Krooninen sairaus

tiivistelmä

inaktivointi kasvaimen p53 havaitaan yleisesti ihmisen eturauhassyövän ja liittyy terapeuttinen vastus. Olemme aiemmin osoittaneet, että vihreä tee polyfenolit (GTP) apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa riippumatta p53 asemasta. Kuitenkin molekyylitason mekanismeista nämä havainnot ovat edelleen epäselvää. Täällä tutkineet mekanismeja GTP aiheuttaman apoptoosin ihmisen eturauhassyövän LNCaP stabiilisti transfektoitu lyhyt hiusneula-RNA vastaan ​​p53 (LNCaPshp53) ja kontrollivektorille (LNCaPshV). GTP indusoi p53 vakauttamiseen ja aktivointi alavirran tavoitteiden p21 /waf1 ja Bax annoksesta riippuvalla tavalla, erityisesti LNCaPshV soluissa. Kuitenkin, GTP-indusoitu FAS upregulation aktivoimalla c-jun-N-terminaalinen kinaasi johti FADD fosforylaatio, kaspaasi-8 aktivaatio ja katkaisu BID, joka johtaa apoptoosin sekä LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja. Samanaikaisesti, solujen käsittely GTP johti inhibitio selviytymisen reitin, välittyy Akt deaktivointi ja menetys BAD fosforylaation enemmän näkyvästi LNCaPshp53 soluissa. Nämä erilliset reitit solukuoleman lähentyneet yhteinen polku, mikä johtaa mitokondrion transmembraanisen potentiaalin, sytokromi c release ja aktivointi terminaalin caspases, jolloin PARP-pilkkominen. GTP: n indusoiman apoptoosin vaimentaa JNK-inhibiittori, SP600125 molemmissa solulinjoissa; kun taas PI3K-Akt estäjä, LY294002 lisännyt solukuoleman näkyvästi LNCaPshp53 soluissa perustamisesta rooli kahden erillisen polkuja GTP-välitteisen apoptoosin. Lisäksi GTP altistus johti inhibitioon luokan I HDAC-proteiinin kertyminen asetyloitua histoni-H3 yhteensä solun kromatiinin, mikä lisää saatavuutta transkriptiotekijöiden sitoutua promoottorisekvenssit p21 /waf1 ja Bax, riippumatta p53 asemasta solut, sopusoinnussa vaikutuksia joka saadaan aikaan HDAC-inhibiittori trikostatiini A. Nämä tulokset osoittavat, että GTP indusoi eturauhassyövän solukuoleman kaksi erillistä mekanismeja riippumatta p53: näin tunnistaa tiettyjä hyvin määriteltyjä molekulaarisia mekanismeja, jotka voidaan kohdistaa chemopreventive ja /tai hoitostrategioita.

Citation: Gupta K, Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A, Babcook MA, Jackson MW, et al. (2012) Vihreä tee polyfenolit Pakotettava p53-Dependent ja p53-riippumattoman Apoptosis eturauhassyöpäsoluissa kahden erillisen mekanismit. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10,1371 /journal.pone.0052572

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29., 2012 Hyväksytty: 19 marraskuu 2012; Julkaistu: 20 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Gupta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus työ tukee Yhdysvaltain Public Health Service avustukset RO1 CA115491, RO1 CA108512, RO1 AT002709, ja R21 CA109424 ja Endowment varoja SG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ovat kiitollisia tohtori Mark W Jackson, joka palvelee yhteis- kirjoittajalle tässä käsikirjoitus ja on akateeminen toimittaja PLoS ONE. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

rajallinen hoitomahdollisuuksia eturauhassyövän, potilaiden relapsoivan tautia hoidetaan anti -androgens. Kuitenkin alustava kliininen vaste seuraa usein syntymistä hormoni-tulenkestävien ja lopulta kemoterapiaa kestäviä syöpä [1]. Se on vakiintunut, että syöpäsolut voivat hankkia chemoresistance kautta erilaisia ​​mekanismeja, joista suurin osa edellytäkään muuttunut apoptoottinen ohjelma [2]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että p53 asema voisi olla ratkaiseva tekijä varten kemiallis-herkkyys ihmisen kasvaimissa [3], [4]. Enemmän kuin 50% ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä, näytteille menetys normaalia p53 toimintoja ja /tai vikojen p53 signalointireitin, sekä aminohapot, joiden mutaatiot tai deleetiot; Näiden molekyyli- muutokset liittyvät resistenssiin solukuolemaan [4], [5]. Suhteellinen tehottomuus nykyisen solunsalpaajahoitojen oikeuttaa jatkuvan etsiä turvallinen ja tehokas aineita, jotka saattavat parantaa hoidon ja /tai estävät resistenssin kehittymistä kemoterapiaa.

p53-proteiini, kasvain vaimennin, toimintoja transkriptio kasvua inhiboivan liittyvien geenien apoptoosin, solusyklin pysähtymisen ja DNA: n korjaukseen [4] – [6]. Kasvain tukahduttava p53 johtuu pääasiassa sen rooli yhdessä kahdesta mekanismista: joko edistää korjaus- ja selviytymistä vaurioituneiden solujen tai edistämällä pysyvä poistaminen vaurioitua solujen apoptoosin kautta [6], [7]. Esimerkiksi p53 aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ensisijaisesti aktivoimalla transkription sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori, p21 /waf1, ja indusoi apoptoosia kautta transkription aktivaation pro-apoptoottisten Bcl2 perheen geenejä, Bax, PUMA ja Noxa [7]. Vaihtoehtoinen ja täydentävä signalointireitin, joka johtaa ohjelmoitua solukuolemaa sisältää ulkoista kuolema reseptorin kautta. Ulkoisessa hyytymistiessä aloitetaan heti reseptorin ligaatio FAS /CD95-ligandi välittyy adapteri molekyyli FAS-liittyvän kuolindomeeniin (FADD), joka yhdistää reseptorin kanssa alavirtavaikuttajainhibiittorit, kaspaasi 8, jolloin kokoonpano kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin [ ,,,0],7], [8]. Ulkoista ja luontainen apoptoosin reitit on kytketty kaspaasi-8–välitteisen pilkkomisen pro-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsenen Bid. Katkaistun Bid (tBid) translokoituu mitokondrioita, jossa se saa aikaan vapautumisen sytokromi C, mitä seuraa apoptoosin induktio [9].

vapautuminen p53-väylän syöpäsolu on yhteinen tapahtuma ja se voi myötävaikuttaa huumeiden vastarintaa, kemoterapia-strategioita, joilla pyritään tässä vialliset mekanismi tarvitaan. Esimerkiksi uusi terapeuttinen lähestymistapa, johon farmakologinen esto histonideasetylaaseja (HDAC: t), sallii paikallisen remontin chromatin ja dynaamisia muutoksia nukleosomi- pakkaus kautta asetylointi /deasetylaatio ydinhistonin proteiinia, ja siten on keskeinen rooli sääntely saatavuutta kromosomaaliseen DNA, ja siten, että geenien transkription säätelystä [10]. Tärkeimpiä säätelijöitä tällaiset ilmiöt ovat erityisiä entsyymejä, jotka säätelevät N-terminaalista asetylaatio lysiinitähteet H3 ja H4 histonien, histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT) ja HDAC [10], [11]. Nämä entsyymit voidaan rekrytoida muuttaa tiettyjä geenejä komplekseja sekvenssispesifisellä transkriptiotekijöiden. Esto HDAC aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin syöpäsoluissa, ensisijaisesti transkription aktivaation p53-välitteisen pro-apoptoottisen vasteen ja solusyklin estäjät p21 /waf1 ja Bax, kautta sekä transkriptionaalisesti riippumaton suoran sitoutumisen p53 ja Bax, Bcl2 ja Bcl-

xL [12], [13].

Seuraava inaktivaatioon apoptoottisten merkinantoelementit kasvaimia kehittyä myös kemoterapian resistenssin aktivoimalla selviytymisen signalointi kuten phosphatidylinositide 3-kinaasi ( PI3K) /Akt-reitillä [14]. Aktivointi PI3K reseptorityrosiinikinaasien johtaa rekrytointi proteiinikinaasi B (PKB /Akt) solukalvoon jos myöhemmin aktivoituu fosforylaation tähteissä Thr308 ja Ser473, jotka vuorostaan ​​fosforyloituu fosfoinositidi riippuvaisten kinaasien. Aktivoitu Akt parantaa solujen eloonjääntiä sekä inhibitio pro-apoptoottisten proteiinien

eli

. BAD tai kaspaasi-9 ja aktivoimalla Antiapoptoottisten proteiineja siten solun eloonjäämisen edistämisessä [14], [15].

Viimeisten vuosikymmenten aikana, joukko luonnollisia polyfenoliyhdisteiden on arvioitu niiden mahdollinen käyttö ehkäisyssä ja hoidossa syövän [16]. Vihreä tee polyfenolit, pääainesosa, joka on epigallocatechic-3-gallaatti (EGCG), on osoitettu indusoivan solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin erilaisissa syöpäsolutyyppien [17]. Meidän laboratorio on tehty laajoja tutkimuksia mekanismeista anti-syöpää aiheuttavia vaikutuksia vihreää teetä polyfenolit ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [12], [13]. Olemme aiemmin osoittaneet, että vihreä tee polyfenolit aiheuttaa apoptoosin eturauhassyövän soluissa riippumatta androgeenireseptorin yhdistyksen ja p53: [13]. Lisäksi osoitimme, että GTP ja EGCG lisääntyminen p53 transkriptionaalisen aktiivisuuden ja asetylaatio tukahduttamalla luokan I Histonideasetylaasit [12]. Esillä olevassa tutkimuksessa, tuloksemme osoittavat, että vihreä tee polyfenolit indusoida apoptoosia syöpäsolujen aktivoimalla FAS kuoleman reseptori /kaspaasi-8-reitin ja inhiboimaan p-Akt /p-BAD solujen eloonjäämistä kautta. Meidän kertynyt havaintoja olla merkittäviä vaikutuksia ymmärrystämme molekyylitason mekanismi chemoresistance eturauhasen syöpäsoluja, ja erityisesti, rooli p53 ja Akt tässä prosessissa. Koska chemoresistance on rajoittava tekijä pyrittäessä koulumenestystä hoito eturauhasen syöpä, on tärkeää ymmärtää, miten GTP differentiaalisesti voittaa terapeuttisia vastus ja indusoi apoptoosia eturauhassyövän solut erityyppisiä p53 poikkeavuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

LNCaPshV ja LNCaPshp53 solut syntyvät infektoimalla ihmisen eturauhassyövän LNCaP saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA), jossa shp53 lentiviruksen valmistaa laboratoriossa transfektoimalla 293T-solut lentivirusvektoreita pLVTHSiGFP tai pLVTHMshp53RNA ja pakkausten konstrukteja kuten aikaisemmin on kuvattu [18], [19]. Soluja kasvatettiin ja pidettiin RPMI 1640 media (Hyclone, Thermo Fischer, Logan, UT), jota oli täydennetty 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (Foundation, West Sacramento, CA) 50-70% konfluenssiin. Solut, jotka seuraavat hoidot: 20 ng /ml trikostatiini A: ta (Sigma, St Louis, MO), liuotettuna DMSO: hon; 20-80 ug /ml Polyphenon E® (Mitsui Norin, Japani) jäljempänä kuin vihreä tee polyfenolit (GTP) varten osoitettu kertaa. Pitoisuudet 10 ug /ml Polyphenon E vastaa 14 uM egcg määritettynä HPLC-analyysillä. Aineosien läsnä Polyphenon E® on aiemmin kuvattu [20]. Vasta-aineet, anti-p53: n (SC-126), anti-p21 /waf1 (SC-397), anti-Akt (SC-8312), anti-Bax (SC-493), anti-BID (SC-6538), anti- -HDAC1 (SC-7872), anti-HDAC2 (SC-6296), anti-HDAC3 (SC-11417), anti-HDAC8 (SC-11405), anti-FAS (SC-715), anti-FADD (SC- 5559), anti-p-FADD Ser194 (SC-12439), anti-kaspaasi-8 (SC-7890) ja anti-β-aktiini (SC-47778) hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita anti-histoni H3 (05-928), anti-histoni asetyyli H3 Lys9 /18 (07-593) Upstate (EMD Millipore, Billerica, MA), ja BID (44-4334) hankittiin Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Vasta-aineet, anti-kaspaasi-9 (# 9502), anti-kaspaasi-3 (# 9662), pilkotaan PARP (# 9544), anti-c-IAP (# 3130), anti-X-IAP (# 2045), anti- -SAPK /JNK (# 9258), anti-p-JNK Thr183 /Tyr185 (# 9251), anti-p-Akt Ser473 (# 4051), anti-BAD (# 9292), anti-p-BAD Ser136 (# 9295 ) ja anti-VDAC (# 4866) ostettiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA).

Generation of LNCaPshV ja LNCaPshp53 solut

293T pakkaus solut maljattiin 100 mm maljoille päivää ennen transfektiota DMEM, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää ilman penisilliini-streptomysiiniä. Solut transfektoitiin 6 gg shp53 tai shGFP (kontrolli) RNA yhdessä toisen sukupolven pakkausrakenteita (pCMV-dR8.74 ja pMD2G) käyttäen Lipofec- tamin’ia Plus-reagenssia (Invitrogen Corp.) kohti protokollan tarjoamia myyjä. Kahtena peräkkäisenä päivänä, media kerättiin ja kerrostetaan LNCaP-solujen lisäämisen jälkeen 10 ui 4 mg /ml polybreeniä per 10 ml ja steriloidaan suodatuksen kautta.

proliferaatiotestillä

vaikutus GTP soluproliferaatioon määritettiin MTT [3- (4, 5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyyli tetrazoliumbromide] määrityksessä ja kasvun esto arvioitiin prosentuaalisena elinkelpoisuutta, jossa ajoneuvo-käsitellyt solut otettiin 100 % elinkelpoisia kuten aikaisemmin on kuvattu [21].

metyleenisinistä Värjäys ja kvantifiointi

Solut maljattiin 6-kuoppaisille viljelymaljoille ja käsiteltiin eri pitoisuus kamptotesiinin (50-200 ng /ml) 24 h. Media poistettiin sitten ja soluja kiinnitettiin metyleenisiniliuoksella käsittelyn jälkeen ja levyjä pidettiin ravistelijassa 1 tunnin ajan. Levyjä pestiin varovaisesti kahdesti tislattua vettä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi, kuivataan ja skannataan.

Light Microscopy

LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin ja käsiteltiin 20-40 ug /ml pitoisuus GTP: ssa 24 tuntia. Kuvat ovat kaapattu x40 suurennusta valomikroskoopilla.

DNA Fragmentation Pitoisuus

Solut kasvatettiin noin 70% yhtymäkohdassa ja käsiteltiin 40 ug /ml pitoisuus GTP 48 tuntia. Sitten solut altistettiin käsittely DNA: n eristäminen ja pirstoutumista määrityksessä. Vyöhykkeet näkyviksi UV transilluminaattorilla, jonka jälkeen digitaalinen valokuvaus aikaisemmin kuvatulla [21].

solukuoleman määritys

Solun apoptoosia mitattiin

in vitro

määrittämisessä sytoplasminen histoni-liittyvä-DNA-fragmenttien (mono- ja oligonukleosomeja) jälkeen solukuoleman induktioon fotometrisellä entsyymi immunomääritys, jossa käytetään Cell Death Detection ELISA kit Roche (Cat # 11774425001) kohti myyjän protokollaa. Lyhyesti, soluja käsiteltiin 20 uM LY294002 tai 20 uM SP600125 8 h ja 40 ug /ml GTP: ssa 16 tuntia tai yhdessä 24 tuntia ja sytoplasminen solu-uutteet siirrettiin streptavidiinilla päällystettyjä mikrokaivoisille levyt immuno-reagenssilla, joka sisältää anti- histoni-biotiini, anti-DNA-POD. Inkuboinnin jälkeen entsymaattinen reaktio suoritettiin ja väri luettiin 405 nm: ssä käyttäen viite aaltopituudella 490 nm. Tausta-arvoja (inkubaatiopuskurissa yksin) vähennettiin, ja OD-arvot, jotka edustavat nukleosomaalisia DNA-fragmentteja käsiteltiin näytteitä verrattiin arvoja käsittelemätön kontrolli solut, ja ilmaistaan ​​kertainen kasvu.

Western blot -analyysi

Solut hajotettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA), puskuria (joka sisälsi 1% NP40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS PBS: ssä, ja juuri lisätty täydellisen proteaasiestäjäseostabletit (Roche Applied Sciences, Indianapolis, iN). proteiini-pitoisuus solulysaatti määritettiin käyttäen pesuaineiden kanssa yhteensopivissa proteiinimäärityksellä Bio-Rad (Hercules, CA). proteiini näytteet altistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. kalvo inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön estetty 5% rasvatonta maitoa PBS: llä. Seuraavana päivänä kalvo poistettiin primäärinen vasta-aine, pestiin pesu- puskurilla ja sen jälkeen niitä inkuboitiin asianmukaisten piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kalvo kehitettiin sitten tehostetun kemiluminesenssin reagenssilla (GE Healthcare, Piscataway, NJ), ja altistettiin Hyblot CL autoradiografia kalvon (Denville Scientific, Metuchen, NJ). Kuva digitointi ja kvantifiointi suoritettiin Kodak 2000 kuvantamisjärjestelmä.

eristäminen ja ilmentäminen Asetyloitu histoniproteiineista

Ihmisen eturauhassyöpä LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja käsiteltiin 20-80 ug /ml GTP 24 h ja kerättiin sitten pestiin kaksi kertaa jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), johon oli lisätty 5 mM natriumbutyraattia. Pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen Triton uuttopuskuria [PBS, joka sisälsi 0,5% Triton X-100 (tilavuus /tilavuus), 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 0,02% (paino /tilavuus) NaN3: a] ja lyysattiin jäillä 10 minuutin ajan varovasti sekoittaen, sentrifugoitiin 2000 rpm 10 min 4 ° C: ssa. Pelletti pestiin Triton uuttopuskuriin ja suspendoitiin sitten uudelleen 0,2 N HCl: lla. Histonit olivat happo uutettiin yli yön 4 ° C: ssa ja sentrifugoitiin 2000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Näytteet käsiteltiin analyysiä varten histonien avulla immunoblottaus.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) Pitoisuus

Ihmisen eturauhassyöpä LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja käsiteltiin 20-80 ug /ml annosta GTP liuotettuna PBS: ää tai vain PBS: llä (kontrolli) ja 3 päivää. Lopussa hoidon, soluja inkuboitiin seerumia, joka sisälsi 1% formaldehydiä 15 minuutin ajan huoneen lämpötilassa silloittumisen. Sitten reaktio lopetettiin käyttäen 0,125 M loppupitoisuudeksi glysiiniä. Kromatiinin pilkottiin monococcal nukleaasilla entsyymiä ja inkuboitiin anti-asetyloitu histoni H3 (Cat # 07-593, Upstate Biotechnology), vasta-ainetta yli yön 4 ° C: ssa. Silloittaminen purettiin inkuboimalla näytteitä yön yli 65 ° C: ssa. DNA puhdistettiin käyttäen fenoli-kloroformi-isoamyyli- ratkaisu, jota seuraa etanolisaostuksella. DNA suspendoitiin sitten uudelleen nukleaasitonta vettä. Käytetyt alukkeet p21 /waf1-geenin promoottori oli seuraava: eteenpäin-alukkeita 5′-GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3 ’, reverse-alukkeita 5′-GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′ ja Bax-geenin promoottori, eteenpäin-alukkeita 5’-TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 ’ja reverse-alukkeita 5’-TGCA GAGACCTGGATCTAGCAA-3 ’, vastaavasti. Immunosaostettiin DNA: t, helmiä tai tulo valvonta saatettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) 30 kierrosta seuraavaa sykliolosuhteita: Stage-1-95 ° C 2 min (1 sykli), vaihe-2-95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 1 min (30 sykliä), vaihe-3-72 ° C: ssa 3 min (1 sykli). PCR-tuotteet suoritettiin elektroforeesi käyttäen 2% agaroosigeelillä.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis Detection

vaikutus GTP solusyklin ja subG1 mitattiin suorittamalla virtaussytometrinen määritys. LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja käsiteltiin GTP ja kerättiin trypsinoimalla jälkikäsittelyn (molemmat ovat kiinnittyneet, ja kelluvat solut jälkikäsittely media) kerättiin. Solut pestiin kahdesti PBS: llä. Noin 1 x 10

6 solut kiinnitettiin 90%: kylmää metanolia ja jätettiin jäille vähintään 30 minuutin ajan ja säilytettiin -20 ° C asti käsitelty solusyklin. Solut pelletoitiin, pestiin, ja suspendoitiin uudelleen 0,04 ug /ml propidiumjodidia ja 100 ug /ml RNaasi-PBS: ssä. Näytteitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan ja virtaussytometria suoritettiin EPICS-XL-MCL virtaussytometriä ja analysoitiin käyttäen Cell Quest Analysis ohjelmisto Modfit määrittämään solujen lukumäärä kunkin vaiheen solusyklin.

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa kahtena kappaleena. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD. Kuvat digitalisoitiin ja kvantifiointi suoritettiin käyttämällä ohjelmisto on Kodak 2000 kuvantamisjärjestelmä. Tilastolliset vertailut tehtiin ANOVA: lla, jota seuraa Dunnettin monivertailukoetta.

P

arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Vaikka tehoa GTP apoptoosin erilaisissa syöpäsolutyyppien on hyvin dokumentoitu [22] – [24], vaikutus GTP puuttuessa p53 poikkeavuuksia ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että inaktivointi p53 siRNA ihmisen eturauhassyövän LNCaP-solujen lisääntyneen resistenssin egcg-välitteisen apoptoosin [25]. Yksiselitteisesti vahvistaa roolia p53 ja tutkimaan polkuja vastuussa lisääntynyt solujen vastus, tuottamaamme isogeenisiin solut lentiviruksen vektori tausta pysyvästi Knockdown p53 LNCaP-soluissa tuottaa LNCaPshp53 ja transfektoitu kontrollivektorilla tuottaa LNCaPshV soluihin. Sen määrittämiseksi, onko p53: n tasot vaikuttavat solukuoleman vaste, isogeenisissä soluja käsiteltiin camptothechin, joka on DNA: ta vahingoittavat syöpälääke, joka aiheuttaa apoptoosin ihmisen eri syöpäsoluissa [26]. Kuten kuviossa 1A, käsittely 50 ja 100 ng /ml camptothechin 24 tuntia johti merkittävään kasvuun LNCaPshV soluja G1-vaiheessa solusyklin. Käsittelemättömään kontrolliin verrattuna, solujen prosenttiosuus G1 vaiheeseen kasvoi 67,36%: sta 79,62% ja 86,22% hoidon jälkeen 50 ja 100 ng /ml pitoisuuksia kamptotesiinin. Samoin LNCaPshp53 solut osoittivat G1 vaiheen pysähtymisen jälkeen kamptotesiinin hoidon 74,43% ja 71,42% hoidon jälkeen 50 ja 100 ng /ml kamptotesiini, verrattuna käsittelemättömiin soluihin 62,51% G1 vaiheessa. Lisäksi G1 vaiheeseen pidätys kampotesiinilla myös aiheutti merkittävää kerääntymistä solujen subG1 vaiheessa alustava apoptoosin. Käsittelemättömiin soluihin verrattuna (3,37%), hoito LNCaPshV solujen kamptotekiini kasvoi 34,91% 50 ng /ml ja 51,97%: 100 ng /ml sub-G1-vaiheessa. Kuitenkin LNCaPshp53 solut olivat resistenttejä camptothechin-välitteisen apoptoosin 23,87% ja 29,59% 50 ng /ml ja 100 ng /ml annoksilla subG1 vaiheessa, verrattuna 1,71%: in käsittelemättömiin kontrolleihin. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, että klonogeeniset määrityksessä jossa knockdovvn p53 lisännyt vastustuskykyä camptothechin välittämää solukuolemaa (kuvio 1 B).

isogeenisiin solujen lenti-virus vektori tausta muodostettiin pysyvä knockdown p53 LNCaP solut [LNCaPshp53] ja transfektoitu kontrollivektorilla, LNCaPshV soluja. [A] Cell hoidettu 50 ja 100 ng /ml camptothecin 24 tuntia kerättiin, värjättiin PI ja analysoitiin virtaussytometrillä mittaamiseksi sub-G1 ja G1 väestöstä. [B] Soluja käsiteltiin 50, 100 ja 200 ng /ml kamptotesiinin 24 tuntia ja värjättiin metyleenisinisellä. Intensiteetti metyleenisineä tarttunut elävät solut mitattiin spectrophotometerically jälkeen eluoimalla väriaineen 0,1 N HCl ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna. [C] pudotus p53 voimistunut Akt /BAD signaloinnin eturauhassyöpäsoluissa. LNCaPshV ja LNCaPshp53 solut hajotettiin ja Western blottaus suoritettiin p53, Akt, p-Akt (Ser473), BAD, p-BAD (Ser136) proteiineja. Aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta. [D] suhteellinen intensiteetti p-Akt ja p-Bad-proteiinin LNCaPshV ja LNCaPshp53RNA soluihin, joissa bändejä normalisoitiin aktiini ja ilmaistaan ​​suhteelliset arvot verrattuna natiivin proteiinin. Yksityiskohdat kuvataan materiaalit ja menetelmät jaksossa.

knockdovvn p53 Korotukset Akt Survival signalointireitin

Koska tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivoitua Akt voi johtaa downregulation p53 tasoilla [27 ], seuraavan kerran määritti p53 knockdown on Akt tasoilla ja sen loppupään tavoitteita. Kuten kuviossa 1C, pudotus p53: n aiheuttama merkittävä kasvu p-Akt (Ser473) ja p-BAD (Ser136) ilmentyminen LNCaPshp53 soluissa, verrattuna LNCaPshV soluihin. 2,0 kertainen lisäys p-Akt tasoilla ja 3,78 kertainen lisäys p-BAD tasot todettiin jälkeen p53 Knockdown vuonna LNCaPshp53 soluissa, verrattuna LNCaPshV soluihin (kuvio 1 D).

Green Tea polyfenolit apoptoosin kummassakin LNCaPshV ja LNCaPshp53 solut Riippumaton p53:

luonnehtia p53 tilan vaikutuksesta GTP hoidon jälkeen tehdyt tutkimukset tehtiin LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja. Kuten kuviossa 2A, MTT-analyysi suoritettiin 24 tunnin kuluttua hoidon 20-80 ug /ml: n konsentraation GTP näytteillä annoksesta riippuvaista inhibitiota solujen elinkelpoisuus 100%: sta 33,98%: in LNCaPshV ja 100%: sta 66%: in LNCaPshp53 soluissa. Verrattuna LNCaPshp53 soluihin, LNCaPshV solut olivat herkempiä GTP altistumista ensimmäisen 24 h hoidon jälkeen. Vaikutusten tutkimiseksi enemmän pitkäaikaista altistumista GTP, ajasta riippuva tehtiin tutkimuksia, joissa 40 ug /ml annos GTP. Solujen käsittely GTP aiheutti selvää kerääntymistä solujen G0 /G1 vaiheeseen; 71,02%: sta 84,57%: in LNCaPshV soluissa, verrattuna 78,39%: sta 81,19%: in LNCaPshp53 solujen välillä 48-96 h, vastaavasti (kuvio 2B). Solujen lukumäärä vuonna subG1 lisääntyi huomattavasti 96 tunnin jälkeinen GTP kohtelu sekä solujen linjat; 0,53%: sta 66,97%: in LNCaPshV soluissa ja 0,31%: sta 83,94%: in LNCaPshp53 soluissa riippumatta niiden p53 asemasta (kuvio 2C). GTP käsittely johti myös apoptoosia sekä LNCaPshV ja LNCaPshp53 solujen havaitaan valomikroskopialla ja DNA: n fragmentoituminen määritys (kuvio 2 D Ajoneuvon käsiteltyjä soluja pidettiin 100% elinkelpoisia. Palkit edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kahden itsenäisen kokeen kukin suoritettiin kaksinkertaisina, **

p

0,001 edustaa merkittäviä eroja verrattuna hallita ryhmään ilman GTP hoitoa. [B] Cell käsiteltiin 40 ug /ml GTP 24, 48, 72 ja 96 h ja jakelu soluja tallennettu eri vaiheissa solusyklin analysoitiin käyttäen FACS-analyysiä. [C] Soluja käsiteltiin 40 ja 80 ug /ml GTP 96 tuntia, ja solujen lukumäärä apoptoosin määritettiin mittaamalla solupopulaation osa G1 vaiheen solusyklin. Palkit edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kahden itsenäisen kokeen kukin suoritettiin kaksinkertaisina, **

p

0,001 edustaa merkittäviä eroja verrattuna hallita ryhmään ilman GTP hoitoa. [D] valomikroskooppinen kuvia LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja käsiteltiin 40 ja 80 ug /ml GTP 96 tuntia. GTP hoito esittelee morfologiset muutokset, jotka apoptoosia sekä näissä soluissa. [E] DNA: n fragmentoituminen määrityksessä. Solut käsiteltiin 40 ug /ml: n konsentraation GTP 48 h, kerätty DNA-eristystä varten ja sille suoritettiin agaroosigeelielektroforeesi, jonka jälkeen visualisointi kaistojen UV-valossa. Yksityiskohdat kuvataan materiaalit ja menetelmät jaksossa.

Aiemmin raportoitu, että ihmisen eturauhasen syöpäsolujen sisältäviä toimiva p53, GTP osatekijän EGCG hoito ylössäätelee p53 ja sen fosforylaatio kriittisiä seriinitähteissä ja p14

ARF-välitteisen downregulation MDM2 p53-riippuvaisella tavalla [28]. Hoito LNCaPshV solujen 20-80 ug /ml pitoisuuksia GTP 24 tunnin osoitti annosriippuvaista lisääntymistä p21 /waf1, Bax ja PUMA, tunnettu alavirtaan tavoitteita p53, kun taas mitään merkittäviä muutoksia havaittiin p-BAD ja p-Akt tasoilla. Vuonna LNCaPshp53 soluissa, GTP käsittely johti myös annoksesta riippuva nousu ilmentymistä p21 /waf1, Bax ja PUMA, vaikka ei siinä määrin, havaittiin LNCaPshV soluissa, mikä osoittaa sekä p53-riippuvaisen ja p53-riippumattoman induktion pro-apoptoottisten proteiinit näissä soluissa (kuvio 3A). Hoidon jälkeen GTP merkittävä lasku Akt ja BAD fosforylaation näkyi LNCaPshp53 soluissa. Yhdenmukainen apoptoosin, ajasta riippuvainen kasvaa lohkaistun kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 havaittiin molemmissa solulinjoissa (kuvio 3B).

[A] Soluja käsiteltiin 20-80 ug /ml: n konsentraation GTP 24 h ja Western blottaus suoritettiin p53, Akt, p-Akt (Ser473), BAD, p-BAD (Ser136), p21 /waf1, PUMA ja Bax proteiineja. [B] Soluja käsiteltiin 40 ug /ml: n konsentraation GTP 3, 6, 9, 12, 24 ja 48 tuntia, ja Western-blottaus suoritettiin prokaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-9 ja pilkottiin kaspaasi-3 proteiineja. Tyypillinen aktiini blot osoittaa sisäisen kuormituksen valvonta. Sytokromi c vapautumista mitokondrioita sytosoliin määritettiin Western blotting GTP käsitellyissä soluissa. Tyypillinen aktiini blot osoittaa sisäisen kuormituksen valvonta sytosoliin taas VDAC sisäisenä kuormituksen valvonta mitokondrioita. [D] Soluja käsiteltiin 20 uM PI3K-Akt-inhibiittori LY294002 8 tuntia ja 40 ug /ml GTP 16 h yksinään tai LY294002: ssa 8 tuntia ja sen jälkeen GTP hoitoon yhdistelmänä seurasi Western-blottaus ja p-Akt , Akt, p-BAD ja BAD proteiineja. Ilmaisut natiiviproteiinien pidettiin lastaus valvontaa. [D] Solukuolemaan mittaus suoritettiin fotometriset entsyymi-immuno- Cell Death Detection ELISA kit. Palkit edustavat keskiarvoa ± SD vähintään kahden itsenäisen kokeen kukin suoritettiin kaksinkertaisina, **

p

0,001 edustaa merkittäviä eroja verrattuna kontrolliryhmään. [E] valomikroskooppinen kuvia LNCaPshV ja LNCaPshp53 soluja käsiteltiin LY294002 ja GTP yksin tai yhdessä. Yksityiskohdat kuvataan materiaalit ja menetelmät jaksossa.

Seuraavaksi analysoimme vaikutukset GTP altistumisen loppupään apoptoottisen reitin, sanottuna efektorit mitokondriaalisen kuolema kaskadi, arvioimalla sytokromi C julkaisu sytosoliin. Hoito LNCaPshV ja LNCaPshp53 solujen GTP lisäsi merkittävästi sytokromi kolesterolitason sytosoliin, joka oli korkeimmillaan 12 tuntia post-GTP altistuksen. Translokaatio sytokromi C mitokondrioita sytosoliin havaittiin molemmissa solulinjoissa on ajasta riippuva tavalla (kuva 3B).

Green Tea polyfenolit estää AKT: Ser473 fosforylaatio ja Downstream tavoitteet vuonna LNCaPshp53 Solut

aikaisemmin osoitimme, että p53 knockdown johti voimistunutta ilmentymistä Akt ja kasvatti fosforylaation Ser473. Seuraavaksi käsitellään molemmissa solulinjoissa GTP ja /tai LY294002, erityinen PI3K-Akt estäjä. Fosforylaatiota Ser473 ja T308 aktivoi Akt fosfory- kohdeproteiinit sen kinaasiaktiivisuuden edistää selviytymistä ja estää apoptoosin [29]. Kuten kuviossa 3C D, solujen käsittely LY249002 alensi p-Akt tasoilla ja lisännyt apoptoosia sekä solulinjoissa, vaikka sen määrää apoptoosin oli korkeampi LNCaPshp53 soluissa. Samoin GTP hoito esti Akt fosforylaation Ser473, mikä oli yhdenmukainen voimistunutta apoptoosia, ja yhdistettynä hoito GTP ja LY294002 tuottaa vielä korkeamman solukuoleman LNCaPshp53 soluissa kuin LNCaPshV soluissa. Tasaisen, fosforylaatio BAD laski huomattavasti seurauksena vähentynyt fosforylaatio kinaasiaktiivisuuden Akt mukaan LY294002 ja GTP; Tämä korreloi samanaikaisesti lisääntynyt solukuolema LNCaPshp53 soluja. Samanlaisia ​​vaikutuksia alempi suuruus havaittiin LNCaPshV soluissa (kuvio 3 D & E). Nämä tulokset osoittavat, että vaikka suuruus solukuoleman aiheuttama GTP altistus on samanlainen molemmissa solulinjoissa, polut, jotka johtavat apoptoosin ovat erilaisia ​​ja saattavat vaikuttaa p53 tila.

Green Tea polyfenolit Pakotettava Death Receptor Pathway in Human eturauhassyöpäsoluissa

jotta tutkia mahdollisia mekanismeja GTP: n indusoiman apoptoosin, me seuraavaksi keskittyneet ulkoinen tie läpi FAS. Kuten kuviossa 4A on esitetty, käsittelemällä GTP aiheuttaman induktion FAS 10 min molemmissa solulinjoissa, minkä jälkeen kohonneet fosforyloitua FADD on Ser194, kun taas kokonais-FADD pysyivät ennallaan. Kuitenkin pohjapinta tasot FADD oli paljon suurempi LNCaPshp53 soluissa verrattuna LNCaPshV soluihin.