Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Erittäin herkkä ja erityiset virtsa-pohjainen havaitsemistestien joko ensisijainen tai toistuvia virtsarakon syöpä ovat osoittautuneet vaikeasti tasalla. Meidän yhä tietämystä perimän poikkeamia virtsarakon syöpä pitäisi mahdollistaa tällaisten testien kehittämiseksi perustuen virtsaan DNA.

Methods

DNA eristettiin virtsasta solupelleteistä ja PCR käytettiin monistamaan alueille on

TERT-

promoottori ja koodaavat alueet

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

KDM6A

ja

RXRA

joita usein mutatoitunut virtsarakon syöpään. PCR-tuotteet olivat viivakoodilla, yhdistettiin ja pariksi loppuun 2 x 250 emäsparia sekvensointi tehtävä sellaisen Illumina MiSeq. Virtsan DNA analysoitiin 20 ei-syöpä valvontaa, 120 ensisijainen virtsarakon syöpäpotilailla (41 pTa, 40 pT1, 39 pT2 +) ja 91 virtsarakon syöpäpotilailla jälkeisen TURBT (89 syöpä-vapaa).

Tulokset

huolimatta pienistä määristä DNA: ta joidenkin virtsasta solupelletteinä 96% näytteistä saatiin keskimääräinen luku syvyyksiin 500. Analysointi vain aikaisemmin ilmoitettiin pistemutaatioita,

TERT

mutaatiot löydettiin 55%: lla virtsarakon syöpä (riippumaton vaihe),

FGFR3

mutaatioita 30%: lla virtsarakon syöpä,

PIK3CA

14% ja

TP53

mutaatioita 12%: lla virtsarakon syöpä. Kaiken kaikkiaan nämä aiemmin raportoitu virtsarakon syöpään mutaatioita havaittiin 86 ulos 122 virtsarakon syöpäpotilailla (70% herkkyys) ja vain 3 ulos 109 potilasta, joilla ei ole havaittavaa virtsarakon syöpä (97%: n spesifisyys).

Johtopäätös

Tämä yksinkertainen, kustannustehokas lähestymistapa voitaisiin käyttää ei-invasiivisia valvonta joilla on ei-lihas-invasiivisia virtsarakon syöpien kätkeminen nämä mutaatiot. Menetelmä on alhainen DNA tulo vaatimus ja voi havaita alhainen mutantti-DNA suuressa ylimäärässä normaalin DNA: ta. Nämä geenit ovat minimaalisen biomerkkiaine paneeli, johon ylimääräisiä markkereita voitaisiin lisätä kehittää erittäin herkkä diagnostinen testi virtsarakon syöpään.

Citation: Ward DG, Baxter L, Gordon NS, Ott S, Savage RS, Beggs AD , et ai. (2016) Multiplex PCR ja Next Generation Sequencing varten ei-invasiivisia havaitseminen virtsarakon syövän. PLoS ONE 11 (2): e0149756. doi: 10,1371 /journal.pone.0149756

Editor: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPANJA

vastaanotettu: 21 syyskuu 2015; Hyväksytty 4 helmikuuta 2016 Julkaistu: 22 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Ward et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Prosenttiosuus mutantti lukee käytettiin panos kaikkien kuvaajat, herkkyydet, erityispiirteet jne., ja nämä esitetään jokaiselle locus jokaisessa näytteen S2 taulukossa.

Rahoitus: Tämä rahoittivat Wellcome Trust seurata -on-rahasto avustusta hallinnoi University of Birmingham. BCPP rahoittaa Cancer Research UK, University of Birmingham ja Birmingham ja The Black Country ja West Midlands Pohjois- ja Etelä Comprehensive Local Research Networks, ja sponsoroi University of Birmingham. BCPP biospecimen keräys tukee rahoituksella Birmingham ECMC. DGW rahoitetaan yleishyödyllinen lahjoitus University of Birmingham tueksi virtsarakon syövän tutkimukseen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : NGS, seuraavan sukupolven sekvensointi; UBC, urothelial virtsarakon syöpä; NMIBC, ei-lihas- invasiivinen virtsarakon syövän; MIBC, lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä

Johdanto

Joustava kystoskopia yhdistettynä virtsa sytologia, on kultakanta lähestymistapa havaitsemiseen rakkokasvaimista. Pitkän aikavälin valvonta uusiutumisen jälkikäsittely on sekä työlästä potilaille ja kallista terveydenhuollon tarjoajat. Jo kauan on toivottavaa, että testi perustuu molekyylit vapautuu virtsaan syöpäsoluissa voi vähentää riippuvuutta kystoskopialla kuitenkin tähän mennessä riittävän herkkä ja erityisiä testejä ei ole kehitetty ja hyväksynyt kliinikot [1].

Olemassa virtsan biomarkkereita virtsarakon syövän kuten NMP22 ja BTA puuttuu herkkyys matala-asteinen sairaus ja voi virheellisesti koholla johtuen ei-pahanlaatuisten sairauksien ja hematuria [1]. Suuria ponnisteluja on kulutettu löytää virtsan biomarkkereita ei-invasiivisia havaitseminen virtsarakon syövän erityisesti menestys saavutetaan mittaamalla kasvain nukleiinihappoa variantteja [2,3,4]. Viimeaikaiset genomista ja transcriptomic kokeet ovat osoittaneet, että matala-asteinen NMIBC ja CIS /HG-NMIBC /MIBC on erilaiset mutaatio ja geeniekspressioprofiilien ja että jopa NMIBC huomattavaa heterogeenisyyttä esiintyy (tarkistetaan [5]). Siten näyttää todennäköiseltä, että paneelin biomarkkereiden joka kaappaa monimuotoisuuden UBC vaaditaan luotettavasti havaita tauti.

Virtsakokeet perustuu DNA osoittaa huomattavaa lupaus ei-invasiivisia havaitseminen UBC. Teoriassa, jos kasvain-DNA on läsnä, se voidaan monistaa PCR: llä ja syöpä-spesifiset muutokset havaitaan. Kaksi useimmin mutatoitunut geenien virtsarakon syövän kanssa point-mutaation kuormittajat ovat

FGFR3

[6] ja

TERT

[7,8,9,10]. Molemmat on arvioitu biomarkkereina havaitsemiseksi virtsarakon syövän virtsan DNA erillisissä tutkimuksissa [7,11,12], mutta niitä ei ole yhdistetty NGS perustuva määritys.

TERT

promoottori on mutatoitunut noin 65% rakkokasvaimista riippumatta vaiheessa ja luokan [13] ja edustaa paras yksittäinen biomarkkereiden virtsarakon syövän kanssa tuoreessa raportissa 62% herkkyys 90% tarkkuus havaitsemiseksi ensisijaisen rakkokasvaimista [7].

Olemme nyt kehittäneet määritys, joka käyttää runsaasti thoughput syvään sekvensointi alueiden 6 UBC liittyviä geenejä, jotka sisältävät mutaation kohteiden ja analysoitiin virtsan DNA 232 potilasta arvioida sen kyky non-invasiivisesti havaita UBC. Teoriassa, syvä sekvensointi pitäisi havaita luotettavasti jopa erittäin alhainen kasvaimen DNA suuri ylimäärä ei-kasvain-DNA. Lisäksi tämä teknologia on kypsymässä siihen pisteeseen, jossa se on tulossa rutiinia lähestymistapa kliinisissä geneettinen testaus laboratorioissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki näytteet saatiin jälkeen kirjallinen suostumus ja hyväksyntä sopiva kuningaskunnan kansallinen tutkimuseettisen tarkastuslautakunta (National Research Ethics Service viitteet totesi alla); allekirjoitettu suostumuslomakkeet pidettiin yksittäisissä potilaan tiedostoja, suostumuksella dokumentoitu asianomaisessa tutkimuksessa tietokannoista.

UBC ja ei-UBC potilaita kerättiin osana virtsarakon syövän Ennuste ohjelman BCPP (NRES komitea East Midlands- Derby: 06 /MRE04 /65), joka on sisällytetty mahdollisille biospecimen kokoelma biomarker tutkimukseen.

toinen virtsa kokoelma (NRES komitea North West-Haydock: 15 /NW /0079) tehtiin potilailta, joille suoritetaan tarkkailusta TURBT for NMIBC.

potilaat

Virtsa kerättiin kolmelta potilasryhmille: ”non-UBC”, ”UBC” ja ”post-UBC”. UBC ja ei-UBC potilasta kerätty osana West Midlandsin ”virtsarakon syövän Ennuste ohjelma, 2005-11 (BCPP, kerrotaan tarkemmin: [14]). Lyhyesti, keskivaiheessa virtsassa (20-50 ml) kerättiin, kun diagnoosi potilailla, joilla on kystoskopialaitteita havainnot osoitus primaarista virtsarakon syöpä; virtsaa sentrifugoitiin ja pelletti ja supernatanttia säilytettiin -80 ° C: ssa. Näytteenoton jälkeen, kukin potilaalle tehtiin TURBT ja lopullisen diagnoosin mukaan histopatologinen tutkimus resektoidun kudosta. Koska ensisijainen virtsarakon

karsinooma in situ

(CIS) on harvinainen vaurio BCPP kohortti ja muualla [15], primaarisessa CIS jätettiin koska meillä ei ole riittävästi voidakseen tehdä luotettavia johtopäätöksiä. Jotkut potilaat rekrytoidaan BCPP ja joka antoi virtsanäytteet myöhemmin diagnosoitiin ei-pahanlaatuisia urologiset olosuhteet, ja ne sisältyvät tutkimukseen ”ei- UBC” potilaille.

Erikseen toinen mahdollinen virtsan keräys tehtiin vuonna West Midlandsin aikana 2012 riippumaton ryhmä 91 potilaalla, joille tarkkailusta TURBT varten NMIBC, ja käyttäen samoja virtsan keräämistä protokollaa. Lukuun ottamatta 2 potilasta, kaikki potilaat olivat taudista vapaan mennessä virtsan keräys ( ”post-UBC ryhmä). 2 potilailla, joilla on uusiutuva sairaus lisättiin UBC ryhmään. Myöhemmät kystoskopian oli saatavilla 38 89 jälkeistä UBC ”potilaita, ja osoitti enää toistuminen on keskimäärin 8 kuukautta. DNA uutettiin virtsasta pelleteiksi virtsan DNA: n eristä- sarjat kuorinnan solujen ja bakteerien (NorgenBiotek.com) ja eluoitiin 100 ul: aan deionisoitua vettä.

PCR ja Barcoding

Yksi multiplex PCR-monistus käytettiin monistamaan 16 amplikonien

TERT-

promoottori ja koodaavat alueet

FGFR3

,

PIK3CA

,

TP53

,

HRAS

,

RXRA

ja

KDM6A

(pohjamaali sekvenssit S1 taulukko). PCR-menetelmä on muokattu ALLORY

et al

[7], koska

TERT

promoottorialue on vaikea monistaa ja ensiyritykset käyttää useita muita polymeraaseja epäonnistui. PCR-monistukset koostui 9 ui DNA, 10 ui KAPA2G Tukeva DNA Polymerase (KapaBiosystems) ja 1 ui alukkeita (0,2 uM lopullinen kutakin aluketta). PCR-ohjelma oli seuraava: 95 ° C 3 minuuttia, 35 x 95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C: ssa 15 s, 72 ° C 15 s ja sen jälkeen 3 min 72 ° C: ssa (alukesekvenssien annetaan tukeminen Information, S1 Taulukko ). PCR-tuotteet laimennettiin 1/100 deionisoidulla vedellä ja 10 emäsparin viivakoodit lisätään toinen 15 syklin PCR käyttäen KAPA2G Kestävä DNA -polymeraasia ja yksisuuntaiset pääsy array viivakoodeja Illumina sekvensserit (Fluidigm).

Yhdistelmät ja tietojen analysointi

viivakoodilla PCR-tuotteet sekoitettiin ja puhdistetaan AMPure helmiä. Yhdistetty amplikonit sekoitettiin sitten 7: 3 PhiX (Illumina), denaturoitu ja ryhmittyneistä kahdeksantoista on Miseq 500 kierto virtauksen solujen ja sekvensoitiin (250 kierrosta eteenpäin, 10 sykliä viivakoodi, 250 sykliä käänteinen). Raw jäljitystiedostot prosessoitiin cutadapt (versio 1.8.1, Python 2.6.6) pariksi lopussa tilassa poistaa sovittimen sekvenssit, ja suodattaa pois paria, jonka järjestysnumero 100 nt jättää lyhyitä lukea artefakteja. Paikallinen rinnastukset lukee sen hg19 genomin tehtiin käyttäen bowtie2 (versio 2.2.4) pariksi lopussa -tilassa. SAM linjaus tiedostot muunnettiin BAM tiedostoja, lajitella ja indeksoida samtools (versio 0.1.19). BAM tiedostot prosessoitiin bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount), vähintään pohja alarajan asetettu 0 | 30 , tuottamaan asentoon erityisiä nukleotidin mittareita sisällä koordinaatit monistettu loci. Bam-readcount lähdöt prosessoitiin mukautetun kirjallinen Perl-skripti. Mutaatiot kutsuttiin jossa ei-viitetukiasemalta oli läsnä 3 lukee ja taajuudella välillä 2,5-97,5% molempiin suuntiin. Me rajoitettu analyysimme yhden emässubstituutiota aiemmin raportoitu UBC COSMIC.

Sangerin sekvensoinnilla

PCR käyttäen samoja alukkeita ja sama BCPP virtsanäytteitä kuin NGS, Sangerin sekvensoinnilla ABI 3730 sekvensseri suoritettiin ortogonaalisten vahvistuksen läsnäollessa ja ilman

TERT-

ja

FGFR3

mutaatiot 12 ja 8 näytettä, vastaavasti.

Tietojen saatavuus

Kaikki tarvittavat tiedot replikointi ovat käsikirjoituksen. PCR-aluke sekvenssit esitetään S1 taulukossa ja olemme käyttäneet prosenttiosuus mutantin kuuluu tulo kaikkien kuvaajat, herkkyydet, erityispiirteet jne, ja nämä esitetään jokaiselle locus jokaisessa näytteen S2 taulukossa.

tulokset

optimointi NGS-amplikoni sekvensoinnilla virtsan DNA

Kun tutkitaan yksittäin, kaikki 16 alukepareilla syntyy oikea koko tuotteita. Alukkeet yhdistettiin sitten ja multiplex-PCR-testataan laajalla mallin pitoisuudet (suunniteltu jäljittelemään vaihteleva määrä DNA virtsasta saadut pelletit): PCR toimi, jolla on pienin DNA tulo testattiin (0,5 ng) ja tuotteen määrä syntyy oli riippumaton määrä DNA-templaatin välillä 2 ja 50 ng (50 ng on suurin tulo testattu). Tässä kokeessa, seuraavan sukupolven sekvensointi multiplex-PCR-tuotteiden tuotti keskimäärin 6000 lukee kohti amplikonin; jopa näytteissä, joissa alle 1 ng DNA: ta käytettiin, lukea syvyyksissä keskimäärin 4000 (S1 Kuva). Titraus DNA uutetaan virtsarakon syövän solulinjat MGH-U3 (

FGFR3

mutantti) ja SW-780 (

TERT

promoottori mutantti) otetaan wtDNA osoitti, että osuus mutantti lukee luotettavasti heijastuu prosenttiosuus mutantti-DNA-alas tasolle alle 2,5%: iin tässä käytetty (S2 Kuva). Lisäksi analyysi ituradan DNA: 6 BCPP potilailla, joilla ei UBC osoitti, että keskimääräinen ”väärä positiivinen” lukea taajuuden 0,20% ± 0,28 klo mutaatio loci kuvattu alla.

Vesi aihioita (n = 37) ajettiin satunnaistetusti kaivot rinnalla virtsan DNA-näytteitä testata saastumista, joka voisi tuottaa vääriä tuloksia, erityisesti virtsanäytteistä alhainen DNA pitoisuuksilla. Keskimääräinen lukea syvyys vedessä aihiot oli 160 (alle 3% keskiarvosta lukea syvyys näytteissä). Näytteet, joilla on alhainen DNA pitoisuudet ja saatiin keskimääräinen lukemaan syvyyttä 500 suljettiin pois tutkimuksesta. Tämä johti sulkemiseen 10 näytettä ulos 242 eli määritys toimi menestyksekkäästi 96% näytteistä. Potilastietoja jäljellä 232 potilasta on esitetty taulukossa 1.

NA: ei määritettävissä, NK: ei tiedetä.

havaitseminen mutaatioita virtsan DNA

Havaitsimme 34 aiemmin raportoitu (COSMIC) mutaatioita potilaamme kohortissa. Tiedot näistä mutaatioista ja lukea syvyydet näissä loci on esitetty S3 taulukossa.

TERT

promoottori mutaatioita havaittiin virtsassa 67 pois 122 UBC potilaista (55%). Prosenttiluvut vaiheessa pTa, pT1 ja pT2 + UBC olivat 56, 63 ja 44%, tässä järjestyksessä (kuvio 1).

TERT

mutaatioita havaittiin myös 1 ulos 20 kuin UBC potilasta ja 1 ulos 89 jälkeisen UBC potilaille.

TERT

mutaatioita havaittiin myös 2 potilasta 2 toistuvia UBC. Prosenttiosuus lukee tukee läsnä mutaation vaihtelivat 5% 50%, mikä osoittaa, että suhde kasvaimen normaaliin DNA virtsaan on melko vaihteleva. Oikea havaitseminen

TERT

mutaatiot varmistettiin Sanger Yhdistelmät useissa potilaalla on 40% mutantti lukee (kuvio 2).

kaavio näyttää prosentteina mutantti lukee kullekin potilaalle näyte otetaan huomioon pistemutaatiot kohdissa CHR5: 1295228, CHR5: 1295242/1295243 ja chr: 1295250.

paneeli A on kuvakaappaus IGV osoittaa osuutta mutantti (vihreä) ja paino (ruskea) base vaatii kolme virtsan DNA: ita (ympäröivä wt sekvenssi harmaana). Sangerin sekvensoinnin samat kolme virtsan DNA: t on esitetty paneelien B: näytettä 661 (CHR5: 1295250 G A), C: näyte 857 (5: 1295228 G A), ja D: Näyte 576 (CHR5: 1242 243 G A).

Mutaatiot

FGFR3

havaittiin 36 virtsan DNA: t potilaista, joilla UBC (30%) ja korkein taajuus NMIBC (prosenttiluvut vaiheessa pTa, pT1 ja pT2 + UBC olivat 41, 30 ja 15%, vastaavasti (kuvio 3)).

FGFR3

mutaatioita havaittiin myös 1 jälkeisessä UBC potilaiden ja 1 2 potilailla, joilla on toistuvia UBC. Kuten

TERT

, mutaatiot varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla useissa näytteissä, joissa on suuri osuus mutantti lukee (tuloksia ei ole esitetty).

Yksittäisten potilaiden on lueteltu pitkin x-akselia kuten on osoitettu, ja taajuus mutantti lukee at koominen loci esitetään kunkin yksittäisen.

Mutaatiot

PIK3CA

havaittiin virtsassa 17 potilaalla on UBC (14%) kaikkiin vaiheisiin tauti (prosenttiluvut vaiheessa pTa, pT1 ja pT2 + UBC olivat 12, 18 ja 10 vastaavasti).

PIK3CA

mutaatio löydettiin virtsasta yhden jälkeisen UBC potilaalle. Mutaatiot

TP53

havaittiin virtsassa 15 potilaalla, joilla UBC (12%) ja korkein taajuus MIBC (prosenttiluvut vaiheessa pTa, pT1 ja pT2 + UBC were5, 13 ja 21%: lla. Mutaatiot

RXRA

,

HRAS

ja

KDM6A

havaittiin virtsassa 7, 1 ja 0 potilaalla on UBC vastaavasti. Kaikki vaihdot eivät olleet synonyymejä paitsi 1

FGFR3

ja ne

TERT

promoottori. täydellinen luettelo mutaatioiden havaittu tutkimuksessa esitetään S2 taulukossa. Kaikkiaan 145 mutaatioita havaittiin 122 UBC potilaiden ja 4 110 potilasta ilman hetkellä havaittavissa UBC.

hyödyntäminen mutaatioita virtsan DNA havaita UBC

jakautuminen mutaatioiden UBC tutkimuspotilaat on esitetty kuvassa 4. Jos käytämme yhden tai useamman mutaatioita havaitsemiseksi UBC, sitten

TERT

on kaikkein informatiivinen (67 syövät havaitaan), jossa

FGFR3

havaitsemaan vielä 12 tapausta,

RXRA

vielä 3 tapausta, ja

TP53

ja

PIK3CA

jokainen havaita 2 ylimääräistä tapausta. Tämä lähestymistapa tunnistaa 86 syöpätapausta ulos 122, mutaatioita havaittiin 3 ulos 109 potilasta ilman UBC (70% herkkyys ja 97% tarkkuus). Tämä ”testi” on vaihe agnostikko kanssa herkkyydet 70, 70 ja 69% vaiheessa pTa, pT1 ja pT2 + UBC, vastaavasti. Mutaatiot havaitaan vastaavan määrän luokan 1 ja 2 kasvaimia (72%) verrattuna luokan 3 kasvaimia (68%), ja ei ole mitään ilmeistä suhdetta kasvaimen koon tai kasvaimen numeron ja testin tarkkuus (S3 kuvassa ja S4 Table, vastaavasti). Jos testi kynnystä on kasvatettu vaatia mutaatioita 2 geenien läsnäolon ilmaisemiseksi UBC, herkkyys pienenee huomattavasti 34%, mutta spesifisyys kasvaa 100%: iin.

Kukin pylväs edustaa yksittäisen potilaan. Oncoprint esitys syntyy https://www.cbioportal.org/.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että mutaatiot useita geenejä voidaan helposti havaita virtsasta DNA käyttäen PCR ja NGS perustuva lähestymistapa. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat käyttäneet NGS analysoida

FGFR3

mutaatioita virtsan DNA [16] ja analysoida

TERT

promoottori mutaatioita virtsan DNA [17], olemme nyt kehittäneet menetelmän, jonka avulla yksittäinen analyysi mitata sekä virtsan biomarkkereita ja muita. On mahdollista multiplex satoja näytteitä yhden sekvensointia aikavälillä, jolloin määritys kustannustehokasta, kun näytteet analysoidaan erissä: 5 USD /euroa sekvensoinnin kustannus per testi (at kirjoitettaessa). Siten saavuttaa matalan kustannukset ja lyhyet läpimenoaikoja, näytteitä olisi lähetettävä keskeinen testauslaboratorio; tällainen infrastruktuuri jo olemassa Yhdistyneessä kuningaskunnassa ja muualla. NGS mahdollistaa havaita pieni määrä tuumori-DNA-molekyylien laimennettu ylimäärä ei-kasvain-DNA, jota ei helposti saavutetaan analogisten sekvensointimenetelmiin tai lähestymistapojen kuten tilannekuva ja Massarray. Jää nähtäväksi, onko pystyy tunnistamaan hyvin alhainen kasvain DNA on edullinen valvonnan asetusta on todennäköistä, että kasvaimia, jotka ovat liian pieniä havaita tai hoitaa vapauta tarpeeksi mutantti-DNA palauttaa positiivisen tuloksen ( ”ennakoiva diagnoosi” [7]). Tutkimuksessamme primaarikasvainten prosenttiosuus

TERT-

ja

FGFR3

lukee sisältävän mutaatioita vaihteli jatkuvasti havaita osoitteeseen 50% koko lukee. Vaikka erittäin vaihteleva yksilöiden välillä, keskimäärin UBC potilailla, joiden mutaatio havaittiin, 20% lukee oli mutantti alleeli viittaa siihen, että noin 40% virtsan solupelletti DNA on peräisin kasvain, vaikka pTa UBC.

Vaikka

TERT-

ja

FGFR3

ovat hämmästyttävän hyviä biomarkkereita UBC takia yleisyys ja keskittämistä pistemutaatiot kuormittajat, mutaatiot muissa geeneissä yleisesti mutatoitunut virtsarakon syöpä ei ryhmittyneet siten [18], ja siksi haastavampaa havaita-paljon DNA on sekvenssi siten, että PCR ja sekvensointi virheitä, ja ei-virtsarakon syöpä erityisiä muutoksia, saattavat antaa vääriä positiivisia tuloksia. Siten vaikka multimarker paneeli varten tarvitaan suurta herkkyyttä taudin havaitseminen (laajempi paneeli kuin olemme alunperin arvioitu täällä), paneelin pitäisi olla suurempi kuin ehdottoman välttämätöntä, tulisi käyttää menetelmiä erittäin alhainen virhemäärien, ja saattavat vaatia rinnakkaisia sekvensointi ituradan DNA.

TERT

promoottori on hyvin GC rikas ja osoittautui vaikeaksi vahvistamaan useiden eri polymeraasien kunnes käytimme KAPA2G (sekä tavoitearvon vahvistusta ja viivakoodi yhtiö).

Yksi merkittävimmistä Tässä raportoidut tulokset on se, että määritys toimi 96% virtsanäytteitä, ja jopa näytteitä jos määrä DNA uutettu virtsasta pelleteistä on liian alhainen mitata tavanomaisin keinoin ( 1 ng). 10 näytteet, jotka eivät anna riittävää lukea perusteellisesti kaikki oli hyvin pieninä pitoisuuksina ja olivat potilailta, joilla ei ole havaittavaa UBC tai pTa sairaus. Helpottamiseksi, kun analysoidaan niin monta näytettä me vain käyttää 9 ui 100 ul DNA: ta 30-50 ml virtsaa sijasta keskittyä enemmän laimean näytteet ja siksi sen pitäisi olla mahdollista parantaa onnistumisprosentti tulevaisuudessa keräämällä lisää virtsa ja eluoimalla DNA pienempään tilavuuteen. Monia määrityksiä, kuten vaativat bisulfiitti muuntaminen olisi epäonnistua monta näytteiden alhainen DNA-pitoisuus. Toinen tärkeä tulos on erittäin korkea spesifisyys meidän paneeli mutaatioiden, jotka voivat tehdä tämä erityinen ”test” hyödyllistä joissakin tilanteissa huolimatta vaatimaton herkkyys; kuitenkin todennäköisempää lähestymistapamme sovitetaan parantaa herkkyyttä. Kolmas tärkeä tulos on havaitseminen 70% PTA kasvaimet (suurella spesifisyydellä vastaan ​​reaalimaailman valvonta), joka näyttää ylittää useimpien biomarkkerit raportoitu tähän mennessä.

Hyväksymme useita rajoituksia tämän tutkimuksen. Ensinnäkin yleinen herkkyys c.70% on huomattavasti alle c.90% herkkyys joustava kystoskopian [19]; Siksi, tämä ei-invasiivisia testi olisi hiottava (todennäköisimmin lisäämällä enemmän mutaatioita ja niiden amplikonien) ennen kuin sitä voitiin pitää lisänä tai korvaaminen joko diagnostista tai valvontaan cystoscopy. Toiseksi, kun otetaan esiintyvyyden (vs. ilmaantuvuus) on NMIBC käyttö tällaisen testin on kliinisesti merkittävää havaitsemiseksi uusiutumisen valvontaan asettaminen; kuitenkin on huomattava, että tapauksissa, tutkimuksemme ovat pääasiassa tapaus UBCs ja että toistuvat kasvaimet voivat olla haastavampaa havaita [20]. Lopuksi suurin osa 110 ’ohjaus’ näytteitä käytettiin arvioitaessa spesifisyyden saatiin erillisestä kohortin potilaista, joille tehdään NMIBC valvonta ( ”post-UBC ’, n = 89), vaikka 20’ ei-UBC” näytteitä BCPP tutkimus edustaa potilaasta, joilla oli oireita ilmenee, UBC (pääasiassa hematuria), mutta jotka olivat syöpää vapaa muista urologiset arviointia. Tulevaisuuden validointitutkimuksia pyrkii saamaan pituus- virtsanäytteistä yhdestä kohortin potilaista, ensimmäisestä diagnoosista kautta valvonnan ja vertailla tai arvioida yhdistelmä NGS mutaation analyysi virtsan sytologian.

Johtopäätökset

Olemme onnistuneesti analysoida useita UBC liittyviä mutaatioita virtsassa solupelletti DNA NGS. Menetelmä toimii hyvin lähes kaikissa virtsanäytteitä, myös ne, joista se on vain mahdollista poimia muutaman nanogrammaa DNA: ta. Herkkyys meidän mutaatiota paneeli havaitsemiseksi UBC oli noin 70% kaikkiin vaiheisiin, UBC ja valittujen geenien olisi sisällytettävä tällaisen DNA-pohjainen biomarkkereiden paneeli virtsarakon syövän havaitsemiseen, mutta geneettisiä tai epigeneettisiä markkereita [7,11, 12,21,22] voidaan tarvita yleispätevä testi.

tukeminen Information

S1 Kuva. Riippuvuus PCR-NGS tulokset määrästä tulon DNA.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s001

(PPTX)

S2 Kuva. Havaitseminen eriasteisesti mutaation

FGFR3

ja

TERT

DNA ylimäärässä wtDNA.

Jokaisessa kaaviossa nähdään tulokset PCR-NGS analyysit sarjan 2-kertaisia mutantti-DNA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s002

(PPTX)

S3 Fig. Oncoprint edustus mutaatioiden havaittu virtsan DNA potilailla, joilla oli asteen 1 grade 2 UBC ja 3. asteen UBC.

doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s003

(PPTX) B S1 Taulukko. Alukesekvenssit PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s004

(XLSX)

S2 Taulukko. Mutaatioiden virtsan DNA.

Tulokset esitetään prosentteina mutantti lukee jokaisen lokukseen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s005

(XLSX)

S3 Taulukko. Yhteenveto mutaatio koordinaattien, seuraukset ja lue syvyydessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s006

(XLSX)

S4 Taulukko. Yhteenveto kasvaimen koon ja moninaisuus ja varmentamiseksi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0149756.s007

(XLSX) B

Kiitokset

Kiitos kaikille West Midlandsin konsultti urologien ja niiden yksiköt mukana BCPP, sekä BCPP tutkimus sairaanhoitajien ja Margaret Grant, Deborah Bird, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman ja Eline van Roekel. BCPP rahoittaa Cancer Research UK, University of Birmingham ja Birmingham ja The Black Country ja West Midlands Pohjois- ja Etelä Comprehensive Local Research Networks, ja sponsoroi University of Birmingham. BCPP biospecimen keräys tukee rahoituksella Birmingham ECMC. Tämä rahoittivat Wellcome Trust seurata vs. rahaston apurahan hallinnoima University of Birmingham. DGW rahoitetaan yleishyödyllinen lahjoitus University of Birmingham tueksi virtsarakon syövän tutkimukseen.