Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin osa ihmisen genomin transkriboidaan ja tuottaa ei-koodaavat RNA: t (ncRNAs), jotka eivät koodata proteiinia tietoja. Pitkien ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) ovat nousemassa uusi luokka ncRNAs, mutta myös näihin ncRNAs on rajallinen. Aiemmin laboratoriossamme on havainnut, että lncRNA, uroteelisyöpä liittyy 1 (UCA1), oli tärkeä rooli virtsarakon syöpään. Huolimatta viime aikoina kiinnostus UCA1 diagnostisena markkerina virtsarakon syövän, vähän tiedetään sen transkription säätelyyn. Valaistaan ​​säätelyyn UCA1 geeniekspressiota, olemme tunnettu ihmisen UCA1 geenin promoottori. 2,0-kb: n fragmentti sen 5 ’reunustavan alueen kloonattiin lusiferaasireportteri- vektori. Poisto ja mutaatio analyysi ehdotti, että Ets-2 sitoutumiskohta oli kriittinen UCA1 geenin promoottorin aktiivisuutta. Tarkempi analyysi Tämän sivuston geeli- siirtämällä, kromatiinin immuuni sateeseen (chip), ja kotransfektiokokeissa osoittivat, että transkriptiotekijä Ets-2 suoraan sidottu UCA1 promoottorialueen ja stimuloi UCA1 promoottorin aktiivisuutta virtsarakon syövän soluissa. Ottaen huomioon anti-apoptoosin toiminto Ets-2, meidän tiedot osoittivat, että Ets-2 säätelee apoptoosia prosessin ekspressiota sääteleviä UCA1 lisäksi UCA1 voi olla osallisena aktivaatioon Akt signalointireittiä Ets-2 virtsarakon syövän soluissa .

Citation: Wu W, Zhang S, Li X, Xue M, Cao S, Chen W (2013) Ets-2 Säätelee solukuoleman kautta Akt Pathway kautta asetukseen uroteelisyöpä Associated 1, joka on Long koodaamattomat RNA, vuonna virtsarakon syövän solut. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10,1371 /journal.pone.0073920

Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu: 12 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Natural Science Foundation of China (Grant nro 81072104). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eukaryotic genomit eivät ole yksinkertaisia, hyvinjärjestys alustoille geenikopioinnin joka oli aikoinaan uskottiin. Me tiedämme nyt ne puhtaaksi laaja kirjo RNA-molekyylien, jotka vaihtelevat pitkä proteiinia koodaavan mRNA: t lyhyen koodaamattomalla selostukset, joka usein päällekkäisiä tai lomitetaan joko lohkon [1]. Pitkien ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) ovat nousemassa uuden luokan ei-koodaavat RNA: t, jotka sisältävät enemmän kuin 200 nukleotidia, mutta tieto näistä lncRNAs on rajallinen. LncRNAs ovat transkriptien, jotka muistuttavat proteiinia koodaavan mRNA: iden, koska ne on peitetty, saumattu ja polyadenyloitu RNA-polymeraasi II transkriptit. Ne eroavat mRNA: iden vain niiden puute proteiinia koodaavan avoimen lukukehyksen (ORF) [2].

Toisin monimuotoisuuden RNA-laji, vain pieni määrä lncRNAs havaittiin olevan kokeellisesti johdettuja toiminnot. Lisäksi dysregulaatio lncRNA on esitetty erityyppisiä syöpiä [3], [4], kuten MALAT-1 keuhkosyöpä [5], HULC maksasolukarsinoomassa [6], ja hotair rintasyövän [7] , mikä osoittaa, että lncRNAs voi olla kriittinen rooli kasvainten synnyssä tai syövän etenemiseen.

Aiemmin loimme BLZ-211 ja BLS-211-solut, jotka ovat pari transitionaalista rakkosolukarsinoomaa (TCC) solulinjat kloonataan erikseen saman potilaan näytteestä, mutta eri biologiset ominaisuudet [8], [9], [10]. Sitten Me raportoitu uusi expressed sequence tag (EST) (Genbank-numero DR159656) eristettiin näistä kahdesta solulinjoja käyttämällä subtraktiivisen suppression hybridisaatio (SSH) tekniikka [11]. Tämän perusteella EST, me kloonattu ja tunnistettu ncRNA nimeltä uroteelisyöpä liittyy 1 (UCA1) (Genbank-EU334869) [12]. UCA1 kuuluu lncRNAs puutteen vuoksi vahva Kozak-konsensussekvenssin translaation aloitusta varten missä tahansa ATG-kodonia on useita pieniä ORF: t [12]. Monet tutkimukset viittaavat siihen UCA1 voi toimia molekulaarinen merkkiaine virtsarakon syövän, koska se on erinomainen spesifisyys ja herkkyys [13], [14]. Aikaisempi tutkimus laboratoriossamme myös ymmärtää, että kohonnut UCA1 ilmentyminen voi vaikuttaa virtsarakon syövän solujen kasvua ja invaasiota virtsarakon syövän solujen [12], mikä viittaa siihen, että olisi uusi terapeuttinen kohdegeenin virtsarakon syöpään. Tästä huolimatta korot, tiedetään vähän

cis

sääntelyvälineitä elementtejä suoraan mukana transkription modulaatioon UCA1 geenin virtsarakon syöpään. Lisäksi tutkimus laboratoriossamme osoittavat, että on olemassa kolme silmukoinnin variantteja UCA1 geenin olemassa olevia virtsarakon syövän soluissa [12], [15]. Kohonnut ekspressio UCA1 virtsarakon syöpä ja olemassaolon silmukoinnin variantteja viittaavat vahvasti siihen, että transkription säätelyn UCA1 geenin tiukasti kontrolloitua. UCA1

cis

asetus voi muovata monimutkaisia ​​geeniekspressiota verkkoja, jotka lopulta ajaa biologisten prosessien, kuten solujen apoptoosin.

Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet promoottori ihmisen UCA1 geenin ensimmäistä kertaa ja tutki säätelyn UCA1 promoottorin ETS-2 transkriptiotekijä. Ets-2 voi vaikuttaa virtsarakon syövän solujen apoptoosin ekspressiota sääteleviä UCA1. Olemme myös todettu lncRNA UCA1 voi olla mukana aktivointi Akt-reitin. Tämä tutkimus antaa käsityksen sääntelyn mekanismi UCA1 ilmaisun jatkotutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Promoottori Prediction

Aiemmin koko pituudeltaan UCA1 cDNA ja sen transkription aloituspaikan (TSS) tunnistettiin käyttäen SMART RACE tekniikkaa [12]. Tässä tutkimuksessa, MegaBLAST (NCBI), ohjelma käytettiin kartoittamaan UCA1 geeni ja sen 5 ’reunustavan alueen ja DNA-sekvenssit ladattu GenBank (NC_000019.9). TSS on UCA1 geeni merkitty +1. Ennustaa promoottori ja oletettua transkriptiotekijöitä, seuraavat joitakin online-ohjelmisto käytettiin. Promoottori ja TSS ennustaa välineitä ovat FPROM ohjelman Softberry ohjelmisto (https://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom group=programs subgroup=promoter) ja PromoterInspector ohjelman Genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. Matlnspector-ohjelman Genomatix (https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18], käytettiin transkriptiotekijä ennustamiseen.

plasmidikonstrukteja

pGL3-UCA1-2000 plasmidi DNA-fragmentti, joka sisälsi

cis

alueen UCA1 geenin -1800-200 bp monistettiin PCR: llä (PrimeSTAR® HS-DNA-polymeraasia, TaKaRa, Dalian ). PCR-tuote hajotettiin sitten leikattiin irti agaroosigeelistä ja eristettiin käyttäen agaroosigeelillä DNA-fragmentin Recovery Kit (TaKaRa, Dalian). Puhdistettu DNA-fragmentti insertoitiin sitten pGL3-Basic lusiferaasi ilmentävällä vektorilla (Promega, USA) kautta

Kpn

I ja

Nhel

I sivustoja. Muut katkaistuja fragmentteja tehtiin edellä kuvatulla tavalla. Alukesarjat käyttää tämän sarjan tuotteet annetaan taulukossa 1. Monistettu DNA-fragmentit insertoitiin pGL3-perusvektoriin läpi saman restriktioendonukleaasikohtia. Kaikki DNA-konstruktit sekvensoitiin.

kohdennettu mutageneesi

korvaaminen mutaatio Ets-2-sitoutumiskohdat muodostettiin PCR-pohjainen kohdennettu mutageneesi (Byotime, Kiina) . PGL3-UCA1-1200 vektoria käytettiin DNA-templaattina ja Ets-2 core sitoutumiskohta (GGGAAG) korvattiin on

Hind

III-restriktiokohdan (AAGCTT) (taulukko 1). Mutantti vektori nimettiin pGL3-UCA1-1200-mut. Mutaatiot varmistettiin restriktioentsyymidigestiolla ja sekvensointi.

Cell Culture, ohimenevä transfektio

Ihmisen virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) solulinjat BLZ-211 ja BLS-211 viljeltiin RPMI 1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). BLZ-211 ja BLS-211 solulinjat perustettiin meidän lab vuonna 1994. virtsarakon syövän kudosta oli kirurgisista näytteitä 55-vuotias mies, jolla diagnoosi multifokaalisia papillaarisen siirtymäkauden cell carcinoma (TCC) luokka II. Kaikki menettely hallinnoi unber hyväksyntää eettisen komitean ensimmäisen Affiliated sairaala, School of Medicine, Xi’an Jiaotong yliopiston [8]. Solut, joissa on enemmän kuin 80% konfluenssiin käytettiin transfektioon.

BLZ-211-solut transfektoitiin FuGENE®HD Transfection Reagent (Roche, USA) 24-kuoppaiselle levylle. Kukin kuoppa sisälsi 2 x 10

5 solua, 0,5 ug pGL3-UCA1 sarjan vektori, 0,02 ug sisäisen valvonnan vektorin PRL-TK (Promega, USA), 1 ui FuGENE®HD, ja 500 ui RPMI 1640 -alustassa ilman seerumia tai antibiootteja. pGL3-basic (Promega, USA) vektori transfektoitiin kontrollina. SiRNA transfektiosta solut transfektoitiin X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, USA) 6-kuoppaiselle levylle. Sekä Ets-2 siRNA ja sekoitetun ohjaus siRNA ovat kaupallisia tuotteita (Santa Cruz, USA).

Lusiferaasimäärityksiä

Ennen koetta solut huuhdeltiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), 48 tuntia sen jälkeen, kun transfektio ja hajotettiin passiivisessa lyysipuskurissa (Promega, USA). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin luminometrillä (Promega, USA) käyttäen Dual-lusiferaasireporttiterilla iinianalyysikitissä (Promega, USA). Tulos oli normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Raportoitu tiedot olivat edustettuina keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

Nuclear proteiinit poimittiin BLZ-211-soluihin käyttämällä tumaproteiiniuutetta Kit (Byotime, Kiina ). Sitten elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä suoritettiin EMSA Kit (Pierce, USA). Sitten koettimet valmistettu perustuu Ets-2 sitoutumiskohta UCA1-geenin promoottorin ja sen vastaavan komplementaarisen sekvenssin (5′-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 ’) kutsutaan UCA1-wt-Ets mukana mutantti versio (5′-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3′ ) samoin, nimeltään UCA1-mut-Ets. 5’-biotiini muutos sisältyi UCA1-wt-Ets anturi. Kilpailun määrityksiä, 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta koettimet ja leimaamattoman mutantti koettimia inkuboitiin reaktioseoksen kanssa ennen lisäämistä leimatun koettimen.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) Pitoisuus

1 x 10

7-soluja silloitettu 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kylmässä PBS: ssä, otettiin talteen kaapimalla ja suspendoitiin uudelleen solujen hajotuspuskuriin, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Roche, USA). Kun oli inkuboitu 10 minuuttia jäillä, soluja sonikoidaan noin 200-1000 bp: n DNA-fragmentit, ja sentrifugoitiin 10 min 4 ° C: ssa. Supernatantit jaettiin ja inkuboitiin joko anti-Ets-2-vasta-ainetta (Santa Cruz, USA), tai IgG: tä (Boster, Kiina) negatiivisena kontrollina 4 ° C: ssa yön yli kierto, vastaavasti. Immuunikompleksien saostettiin lohen sperman DNA: ta /proteiini-G-agaroosin (Millipore, USA) 2 tuntia 4 ° C: ssa, sitten otettiin talteen, pestiin, eluoitiin ChIP eluutiopuskurilla ja kääntää silloitettu kuumentamalla 65 ° C: ssa 4 h. DNA puhdistettiin immunosaostuksella vasta-aineella tai tulo näytteitä ja analysoitiin PCR: llä käyttämällä alukkeita, jotka reunustavat Ets-2 sitoutumiskohta UCA1 geenin promoottori (taulukko 1). ChIP määritykset suoritettiin kahtena kappaleena.

Western Blot

Solut pelletoitiin ja sitten hajotettiin RIPA-puskuria (Thermo Scientific, USA). SDS-PAGE resoluutio ja kalvon siirron kohdeproteiinit seulottiin vasta-aineen kanssa ihmisen Ets-2 (Santa Cruz, USA), Akt, Pakt (Cell Signaling, USA), Bax (Epitomics, USA) tai GAPDH (Abmart, Kiina ), jota seurasi inkubointi piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen immunoglobuliini-vasta-aineita (Santa Cruz, USA). Lopuksi, nauhojen visualisoitiin kemiluminesenssin avulla kemiluminesenssidetektiolla (Pierce, USA) ja spesifistä vyöhykettä rekisteröitiin röntgenfilmille.

Apoptosis Assay

määrittää apoptoosin, soluja värjätään anneksiini V ja PI käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis havaitseminen kit (Keygene Biotech, Kiina) valmistajan ohjeita. Fluoresenssi havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus, Japani) ja virtaussytometria syaanin ADP 9 väriä Beckman Coulter (Beckman Coulter Brea, CA). Virtaussytometria kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD) kolmesta erillisestä kokeesta. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistoa. Erot ryhmien analysoitiin käyttämällä Student

t

-testi.

P

0,05 arvon katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Kloonaus ja Bioinformatial analyysi UCA1 promoottorialueen

Aiemmissa tutkimuksessa transkription aloituskohdasta (TSS) on UCA1 tunnistettiin 5′-RACE [12]. MegaBLAST ohjelma NCBI käytettiin määrittämään TSS on UCA1-geenin, joka oli sijoitettu 15939757 asemaan CHR 19 (GRCh37 /hg19). Merkintä tämän sivuston +1, yhteensä 3,0 kb: n DNA-sekvenssit UCA1 5′-asetus alue (-2000 BP- + 1000 ep) on saatu GenBank, jota käytettiin bioinformatical analyysiä. Tulos FPROM ohjelma ehdotti, että TSS sijaitsee +135 bp, ja TATA-laatikko +105 bp. Analyysi PromoterInspector ohjelma osoitti, että promoottorialueen välillä -515 bp: n ja +100 bp alueella. Ottaen huomioon edellinen 5′-RACE tulokset ja tulosennusteita, päätimme sekvenssit -1800 bp + 200 emäsparia seuraavista tutkimukseen. Arvioida UCA1 promoottorin aktiivisuutta, toimittaja konstrukteja, jotka sisältävät useita 5′-reunustavia sekvenssejä (pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) mitattiin lusiferaasianalyysissä in BLZ-211 soluja. Konstruktit pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 ja pGL3-UCA1-600 näytetään eri promoottorin aktiivisuutta. PGL3-UAC1-1200 saatiin vahvin promoottori toiminnan Näiden rakenteiden. Erityisesti silloin, kun DNA-fragmentti välillä -400 bp ja -150 bp poistettiin, promoottorin aktiivisuus oli lähes poistetaan (Fig. 1A), mikä viittaa siihen, että on olemassa kriittinen positiivisen säätelyelementin tällä alueella. Nämä poistetaan kokeet viittaavat siihen, että UCA1 promoottorin aktiivisuutta havaittu BLZ-211-solut on pääosin seurausta positiivisen sääntely elementti välillä -400 bp ja -150 bp promoottorialueen. Oli monia transkriptiotekijä (TF) sitoutuvilla sivustoja tällä alueella ennusti bioinformatiikan ohjelmassa Matlnspector, myös otaksuttu Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,

et, al

. (Fig. 1 B). Näistä transkriptiotekijät, valitsimme Ets-2 mahdolliset TF johtuen korkeimman ennusteen pisteet.

(A) lusiferaasianalyysissä. Viisi typistettyjä DNA fragmentteja UCA1 promoottorialueen pGL3 vektoreihin, negatiivinen kontrolli vektorin pGL3-basic, ja positiivinen kontrolli vektori, pGL3-kontrolli, transfektoitiin BLZ-211 soluja. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05. (B) transkriptiotekijöitä ennuste käyttämällä Matlnspector ohjelmistoa. Transkriptiotekijät korkea ennustaminen pisteet olivat läsnä.

Ets-2-sitoutumiskohtia edesauttaa promoottoriaktivoinnilla

Sen tutkimiseksi, Ets-2 on kriittinen UCA1 promoottorin toimintaa, voimme korvata ETS-2 sitovat kohdat

Hind

III restriktioendonukleaasipaikat in pGL3-UCA1-1200-mut. Verrattuna reportteri lusiferaasiaktiivisuutta villityypin pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-1200-mut tuotti paljon pienempi promoottorin aktiivisuutta BLZ-211-solut (Fig. 2A), jotka osoittavat, että nämä Ets-2 sitoutumiskohtia todellakin pelataan keskeinen rooli sääntelyn UCA1 promoottorin aktiivisuutta. Vahvista jos transkriptiotekijä Ets-2 voi sitoutua tähän alueeseen, ydin- ote BLZ-211-solut valmistettiin ja EMSA suoritettiin. 22 bp: n oligonukleotidit -378–357 nt sisältävät Ets-2 sitoutumiskohdat käytettiin villityypin koettimen ja saman alueen mutatoitunut sitoutumiskohdista käytettiin mutantti koetin (Fig. 2B). Kuten on esitetty kuviossa. 2B, yksi näkyvä DNA-proteiini-kompleksi on muodostettu villityypin koetin. Sitova kilpaili pois 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta villityypin koetin, mutta ei 200-kertainen ylimäärä leimaamatonta mutantti koetin. Tulokset osoittivat, että tämä alue on vastuussa DNA-proteiini-kompleksin muodostumisen. Tutkia tarkemmin, ovatko Ets-2 voi sitoutua suoraan proksimaaliseen UCA1 promoottori

in vivo

, siru suoritettiin käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​Ets-2 immunopresipitoivan formaldehydi-kiinteä chromatin välillä BLZ-211 soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, näkyvä PCR-tuotteita sisältävien Ets-2 sitoutumiskohtia todettiin käyttäen DNA vedettävä alas vasta-ainetta Ets-2, kun taas mitään vahvistusta ei havaittu DNA immunosaostettiin IgG, osoittaa, että Ets-2 voi suoraan sitoutua UCA1 promoottori BLZ-211-soluissa.

(A) Lusiferaasianalyysi. ETS-2 sitoutumiskohtia (GGGAAG) korvattiin

Hind

III sivustoja (AAGCTT) by mutageneesillä (ylempi paneeli). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudet villityypin (wt) ja mutantti-vektorit (mutantti) mitattiin lusiferaasianalyysissä. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05. (B)

In vitro

havaitsemiseksi Ets-2 transkriptiotekijän sitoutumiseen promoottorialueen UCA1 geenin EMSA-määrityksellä. Yksi Havaittu pää- vyöhyke, kun biotiini-leimattu Ets-2 koetinta inkuboitiin tumauutteen (kaista 2). Ets-2 sitoutumista ei voitu estää mutantti koetin (kaista 3), kun se kilpaili leimaamattoman kylmä koetin (kaista 4). (C)

In vivo

havaitseminen Ets-2 transkriptiotekijän sitoutumiseen promoottorialueen UCA1 geenin promoottorin ChIP määrityksessä. Input kromatiinin (input), jotka edustivat osat sonikoitua kromatiinin ennen immunosaostus, käytettiin positiivisena kontrollina. IgG-vasta-ainetta käytettiin negtive valvonta ChlP määrityksen.

Ets-2 on Olennaista transkriptio asetukseen UCA1

Sen määrittämiseksi, onko transkriptiotekijän Ets-2 voi säädellä UCA1 ilmentymistä , semi-kvantitatiivisia RT-PCR suoritettiin jälkeen kaatamalla Ets-2 erityisten siRNA BLZ-211 soluja. PCR-tulokset osoittivat, että UCA1 mRNA: n ekspressio väheni noin 50% sen jälkeen, vaimennus Ets-2: n ilmentymisen (Fig. 3A). Kuten lusiferaasimääritystä esitettyjen tulosten, kun kotransfektoitiin ETS-2 erityisiä siRNA tai salattu ohjaus siRNA pGL3-UCA1-1200 osaksi BLZ-211 soluja, knockdovvn Ets-2 aiheutti laski aktiivisuutta UCA1 promoottorin verrattuna kanssa salattu ohjaus siRNA ryhmä (Fig. 3B). Nämä tulokset osoittivat, että Ets-2 voi säädellä ilmentymistä UCA1 vaikuttamalla aktiivisuutta UCA1 promoottorin.

(A) Expression of Ets-2 ja UCA1 mitattiin RT-PCR: llä seuraavasti Ets-2-spesifistä siRNA tai salattu siRNA hoidon BLZ-211 soluja. 18 S rRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) Lusiferaasianalyysi. Ets-2-spesifistä siRNA tai sekoitetun ohjaus siRNA oli ko-transfektoitiin pGL3-UCA1-1200 osaksi BLZ-211-soluja. Arvot edustavat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *

P

0,05. NSC: epäspesifiset ohjaus siRNA.

UCA1 voidaan Osallisena indusoiman apoptoosin Ets-2 knockdovvn in BLZ-211 solut

rooli Ets-2 virtsarakon syöpä on epäselvää, näin me tarkistanut toiminnallinen seuraus Ets-2 knockdovvn virtsarakon syövän soluissa. Nostamalla taso apoptoosin havaittiin seuraavat 48 tuntia hoidon Ets-2 siRNA in BLZ-211-solujen kautta fluoresenssimikroskooppiin. Tulokset solujen apoptoosin määritykset osoittivat lisääntynyttä tasoa apoptoosin BLZ-211-soluja, kun soluja käsiteltiin Ets-2-spesifistä siRNA verrattuna salattu ohjaus siRNA hoitoon (Fig. 4A). Voit tarkistaa, Ets-2 indusoi UCA1 geenin ilmentyminen oli mukana apoptoosin tutkittiin toisen virtsarakon TCC solulinjaa, kutsuttu BLS-211. BLS-211 on puute endogeenisen UCA1 ilmaisun ja on peräisin samasta potilaasta kuin BLZ-211-solulinja. Mielenkiintoista, kun kaatamalla ETS-2-geenin, emme jälkeen havaituista apoptoosin BLS-211-solut (Fig. S1). Lisäksi laskimme apoptoottisten solujen käyttäen virtaussytometria molemmissa solulinjoissa erikseen. Yhdenmukainen fluoresenssimikroskoopilla tuloksia, virtaussytometrillä tulokset osoittivat merkittävää lisäystä solujen pro-apoptoosi (oikeasta yläneljänneksestä) jälkeen Ets-2 knockdovvn in BLZ-211-solut (12.49 ± 1,21%

vs.

6,40 ± 1,47%), kun taas ei lisäänny pro-apoptoosin jälkeen havaittiin Ets-2 knockdovvn in BLS-211-solut (4,12 ± 0,28%

vs.

3,20 ± 2,50%) (Fig. 4B). Nämä tulokset viittaavat siihen, UCA1 voi olla osallisena solun indusoiman apoptoosin tukahduttaminen Ets-2.

(A) Apoptoosin induktio jälkeen 48 tunnin hoito Ets-2 siRNA tai salattu ohjaus siRNA in BLZ-211-soluissa tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Solut värjättiin anneksiini V (vihreä) ja PI (punainen). Mittakaava 25 pm. Kuvat edustivat kolmen erillisen kokeen. (B) Apoptoosi kvantifioitiin virtaussytometrialla (FCM). FCM tulokset edustivat kolmen erillisen kokeen. Cellular pro-apoptoosin prosesseihin (oikeasta yläneljänneksestä) lisättiin jälkeen Ets-2 knockdovvn in BLZ-211-solut (12.49 ± 1,21% vs. 6,40 ± 1,47%, *

P

0,05), kun taas mitään merkittävää muutosta in BLS-211-solut (4,12 ± 0,28% vs. 3,20 ± 2,50%,

P

0,05). NSC: epäspesifiset ohjaus siRNA.

UCA1 saa osallistua inaktivointi Akt Pathway in Cell indusoiman apoptoosin Ets-2 säätely alaspäin

onko tukahduttamista Ets -2 aiheuttaa apoptoosin virtsarakon syövän soluissa kautta Akt-reitin, joka on privotal apoptoosin säädin koulutusjakson, tutkimme ekspressiotaso koko Akt ja fosforyloidun Akt (Pakt). Mielenkiintoista, Western blotting tulokset osoittivat, että kun hiljentää Ets-2, Pakt ilmentyminen jälkeen laskenut, kun taas ekspressio proapoptoottiset proteiinin Bax nostettiin (Fig. 5, vasen paneeli). Tuloksemme ymmärtää, että Ets-2 Knockdown käytössä apoptoosin indusoimiseksi BLZ-211-soluihin inaktivaatio Akt-reitillä ja johtanut muutoksiin loppupään kohde- molekyylit. Näin ollen on oletettu, että UCA1 geenin ilmentymistä voi liittyä aktivointi Akt-reitillä, joka on mukana Ets-2: n välittämien anti-apoptoosin prosessi virtsarakon syövän soluissa. Käsitellä tätä käsitettä, me seuraavaksi tutkittiin proteiinin ilmentymistason Akt, Pakt ja Bax in BLS-211 soluja. Kuten on esitetty, se ei ollut havaittavaa eroa Ets-2 siRNA käsitellyssä ryhmässä ja salattu siRNA hoidetussa ryhmässä (kuvio. 5, oikea paneeli). Meidän tulokset viittasivat siihen, että down-regulation Ets-2, transkriptiotekijä on UCA1 geenin, voi indusoida apoptoosia BLZ-211-solujen vähentämällä UCA1 ilmentymisen, ja tämä voi edistää inaktivointi Akt-reitin (Fig. 6).

Ets-2 ja apoptoosiin liittyvien proteiinien havaittiin Western blot. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. NSC: epäspesifiset ohjaus siRNA.

Katkoviiva välillä UCA1 ja Akt osoittaa, että yhdistyksen välillä UCA1 ja Akt voi olla epäsuoraa.

Keskustelu

Virtsarakon syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia Kiinassa, sijoitus ensimmäisenä usein kasvain virtsateiden. Olemme aiemmin osoittaneet, että UCA1 voi edistää solujen kasvua ja invaasiota virtsarakon syöpä [12]. UCA1 on lncRNA, koska sillä on useita pieniä ORF, vaikka ei ole vahvaa Kozak-konsensussekvenssit löydy mitään ATG-kodonia [12], [13]. Useita lncRNAs on tunnistettu, jotka liittyvät ihmisen sairauksiin ja on erityisiä tehtäviä, jotka liittyvät ihmisen sairauksiin [19]. Aikaisemmin osoitimme ajallisen ja ekspressiokuviota UCA1. Kuitenkin, transkription säätely UCA1 geenin ilmentymisen ei ole tutkittu. Tässä ensimmäistä kertaa olemme ominaista promoottorialueen ihmisen UCA1 geenin ja raportoi sääntelyä Ets-2 transkriptiotekijä.

Toisin kuin perinteiset proteiinia koodaavan geenien sekvenssit transkription aloituspaikat eksoni rakenteet, ja pituudet näiden pitkien ei-koodaavan geenit ovat hyvin vaihtelevia [20]. Perustuu niiden genomista läheisyys proteiinia koodaavan geenit, lncRNAs luokitellaan päällekkäisiä, cis-antisense, kaksisuuntainen tai introni ncRNAs [21], [22] kantavassa mekanismit lncRNA ilmaisun ei tunneta, vaikka on paljon näyttöä siitä, että lncRNAs säännellään samanlaisia ​​mekanismeja kuin proteiinia koodaavan geenien. Lyhyesti, tutkimuksessa Wang et ai, he löysivät ydin promoottorialue (nukleotidit -132 ja -48) ja lncRNA HULC geeni ja ne ominaista CREB sitoutumiskohta nukleotidien -67 ja -53 ytimessä promoottorialue [ ,,,0],23]. Eräässä toisessa tutkimuksessa Zhao et ai, ne analysoitiin 5 kb genomista DNA-fragmentti ylävirtaan ensimmäisen eksonin lncRNA MEG3 geeni, tunnettu siitä, CRE-sivuston mukana MEG3 geenin transkription ja totesi myös useita proteiineja CREB perheen sitoutua suoraan CRE sivustolla [24]. Lisäksi monet tutkimukset viittaavat siihen, että mekanismit, joilla ncRNA ekspressio on muuttunut syövät ovat samanlaiset kuin proteiinia koodaavan geenien, mukaan lukien epigeneettinen mekanismeja [25], [26], [27], [28].

tutkimuksessamme olemme analysoineet proksimaalisen promoottorialueen UCA1, joka sijaitsee -2000 nukleotidiä ylävirtaan transkription aloituskohdasta ja UCA1 geenin. Me osoitetaan lusiferaasiaktiivisuus määritys ja deleetioanalyysi että alue nukleotidivälillä -400–150 voi osaltaan perus promoottorin aktiivisuutta. Ja tällä alueella ennustimme monia tunnettuja transkriptiotekijän kautta bioinformatiikan ennuste menetelmiä. Olemme myös osoittaneet EMSA ja siru analyysi että Ets-2 sitoutumiskohtiin nukleotidien -385 ja -380 ollut tärkeä rooli sääntelyn UCA1 promoottorin aktiivisuutta. Tutkimuksessamme käytimme BLS-211-solut, jotka oli jättänyt ilmentämään UCA1 geeniä, vaikka ne ilmaisivat Ets-2-geenin. Kun käsittelimme solut Ets-2 siRNA, The UCA1 promoottorin aktiivisuutta ei poistaa kokonaan. Molemmat havainnot viittaavat siihen, että UCA1 ekspressiota voidaan ohjata muita transkription tekijöitä. Huomionarvoista kun välisellä alueella nukleotidien -700 ja -400 poistettiin, promoottorin aktiivisuus vähentynyt huomattavasti. Siinä ehdotetaan läsnä noin transkription aktivaattoreita tällä alueella. Lisäselvityksiä tulevissa tutkimuksissa on keskitytty muiden TF promoottorin alueen UCA1 geeni, joka edistää aktiivisuutta UCA1 geenin.

Ets-2 oli alun perin tunnusomaista proto-onkogeeni. Vuosien ETS transkriptiotekijä perhe tuli yhteinen tekijä tuumorigeneesiä [29]. Havainnot Carbone

et al

ehdotti, että downregulation Ets-2 eturauhassyöpäsoluissa nähtiin lisääntynyt tasoja anti-apoptoottista proteiinia Bcl-x (L), kasvu säätelytekijöitä sykliini D1, ja c-myc . Tutkimus osoitti erityistä roolia Ets-2 edistämään kasvua ja selviytymistä eturauhassyöpäsolujen [30]. Toisessa tutkimuksessa, ne osoittivat, että väliaikainen ekspressio Ets-2 suojaavat soluja apoptoosin lisäämällä promoottorin aktiivisuutta Bcl-xl, ja näin ollen parantaa sen mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot mesoteliooma solulinjoissa [31]. Aiemmin Hanke

et ai

havaittu, että suhde Ets-2-mRNA: urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) mRNA virtsassa voi olla mahdollinen markkeri virtsarakon syövän [32]. Vaikka data tuettu että Ets-2 osallistuu virtsarakon syövän kehittymisen tarkka roolit ja mekanismit Ets TF: iä virtsarakon syöpä ovat enimmäkseen tuntemattomia.

Tutkimuksessamme me osoitti esto UCA1 ilmaisun aiheuttamien Ets-2 geenien. Toiminnallinen seurauksena Ets-2 geenien johti apoptoosin BLZ-211 soluja. Olemme myös osoittaneet, että Akt koulutusjakso on mukana tässä prosessissa. Seriini-treoniinikinaasi Akt (tunnetaan myös nimellä proteiinikinaasi B) on keskeinen lähentyminen solmun laajasti vaikuttaja signalointiverkon. Akt säätelee olennainen solun toimintoihin, kuten muuttoliike, proliferaatio, erilaistuminen, apoptoosi, ja aineenvaihdunta [33]. Lisäksi aktivointi Akt-reitillä on keskeinen rooli apoptoosin indusoiman useiden ärsykkeiden, kuten kasvutekijä peruuttaminen, irtoaminen soluväliaineen, UV-säteilyllä, solusyklin discordance ja aktivointi FAS signaloinnin [34], [35] , [36]. Sen testaamiseksi, Ets-2 säätelee Akt-reitin kautta UCA1, käytimme toisen virtsarakon syövän solulinja BLS-211, josta puuttuu sekä UCA1 geenin ilmentymisen, ja se on peräisin samasta potilaasta kuin BLZ-211. Mitä mielenkiintoisinta jälkeen heikennettyjä ilmaus Ets-2 in BLS-211-solujen emme tarkkailla alas-säätely Pakt ja kasvu solujen apoptoosin. Nämä tulokset osoittivat, että UCA1 voi olla osallisena aktivaatioon Pakt-reitin Ets-2 (Fig. 6). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimus osoitti, että Pakt säätyy alas vuonna UCA1 vakaa knockdown BLZ-211-solujen [37]. LncRNAs on osoitettu satamaan biologisia vaikutuksia. Sikäli kuin tiedetään, laajaa toiminnallista ohjelmistoon lncRNAs sisältää roolit korkean kertaluvun kromosomi dynamiikka, telomeerien biologian ja subcellular organisaatiorakenteesta [22], [38]. Sitä paitsi Tutkimuksessamme muut tutkimukset ehdotti myös, että lncRNA voi olla osallisena säätelyssä signaalireitin, kuten Wnt koulutusjakson, Ras pathway [39], [40]. Kuitenkin mekanismi, miten Ets-2 säätelee Akt polku jää epäselväksi ja onko Akt viestintäproteiinit suoraan vuorovaikutuksessa UCA1 on osoittautunut edelleen.

Yhteenvetona tarkastelimme säätelyelementtejä suoraan mukana UCA1 geenin transkriptio ja totesi, että promoottorin aktiivisuus UCA1 johtuu pääasiassa ETS-2 sitoutumiskohdan sisällä proksimaalisen promoottorialueen. Olemme osoittaneet, että transkriptiotekijän Ets-2 voi sitoutua suoraan tämän sivuston ja on tärkeää, että transkription valvonta UCA1 ilmaisua. Lisäksi tuloksemme paljasti, että UCA1 voi olla osallisena säätelyssä Akt-reitin Ets-2. Sen vuoksi päättelimme, että Ets-2 säätelee ilmentymistä UCA1 lisäksi lncRNA UCA1 voi olla mukana aktivointi Akt signalointireittiä Ets-2. Meidän havainnot puoltavat edelleen tutkimusta tällä alalla. Tämä on uusi kenttä jatkuvasti kasvavaa merkitystä. Se on nouseva tärkeä ja kiinnostava tutkia toiminta ja sääntely näiden lncRNAs.

tukeminen Information

Kuva S1.