja murto-suhde solujen (F: Capan-1, I: Panc 03,27) pidettävästä siru. Arvot edustavat keskiarvoa ± keskihajonta.

ymmärtää, miten hENT1 vaikuttaa solujen mekaniikka, fysiologisia muutoksia soluissa jälkeen hENT1 pudotus tutkittiin konfokaalimikroskopialla. Havaitsimme, että solun morfologiset muutokset liittyvät hENT1 knockdown. Kuten kuviossa 4 on esitetty, solut visualisoitiin käyttäen konfokaalista laser- skannaus mikroskoopilla ja solujen pyöreyttä analysoitiin kvantitatiivisesti laskemalla muodossa tekijät (FF). FF saadaan yhtälöstä, 4π (alue) /(ympärysmitta)

2, joka antaa arvoa 1. täysin pyöreä kehä ja pienentää niitä pienemmät positiiviset arvot vähemmän pyöreä kehä [22]. Capan-1 ja Panc 03,27 solut ovat epiteelin tyyppi ja ne ovat läheisessä yhteydessä toisiinsa välistä adheesiota komplekseja. Heillä on squarish muodot FF arvoilla 0,74 ± 0,08 ja 0,77 ± 0,06, vastaavasti (kuva 4B). Sitä vastoin sekä solujen jälkeen hENT1 Knockdown tuli pitkänomainen paljon pienemmillä FF arvoilla 0,44 ± 0,14 ja 0,52 ± 0,16, vastaavasti.

(A) edustaja konfokaali micrographs haiman soluja (Ylälevy: Capan-1, Pohjalevy: Pancin 03,27) osoittaa f-aktiini jakelu, (B) muodossa tekijä (f = 4πa /p

2; a: alue, p: kehä) analysoitiin Image J (Capan-1-solut, ctrl: n = 37, SCRL: n = 59, hENT1 ↓: n = 29; Panc 03,27, ctrl: n = 36, scrl: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: tilastollisesti merkitsevä).

Lisäksi vaikutus hENT1 knockdown organisaatio solun tukirankojen arvioitiin. Olemme värjättiin vinkuliinin, joka ohjaa muodostumista paikallisessa tarttumisessa (FA) suoraan vuorovaikutuksessa aktiinin ja muiden proteiinien, jotka osallistuvat FA muodostumiseen [23]. FA, sivustot kiinnikkeiden välissä solun ja soluväliaineen (ECM), ja stressi kuidut kate on selkeät roolit liikkuviin solussa eteenpäin [23], [24]. Tutkimukset ovat raportoineet, että FA koko korreloi solujen nopeudella; Suuremmat FA löytyy enemmän pitkänomainen ja nopeammin liikkuvia soluja [25], [26]. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet uudelleenjako F-aktiini ja muutokset fokaalisen adheesion alueella hENT1 knockdown-soluja (kuvio 5). Aktiini kuituja molemmissa kontrolliryhmissä oli enimmäkseen keskittynyt solun reuna, ja pieni, orastavan FA havaittiin. Mutta sen jälkeen, kun hENT1 pudotus, lisääntyi määrä stressiä kuituja sekä mitattavissa fokaalisen adheesion alueilla. Nämä tulokset viittaavat siihen, lisääntynyt solujen liikkuvuuden molemmissa solulinjoissa.

konfokaali micrographs (z-pinoja pohjapinta tasossa, 0-1,5 um) osoittaa vinkuliini (punainen) ja F-aktiini (vihreä) (A) Capan- 1 ja (B) Panc 03,27 soluja. Alue fokaalisen adheesion (pixel

2) analysoidaan Image J.

Lisäksi jotta ymmärtää vaikutus hENT1 Knockdown solun liikkuvuuteen, tutkimme vaikutus downregulation hENT1 on solujen vaeltamiseen. Haava alusta otettiin käyttöön konfluentin yksisolukerroksen, ja sitten haava tiiviste havaittiin 18 tuntia (kuvio 6). Alue haavan laskettiin käyttäen Image J ja siirtonopeutta (alue haavan (im

2) /h) laskettiin, kuten on esitetty kuviossa 6. haava tiivistysalueeksi ja siirtonopeutta kummankin kontrollisolujen ja solut transfektoitu scramble siRNA ovat samankaltaisia. Mutta hENT1 tukahdutti Capan-1 tai Pancin 03,27 solut vaeltavat 1,8 (1,7) eli 1,5 (1,5) kertainen nopeammin kuin kontrolli (ryntäily siRNA transfektoidut solut), tässä järjestyksessä. Niinpä vahvistaa downregulation hENT1 indusoi muodostuu suurempia paikallisessa tarttumisessa ja edistää nopeammin solujen vaeltamiseen. Joka perustuu solujen morfologisia muutoksia ja lisääntynyt solun liikkuvuus, on mahdollista, että molemmat solut käyvät läpi fenotyyppisiä muutoksia, johon liittyy irronneen solujen välinen tarttuminen ja cytoarchitectural uudelleenjärjestelyä. Kun EMT, uudelleenjärjestely solun tukirankojen ohella kasvu FA dynamiikka on ratkaisevan tärkeää solujen lähteä epiteelin ja aloittaa vaeltavat läpi ECM [22], [27], [28]. Esimerkiksi tuore tutkimus osoitti lisääntynyt maahanmuutto jälkeisten EMT SKOV-3-soluja, jotka oli transformoiva kasvutekijä-β (TFG-β), joka syntyy suurempi FA mekaanisia voimia kuin ennalta EMT soluihin [16]. TGF-β ilmoitetaan EMT induktori eri epiteelisolujen solulinjojen munuaisten proksimaalisten tubulusten ja keuhkorakkuloiden epiteelisolujen [16], [29], [30]. Lisääntynyt vuorovaikutus aktiinisytoskeletonin ja solunsisäisten molekyylien FA aloittanut yhdistyksen integriini α5β1 ja fibronektiinin parannettu solujen liikkuvuutta [16].

naarmuja esiteltiin yksikerroksista (A) Capan-1 ja (D) Pancin 03,27 solut. Valokuvat otettiin heti haavan induktion 18 tuntia. Haava tiivistys alueet (B) Capan-1 ja (E) Pancin 03,27 solut laskettiin käyttäen Image J ja verrattiin kontrolli, ryntäily siRNA transfektoitu, ja hENT1 pudotus soluja. Migration nopeus (C) Capan-1 ja (F) Pancin 03,27 solut laskettiin.

Jotta voitaisiin vahvistaa niitä fysiologisia muutoksia aiheuttamien hENT1 Knockdown liittyvät EMT, analysoimme muutoksia EMT merkki proteiineja, kuten E-kadheriinin ja N-kadheriinin, kun hENT1 knockdown. E-kadheriinin on yksi solu-soluadheesion molekyylejä. Joka ylläpitää solu-solu kontakteja ja epiteelin arkkitehtuuria. Vuorottelu ilmaus kadheriineja E-kadheriinin N-kadheriinin, joka on ensisijaisesti ilmaistaan ​​mesenkyymisolujen, tapahtuu EMT. Tämä vuorottelu johtaa jyrkkä muutos liima ominaisuuksia solujen, koska se menettää affiniteetti epiteelin naapureille ja voitot affiniteetti mesenkyymisolujen, jotka ovat nonpolarized, puute välisissä liitoksissa, ja on ainutlaatuinen kara kaltainen muoto [27], [ ,,,0],31], [32]. Jälkeen hENT1 downregulation, sekä solulinjat osoittivat heikkoa ilmentymistä E-kadheriinin ja korkea ekspressio N-kadheriinin, jotka ovat merkittävä tunnusmerkki EMT (kuvio 7). Menetys E-kadheriinin ja voitto N-kadheriinin kasvattaa solun liikkuvuus ja metastaattisen potentiaalia. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että alennettu solu jäykkyys suoraan korreloi lisääntyneeseen metastaattista potentiaalia käyttämällä erilaisia ​​in vitro biomekaaniset analyysimenetelmiä [11], [17], [33]. Väheneminen solujen jäykkyys moduloi, että solut ovat parhaillaan EMT jälkeen hENT1 pudotus, kun se on osoitettu kuviossa 2. Kuitenkin, on merkityksetön ero ekspressiotasot väli lankojen, sytokeratiini 18, ja ydin- solun tukirangan, lamiini A /C molemmissa solulinjoissa (Kuva S5 File S1).

Länsi pyyhkii ja suhteelliset ekspressiotasot E-kadheriinin (110 kDa), N-kadheriinin (140 kDa) (A) Capan-1 ja (C) Pancin 03,27 soluja hoidon jälkeen hENT1 siRNA. Sarakkeet histogrammit ovat keskiarvo kahdesta riippumattomasta kokeesta (intensiteetti suhde GAPDH E-kadheriinin tai N-kadheriinin). Edustavia konfokaali kuvia E-kadheriinin (punainen fluoresenssi) ja N-kadheriinin (vihreä fluoresenssi) ilmaisuja (B) Capan-1 ja (D) Pancin 03,27 soluja.

Vahvista meidän forementioned tutkimuksia, jotka viittaavat siihen, että EMT voidaan luonnehtia muutoksia solujen jäykkyys, arvioimme fenotyyppisiä muutoksia haimasyövän soluja käsittelyn jälkeen TGF-β. TGF-β on raportoitu useissa tutkimuksissa indusoida EMT [15], [16], [30]. Siksi olemme edelleen tutkitaan nämä tulokset toisessa kokeessa käyttämällä EMT aiheuttama haiman syöpäsoluja. Panc 03,27 solut altistettiin TGF-β 2 päivää, jonka pitoisuus on 10 ng /ml aiheuttamaan EMT, ja sitten mitataan solujen jäykkyys. Hieman tukahdutti E-kadheriinin ja kohonnut N-kadheriinin ja vimentiinista ilmaisuja osoittavat, että EMT indusoituu Pancin 03,27 soluissa (kuvio S6A File S1). Pancin 03,27 solut käsiteltiin TGF-β osoitettiin vähentynyt Youngin kerroin (1,42 ± 0,53 kPa) versus käsittelemättömien solujen (1,91 ± 0,78 kPa). Tämä tulos viittaa siihen, että solun jäykkyys pienenee, kun solut on meneillään EMT. Viime aikoina on raportin, joka koskee solujen jäykkyys muutoksista EMT aiheuttama A549-solujen TGF-β hoito [15]. Heidän tutkimuksessaan he mittasivat paikallinen mekaaniset ominaisuudet A549-solut terävällä DNP ulokkeen (20 nm kärjen säde), joka on pienempi kosketuspinta verrattuna mikrohiukkasten modifioitua uloke. Vaikka on olemassa ratkaisevaa näyttöä solun fenotyypin muutos epiteelin ja mesenkymaalisten eli solujen muoto muuttuu ja kasvaa stressi kuidut ovat edelleen sopusoinnussa työtämme.