Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kätkeminen kasvutekijän reseptorin (EGFR) mutaatiot saavuttaa mielekäs vastaus EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (TKI). Kuitenkin kehittynyt resistenssi EGFR-TKI voi vaikuttaa pitkän aikavälin tulos melkein kaikilla potilailla. Tunnistamaan mahdollisia resistenssin perustimme solulinjat vastustuskykyisiä EGFR-TKI ihmisen keuhkosyövän solulinjat PC9 and11-18, joka kanna aktivoivat EGFR mutaatioita. Yksi erlotinibin kestävä solulinja PC9 ja kaksi erlotinibin kestävät solulinjat ja kaksi gefitinibin kestäviä solulinjoja 11-18 olivat itsenäisesti perustettiin. Lähes täydellinen menetys mutantti delE746-A750 EGFR-geenin havaittiin erlotinibin-resistentit solut eristettiin PC9, ja osittainen menetys mutantti L858R EGFR-geenin kopion erityisesti havaittu erlotinib- ja gefitinibin-resistentit solut 11-18. Kuitenkin, konstitutiivinen aktivointi EGFR alavirran signalointia, PI3K /Akt, ei havaittu edes sen jälkeen, kun menetys mutatoidun EGFR-geenin kaikki resistenttejä solulinjoja jopa lääkkeen läsnä ollessa. Vuonna erlotinibin vastustuskykyisten solujen PC9, konstitutiiviset PI3K /Akt aktivointi estettiin tehokkaasti lapatinib (dual TKI EGFR ja HER2) tai BIBW2992 (pan-TKI EGFR proteiinit). Lisäksi erlotinibi joko HER2 tai HER3- pudotus niiden samaa alkuperää siRNA esti myös PI3K /Akt aktivointi. Transfektio aktivoimalla mutantti EGFR komplementaarinen DNA palautettu lääke herkkyyttä erlotinibin kestävä solulinjassa. Tutkimuksemme osoittaa, että menetys riippuvuus mutanttiin EGFR johti vahvistuksen riippuvuus sekä HER2 /HER3- ja PI3K /Akt signalointi hankkia EGFR-TKI vastus.

Citation: Tabara K, Kanda R, Sonoda K, Kubo T, Murakami Y, Kawahara A, et al. (2012) menetys aktivointi EGFR Mutant Gene Auttaa kehittynyt vastustuskyky EGFR tyrosiinikinaasiestäjiksi Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (7): e41017. doi: 10,1371 /journal.pone.0041017

Editor: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 17 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Tabara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Apurahat-in-tuki tieteellisen tutkimuksen Priority Areas (Cancer) alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- ja teknologiaministeri Japanissa ja 3. Term Kattava ohjaus Research for Cancer alkaen terveysministeriön, työ ja Welfare, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten syöpien ja johtava kuolinsyy maailmassa. Kehittäminen syöpälääkkeiden, jotka kohdistuvat kasvutekijän reseptorin (EGFR) on parantunut hoito NSCLC. Kaksi edustavaa EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI), gefitinibi ja erlotinibi, on yhteinen kinatsoliinin rakenne ja on hyväksytty hoitoon progressiivisen NSCLC. Sekä erlotinibin ja gefitinibin osoittavat samanlaista kinaasin estäminen valikoivuus perustuu määrällisen analyysin pienimolekyylisiä-kinaasi vuorovaikutus karttoja 38 estäjät [1], ja osoittaa terapeuttista tehoa vastaan ​​progressiivinen pienisoluista keuhkosyöpää [2] – [4].

yleisin aktivoivia EGFR mutaatioita ovat lukukehyksessä poisto eksonissa 19 (delE746-A750) ja pistemutaatio korvaamalla leusiini arginiinin kodonin 858 exon21 (L858R) [5] – [9]. Nämä kaksi suurta mutaatiota osuus 85-90% kaikista mutaatioiden ja parantaa terapeuttisen tehokkuuden EGFR-kohdennettuja lääkkeitä [10] – [13]. Lisäksi nämä aktivoivat mutaatiot saanut riippuvuus EGFR keuhkojen syöpäsoluja, mikä parantaa alttius EGFR-TKI kuten gefitinibi ja erlotinibi [6], [14] – [16].

Yksi vakava ongelma EGFR -TKI hoito on ulkonäkö lääkkeille vastustuskykyisten kasvainten. Hankittu resistenssi, toisen mutaation EGFR-geenin T790M [16] – [18], tai vaihtoehtoisia EGFR-riippumaton aktivaatio solujen kasvua signalointireittien, mukaan lukien c-Met aktivointi on tunnettu [19], [20]. Menetys PTEN ilmaisu on yksi hankitun resistenttien mekanismeja, jotka on osoitettu eristämällä gefitinibin-mutantteja päässä PC9 soluista, jotka Harbor aktivoiva mutaatio EGFR [21], [22]. Sen lisäksi, että hyvin tunnettu syitä lääkeresistenssin keuhkosyöpäpotilaita, selvittämiseen edelleen mekanismi hankittu resistenssi on välttämätöntä kehittää uusia EGFR-kohdennettuja lääkkeitä.

Tässä olevassa tutkimuksessa, erlotinib- ja gefitinibi kestävä solulinjat perustettiin kaksi ihmisen keuhkosyövän solulinjat, PC9 -solut delE746-A750-mutaation ja 11-18 -solut L858R-mutaation, vastaavasti. Yllättäen osittainen tai täydellinen menetys mutantti EGFR-geenin kopio havaittiin erlotinib- ja gefitinibin-resistenttejä solulinjoja. Kliinistä merkitystä menetys mutantti EGFR on tarkasteltava suhteessa sen tiiviissä hankinta lääkeresistenssin EGFR-TKI-pienisoluista keuhkosyöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture ja reagenssit

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat, PC9, QG56 ja 11-18 viljeltiin RPMI 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kuten aiemmin on kuvattu [14], [21]. PC9 ja QG56 ystävällisesti Dr. Yukito Ichinose (National Hospital Organization Kyushu Cancer Center, Fukuoka, Japani), ja 11-18 oli Dr. Kazuhiko Nakagawa (Kinki University, Osaka, Japani). Erlotinibi oli ystävällisesti F. Hoffmann-La Roche Ltd gefitinibin jonka AstraZeneca Inc. BIBW2992 ostettiin Selleck Chemicals, SU11274 ja wortmanniini oli Calbiochem, LY294002 oli peräisin Cell Signaling Technology ja Lapatinibin oli Toronto Research Chemicals. Anti-HER2 ja anti-fosfo-HER2-vasta-aineita ostettiin Upstate Biotechnology, Anti-fosfo-EGFR, anti-EGFR, anti-fosfo-HER3-, anti-fosfo-c-Met, anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-PTEN, anti-fosfo-ERK1 /2, anti-ERK1 /2, ja mutaatio-spesifinen (L858R eksonissa 21 ja poistetaan E746-A750 eksonissa 19) vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology, anti-HER3 ja anti-c Met-vasta-aineita olivat Santa Cruz Biotechnology, anti-α-tubuliinin vasta-aine oli yhtiöltä Sigma-Aldrich, ja anti-GAPDH-vasta-aine oli peräisin Trevigen. Täydentävä DNA: t (cDNA) EGFR ja aktivoimalla mutantti EGFR ystävällisesti tri Willam Pao ja Dr. Nishio. Solut transfektoitiin cDNA käyttäen Lipofectamine LTX, PLUS-reagenssia ja Opti-MEM (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Rekombinantti ihmisen EGF ostettiin Peprotech. Pieni häiritsevä RNA: t (siRNA), joka vastaa HER2 (5′-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 ’), HER3 (5′-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3′) ja PIK3CA (5’-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 ’) hankittiin yhtiöltä Invitrogen, ja vastaavat EGFR (5’-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 ’) hankittiin Sigma-Aldrich. Solut transfektoitiin siRNA-dupleksit käyttäen Lipofectamine RNAiMAX ja Opti-MEM (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti.

sytotoksisuusmääritykset

Eksponentiaalisesti kasvavat solususpensiot ympättiin kuhunkin kuoppaan ja seuraavan päivänä osoitetut pitoisuudet eri lääkkeiden lisättiin. Kun oli inkuboitu 72 tunnin ajan, sytotoksisuus määritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21].

Western blot -analyysi

Solut huuhdeltiin jääkylmällä PBS: llä ja lyysattiin Triton X-100-puskuria (50 mmol /L HEPES, 150 mmol /l NaCI: a, 50 mmol /L NaF, 1% Triton X-100, ja 10% glyserolia, joka sisälsi 5 mmol /l EDTA, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 1 mmol /l natriumortovanadaattia), ja proteiinit solulysaateista erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immobilon kalvoja (Millipore Corp.), kuten aiemmin on kuvattu (21). Siirron jälkeen kalvoja inkuboitiin blokkausliuoksessa, tutkittiin eri vasta-aineet, pestiin, ja visualisoitiin käyttäen piparjuuren peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (GE Healthcare) ja tehostetun kemiluminesenssin reagenssia (Amersham).

A, Western blot analyysi osoittaa ekspressiota pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, pc-Met, c-Met, PTEN, Pakt, Akt, pERK1 /2, ja ERK1 /2-proteiineja, ja α-tubuliinin latauskontrollina. B, Eksponentiaalisesti kasvavat PC9 ja PC9 /ER1 solut altistettiin eri annoksilla erlotinibin 5 tuntia, ja sen jälkeen Western blot -analyysillä. C, Eksponentiaalisesti kasvavat 11-18, 11-18 /ER1-7, ja 11-18 /ER2-1 solut altistettiin erilaisten annosten erlotinibin 5 tuntia, ja sen jälkeen Western blot-analyysi.

Human RTK Arrays

Proteome Profiler ihmisen fosfo-RTK-vasta paneelit (R R

h (testi) = M x (X /Y), jossa M on alleeli riippuva vakio, joka on peräisin eroista PCR-monistuksen tehokkuus, merkintöjä tehokkuus, ja muoto huippu, välillä villityypin ja mutanttialleelia. Samoin R

h yhtäläinen-osan sekoitus testihuonetiloissa viitteen, R

h (mix), on esitetty seuraavassa yhtälössä.

Valitse kahta yhtälöä edellä, X ja Y on saatu seuraavasti.

yhtälöitä edellä sotkea että absoluuttinen copy-numero mutanttialleelin testatuissa soluissa ei voida arvioida, koska M on tuntematon. Kuitenkin suhteelliset arvot copy-numeroita samoista mutantti alleeli eri testissä soluissa voidaan arvioida, koska M on vakio.

, Western-blotit osoittavat ilmentymisen delE746-A750 EGFR ja yhteensä EGFR PC9 ja PC9 /ER1 soluja. B, havaitseminen villityypin ja mutaation sekvenssien spesifisiä alukkeita käyttäen. PC9 soluilla sekä villityyppi- ja mutantti-erityisiä bändejä, kun taas PC9 /ER1, 11-18, ja QG56 solut näyttää vain villityypin-tietyllä taajuusalueella. Mut, mutantti exon19, ja WT, villityypin exon19. C, PCR-analyysi osoittaa, heterodupleksianalyysi (Mut /WT) ja homodupleksi (WT /WT ja Mut /Mut) in PC9 soluissa, ja ainoastaan ​​homodupleksi (paino /paino) on PC9 /ER1 soluja, 11-18 -solut L858R-mutaation, ja QG56 -solut villityypin EGFR.

, Western blot-analyysi käyttäen L858R-spesifistä vasta-ainetta ja yhteensä EGFR tunnistavaa vasta-ainetta sekä villityyppi- ja mutantti EGFR. Ekspressiotasot mutantti EGFR (L858R), yhteensä EGFR, ja L858R verrattuna yhteensä EGFR (L858R /yhteensä EGFR) normalisoidaan niiden ekspressiotasoja 11-18 soluissa. Western blot analyysi ensisijainen ihmisen endoteelisolujen (HUVEC) esittää ilmentymä yhteensä EGFR, mutta ei mutantti L858R EGFR. B, DNA-sekvenssit lukee 15 perustaa ympäri L858R mutaatio 11-18, 11-18 /ER1-7, ja 11-18 /ER2-1 soluja verrataan. Nuolet osoittavat tukikohdan 2573. Huomaa, että nukleotidin 11-18 klo 2573 oli G /T heterotsygoottianalyysin. C, Place-SSCP-analyysi DNA-näytteiden 11-18, 11-18 /ER1-7, ja 11-18 /ER2-1 solujen puuttuessa tai läsnä on yhtä suuret määrät DNA: ta ihmisen verisuonten endoteelisoluissa (HUVEC: t) ovat esitetty. Kaksi huippua esittävät villityypin (WT) ja mutantti (Mut) EGFR-geeni (a). Perustuen yhtälöihin esitetty materiaalit ja menetelmät, kopioluvun muutoksia villin tyypin ja mutantti EGFR-geenien arvioidaan (b).

PCR-analyysi

analysoimiseksi deleetiomutaatiolla , eksonin 19 EGFR-geeni monistettiin käyttäen seuraavia PCR-eteenpäin-alukkeita:

villityypin erityisiä, 5′-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 ’mutantti erityisiä, 5′-TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3′ sekä villityypin ja mutantti- tyyppi, 5’-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 ’reverse-aluke 5′-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3’ ja TaKaRa ExTaq-polymeraasia.

analysoimiseksi deleetiomutaatio, exon5 ja 8 PTEN-geeni monistettiin käyttäen seuraavia PCR-eteenpäin-alukkeita : exon5, 5′-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT-3 ’exon8, 5′-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3’ reverse-aluke: exon5, 5’CCAATAAATTCTCAGATCCAGG-3 ’exon8, 5′-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3’.

analysoida poisto mutaatio, Akt geeni monistettiin käyttäen seuraavia PCR eteenpäin alukkeita: 5′-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT-3 ’käänteinen aluke: 5′-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3’.

Potilasvalinta

Valitsimme ensisijainen NSCLC kätkeminen EGFR mutaatioita, kuten eksoni 19 delE746-A750 ja eksonin 21 L858R pistemutaatio päässä EGFR-mutaatio asema kirjaa Department of Diagnostic Pathology, Kurume University Hospital, Kurume, Japani. Nämä EGFR-mutaatio asema kirjaa oli määritetty DNA suoralla sekvensoinnilla tai PNA-LNA PCR puristin määritys [27], [28].

Sytologinen näytteet syöpäpotilaiden

Cell näytettä otettiin keuhkopussin effuusio (5 tapausta), imusolmukkeesta hieno neula pyrkimys sytologia (2 tapausta), perikardiumeffuusio (1 tapaus), ja aivo-selkäydinnesteen (3 tapausta), mukaan aiemman tutkimuksen [28]. Keuhkopussin nestekertymä aivo-selkäydinnesteessä sentrifugoitiin 1500 rpm: llä 10 minuutin ajan, ja supernatantti neste poistettiin. Sedimentti levitettiin lasilevyille, ja kiinnitettiin 95% etanolissa yli yön. Hieno neula pyrkimys sytologia imusolmukkeiden suoritettiin käyttäen 23 gaugen kertakäyttöneulasta kiinnitetty 10 ml: n muovinen ruisku, ja luisti kiinnitettiin yön yli 95% etanolia.

immuunivärjäytyminen aktivointi EGFR mutaatioita

Immunovärjäys analyysi suoritettiin käyttäen anti-EGFR delE746-A750 erityinen (6B6), EGFR-L858R Mutant-spesifinen (43B2), ja yhteensä EGFR (D38B1) vasta-aineita (Cell Signaling Technology), kuten aiemmin on kuvattu [27].

Ethics lausunto

tutkimus kliinisissä näytteissä on hyväksynyt eettinen komitea Kurume yliopistosta.

A, B, Eksponentiaalisesti kasvavat PC9 ja PC9 /ER1 solut altistettiin eri annoksilla wortmanniinin (A) ja LY294002 (B) 5 tunnin ajan, ja sen jälkeen Western blot-analyysi. C. PC9 ja PC9 /ER1 soluja käsiteltiin PIK3CA siRNA tai scramble (SC) siRNA 48 tuntia, ja sen jälkeen Western blot analyysi.

Tulokset

perustaminen Erlotinib- ja Gefitinibi kestävä Cell Lines PC9 ja 11-18 solut

eristämiseksi erlotinibin kestäviä solulinjoja PC9 -solut delE746-A750, ja 11-18 -solut L858R, molemmat solulinjoja viljeltiin portaittain kasvavia annoksia erlotinibin 0,05-10 uM, noin 6 kuukautta, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Sitten solut valitaan itsenäisesti kustakin erlotinibin kestävästä solulinja kustakin muovista lautasen, että kloonaamalla laajentaa yhden erlotinibin vastustuskykyisten solulinja, PC9 /ER1, mistä PC9 soluista, ja kaksi erlotinibi kestävä solulinjat, 11-18 /ER1- 7 ja 11-18 /ER2-1, 11-18 soluista, vastaavasti. Lisäksi gefitinibi-resistenttejä solulinjoja myös itsenäisesti eristettiin ja kloonaamalla laajennettu (11-18 /GEF10-1 ja 11-18 /GEF20-1) 11-18 soluista. Annosvastekäyrät lääkeaineresistenttien solulinjoja ja niiden vanhempien vastine erlotinibille tai Gefitinibillä hankkiminen resistenssin näille lääkkeille eri resistenttejä alalinjoja (kuva S1).

, Eksponentiaalisesti kasvavat PC9 ja PC9 /ER1 soluja altistetaan eri annoksia erlotinibin 5 h, ja tämän jälkeen western blot -analyysillä. B, C, D, PC9 ja PC9 /ER1 soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 10 nM scramble (sc) siRNA, 2 nM tai 10 nM EGFR siRNA, HER2 siRNA tai HER3- siRNA vastaavasti, ja sen jälkeen Western blot-analyysi.

A, PC9 /ER1 soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 1 uM erlotinibin, ja 5 uM lapatinib 5 tuntia, ja sen jälkeen Western blot-analyysi. B, PC9 /ER1 soluja käsiteltiin 10 nM siRNA: iden ja scrumble ja EGFR-perheen geenejä, ja altistettiin erlotinibin (1 uM) tai BIBW2992 (1 uM) 5 tunnin ajan, ja sen jälkeen Western blot-analyysi.

, PC9 /ER1 solut transfektoitiin del EGFR (E746-A750) cDNA, ja seurasi inkubaatio eri viikonpäivinä. Western blot -analyysi suoritettiin vasta-aineilla tunnustaa del EGFR ja yhteensä EGFR. B, Annosvastekäyrät of jäljitellyistä ja aktivoitua mutantti EGFR cDNA transfektantteja PC9 /ER1 määritettiin sytotoksisuusanalyysin. Jokainen arvo on keskimäärin kolmena ruokia ± SD. C, 11-18 /ER1-7 solut transfektoitiin L858R EGFR-cDNA, ja sen jälkeen Western blot-analyysi, jossa on spesifisen vasta-aineen ja L858R EGFR. D, Annosvastekäyrät of jäljitellyistä ja aktivoitua mutantti EGFR cDNA transfektantteja 11-18 /ER1-7. Jokainen arvojen keskiarvo kolmena ruokia ± SD.

PC-9 /ER1 solut osoittivat 160-250 kertaa korkeampi resistenssi erlotinibille ja gefitinibin, 5 kertaa korkeampi resistenssi lapatinibille enimmillään noin 2000-kertainen suurempi vastustuskyky BIBW2992 (taulukko 1). 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, ja 11-18 /GEF20-1 solut osoittivat 20-110 kertaa korkeampi resistenssi erlotinibille ja gefitinibin ja 7 kertaa korkeampi resistenssi lapatinibi ja BIBW2992 korkeintaan (taulukko 1). Toisaalta, kaikki nämä resistenttien solujen osoitti samanlaista herkkyyttä SU11274 ja sisplatiinin niiden vanhempien kollegansa (taulukko 1).

Expression Kasvutekijäreseptorien ja niiden aktivointi Status Erlotinibi vastustuskykyisten solulinjojen Perustettu maasta PC9 ja 11-18 solut

Western blot-analyysi osoitti, silmiinpistävin ero fosforylaatioon EGFR ilman Huomattava muutos fosforylaatioon tilasta HER3-, c-Met, Akt ja ERK1 /2 välillä PC9 ja PC9 /ER1 soluja. Toisaalta, suhteellisen alhainen fosforylaatiota EGFR nähtiin 11-18 /ER1-7 ja 11-18 /ER2-1 soluja kuin 11-18-soluja (kuvio 1A).

seuraavan verrattuna aktivoinnin tila useiden reseptorityrosiinikinaaseja lukien c-Met, Axl, PDGFR ja IGF1 R, jotka yli-ilmentynyt kasvaimissa EGFR mutaatioita erlotinibin kestävä alalinjoja ja heidän kollegansa käyttämällä phospho reseptorityrosiinikinaasin (RTK) array [29]. Kuitenkin, ei ollut eroa aktivoinnin tila näiden kasvutekijän reseptorit mukaan lukien c-Met välillä huumeiden herkkiä ja resistenttejä solulinjoja (kuva S2).

Yhteensä EGFR-vasta värjätään kaikki neljä histologisia ja sytologinen näytteitä. Anti-delE746-A750-vasta värjätään vain syöpäsolujen kanssa delE746-A750 mutaatio (A, tapaus 1) (katso taulukko 2), ja EGFR L858R vasta-värjätä ainoastaan ​​syöpäsolujen kanssa L858R mutaatioita (B, tapaus 9) sekä histologisia ja sytologinen näytteitä. Ei värjäystä oli ilmeistä sekä EGFR delE746-A750 ja EGFR L858R vasta syöpäsoluissa ilman aktivoimalla EGFR mutaatioita Sytologisten näytteistä (C: tapaus 6 ja D: tapaus 11).

Akt fosforylaation ei estä erlotinibin Erlotinibi kestävä Cell Lines

vieressä tutkittiin vaikutusta erlotinibin fosforylaatiota EGFR, Akt, ja ERK1 /2 in erlotinibin kestävät solulinjat ja niiden vanhempien vastineet (kuvio 1 B ja 1C). Vuonna PC9 soluissa, EGFR, Akt, ja ERK1 /2 fosforylaation olivat kaikki inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla erlotinibi. Kuitenkaan ollut juuri lainkaan estoa Akt fosforylaation PC9 /ER1 solujen erlotinibin, mutta ERK1 /2 fosforylaatio oli samalla esti kuin PC9 soluissa (kuvio 1 B). Toisaalta, EGFR fosforylaatio havaittiin yhtäpitävästi vaimentaa 11-18, 11-18 /ER1-7, ja 11-18 /ER2-1 solujen erlotinibi. Kuitenkin verrattuna 11-18 soluja, Akt-fosforylaation 11-18 /ER1-7 ja 11-18 /ER2-1 soluissa ei inhiboinut erlotinibi. Sen sijaan, ERK1 /2 fosforylaatio oli erittäin herkkä erlotinibille kaikissa 11-18, 11-18 /ER1-7, ja 11-18 /ER2-1 soluja (kuvio 1 C). Hankinta erlotinibin vastus antaa siis konstitutiivinen PI3K /Akt: n fosforylaation resistenttien solujen PC9 ja 11-18 solut.

Täydellinen Menetys aktivointi Mutant EGFR (delE746-A750) Gene in Erlotinibi kestävä PC9 /ER1 Cells

sitten ensi tutkitaan EGFR tilaansa PC9 /ER1 soluja. Western blot-analyysi käyttämällä anti-delE746-A750, L858R, ja yhteensä EGFR-vasta-aineita osoittivat, täydellinen menetys mutantti EGFR-proteiinin ilmentymisen PC9 /ER1 solut (kuvio 2A). Sitten geeni profiili villityypin ja mutantti-EGFR välillä PC9 ja PC9 /ER1 soluja verrattiin. Suora sekvenssianalyysi eksonin 19 EGFR-geenin paljasti täydellisen menetyksen vain mutantin sekvenssin PC9 /ER1-soluja (tietoja ei esitetty). Seuraavaksi PCR-analyysi suoritettiin eksonin 19 EGFR-geenin käyttämällä villityypin ja mutaation alukkeita. PC9 solut sisälsivät sekä villityypin ja deleetiomutaatio sekvenssejä, mikä osoittaa, heterotsygoottinen alleelien villityypin ja mutantti-EGFR, kun oli vain villityypin sekvenssin PC9 /ER1 soluja (kuvio 2B). Eksoni 19 EGFR-geenin monistettiin edelleen, ja analyysi näistä DNA-näytteet geelissä jatkuvasti osoitti, että läsnä on ainoastaan ​​villityypin sekvenssin eksonissa 19 EGFR-geenin PC9 /ER1 soluja, vaikka PC9 solut sisälsivät sekä poisto ja villityypin sekvenssi (kuvio 2C). Yhdessä tarkasteltuina PC9 /ER1 solut osoittivat täydellinen menetys mutantti EGFR geenin hankkiminen lääkeresistenssin erlotinibille.

Solulisääntyminen ja selviytyminen ihmisen keuhko- syöpäsoluja kätkeminen aktivoitua mutantti EGFR (PC9 ja 11-18 solut ) tiiviisti riippuu EGFR-ajettu PI3K /Akt-reitin, ja tämä lisäkasvu /selviytyminen on erittäin altis erlotinibille ja muita EGFR TKI. Ensinnäkin on osittainen tai täydellinen menetys mEGFR geenin alleeli lääkeresistenttiä solulinjat, ja sitten saada riippuvuus HER2 /HER3- ja PI3K /Akt signalointi (PC9 /ER1 solut). Kuitenkin enemmän lopullista analyysiä resistenttejä solulinjoja 11-18 on tarpeen, koska 11-18 resistenttejä solulinjoja näyttää vain osittainen menetys mEGFR.

osittainen menettäminen aktivointi Mutant EGFR (L858R) Gene in Erlotinib- tai Gefitinibi kestäviä Cell Lines 11-18

verrataan edelleen ekspressiotasot villityypin EGFR ja mutantti EGFR, jonka spesifinen vasta-aine, joka tunnistaa L858R mutantti EGFR western blot -analyysillä. Verrattuna vanhempien 11-18-solut, ilmentyminen mutantti L858R EGFR-proteiini oli suhteellisen alhainen verrattuna solun kokonais-EGFR tasoja (kuvio 3A).

seuraava tutkittava, onko aktivointi mutantti EGFR-geenin 11-18 /ER1- 7 ja 11-18 /ER2-1 solujen vaikutti hankinnan erlotinibin resistenssin tai ei. DNA-sekvenssianalyysi osoitti, että läsnä mutaation (L858R) sekä vanhempien ja resistentit solut (kuvio 3B, nuolet osoittavat nukleotidin 2573), vaikka vuorottelu piikkien korkeudet on nukleotidi 2573 oli ilmeinen. Altered suhde villityypin mutanttiin EGFR geeni havaittiin myös PLACE-SSCP-analyysi [23], [24], kuten esimerkki 3C. Tämä määritys osoitti kaksi toisistaan ​​riippumatonta piikkiä, yksi villityypin ja toinen mutantti EGFR-geenin, sekä 11-18 ja erlotinibin-resistentit solut. Kuitenkin piikin korkeuden suhde (Rh) kahden resistenttien solulinjojen oli selvästi erilainen. Antamalla sekoittamalla strategia, joka on, sekoittamalla DNA: t HUVEC: ien kuljettaa 2 kopiota villityypin EGFR-geenin kanssa, resistentit solut, muutos kopioluvun alleelin voitiin määrittää, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset osoittivat noin 50%: n lasku mutantti EGFR-geeni ilman havaittavaa muutosta villin tyypin EGFR-geenin kopio (kuvio 3C).

Myös tutki valinta lääkeresistenssin gefitinibille myös indusoi samanlaisia ​​muutoksia vähentynyttä ilmentymistä aktivoivan EGFR-geenin. Kaksi gefitinibin kestävä solulinjat, 11-18 /GEF10-1 ja 11-18 /GEF20-1, osoittivat lisääntynyttä EGFR-proteiinin ilmentymistä suhteellisen vähentynyt ilmentyminen HER2 ja pHER2 verrattuna niiden vanhempien 11-18 soluja (kuvio S3A). Verrattuna vanhempien 11-18 soluja, Akt-fosforylaation 11-18 /GEF10-1 ja 11-18 /GEF20-1 ei vaikuttanut gefitinibi kun fosforylaatio EGFR ja ERK1 /2 saatiin samalla inhiboitui gefitinibin (kuvio S3B) . Western blot-analyysi anti-L858R-vasta-aine osoitti vähentynyttä ilmentymistä mutantti-EGFR ja vastaava ilmaisu koko EGFR kaksi resistenttejä solulinjoja verrattuna 11-18-soluja (kuvio S3C). Seuraavaksi suoritetaan DNA-sekvenssianalyysillä ja löysi vuorotteleva piikin korkeus nukleotidin 2573 in gefitinibin-resistenttien solujen (kuvio S3D). PLACE-SSCP-analyysi paljasti myös vähentynyt mutantti EGFR geenikopiomäärä ilman näkyvää muutosta villin tyypin EGFR-geenin kopion, ja kvantitatiivinen analyysi osoittaa noin 50%: n lasku mutantti EGFR geenin gefitinibin-resistenttien solujen (kuvio S3E). Näistä analyysejä erlotinib- tai gefitinibin-resistentit solut linjat, hankinta lääkeresistenssin voidaan välittyvän alentunut mutantti EGFR-geenin kopio.

knockdovvn HER2 tai HER3- herkistää konstitutiivisen aktivaation Akt erlotinibille in PC9 /ER1 Solut

ei ollut lähes täydellinen menetys mutantti EGFR geenin PC9 /ER1 kun taas vain osittainen menetys mutantti EGFR geenin erlotinibin kestävä solulinjoissa 11-18. Olemme edelleen analysoitu tarkemmin mekanismia taustalla acquirement erlotinibin resistenssin PC9 /ER1. Olemme tutkineet vaikutus PI3K-estäjien, wortmanniini ja LY294002 siitä Akt aktivaatio PC9 ja PC9 /ER1 soluja (kuvio 4A ja 4B). Molemmat PI3K-estäjien samalla esti fosforylaatiota Akt, mikä osoittaa, että aktivoitu Akt on samalla herkkä sekä estäjien PC9 /ER1 ja PC9 soluja. Olemme myös vahvistaneet erityisiä tukahduttaminen Akt aktivaation sekä PC9 ja PC9 /ER1 soluja käsiteltiin PIK3CA siRNA (kuvio 4C). Lisäksi sekvenssianalyysi paljasti, että ei ollut mutaation hot spots PIK3CA, PTEN ja Akt-geeni (tietoja ei esitetä). Konstitutiivinen Akt aktivaatio PC9 /ER1 ei näytä johtuvan muuttunut PI3K /Akt-reitin itse.

Lisäksi selvitettiin mitkä molekyylit keskuudessa EGFR, HER2 tai HER3- voisi olla vastuussa konstitutiivisen Akt aktivaation erlotinibi kestävä PC9 /ER1 soluja. Olemme löytäneet fosforylaatio HER3- ei tukahdutettiin erlotinibin PC9 /ER1 verrattuna PC9 (kuvio 5A). Sitten tutki knockdovvn EGFR, HER2 tai HER3- niiden samaa alkuperää siRNA pystyi mukauttamaan aktivointi Akt ja EGFR proteiinit. Pudotus EGFR johti merkittävästi vähentynyt aktivoituminen Akt vain PC9 soluissa, mutta ei PC9 /ER (kuvio 5B). Toisaalta, knockdovvn HER3 voisi tukahduttaa aktivaation Akt sekä PC9 ja PC9 /ER (kuvio 5D). Lisäksi aktivointi HER3- suppressoitui merkittävästi HER2 pudotus vain PC9 /ER (kuvio 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HER3- yhdessä HER2 signalointi vastaavat konstitutiivisen aktivaation PI3K /Akt sisään kehittynyt resistenssi erlotinibin PC9 /ER.

tutkittiin lisäksi lapatinibi dual estäjä EGFR ja HER2, voisi tukahduttaa Akt aktivaatio PC9 /ER1. Hoito lapatinib esti fosforylaatioon Akt ja HER3- vaikka erlotinibi ei (kuvio 6A). Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus erlotinibin tai yleiseurooppalainen estäjä kaikista EGRF, BIBW2992 [30], on Akt-fosforylaation PC9 /ER1 kun kukin EGFR, HER2 tai HER3- hiljennettiin (kuvio 6B). Fosforylaatio HER2, HER3 ja Akt kaikki oli tukahdutti BIBW2992 yksin. Toisaalta, fosforylaatiota Akt inhiboitui erlotinibi joko HER2 tai HER3- knockdown. Lisäksi HER2 knockdown johti huomattavan estymisen HER3- fosforylaation, mikä viittaa siihen, että PC9 /ER1 solut saavat riippuvuus HER2 /HER3- signalointi (kuvio 6B).

Olemme vihdoin tutki ilmentymistä aktivoimalla mutantti EGFR voisi palauttaa huumeiden herkkyys erlotinibille in lääkkeille vastustuskykyiset solulinjat, PC9 /ER1 ja 11-18 /ER1-7. Ohimenevä transfektio of del (E746-A750) EGFR cDNA aiheuttama lisääntynyt ilmentyminen aktivoituneiden mutantin EGFR PC9 /ER1 (kuvio 7A). Yliekspressio del (E746-A750) EGFR cDNA voittaneet lääkeresistenssin erlotinibille in PC9 /ER1 (kuvio 7B). Lisäksi transfektio toisen aktivoitua mutantti L858R EGFR cDNA indusoi myös lisääntynyt ilmentyminen (kuvio 7C) ja palauttaa huumeiden herkkyys erlotinibin 11-18 /ER1-7 soluja (kuvio 7D).

Menetys aktivointi Mutant EGFR Tulenkestävät Ei-pienisoluinen keuhkosyövässä

Kuva 8 osoitti edustava IHC kuvien villityypin, delE746-A750, ja L858R EGFR perusterveydenhuollossa keuhkosyövän kudoksiin (kuvio 8, kukin ylempi paneeli), ja myös syövän solut pleuraeffuusio tai selkäydinnesteestä toistuviin potilailla hoidon jälkeen gefitinibin (kuva 8, kukin alempi paneeli). Kuten taulukosta 2, pois 11 potilailla, jotka ensin saivat gefitinibi keuhkosyövän jälkeen leikkauksen ja sitten osoitti uusiutumisen, 8 potilasta oli delE746-A750-mutaation ja 3 oli L858R mutaatio niiden ensisijainen keuhkokasvaimia. Neljä oli T790M mutaatio levittämiseen tai metastaattisen sytologinen näytteitä. Pois 11 reagoivilla potilailla, 2 8 tapausta, joka oli kanna delE746-A750 osoitti menetys aktivoivan EGFR-mutaatio, ja 1 3 tapausta, joka oli tunsivat L858R osoitti menetys aktivoiva mutaatio (taulukko 2). Yhdessä tapauksessa (tapaus 6), sekä T790M mutaatio ja villin tyypin EGFR havaittiin. Ei ollut eri mieltä ilmaisun EGFR-mutaatio-spesifisten vasta-aineiden ja havaitsemista EGFR mutaatioita sekvenssianalyysillä käyttämällä PNA-LNA PCR puristin määritys kaikissa testatuissa näytteissä tässä tutkimuksessa.

Keskustelu

aktivointi EGFR mutaatioita, kuten delE746-A750 ja L858R, syy keuhkosyöpään solut tiiviisti pari EGFR soluproliferaatioon tai eloonjäämistä [5], [6], [15].