Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kuihtuminen on paraneoplastinen oireyhtymä, joka aiheuttaa syvällisiä laihtuminen ja lihasmassan surkastumista, ja sen arvioidaan olevan aiheuttaa jopa 30% syövän kuolemia. Vaikka tarkka syy on tuntematon, syöpäpotilailla kuihtuminen ovat lihasten proteiinikataboliaa. Terveillä lihas, vahinkoa aktivoi luurankolihasten kantasoluja, nimeltään satelliitti solujen, erilaistumaan ja edistää uudistumista. Täällä tarjoamme todisteita siitä, että tämä mekanismi estyy syöpäkakeksialle johtuen pysyviä ilmentymisen CCAAT /edistäjän sitova proteiini beeta (C /EBPβ) lihasten myoblasteja. C /EBPβ on bzip transkriptiotekijä, joka on ilmaistu lihasten satelliitti solujen ja on yleensä vaimentua upon erilaistumista. Kuitenkin myoblastit alttiina kakektisia miljöössä, C /EBPβ ilmaisu on koholla, vaikka aktivointi erottaa, mikä johtaa inhibitioon myogeniinin ilmaisun ja myogeneesin.

In vivo

, syöpäkakeksialle johtaa lisääntynyt määrä Pax7 + soluja, jotka ilmentävät myös C /EBPβ ja estämällä normaalin korjausmekanismeja. Menetys C /EBPβ ilmentymisen ensisijainen myoblastien pelastaa erilaistumista alle kakektisia olosuhteissa palauttamatta myotube koko, mikä osoittaa, että C /EBPβ on tärkeä estäjä myogeneesin in syöpäkakeksian.

Citation: Marchildon F, Lamarche É, Lala- Tabbert N, St-Louis C, pyyhin-Bergeron N (2015) Expression of CCAAT /edistäjän sitova proteiini Beta Muscle Satellite solut Estää myogeneesin sisään syöpäkakeksialle. PLoS ONE 10 (12): e0145583. doi: 10,1371 /journal.pone.0145583

Editor: Atsushi Asakura, University of Minnesota Medical School, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 14 syyskuu 2015; Hyväksytty: 04 joulukuu 2015; Julkaistu: 28 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Marchildon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittaa avustuksin ja NWB Kanadan Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) ja Cancer Research Society (https://www.crs-src.ca/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

Kuihtuminen aiheuttaa syvällisiä laihtuminen ja lihasmassan surkastumista, ja tapahtuu samanaikaisesti erilaisia ​​sairauksia kuten sepsis, aIDS, huumeriippuvuus, ja syöpä [1, 2]. Vaikka usein yhdistettynä anoreksia, laihtuminen ja lihasten proteiinikataboliaa nähdään kakektisia potilaita ei voida kumota ravintona ja näin ollen voida katsoa johtuvan huonosta ravinnontarpeestaan ​​yksin [3]. Jopa 80% kaikista syöpäpotilailla on kakeksia edennyt pitkälle heidän sairautensa [4-6], ja tämä korreloi haurautta, lisääntynyt sairastuvuus ja huono tuloksia. Edelleen, noin 30% syöpäkuolemista ovat johtuvan kakeksian sijaan tuumorikuorma, joten syöpäkakeksialle tärkeä kuolleisuuden aiheuttaja Pohjois-Amerikassa [1]. Sinänsä luomista hoitoon ja ehkäisyyn strategioita on äärimmäisen tärkeää, koska kakeksian korreloi käänteisesti menestys syövän hoitojen ja potilaan eloonjääminen [3, 7-9]. Syy syöpäkakeksialle ajatellaan johtuvan yhdistelmästä ruoansulatuskanavan (dysfagia ja makuhäiriö), humoraalinen (systeeminen tulehdus), hormonaaliset ja tuumorista peräisin tekijät [10-13]. Molemmat kakektisia syöpäpotilaiden ja eläinmalleissa kuihtuminen ovat kohonnut tulehdusta edistäviä sytokiini (esimerkiksi TNFa, IL-1, IL-6) ilmentymistä verenkiertoon, mikä viittaa siihen, että nämä tekijät rooli kehitettäessä kuihtuminen [14-18].

terve yksilö, lihasmassaa homeostaasin saavutetaan tasapainottamalla lihasten proteiinikataboliaa proteiinisynteesiä. Poikkijuovaisen lihaskudoksen surkastuminen, kuten nähdään syöpäkakeksia, välittyy ainakin osittain säätelyä ATP-riippuvaisten ubikitiini E3 ligaasit (Murf, MAFbx /atrogin-1), jotka stimuloivat hajoaminen lihaksen rakenteellisten proteiinien 26S-proteasomin, ja sitä estävät translationaalinen koneisto [19, 20]. Pro kakeksian sytokiinien edistää ilmentymistä näiden ligaasit ja siten edistää lisääntynyt lihasten proteiinia liikevaihdon [18, 21-23].

Satelliitti-solut ovat ensisijainen lähde uusiutumiskykyä luurankolihasta ja löytyy välillä sarcolemma ja tyvikalvon eriytetty lihassyiden [24]. Nämä solut voidaan aktivoida sekä lisääntyvät nopeasti ja erilaistua vastauksena ulkoisiin ärsykkeisiin, mikä tärkeintä lihas ja liikunta [25]. Satelliitti solujen määritellään niiden ilmentymistä CD34

+ ja Pax7, muun muassa [26, 27]. Satelliitti solut erikoistuvat, ne menettävät asteittain ilmaus Pax7 ja ilmaista koordinoidusti myogeenisen bHLH tekijät MyoD myogeniinin ja MRF-4, jotka ovat vastuussa induktion myosyyttiä geenejä [28]. Lihasten kuihtumista olosuhteissa, on väheneminen MyoD ilmentymisen siten, että lisäksi hyperkatabolismi, vähentynyt palautuminen on patogeneesiin kakeksian, joka yhdistää inhibition MyoD ilmaisun ja vähentää erilaistumista kyky kehittämiseen kakeksian

in vivo

[29-31].

CCAAT /edistäjän sitova proteiini beeta (C /EBPβ) on bzip transkriptiotekijä mukana monissa sääntely- ja erilaistumista prosessien sekä aktivaattorina ja repressori. Esimerkiksi se on tarpeen maksan regeneraation, toimii voimakas sitoutuminen tekijä adiposyyttien erilaistumiseen, ja säätelee akuutin vaiheen vasteen immuunijärjestelmän [32-36]. Lisäksi olemme osoittaneet, että C /EBPβ on myös tärkeä säätelijä mesenkymaalisten kantasolujen kohtalo kudosviljelmässä malleihin, joissa se toimii aktivaattorina adipogeneesi ja repressori osteoblastogenesis [37-39]. Terveillä lihas, C /EBPβ ilmentyminen rajoittuu Pax7

+ satelliitti, ja sen ekspressio vähenee aktivoinnin [40-42]. Kohdunulkoinen C /EBPβ ilmaisun estää myogeneesin estämällä MyoD proteiinin ilmentymisen, mikä vähentää myogeniinin ja MyHC ilmaisun ja laski fusogeenistä toimintaa [41].

In vivo

, sepsis, syövän ja glukokortikoidit voivat upregulate ilmentymisen C /EBPβ lihasten, sekä laukaista kakeksia [43, 44]. Todellakin, kuihtuminen voivat stimuloida C /EBPβ ilmentymisen lihassyiden johtaa ilmentymistä atrogin-1 ja kuidun surkastuminen [45]. Kynsien Lewisin keuhkosyöpä (LLC) kasvain osaksi C /EBPβ null eläimiä esti stimulaation atrogin-1 lihasten kuituja ja lihasten surkastumista [45], mikä viittaa siihen, että menetys C /EBPβ voi estää lihasten surkastumista syöpäkakeksialle. Kuitenkin nullizygous C /EBPβ eläin on immuunipuutteisilla, ja näin tuskin on normaalia vastauksia kasvaimen varttaminen lukien sytokiinien tuotannon kehittäminen edellyttää kuihtuminen [46, 47], mikä viittaa siihen, että ehdollinen mallit tarjoaisivat enemmän syvyyttä ymmärrystä. Edelleen nullizygous malli ei voi erottaa roolia C /EBPβ lihaksen fiber verrattuna mahdollisia vaikutuksia satelliitin solupopulaation ajo uudistumista.

Useita rivejä todisteita osoittavat, että esto luuston lihasten palautumista, onko kautta menetys myogenic lähtöaineiden, inhibition MyoD tai aktiviinin tyypin 2 reseptorin aktivoitumisen, osallistuu syövän kehittymiseen kuihtuminen [31, 48-50]. Tässä osoitamme, käyttäen malleja syövän kuihtuminen, että stimulointi C /EBPβ ilmentymisen satelliitti solujen ja myoblastit jonka kakektisia ympäristö estää myogeenisen regeneratiivinen vaste.

Tulokset

elatusainetta ihmisen syövät indusoi C /EBPβ ilmentymisen myoblastit

Koska C /EBPβ on tärkeä säätelijä immuunijärjestelmää ja on alavirtaan lukuisista sytokiinien signalointireittien, me ennusti, että kunnostetussa alustassa ihmisen syövistä lisäisi C /EBPβ ilmaisu in myoblastit. C2C12 myoblastit viljeltiin elatusaineessa (CM) eri ihmisen syövän solulinjojen 2 päivää ja C /EBPβ ilmentymistä arvioitiin Western blot. Inkubointi C2C12 solujen CM kaikista kasvaimista testattu stimuloidaan C /EBPβ ilmaus vaihtelevasti, PC-3, MCF7 ja A549 linjat tuottavat vahvin kasvu ilmaisu (kuvio 1A). Sitä vastoin munasarjasyövän solulinja SKOV3 ja ihmisen paksusuolen syövän HCT116 stimuloidaan C /EBPβ ilmentymisen vähiten. Inkubointi PC-3 CM myös edistänyt

CEBPB: lle

mRNA: n ilmentymisen lähes 2-kertaiseksi (kuvio 1 B). Mielenkiintoista on, että PC-3-solut ilmentävät TNFa, IL-1β ja PIF mRNA, ja C /EBPβ ilmentymisen on osoitettu olevan positiivisesti säädellä IL-6, sytokiini, jonka ilmentyminen on voimistunut IL-1 ja TNFa: n signaloinnin [15, 51 -53]. Todellakin, kun taas PC-3-solut ilmentävät

Il1b

, ote oli havaitsematon SKOV3- soluissa, mikä viittaa mekanismi selittää ero stimulaation C /EBPβ ilmentymistä Myoblastien näiden kahden syövän solulinjoista (kuvio 1 C).

(A) C2C12 myoblastien inkuboitiin kunnostetun alustan välillä osoitti ihmisen syövistä tai ehdoton väliaineen (UM) sekoitettuna 1: 1 tuoreella myoblas- väliaineen 48 tuntia. C /EBPβ ilmentymistä arvioitiin Western blot. β-aktiini on latauskontrollina. (B)

CEBPB: lle

mRNA ilmaisun Myoblastien käsitelty PC-3 keskipitkällä tai unconditioned väliaine 48 tuntia. * P 0,05, n = 5 (C)

Il1b

ilmaisun SKOV3 ja PC-3 syöpäsolujen. * P 0,05, n = 5.

Kasvain väliaine estää myogeneesin

roolin tutkimiseksi C /EBPβ lihaksen kantasoluja aikana syöpä kuihtuminen, käytimme validoitu kudos kulttuuri malli [53], jossa subkonfluenteista C2C12 myoblastien inkuboitiin kunnostetun alustan (CM) ihmisen eturauhasen syöpiä PC-3 ja DU145 tai ehdottomalla media (UM) 2 päivää ennen induktiota erilaistua (kuvio 2A). Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien inkubointi CM molempien syöpiä kumottu myogeneesin, mistä on osoituksena väheneminen määrän ja koon myosiinin raskasketjun (MyHC) positiivinen lihasputkia (kuvio 2B) [53]. Fuusio-indeksi (# ytimien MyHC + solua /# myocytes) vähennettiin ~ 60% PC-3 keskipitkällä ja ~ 30%: iin DU145 keskipitkällä kontrolleihin verrattuna (kuvio 2C), erilaistuminen indeksi (#nuclei in MyHC + solua /yhteensä ytimet) aleni noin 40% soluissa esikäsitelty PC-3 medium, ja ~ 30% saaneista DU145 väliaineen, verrattuna kontrolleihin (Kuva 2C), mikä viittaa siihen, että sekä määrä ja kypsyys lihasputkia vaikutti lyhyt altistus kasvaimen kunnostettua alustaa. Lisääntyvissä myoblastit, altistuminen CM sekä kasvainten stimuloitujen C /EBPβ ilmaisu kahden päivän kuluttua, vaikuttamatta Pax7 ilmentymistä (kuvio 2D). Ilmentyminen MyoD väheni käsitellyissä soluissa DU145 CM, mutta ei käsitellyissä soluissa PC-3-alustassa (kuvio 2D). Erilaistumisen jälkeen (päivä 7), esikäsittely PC-3 väliaine esti myogeniinin ja MyHC ilme, sopusoinnussa heikentynyt erilaistumista vaikuttamatta MyoD ilmaisu (kuvio 2E). Lisäksi mRNA ilmaus

Myod1

,

Myog

ja vastasyntyneen

MYH

isoformeja (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

ja

Myh13

) inhiboi altistuminen PC-3 keskipitkällä suhteessa solujen altistettiin ehdoton keskipitkän (kuvio 2F). DU145 keskipitkän pienennettävä

Myog

ja vastasyntyneen

MYH

isoformin ilmentyminen, vaikuttamatta

Myod1

ilme.

(A) Kaavamainen hoidon menettelystä kudosviljelmälaitteita malli kuihtuminen. Esikäsitelty väliaine PC-3-solut sekoitettiin 1: 1 tuoreella väliaineella ja lisättiin päälle lisääntyvissä C2C12 myoblastit 48 tuntia, minkä jälkeen solut indusoitiin erilaistumaan tuoreessa DMEM, joka sisälsi 2% hevosen seerumia, 5 päivää. (B) Immunosytokemia värjäyksen myosiinin raskaan ketjun ilmentymisen C2C12 käsitellyissä viljelmissä vakioitua elatusainetta PC-3 tai DU145 eturauhasen syöpiä tai ehdoton media (UM) kuten (A). DAPI tahrat ytimiä sininen. (C) C2C12 viljelmät indusoitiin erilaistumaan kuten (A) ja fuusio-indeksi (# myonuclei /myotube) ja erilaistumista indeksi (# myonuclei /# yhteensä ytimet) laskettiin, ja esitetään suhteessa UM. Todelliset arvot näkyvät baareissa. * P 0,05, n = 7 (D) Western blot-analyysi C /EBPβ, Pax7, ja MyoD ilmaisun lisääntyvissä C2C12 soluissa päivänä 2 inkubaation jälkeen kunnostetun alustan. Aktiini on latauskontrollina. (E) Western blot-analyysi myogenic merkki ilmentymisen eriytetty C2C12 soluissa 7. päivänä Actin on latauskontrollina. (F) qRT-PCR-analyysi

Myod1

,

Myog

ja vastasyntyneen myosiinin raskasketjun (

Myh1

,

Myh2

,

Myh8

,

Myh13

) ilmentymistä, joka on esitetty suhteessa solujen käsiteltiin ehdoton väliaineen (UM) päivänä 7. * p 0,05, n = 4.

Inhibition of myogeneesin mukaan kasvain-väliaine vaihtelee kyky aiheuttaa C /EBPβ sisään C2C12 ja ensisijainen myoblastien

Koska kasvualusta odotettaisiin sisältävät seoksen kasvutekijöiden ja sytokiinien, jotka voivat vaikuttaa tuloa myogeneesin, me toisti kulttuuriin kakeksiamalliin käyttäen kasvualusta alkaen SKOV3- soluista että vain heikosti stimuloi C /EBPβ ilme. Vaikka esikäsittely SKOV3 keskipitkän sallittu vankka erilaistumiseen, esikäsittely PC-3 väliaine esti muodostumista lihasputkia, vähentää erilaistumista indeksi noin 50% ja fuusio-indeksi ~ 40% (kuvio 3A ja 3B). Edelleen, mukaisesti eroja C /EBPβ induktion SKOV3 ja PC-3 CM, myogeniinin ilmaisun ja MyHC ekspressio väheni altistuneiden solujen PC-3 väliaineessa verrattuna SKOV3 kontrolleihin (Kuva 3C).

(A) Immunosytokemia värjäys myosiinin raskaan ketjun ilmentymisen C2C12 myoblastien esikäsitelty vakioitua elatusainetta SKOV3 tai PC-3-solujen sekoitettu 1: 1 tuoreella väliaineella, 48 tuntia, ja indusoida erilaistumaan vielä 5 päivää. DAPI tahrat ytimiä sininen. (B) C2C12 viljelmät indusoitiin erilaistumaan kuten (A) ja erilaistumista ja fuusio indeksit laskettiin suhteessa SKOV3- käsiteltyjä soluja. Todelliset arvot näkyvät kunkin baareissa. * P 0,05, n = 5 (C) C /EBPβ, ja myogenic markkeri proteiiniekspressiota C2C12 myoblastien käsiteltiin kuten (A). Syklofiliinistä B (CyPB) esitetään latauskontrollina. (D) Immunosytokemia värjäys myosiinin raskasketjun (MYH) ilmentyminen ensisijainen myoblastien esikäsitelty vakioitua elatusainetta SKOV3 tai PC-3-solujen sekoitettu 1: 1 tuoreella väliaineella, 48 tuntia, ja indusoida erilaistumaan vielä 48 tuntia DMEM, joka sisälsi 10% hevosen seerumia. DAPI tahrat ytimiä sininen. (E) Ensisijainen myoblasti viljelmät indusoitiin erilaistumaan kuten (D) ja erilaistumista ja fuusio indeksit laskettiin suhteessa SKOV3- käsiteltyjä soluja. Todelliset arvot näkyvät kunkin baareissa. ** P 0,01, n = 4 (F) Suhteellinen Pax7 + solujen suhteessa koko ytimiä jäljellä C2C12 soluilla kunnostetussa alustassa ja eriytetty kuten (D) määritettynä immunosolukemiallisella. * P 0,05, n = 4 (G) C /EBPβ ja myogenic markkeriproteiinina ilmentymisen ensisijainen myoblastien käsiteltiin kuten (D). Syklofiliinistä B (CyPB) esitetään latauskontrollina.

suostumuksella C2C12 mallin esikäsittely ensisijainen myoblastien kanssa kunnostetun alustan PC-3 kasvain johtaa muodostumista vähemmän ja pienempi lihasputkia jälkeen 2 päivää erilaistumisen väliaineessa verrattuna käsiteltyjen solujen elatusaine SKOV3 kasvain (kuvio 3D). Eriyttäminen indeksi laski ~ 30% PC-3 esikäsittelyn verrattuna soluihin käsitelty SKOV3, kun fuusio-indeksi laski ~ 50% PC-3-käsiteltyjen Myoblastien (kuvio 3E). Lisäksi määrä Pax7 + jäljellä oleviin soluihin viljelmissä erilaistumisen jälkeen, määritettynä käyttäen immunosytokemialla, oli merkittävästi lisääntynyt viljelmissä esikäsitelty PC-3 väliaineessa noin 25% verrattuna SKOV3 kontrolleihin (kuvio 3F). Kuten ennustettu, C /EBPβ kohoamiseen PC-3 käsiteltyjä soluja verrattuna kontrolleihin, ja ilmaus myogeniinin ja myosiinin raskasketjun laskivat. Mielenkiintoista on, että toisin kuin meidän huomautuksensa C2C12 mallissa ensisijainen myoblastien käsitelty PC-3 CM osoitti myös lasku MyoD proteiinin ilmaisun, löytää yhdenmukainen aiempien havaintojen tässä järjestelmässä (kuvio 3G) [41, 42].

C /EBPβ ilmentyminen lisääntyy perusterveydenhuollossa myoblastien eristetty kakektisia hiiristä

Voit selvittää syöpä ympäristö voisi lisätä C /EBPβ ilmentymisen myoblastien

in vivo

, me eristää lihas satelliitti solujen terveistä ja kakektisia LLC kasvain eläimiä ja eriytetty ne

ex vivo

(kuvio 4A). Kun taas lyhytsanomapalvelukeskusta puhdistettu terveitä lihaksia eriytetty tehokkaasti, myoblastit eristettyjen kakektisia eläimistä tuotettu vähemmän ja pienempiä lihasputkia (kuvio 4B). Eriyttäminen indeksi väheni 38% kulttuureissa kakektisissa eläimistä ja fuusio-indeksi aleni 46% verrattuna terveisiin kontrolleihin (Kuva 4C). Koska nämä solut laajennettiin normaalissa väliaineessa 5 päivää ennen induktiota eriyttää, C /EBPβ tasot olivat vain lievästi lisääntynyt erilaistumisen jälkeen, jolloin normalisoitu MyoD ilmaisu (kuvio 4D) ja pieni lasku myogeniinin ilme. Ensisijainen myoblastit poistetaan kakektisia hiiristä osoitti myös lasku MyHC ilmaisun verrattuna laparotomiakontrolleihin, sopusoinnussa erilaistumista vika havaittu (kuvio 4D). Siksi samanlainen kuin meidän CM kokeita, satelliitti solujen peräisin LLC kasvain-oksastettu eläimet ovat kasvaneet C /EBPβ ilmaisun ja vika erilaistumiseen, joka jatkuu

ex vivo

.

(A) 5×10

5 Lewis-keuhkokarsinooma (LLC) soluja tai PBS: ää (Sham) injektoitiin kylkeen C57BL /6-hiiret ja annettiin ympätä ja 3 viikkoa aiheuttaa kuihtuminen. (B) Immunosytokemia varten myosiinin raskaan ketjun ilmentymisen ensisijaisen myoblastien eristetty näennäistä suihkutuksella ja LLC-ruiskutettiin hiiriin ja eriytetty 2 päivää. (C) eriyttäminen (DI) ja fuusio (FI) indeksit viljelmistä eristettiin ja eriytetty kuin (B). * P 0,05, n = 5 (D) Western-analyysi C /EBPβ ja myogenic markkeri ilmentymistä soluissa eristää terveistä tai kakektisia hiirten (A) ja sen jälkeen kulttuuri laajennus 5 päivää, eriytetty 2 päivää. Syklofiliinistä B (CyPB) on latauskontrollina.

syöpäkakeksialle estää lihasten palautumista in vivo

arvioimiseksi luurankolihasten uusiutumiskykyä kakektisilla eläimillä, me loukkaantunut vasen TA-lihakseen kardiotoksiinia (CTX) kerran kuihtuminen perustettiin ja arvioitu korjaus viikkoa myöhemmin (kuvio 5A). Seitsemän päivää loukkaantumisen jälkeen, TA lihas terveistä eläimistä korjataan tehokkaasti lukuisia -lihassäikeitä kanssa keskeisellä paikalla ytimien näkyvissä, kun taas loukkaantunut TA kakektisissa eläimillä oli laaja fibroosi ja tulehdussolujen infiltraatiota juurikaan näyttöä palautuminen (kuvio 5B). Todellakin, kun taas korjaus palauttaa kuidun poikkipinta-ala on vahingoittumaton tasolle terveillä verrokeilla hiirillä, kakektisilla hiirillä, elvyttäminen lihassyyrakenne poikkipinta-ala väheni edelleen 28% loukkaantumisen jälkeen, mitataan vain 59% CTX-loukkaantuneiden ei kakeksian lihas (kuvio 5C). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, TA paino loukkaantuneiden terveitä eläimiä ruumiinavauksessa oli palannut että valvonnan, kun taas paino loukkaantunut TA kakektisilla eläimillä oli vain 73% loukkaantumattomien kakektisissa ohjaus (kuvio 5D).

(A) Kaavamainen esitys vahingon mallin. Kakeksia aiheutettiin toimivasti siirtyviä LLC syöpäsolujen ihon alle ja mahdollisuuden kasvaa 3 viikkoa. Kun kuihtuminen perustettiin, eläimet loukkaantuivat injektoimalla kardiotoksiinia (CTX) TA lihakseen. Sham vamma saatiin aikaan käyttämällä PBS. Vahinko annettiin korjata viikon ajan ennen analyysiä. (B) H 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 4 (D) TA massa PBS ja CTX-loukkaantunut huijausta ja LLC hiirten (B). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, n = 5 (E) Prosenttiosuus Pax7 + solujen (suhteessa koko DAPI + ytimiä) PBS: ssä ja CTX-loukkaantunut TA näennäistä ja LLC eläimiä. ** P 0,01, *** p 0,001, n = 5 (F) Suhteellinen C /EBPβ + /Pax7 + soluja (suhteessa uninjured sham eläimet) PBS: ssä ja CTX-loukkaantunut TA näennäistä ja LLC eläimiä. * P 0,05, *** p 0,001, n = 3.

vieressä teki lukumäärä Pax7 + solujen TA poikkileikkaus (kuvio 5E). Vaikka noin 1,6% ydinten värjättiin positiivisesti Pax7 että loukkaantuneet TA lihakset huijausta eläimiä, tämä määrä oli 3,5% uninjured LLC omaavilla eläimillä. Sen jälkeen CTX vamma, Pax7 + solut lisääntyi sekä huijausta ja LLC eläimiä, joiden 2-kertainen lisäys huijausta kontrollieläimillä verrattuna loukkaantumattomien jalkaan ja 4,5-kertainen lisäys yli loukkaantumattomien jalan kasvaimia omaavilla eläimillä lähes 20%: ytimeksi. Edelleen, vaikka vahinko ei vaikuttanut prosenttiosuus Pax7 + /C /EBPβ + satelliitti solujen terveitä eläimiä, että kasvain kohortin prosenttiosuus kaksinkertainen positiivisten solujen lisääntyi sekä uninjured ja loukkaantunut lihas (kuvio 5F), yhdenmukainen

ex vivo

analyysi satelliitti solujen (kuvio 4D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että syövän aiheuttama kakeksia lisää Pax7 + osaston koko ja nämä solut ovat lisääntyneen ekspression C /EBPβ mutta alensi regeneratiivisen ominaisuuksia.

Loss of C /EBPβ ilmentymisen suojaa myoblastien kakeksiasta viljelmässä

vahvista roolin C /EBPβ kehittämisessä syövän kuihtuminen, me eristetty

CEBPB: lle

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) ja

CEBPB: lle

fl /fl

Pax7

Creer /+ (CKO) satelliitti solujen, ja esikäsitellyt ne CM PC-3 kasvain tai SKOV3 kasvain ( ohjaus) ennen induktion erottamaan matalan seerumin olosuhteissa. 2 päivän jälkeen erilaistumisen väliaineessa, viljelmiä immunovärjättiin MyHC ilmentymistä (kuvio 6A). Vaikka esikäsittely PC-3 CM esti erilaistumista WT Myoblastien menetys C /EBPβ ilmaisu pelastettiin erilaistumista näissä olosuhteissa (kuvio 6A ja 6B), mikä viittaa siihen, että menetys C /EBPβ ilmaisun suojaa myoblastit päässä kakektisia miljöö. Huolimatta palauttaminen eriyttäminen indeksi CKO kulttuureissa, menetys C /EBPβ ilmaisua ei palauta myotube koko (fuusio-indeksi), joka pienensi inkuboitu PC-3 väliaineessa (kuvio 6C). Vaikka hoito WT solujen PC-3 väliaine lisäsi prosenttiosuutta Pax7 + solujen viljelmissä, sopusoinnussa vähentää erilaistumista indeksin kulttuureissa puuttuu C /EBPβ oli huomattavasti vähemmän varauksesta solujen erilaistumisen jälkeen sekä valvontaa ja kakektisia olosuhteissa (kuvio 6D ). Vaikka mitään eroja myogenic merkki ilmaisun havaittiin verrattaessa WT ja CKO solujen SKOV3 ohjaus väliaineessa, western-analyysi paljasti, että MyoD ja myogeniinin ilmaisun vähenivät inWT soluissa esikäsittely PC-3 väliaineessa (kuvio 6E). Kuitenkin CKO soluissa, MyoD ekspressio lisääntyi inkuboinnin jälkeen PC-3 väliaineessa verrattuna WT ja myogeniinin ilmaisun palautettiin verrokkitasojen (kuvio 6E). Siten menetys C /EBPβ lihaksen satelliitin solut voidaan pelastaa myogeneesin läsnä kunnostettua alustaa, palauttamatta myotube koko.

(A) Epäsuora immunofluoresenssi myosiinin raskasketjun (MyHC) ilmentyminen ensisijainen myoblastien eristetty

CEBPB: lle

fl /fl

Pax7

+ /+ (WT) ja

CEBPB: lle

fl /fl

Pax7

Creer /+ (CKO), hiiret ja viljeltiin SKOV3 tai PC-3 median 2 päivää, ja indusoida erilaistumaan vielä 2 päivää. (B) eriyttäminen indeksi (# myonuclei /# ytimiä) ensisijaisen myoblastien kulttuurien (A). * P 0,05, *** p 0,001, n = 6. (C) Fusion-indeksi (# myonuclei /myotube) soluille eriyttää kuten (A). * P 0,05, ** p 0,01, n = 6 (D) Suhteellinen Pax7 + solujen suhteessa koko ytimien kulttuureissa (A) seuraavat erilaistuminen, nimetty varaukseen soluissa. * P 0,05, ** p 0,01, n = 6 (E) Western blot-analyysi C /EBPβ ja myogenic merkki ilmaisun ensisijainen myoblastien käsiteltiin kuten (A). Syklofiliinistä B (CyPB) on latauskontrollina.

Keskustelu

C /EBPβ on transkriptiotekijä osallisena lukuisissa biologisissa prosesseissa, mukaan lukien solujen erilaistuminen, solusyklin säätelyssä, immuunijärjestelmän toimintaan ja solujen eloonjäämistä [33, 54-59]. Sellaisenaan, C /EBPβ ilmentyminen vaikuttaa monia eri reittejä, mukaan lukien sytokiinisignaloinnin, kasvutekijät, proteasomin ja cAMP signalointia [42, 60, 61]. Tässä osoitamme, että C /EBPβ ilmentymistä voidaan stimuloida altistuminen kunnostettua alustaa ihmisen syövistä, vaihtelevalla tehokkuutta. Vaikka tämä väliaine sisältää todennäköisesti sytokiinien välittäjiä, tarkka tekijöitä elatusaine ajo C /EBPβ ilmaisu eivät ole tiedossa, ja se voi olla eri kunkin syöpä. Kuitenkin, stimulaatio C /EBPβ ilmentymisen myoblastit korreloi inhibition myogeneesin, että voitaisiin kääntää menetys C /EBPβ.

esikäsittely lisääntyvien myoblastien kanssa kunnostettua alustaa oli riittävä estämään myogeneesin, vaikka vaikka erilaistuminen toteutettiin väliaineessa vapaa pro kakeksian signaaleja. Nämä kokeet erottavat siten anti-myogenic vaikutuksia vakioitua väliainetta myotube atrofia vaikutuksia, joita voi esiintyä. Mielenkiintoista, myogenic vika toisteta ensisijainen myoblastien eristetty kakektisia hiiristä, vaikka laajennuksen jälkeen kasvualustaan ​​ei ole lainkaan hiiren seerumia tai kunnostettu alusta. On ajateltavissa, että altistuminen kakektisia miljöön ajaa pysyviä epigeneettisellä muuttaminen loci mukana myogeneesin jotka heikentävät asianmukainen proteiinien ilmentymiseen tarvitaan erilaistumiseen. Altistuminen TNFa, sytokiini liittyy usein kakeksia, on osoitettu indusoivan metylaation CpG-saarekkeiden sisällä MyoD lokuksessa, ja histoni metyyliarginiini transferaasit PRMT5 ja WDR77 /MEP50 voi aiheuttaa transkription repression C /EBPβ kohdegeenien indusoimalla symmetrinen dimetylaatio histonien H4 arginiini 3 [62, 63]. Koska ensisijainen myoblastien puuttuu C /EBPβ ilmaisu voivat erilaistua normaalisti altistuminen kakeksian aiheuttavia miljöö, C /EBPβ todennäköisesti tarvitaan kuviointi näiden ehdotettujen epigeneettiset muutokset. Vaikka eriyttäminen hoidon jälkeen PC-3 väliaine palautuu menetys C /EBPβ, The myotube koko mitattuna fuusio-indeksi, ei pelastettiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että esikäsittely, jossa kakektisia väliaineeseen ennen erilaistumista vähentää fusogeenisen kapasiteettia solujen erilaistumisen jälkeen, jopa normaalissa väliaineessa. Sinänsä lisäksi suoraan ajo surkastuminen kypsän kuituja ja vähentää niiden erilaistumista, kuihtuminen voivat myös heikentää fuusio onnistuneesti erilaistuneita soluja. Vaikka tuumoriresektion voi parantaa kuihtuminen, ei tiedetä, regeneratiivinen vastauksia toipua kokonaan tai onko vika ei poistu, kun kakektisia ympäristö ratkaisee, ja olisi tutkittava tarkemmin.

erilaistuminen vika hoidon jälkeen PC-3 väliaine voi olla johtuvan epäonnistuminen aiheuttaa myogeniinin täysin, mikä voidaan kääntää menetys C /EBPβ. Vuonna ensisijainen Myoblastien, MyoD proteiinin ilmentyminen pienensi myös altistuminen kakektisia miljöö, mutta ei havaittu C2C12 soluissa. Todellakin, C /EBPβ ilmaisu on pienempi C2C12 verrattuna ensisijainen myoblastien, ja siten erot C /EBPβ tasoa altistumisen jälkeen kasvualusta voi sinällään selittää ero herkkyyttä MyoD ilmentymisen kahdessa järjestelmässä [41]. C /EBPβ voi estää MyoD kykyä transaktivoi myogeniinin promoottorin ja ilmentymistä myogeniinin johdonmukaisesti vaimentua kaikissa malleissa testattu, mikä viittaa siihen, että häiriötä MyoD toiminta mahdollisena mekanismi menetys myogeniinin ilmentymisen Myoblastien esikäsitelty kasvualusta [ ,,,0],41].

MyoD proteiinin ilmentymistä säätelee negatiivisesti C /EBPβ, ilman samanaikaista muutoksia

Myod1

mRNA [41]. Edelleen, MyoD proteiinia ei voitu pelastettiin inhibition proteasomin [42]. Mielenkiintoista, menetys C /EBPβ ilmaus ei lisää MyoD ilmentymistä kontrolloiduissa olosuhteissa (SKOV3) verrattuna WT soluihin vaikka näissä kokeissa, erilaistuminen hyötysuhde viljelmiä on noin 80%, joten se haastavampaa nähdä nousua myogeenisen merkki ilmaisun . Kuitenkin puuttuessa C /EBPβ hoidon jälkeen PC-3 väliaine, emme tarkkailla kasvua MyoD ilmentymistä on havaittu WT kulttuureissa, mikä viittaa siihen, että menetys C /EBPβ estävä mekanismi on leikkiä tässä järjestelmässä.

Vaikka menetys C /EBPβ ilmaisu voi parantaa eriyttäminen jälkeen väliaine esikäsittelyyn, on epäselvää, onko estyminen myogeneesin syövän kuihtuminen myötävaikuttaa patogeneesiin oireyhtymä. Koska kakeksian aiheuttaa myös lihas- [50], stimulaatio regeneratiivisen vasteen voidaan ennustaa olevan suojaavia, ja itse asiassa, monet raportit ovat osoittaneet, että vahvistamalla palautuminen parantaa lihasten surkastumista nähdään kuihtuminen [49, 50, 64]. Valitettavasti tuloksemme osoittavat, että tämä vastaus estyy C /EBPβ ilme, mahdollisesti pahentaa lihasten kuihtumista. Siitä huolimatta, joiden tarkoituksena on edistää myogeneesin eivät parantaa lihasten histologia ja elinikä eläinmalleissa viittaa siihen, että edistäminen uudistaminen on tärkeä terapeuttinen avenue kakeksian hoitoa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

C2C12 myoblasteja ja Lewis-keuhkosyöpä (ATCC) viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco). PC-3 ja DU145 eturauhasen adenokarsinooma-soluja (ATCC) viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia ja 2 mM L-glutamiinia (Sigma). SKOV3 munasarja adenokarsinooma ja HCT116 kolorektaalikarsinooman viljeltiin McCoyn media, MCF7 rintarauhasen adenokarsinooman viljeltiin DMEM ja A549 keuhko epithelia karsinooma viljeltiin F-12K media, kaikki täydennetty 10% naudan sikiön seerumia.

Luuston lihaksen ensisijainen myoblastien soluja eristettiin, kuten on kuvattu [65]. Alempi takaraajan lihasten C57BL /6-hiiriä leikeltiin ja hajotettiin dispaasilla ja kollagenaasi (Roche), 37 ° C: ssa 1-2 tuntia, kunnes lihakset hajotettiin.