Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän reseptorin (EGFR) on vakiintunut tavoite syövän hoitoon. EGFR-tyrosiinikinaasi (TK) estäjät, kuten gefinitib ja erlotinibin, on kehitetty, kuten syöpälääkkeet. Vaikka ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, jonka aktivoiva EGFR-mutaatio, L858R, reagoi hyvin gefinitib ja erlotinibin, kasvaimet, joilla on kaksinkertaisesti mutatoitunut EGFR, T790M-L858R, resistenteiksi näille lääkkeille.

C. elegans

EGFR homologin LET-23 ja sen loppupään signalointireitille on tutkittu paljon antaa yksityiskohtaista tietoa sääntelymekanismeja konservoitunut

C. elegans

ihmisille. Kehitetään

in vivo

seulonta järjestelmä syöpälääkkeitä suunnattu tietyille EGFR mutantit, esitimme kolme LET-23-kimeerojen jossa TK verkkotunnuksen korvattiin joko ihmisen villityypin TK domain (LET-23: : hEGFR-TK), TK domaineihin L858R mutaatio (LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]), tai TK domaineihin T790M-L858R mutaatioita (LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]) in

C. elegans

vulval soluihin käyttämällä

let-23

promoottori. Villityypin hEGFR-TK kimeerisen proteiinin pelastettiin

let-23

mutanttifenotyyppiä, ja aktivoimalla mutantti hEGFR-TK-kimeerojen indusoi multivulva (Muv) fenotyypin villityypin

C. elegans

tausta. Anti-syöpälääkkeet gefitinibin ja erlotinibin tukahdutti Muv fenotyyppi LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] ilmentävä siirtogeenisiä eläimiä, mutta ei LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] siirtogeenisiä eläimiä. Pilottina näyttö, 8960 pieni kemikaalit testattiin Muv tukahduttaminen, ja AG1478 (EGFR-TK-estäjä) ja U0126 (a MEK estäjä) tunnistettiin mahdolliset inhibiittorit EGFR välittämän biologisen toiminnan. Lopuksi siirtogeenisiä

C. elegans

ilmentävät kimeeristä LET-23 :: hEGFR-TK-proteiinit ovat malli, jota voidaan käyttää mutaation-tiettyjä näyttöjä uusia syöpälääkkeitä.

Citation: Bae YK, Sung JY, Kim YN, Kim S, Hong KM, Kim HT, et ai. (2012) Lentotoiminnan

In vivo C. elegans

Model System for seulonta EGFR estäviä syöpälääkkeitä. PLoS ONE 7 (9): e42441. doi: 10,1371 /journal.pone.0042441

Editor: Anne C. Hart, Brown University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2012; Julkaistu: 05 syyskuu 2012

Copyright: © Bae et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli ainoastaan ​​tukena toimii avustusta National Cancer Center (NCC-1110060) Etelä-Korea (www.ncc.re.kr). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittäminen suurikapasiteettisten, edullinen

in vivo

seulonta järjestelmä pienimolekyylisiä syöpälääkkeen reagenssien olisi mieluiten pystyä voittamaan suuria ongelmia tavanomaisten

in vitro

seulontamenetelmiä. Johtuen nopea sukupolven ajan, korkea jälkeläiset numeroita, alhaiset kustannukset, ja vakiintunut geneettisiä työkaluja, sukkulamato

Caenorhabditis elegans

(

C. Elegans

) on houkutteleva ehdokas eläinmallissa seulonta järjestelmä , ja monet edut

in vitro

seulajärjestelmää ja eläinmalleissa [1].

EGFR yli-ilmentyy tai poikkeuksellisesti aktivoida erilaisia ​​ihmisen syövän, kuten rinta-, munasarja-, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2]. EGFR on mukana eri vaiheissa syövän kehityksen kuten kasvainten synnyssä, invaasio, etäpesäke, ja angiogeneesi [3], ja tarjoaa näin houkutteleva kohde syövän lääkekehityksessä. Gefitinibi (Kauppanimi: IRESSA) oli ensimmäinen EGFR-TK-estäjä lääke kehitettiin hoitoon epiteelisyövissä kuten NSCLC [4]. Mutaatiot EGFR-TK domain on liitetty gefitinibin herkkyys osajoukko keuhkosyövässä, ja on myös havaittu aktivoivan antiapoptooppinen reittejä [5], [6].

C. elegans

vulval kehitys on vakiintunut malli, jota käytetään tutkimaan EGFR signalointireitille [7] – [9]. Niistä kuusi vulval esiastesolujen (VPCs), P5.p, P6.p ja P7.p hyväksyy 2 ° -1 ° -2 ° solukohtaloina vastaavasti ja jatkaa jakamalla muodostamaan kypsä häpy. 1 ° solun kohtalon määritetään seurauksena EGFR-Ras-MAPK signaloinnin P6.p, kun taas 2 ° solun kohtalon määritetään LIN-12 /Notch-signaloinnin P5.p ja P7.p, joka aktivoituu tuloksena EGFR-Ras-MAPK signalointi viereisessä solussa. Komponentit EGFR-reitin, kuten EGFR, Ras, Raf, MEK, ja MAPK, ovat erittäin konservoituneita ihmisen ja

C. elegans

[8]. Rajallinen määrä kemiallisia yhdisteitä, jotka kohdistuvat EGFR polku on testattu käyttämällä

C. elegans

vulval kehittämisen mallina. Famesyylitransferaasin estäjät, jotka estävät Ras aktiivisuutta, ja MCP yhdisteitä, jotka häiritsevät Ras-Raf yhteisvaikutuksia ei havaittu toimivan nimenomaan ortologiset proteiinit

C. elegans

EGFR-Ras-reitin [10] – [12]. Myrkyllisyys EGFR estäjät BIBU1361 ja BIBX1382 arvioitiin myös

C. elegans

[13]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen hyödyntämismahdollisuuksia

C. elegans

välineenä EGFR-reitin lääkeseulontaan.

Tässä tutkimuksessa kehitimme ja analysoitiin ihmisen EGFR-ajettu

C. elegans

malli, joka esittelee Muv fenotyyppi. Mallin, lentäjä näyttö 8960 kemikaalien suoritettiin sekä EGFR estäjä ja MEK estäjä eristettiin vaimentimet, mikä viittaa siihen, että tämä

C. elegans

-pohjainen järjestelmä voidaan tehokkaasti seuloa uusia EGFR-estäviä lääkkeitä.

Materiaalit ja menetelmät

Worm kulttuuri ja kantoja

Villityypin N2 ja mutanttikantoja kasvatettiin, kuten ovat kuvanneet Brenner [14]. Mutanttialleelit käytetään tässä työssä ovat

let-23 (SY1), let-23 (SA62), let-60 (n1700) B ja

lin-15 (n765)

. Integrointi linjat käytetään tässä työssä ovat

jgIs6

[

let-23p unionin :: LET-23 :: hEGFR-TK [L858R],

rol-6 (su1006) B ],

jgIs19

[

let-23p unionin :: lET-23 :: hEGFR,

rol-6 (su1006) B],

jgIs25

[ ,,,0],

let-23p unionin :: lET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R],

rol-6 (su1006), myo-2p :: mCherry

],

jgIs14

[

EGL-17p unionin :: EMR-1 :: RFP,

DHS-31p unionin :: NLS :: GFP,

rol-6 (su1006) B ], JJ1136 (HMP-1 :: GFP), PS4657 (AJM-1 :: GFP) ja PS3352 (CDH-3 :: GFP).

rakentaminen LET-23 :: hEGFR kimeeristen plasmidien

Käytimme perimän DNA

let-23

geeni ja cDNA, joka koodaa ihmisen EGFR. Kukin DNA-fragmentti monistettiin PCR: llä, kloonattiin pGEM-T-easy-vektoriin (Promega Inc., Madison, WI, USA), ja varmistettiin sekvensoimalla. Sitten kootaan DNA-fragmentit käyttäen sopivia restriktioentsyymejä ja vastaaviin kohtiin on pPD117.01 vektorin (tri Andrew Fire, Stanford Univ., CA, USA). QuikChange kohdennettu mutageneesi (Cat # 200523, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) ja EGFR-TK-cDNA tehtiin tuottaa EGFR [L858R], EGFR [T790M] ja EGFR [T790M-L858R]. Yksityiskohtainen menettely ja alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa annetaan täydentävä Materials (Fig. S1B). Käyttää toissijaisena solukohtalo- markkeri, pJG205 konstruoitiin yhdistämällä PCR-fragmentti monistettiin genomisesta DNA-sekvenssistä 4,0 kb ylävirtaan

egl-17

kanssa

EMR-1

cDNA, DsRed ( RFP, Clontech Takara Bio Inc.) ja pPD95.77 (A. palo). GFP-koodaava sekvenssi pPD95.77 korvattiin DsRed cDNA. Toisen solun kohtalon markkeri, pJG207, tehtiin kloonaamalla

DHS-31

promoottorialueen osaksi pPD95.69 (A. Palo), joka sisältää SV40 tumalokalisaatiosignaalin (NLS) ja GFP. Kaikki plasmidi-konstruktit varmistettiin sekvensoimalla.

mikroinjektio ja integrointi

injektion pitoisuuden DNA-rakenteita ja merkkiaineet olivat 75 ug /ml pRF4 [

rol-6 (su1006)

], 50 tai 25 ug /ml EGFR kimeerisiä plasmideja, 50 ug /ml

ttx-3 :: gfp

, 35 ug /ml pJG205 [

egl-17-beeta

:: EMR-1: : RFP], 40 ug /ml pJG207 [

DHS-31p

:: NLS :: GFP], ja 5 ug /ml pCFJ90 [

myo-2p

:: mCherry] (Addgene, Cambridge, MA, USA). Kokonais-DNA konsentraatio kunkin injektion seos oli 150 ug /ml, jossa on pBluescript SK + DNA on lisätty tarpeen mukaan. Kaikki integroitu linjat tehtiin käyttämällä UV-säteilyä ja out-ristissä neljä kertaa.

Mikroskopia ja Hoechst33342 värjäys

Kaikki mikroskooppiset kuvat otettiin kiinni ja käsitellään käyttämällä AxioCam HRc digitaalikameran kiinnitetty Imager M1 fluoresenssi mikroskooppi ja Axiovision Rel. 4.6 ohjelmisto (Zeiss Inc., Saksa). For Hoechst33342 (Molecular Probes of Life Technologies Co., Grand Island, NY, USA) värjäys,

jgIs6

matoja kerättiin ja pestiin useita kertoja M9 puskurilla. Madot liotettiin 1 ug /ml Hoechest33342 liuosta 30 minuuttia. Pesun jälkeen madot valmistettiin havainnointiin.

Kemiallinen käsittely ja tilastojen

Kemikaalit lukien gefitinibi, erlotinibi, U0126, AZD6244, PD0325901 ja WZ4002 ostettiin Selleck Chemicals LLC. (Houston, TX, USA), ja 1280 kemiallinen kirjasto hankittiin Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA). Toinen 7680 kemikaalit saatiin Korea Chemical Bank of KRICT. Kemikaalit liuotettiin 100% DMSO-liuosta, ja pidettiin -20 ° C: ssa 1 tai 10 mM varastot seulontaan. Kaikki kemialliset kokeet toteutettiin 96-kuoppalevyillä, ja lopullinen kuoppaa kohti oli 100 ui kuten matoja, kolesteroli, ja kuolleet

E. coli

. DMSO-pitoisuus kontrolliryhmän pidettiin 0,5%, ja DMSO pitoisuudet kaikki koeryhmät olivat alle 0,5%. Lopullinen kemiallinen pitoisuus, jota käytetään näytön oli 5 uM ja 20-50 L1 matoja kasvatettiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle. Jokainen kemiallinen testi sisältyy vähintään kolme syvennystä per kemiallisten ja toistettiin ainakin kahdesti. Virhe palkit kaikki graafit edustavat SD (keskihajonta), ja

P

arvot suhteessa kontrolliin laskettiin parittomia Studentin

t

-testissä.

Tulokset

Kimeerisiä LET-23 :: hEGFR-TK-proteiini on toiminnallinen

C. elegans

Kehitetään

C. elegans

mallijärjestelmä seulomiseksi kemikaaleja, jotka estävät ihmisen EGFR (hEGFR) aktiivisuus, suunnittelimme plasmidikonstrukteja jotka ilmentävät

C. elegans

EGFR ortologisista, LET-23, ja hEGFR fuusioproteiinin, vaihtamalla sytoplasmisen tai TK domeeni LET-23 jokaisen hEGFR domain (Fig. 1A ja kuvio. S1). Meidän tavoitteena oli helpottaa funktionaalisen ekspression ihmisen vastine

C. elegans

säilyttämällä useimmat

C. elegans

LET-23 koodaus- ja säätelysekvenssejä, esimerkiksi ylläpitämällä C-terminaalisten tähteiden tärkeää asianmukaisen kaupan [15]. N oletettu proteiini tuotteita näiden siirtogeenien on 1388 aminohappoa (LET-23 :: hEGFR) tai 1323 aminohappoja (LET-23 :: hEGFR-TK). Kuten kuviossa 1A ja kuviossa S2, LET-23 :: hEGFR sisältää 841 aminohappoa LET-23 N-terminaalisen domeenin, 542 aminohapon ihmisen EGFR C-terminaalinen domeeni, ja 5 aminohappoa LET-23 PDZ vuorovaikutuksessa motiivi. LET-23 :: hEGFR-TK sisältää 841 aminohappoa LET-23 N-terminaalisen domeenin, 306 aminohapon ihmisen EGFR-TK domeeni ja 176 aminohapon LET-23 C-terminaalista domeenia. Sen testaamiseksi, onko tämä kimeerinen LET-23 :: hEGFR-TK-proteiini on toiminnallinen, konstrukti mikroinjektoitiin

let-23 (SY1)

mutantti. Useimmat

let-23

mutantit ovat tappavia, mutta

let-23 (SY1) B on elinkelpoinen ja vulvaless (Vul) takia poikkeava kaupan LET-23 [15] – [17]. Kimeerisen LET-23 :: hEGFR-TK-proteiinin pelasti Vul fenotyypin

let-23 (SY1)

(Fig. 1 B), mikä osoittaa, että kimeerinen proteiini on toiminnallinen

C. elegans

. Kun

let-23 (SY1) B-mutantti pelastettiin

jgIs19

, integroitu kantaan, joka sisältää LET-23 :: hEGFR siirtogeenin,

let-23 (SY1); jgIs19

kanta oli merkittävästi vähentynyt vulvaless väestöstä (9,1%) verrattuna

let-23 (SY1) B mutantti (92%) (Kuva. S1C).

(A) LET-23 ja LET-23-pohjainen kimeerireseptorin konstruktioita. Kaikki rakenteet on suunniteltu ilmaisemaan jokaisen kimeerisen reseptorin

let-23

promoottori. (B) toinen LET-23 :: hEGFR-TK-kimeeran pelastaa vulvaless fenotyypin

let-23 (SY1)

mutantti. (C) Vertailu useiden Muv mutanttien ja

jgIs6

siirtogeenisiä kanta, joka ilmentää LET-23 :: hEGFR-TK [L858R].

C. elegans

ilmentävät LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] osoitti suurempaa pseudovulva verrattuna

let-23 (SA62) B ja

let-60 (n1700)

Muv mutantteja. (D) Hoechst33342 (H33342) värjäys pseudovulval alueen

jgIs6

paljasti monia ytimiä. Boxed alue alemman paneelin suurennetaan oikeassa paneelissa. (E) Expression of a 1 ° solumerkille CDH-3 :: GFP villin tyypin mato ja

jgIs6

. CDH-3 :: GFP ilmentyy voimakkaasti sekä häpy ja pseudovulva on

jgIs6

. (F) Expression of 2 ° vulval solukohtalo- merkkiaineiden

lin-15

Muv mutantti ja

jgIs6

. Reportteri geenit ohjataan edistäjät

EGL-17

ja

DHS-31

ilmaistiin häpy ja pseudovulva. Arrowheads ilmoitetaan tavallinen vulvae ja pienet nuolet osoittavat pseudovulvae. Mittaviivat 50 pm.

Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksia yli-ilmentävien aktivoiva mutantti muoto LET-23 :: hEGFR-TK on

let-23

( +) tausta. Lisääntynyt aktiivisuus EGFR-Ras-MAPK-reitin johtaa hyper-induktion ulkosynnyttimien solujen kutsutaan Muv fenotyyppi, kuten on nähty semi-hallitseva

let-23 (SA62) B mutaatio ja konstitutiivisesti aktiivinen

let-60 (n1700)

mutaatio.

lin-15

toimii ylävirtaan

let-23

negatiivisesti säännellä EGFR-Ras-MAPK-reitin [18]. Tämä negatiivinen asetus häiriintyy

lin-15 (n765) B mutantti, jolloin tuloksena on vahva Muv fenotyyppi [18], [19]. Niinpä odotimme, että aktivoivat mutaatiot EGFR-TK alueella saattaisi aiheuttaa myös Muv fenotyypin. Kaksi aktivoivia EGFR mutaatioita, jotka antavat gefitinibi herkkyyttä tietyille keuhkosyövässä testattiin: EGFR [L858R] ja EGFR [Δ747-752] [20], [21]. In-frame deleetiot eksonissa 19 lukien Δ747-749 (44%), ja yhden pistemutaatioiden eksonissa 21 lukien L858R (41%) ovat useimmin havaittu EGFR-TK aktivoivat mutaatiot NSCLC [20],. Gefitinibin kestävä EGFR [T790M-L858R] mutaatio testattiin myös. T790M on toissijainen mutaatio, joka hankkii gefitinibin resistenssin L858R vaurion [21]. Kimeeriset LET-23 :: hEGFR-TK, joka sisältää mitä tahansa näistä mutaatioista indusoi hyper-induktio ulkosynnyttimien solujen johtaa Muv fenotyypin (Fig. 1 C ja taulukko 1). Siirtogeenisiä eläimiä ilmentävät LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] tai LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] oli fenotyyppi samanlainen

lin-15 (n765) B, 2-4 suuri pseudovulvae. Sen sijaan, ekspressoivien siirtogeenisten eläinten LET-23 :: hEGFR-TK [T790M] ei näytteille Muv fenotyyppi. Helpottaakseen tarkempaa analysointia, valitsimme LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] siirtogeenisiä linja tuottaa

jgIs6

, rasittava siirtogeeninen array integroitu genomiin. Transgeenin integraation suuresti parantanut penetrance on Muv fenotyyppi; 49% Muv ennen integrointia vs. 94,6% Muv integroinnin jälkeen (taulukko 1). Värjäys ytimien kanssa Hoechst33342 paljasti, että läsnä monien tumien pseudovulval alueella (Fig. 1 D), ja tämä tarkoittaa, että solujen lukumäärät kasvoivat pseudovulva meidän siirtogeenisen kannan samanlainen kuin muut Muv mutantit, kuten

let-60 ( n1700) B, ja

lin-15 (n765)

. Siirtogeeniset eläimet osoittivat liikkuvan fenotyyppi koska pRF4 [

rol-6 (su1006) B] käytettiin siirtogeenisiä merkki. Helpottaakseen Muv fenotyyppi havaitsemista, otimme käyttöön

SQT-1 (jg52) B mutaatio transgeenisissä linjoissa. Tämä

SQT-1

mutantti estää liikkuvan fenotyyppi

rol-6

ilman ilmeisiä vikoja [23]. Yllättäen huomasimme, että

SQT-1 (jg52) B mutaatio parannettiin Muv fenotyypin EGFR siirtogeenisten linjojen (taulukko 2).

MUV fenotyyppi

jgIs6

johtuu kohdunulkoinen aktivointi LET-23 /EGFR-reitin

Varmista, että pseudovulvae muodostuminen

jgIs6

johtuu erityinen aktivointi EGFR-Ras-MAPK reitti kimeerisen LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] proteiinia, voimme suorittaa RNAi geenien EGFR-Ras-MAPK-reitin. Yhdenmukainen ektooppiseen aktivointi EGFR-Ras-MAPK-reitin, knock-down geenien alavirtaan

let-23

, kuten

let-60 /Ras, MEK-2 /MEK

, ja

MPK-1 /MAPK

, tukahdutti Muv fenotyyppi

jgIs6

. RNAi on LET-23 /EGFR ylävirtaan geenistä

lin-3 /EGF

myös tukahdutti Muv fenotyyppi. MUV fenotyyppi toisen siirtogeenisen linjan,

jgIs25

, joka ilmaisee LET-23 :: hEGFR-TK [L858R-T790M], myös tukahdutti RNAi on

lin-3, anna-60, mek -2

, ja

MPK-1

(Fig. S3A). Koska Wnt-reitin toimii rinnakkain

lin-3

ylläpitää VPC pätevyyden [24], myös suorittaa Wnt reitin geeni pudotus RNAi testata onko Wnt toiminta vaikuttaa Muv muodostuminen

jgIs25

. Kaksi Wnt-reitin geenit (

baari-1

ja

CWN-2

) testattiin, koska niiden knockdown fenotyypit liittyy vulval kehitykseen [25], [26]. Samanlainen

lin-3

knockdovvn, RNAi on

baari-1

tai

CWN-2

johti tukahduttaminen Muv fenotyypin

jgIs25

( ). Havaitsimme harvinainen toukkien kuolleisuutta näistä RNAi kokeissa koska synkronoitu L1 toukkien hoidettiin RNAi, sama kuin samaa menetelmää käytimme lääkehoitoa kuvattu alla. Vahvista tappava RNAi vaikutusta EGFR alavirran geenien, käsittelimme

jgIs25

L4-toukat kanssa

let-60

tai

MPK-1

RNAi, ja lasketaan numerot F1 jälkeläiset. Toukkien kuolleisuutta lisääntyi merkitsevästi

let-60

tai

MPK-1

RNAi (kuvio. S3C).

Vertasimme vulval solukohtalo- merkkiaineiden

jgIs6

ja Muv mutantit, jotka ovat EGFR-Ras-MAPK-reitin aktivoitu. Kun 1 ° solukohtalo- markkeri tutkittiin,

jgIs6

pseudovulvae osoittivat ilmentymistä 1 ° solukohtalo- markkeri CDH-3 :: GFP (Fig. 1 E). CDH-3 on kadheriinin ilmaistaan ​​1 ° vul C, D, E, ja F-soluja [27]. Testaamiseksi 2 ° kohtalon merkki ilmaisun, rakensimme integroitu siirtogeenisiä linja ilmensivät sekä

EGL-17p unionin :: EMR-1 :: RFP ja

DHS-31p unionin :: Maanmittauslaitoksen :: GFP . EGL-17 ilmentyy 2 ° vul C ja D soluja, ja DHS-31, 2 ° vul B1, B2 ja D soluja aikuisen vaiheessa [27], [28]. EMR-1 on homologi ihmisen kiinteä tumakalvon proteiinin emerin [29], ja sen vuoksi aiheuttaa lokalisointi ydin- kuori. Vuonna villityypin taustaa

EGL-17p unionin :: EMR-1 :: RFP ja

DHS-31p unionin :: Maanmittauslaitoksen :: GFP ilmennetään ydinvoiman kirjekuori ja ytimen 2 ° ulkosynnyttimien soluissa, vastaavasti. Molemmat

lin-15 (n765) B ja

jgIs6

eläimillä oli samankaltainen ilmentymisen

EGL-17p unionin :: EMR-1 :: RFP ja

DHS -31p unionin :: NLS :: GFP (Fig. 1 F). Sillä verrataan edelleen

jgIs6

ja Muv mutantteja, tutkimme ilmentymistä AJM-1 :: GFP ja HMP-1 :: GFP, joita molempia ilmaistiin vyöliitos ja merkitse rajojen yleistyvät ja erottaa epiteelisolut [30]. AJM-1 :: GFP ja HMP-1 :: GFP: n ilmentymisen havaittiin ventral kohtiin, mukaan lukien otaksuttu pseudovulval alueet

jgIs6

,

let-60 (n1700) B, ja

lin-15 (n765) B mutantteja L4 vaiheessa. Nämä kaksi risteyksessä markkereita havaittiin myös, että pseudovulva on

jgIs6

täysikasvuisen vaiheessa (Fig. S4). Yhdessä edellä kuvattujen tulosten viittaavat siihen, että

jgIs6

siirtogeenisiä rasitusta ilmentävät kimeeristä LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] proteiininäyttösirua ominaisuudet, jotka ovat yhdenmukaisia ​​yli-aktivointi EGFR väylän Muv mutantteja.

Gefitinibi ja erlotinibin estävät Muv fenotyyppi

jgIs6

onko

jgIs6

siirtogeenisiä rasitusta ilmentävät kimeeristä LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] proteiinia voitaisiin käyttää laaja näyttö ihmisen EGFR-TK-inhibiittorit, testasimme vaikutuksia huumeiden gefitinibin ja erlotinibin. Kun villin tyypin

C. elegans

hoidettiin gefitinibin, jopa suurina annoksina (40 uM) ei vaikuttanut alkionkehityksen tai toukkien kehitys (Fig. 2A). Tämä osoitti, että gefitinibi ei ole toksinen villityypin

C. elegans

, ja näyttää olevan juurikaan mitään vaikutusta LET-23-toiminto, mikä ei ole yllättävää, koska alhainen sekvenssi-identiteetti ihmisen EGFR-proteiinin tai korrelaatio gefitinibin vasteen ja aktivoivia EGFR mutaatioita [31]. Sen sijaan Muv fenotyyppi

jgIs6

estyi 90%: iin 1 uM gefitinibin ja estää täysin 5 uM gefitinibin (Fig. 2B ja C). Ottaen huomioon, että 250 tai 500 mg gefitinibin suun kautta kerran päivässä suositellaan syöpäpotilaille (noin 10 uM) [4], [32], estävää vaikutusta gefitinibin näyttää olevan samanlainen

C. elegans

ja ihmisiin. Voit tarkistaa vaikutusmekanismi palautuvia EGFR-TK-inhibiittorit (TKI) meidän LET-23 :: hEGFR-TK-ilmentäviä siirtogeenisiä

C. elegans

, käsittelimme

jgIs25

gefitinibin kanssa. T790M mutaatio voi johtaa muutoksiin EGFR topologia, joka estää sitoutumisen palautuvia EGFR-TKI kautta steerisen esteen tai T790M voi lisätä affiniteetti kinaasidomeenin ATP [21], [33] – [35]. Gefitinibin hoito ei estänyt Muv fenotyypin

jgIs25

(Fig. 2C). Erlotinibin, toinen EGFR-TKI syöpälääkettä, tuottivat samankaltaisia ​​inhiboivia vaikutuksia gefitinibin (Fig. 2D). Yritimme vertailla ekspressiotason kahden kimeerisen proteiinien

jgIs6

ja

jgIs25

, mutta emme pystyneet määrittämään kimeeristä proteiinia. Olettaen samantasoista Siirtogeeniekspression, havaitun eron aktiivisuus johtuu todennäköisesti vähenemisestä huumeiden herkkyyden siirrettävä jonka L858R mutaatio.

(A) suuren annoksen gefitinibin (40 uM) ei vaikuta normaaliin embryogeneesi , toukkien kasvu tai vulval muodostuminen villityypin

C. elegans

. (B) Gefitinibi esti Muv fenotyyppi

jgIs6

joka ilmentää LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]. (C) Gefitinibi esti Muv fenotyypin

jgIs6

annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta ei estänyt että

jgIs25

, joka ilmentää LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]. Numerot matoja laskettiin (

n

) olivat 159, 96, 130, 85, 87, 125, 108 ja 88 vasemmalta pitkin X-akselia. (D) erlotinibi tuotti samanlaisen vaikutuksen kuin gefitinibi sekä

jgIs6

ja

jgIs25

malleja. (

n

= 159, 96, 67, 110, 80, 106, 95 ja 176). (E) määrittäminen kehitysvaiheen

jgIs6

joka on herkin gefitinibille. Kuten normaalissa ulkosynnyttimien kehittämiseen, varhainen toukat (L1-L3) vastannut hyvin gefitinibi. (

n

= 128, 224, 134, 116, 139, 167, 99 ja 66). Mittaviivat 50 um (A, B). X-akseli, pitoisuus gefitinibin (C), erlotinibi (D) ja mato vaiheessa gefitinibin hoito (E). Y-akseli,% matojen osoittaa Muv fenotyypin (C-E). *

P

0,001.

määrittämiseksi vaiheessa mato kehitystä, jonka aikana gefitinibi hoito on tehokkainta, käsittelimme

jgIs6

jokaisen toukka kanssa 1 uM gefitinibin ja pisteytetään Muv fenotyyppi aikuisen vaiheessa. Eläimet altistetaan gefitinibin päässä L1, L2 tai L3 vaiheisiin pieneni selvästi vuonna Muv fenotyypin, ja aste vastaus oli samankaltainen kolmessa vaiheessa (Fig. 2E). L4 eläimet eivät olleet yhtä alttiita gefitinibin, mikä osoittaa, että gefitinibi käsittely ennen L3 /L4 karvanlähtö, kun ulkosynnyttimien kehitys vihittyjen, on kriittinen tehokkaan inhibition LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] proteiinia. Tämän seurauksena meillä päätteli, että varhainen toukkia, L1 ja L3, voidaan käyttää seulontaan uusia estäjiä vastaan ​​aktivoitu EGFR-TK signalointireitin.

Pilot näytön estäjiä hillitseviä Muv fenotyyppi

jgIs6

Perustuu nopeasti tuloksia, suunnittelimme protokolla suuren mittakaavan high-seulontaan EGFR: n estäjien avulla

jgIs6

. Valmistella useita synkronoitu toukkien,

C. elegans

kasvatettiin kunnes maljat täynnä munia, ja toukat ja aikuiset poistettiin yksinkertaisella pesemällä M9 puskurilla. 12 tunnin kuluttua, kuoriutuneet toukat kerättiin ja pestiin kolme kertaa M9-puskuria. Me annostellaan L1 toukat 96-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät yhdistelmä kuollut

E. coli

ja kemikaalit testataan. 3-4 päivän Muv fenotyyppi havaittiin preparointimikroskooppia (Fig. 3A). Käyttäen tätä protokollaa, teimme näyttö 1280 pienten molekyylien kanssa tunnettujen molekyylien tavoitteet ja tehokkuus. Niistä 1280 kemikaaleja, AG1478 ja U0126 esti Muv fenotyyppi

jgIs6

. AG1478 on EGFR-inhibiittoria käytetään usein

in vitro

kokeita, joilla on samanlainen rakenne kuin gefitinibin (Fig. 3B). U0126, joka on tunnettu estäjä MEK, estivät

jgIs6

Muv fenotyyppi 5 uM, mutta ei alemmilla pitoisuuksilla (Fig. 3C). Kun vaikutukset AG1478 ja U0126 on gefitinibi kestävä LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] mallin

jgIs25

testattiin vain U0126 oli estävä vaikutus, kun taas AG1478 oli tehoton (kuvio. 3D).

(A) seulonta menetelmä, mukaan lukien synkronointi

C. elegans

ja nesteviljelmä käyttäen 96-kuoppalevyn varten estäjä näytöllä. (B) Kemialliset rakenteet gefitinibin, AG1478 ja U0126. (C) Sekä AG1478 ja U0126 estää Muv fenotyypin

jgIs6

annoksesta riippuvaisella tavalla. (

n

= 295, 193, 381, 133, 254, 304 ja 415 vasemmalle pitkin X-akseli). (D) vaikutus gefitinibi, erlotinibi, AG1478 ja U0126 on

jgIs25

. Gefitinibi, erlotinibi ja AG1478 ei estänyt Muv fenotyyppi

jgIs25

, mutta U0126 estyy. (

n

= 81, 99, 106, 90 ja 81). Kemialliset pitoisuus, 5 uM. *

P

0,001.

MEK estäjät saattavat kohdella gefitinibin kestävät syövät

Havainto, että U0126 esti Muv fenotyyppi

jgIs25

ehdotti, että jotkut MEK inhibiittorit voivat olla kyky estää gefitinibin vastustuskykyisiä muotoja EGFR mutaatioita. Siksi testasimme toisen vaikutuksen MEK-inhibiittorin, PD0325901, sekä Raf [V600E] estäjä (AZD6233), ja EGFR-[T790M] estäjä (WZ4002) mallissamme järjestelmässä. Mikään näistä kemikaaleista esti Muv fenotyyppi

jgIs6

eläimet annoksina tehokas U0126 (1 uM tai 5 uM) (Fig. 4A). Kuitenkin suuremmilla annoksilla (5 uM tai 20 uM), MEK-inhibiittori PD0325901 hieman esti Muv fenotyypin

jgIs25

(Fig. 4B). Nämä tulokset vahvistettiin side-by-side testi, jossa

jgIs6

ja

jgIs25

eläimiä käsiteltiin 100 uM kutakin kemiallisen tarkkailla vaikutuksia Muv fenotyyppiin. WZ4002, joka on inhibiittori vastaan ​​EGFR [T790M] gatekeeper-mutaatio [36], inhiboi Muv fenotyypin

jgIs25

parempi kuin

jgIs6

. Samanlaisia ​​U0126, PD0325901 täydellisesti esti Muv fenotyypin sekä

jgIs6

ja

jgIs25

(Fig. 4C). Testasimme myös näiden kemikaalien tavoite

C. elegans

geenejä käsittelemällä

lin-15

Muv mutantti kanssa U0126 ja PD0325901. Sekä U0126 ja PD0325901 tukahdutti Muv fenotyyppi

lin-15

at liialliseen keskittymiseen (Fig. 4D). Tämä tulos viittaa siihen, että

mek-2

, yksi Meks in

C. elegans

, joka liittyy ulkosynnyttimien kehitykseen, on yksi mahdollinen kohde ehdokkaita U0126 ja PD0325901.

(A) U0126, PD0325901 (MEK: n estäjä), AZD6244 (RAF [V600E] estäjä) ja WZ4002 (EGFR [T790M] estäjä) lisättiin

jgIs6

. (

n

= 86, 94, 116, 64, 88, 66, 79, 110 ja 98 vasemmalle pitkin X-akseli). (B) Kemikaalit lisättiin gefitinibille vastustuskykyisiä

jgIs25

. MEK-inhibiittoreita, U0126 ja PD0325901, esti Muv fenotyypin

jgIs25

, mutta muita kemikaaleja ei. (

n

= 64, 100, 128, 113, 89, 64, 63, 79 ja 98). (C) Liialliset (100 uM) kemikaaleja lisättiin

jgIs6

ja

jgIs25

. Kaksi MEK estäjät täydellisesti esti Muv fenotyyppi

jgIs6

ja

jgIs25

. WZ4002 esti Muv fenotyypin

jgIs25

parempi kuin

jgIs6

. (

n

= 160, 213, 186, 312, 195, 323, 192 ja 237). (D) Muv fenotyyppi

lin-15

tukahdutettiin U0126 ja PD0325901; kemiallinen pitoisuus, 100 uM (X-akseli). (

n

= 119, 89, 90 ja 143). *

P

0,001.

Kaikki siirtogeenisiä kantoja, jotka ilmentävät aktivoitua EGFR-kimeerojen, kuten

jgIs6

ja

jgIs25

, kasvavat hitaasti ( Fig. 5A ja kuva S5) samanlainen siirtogeenisiä kantoja ektooppisesti ilmentävät LIN-3 /EGF [37]. Mielenkiintoista, EGFR-TK-inhibiittorit korjattu kasvuvauhti

jgIs6

tasolle villityypin, ja U0126 ja PD0325901 pelastettiin kasvu sekä

jgIs6

ja

jgIs25

(Fig. 5B).

(A) Suhteita aikuiset 3 päivän kuluttua saattamisen alkioiden lautaselle. Kaikki villityypin kannat olivat aikuisia, mutta useimmat

jgIs6

ja

jgIs25

siirtogeenisiä kantoja olivat nuorempia kuin L4 vaiheessa. Viisi aikuiset siirrettiin kukin levy ja poistettiin sen jälkeen 6 tuntia muninta. Kolmen päivän kuluttua poistamisen P0 matoja, F1 matoja havaittiin. Neljä levyt laskettiin kullekin kannalle. (

n

= 488, 313, 104 ja 94 vasemmalta pitkin X-akseli). *

P

0,001 ja **

P

0,05. (B) U0126 ja PD0325901 tukahdutti hidas kasvu fenotyyppi

jgIs6

ja

jgIs25

. Gefitinibi ja AG1478 tukahdutti hidas kasvu fenotyyppi

jgIs6

, mutta ei

jgIs25

. L1 asteen toukat inkuboitiin kunkin kemikaalin 4 päivää 96-kuoppalevyille, ja ne otettiin talteen tuoretta levy 6 tuntia ennen kuvien ottamista.

C. elegans

kasvoi hitaasti, kun niitä viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä. Ohjaus (0,5% DMSO) ja kemiallinen pitoisuus (50 uM). Mittakaava, 500 um.

Keskustelu

rakennettu siirtogeenisiä

C. elegans

sisältävät useita eri EGFR konstruktioita. Siirtogeenisiä jotka ekspressoivat LET-23 :: hEGFR kimeerisiä reseptoreja osoitti paljon vahvempi fenotyyppi kuin ilmentävät LET-23 :: hEGFR-TK kimeerisiä reseptoreita (taulukko 1). Valitettavasti emme onnistuneet saamaan integraatio linjat niille konstruktioita ja vain dataa tuotetaan integraatio linjat LET-23 :: hEGFR-TK siirtogeenisiä linjoja. Sytoplasmisen hännän hEGFR ehkä ovat kehittyneet lähettää aktivoitu signaaleja tehokkaammin kuin LET-23,

C. elegans

EGFR, jopa VPCs.

perustaa mallimme järjestelmä, kimeeriset LET-23 :: hEGFR-TK-siirtogeeni ilmentyi

let-23

(+) tausta . Mahdollinen muodostuminen heterodimeerejä endogeenisen LET-23 kimeerisen LET-23 :: hEGFR-TK proteiini voi selittää joitakin havaintoja, jotka tehtiin aikana tutkimuksemme. Olemme toisinaan havaittu, että suuret annokset gefitinibin esti normaalin vulval kehitys

jgIs6

. Lisäksi RNAi EGFR ylävirtaan geenistä,

lin-3 /EGF

, tukahdutti Muv fenotyypin

jgIs6

ja

jgIs25

(Fig. S3A), joka voi olla