Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular alatyyppejä vakavien munasarjasyövän on hiljattain kuvattu. Käyttämällä tietoja riippumattomien aineistot mukaan lukien yli 900 primäärikasvain näytteitä, osoitamme, että vapauttaminen

Anna-7

reitin on nimenomaan liittyy C5 molekyyli- alatyypin vakavasta munasarjasyöpä. DNA kopiomäärä ja geenin ilmentyminen

HMGA2

, alleelit

Anna-7

,

LIN28

,

LIN28B

,

MYC

MYCN

,

DICER1

, ja

RNASEN

mitattiin mikrosirujen ja määrällisten käänteistranskriptaasia PCR. Immunohistokemia suoritettiin 127 näytteitä kudossiruina ja anti-HMGA2 vasta-aineita. Fluoresenssi in situ hybridisaatio bakteerien keinotekoiset kromosomit hybridisoitiin 239 munasarjakasvaimia käytettiin mittaamaan translokaatio on

LIN28B

lokukseen. Lyhyt häiritsevä RNA pudotus munasarjojen solulinjoissa käytettiin testaamaan toimivuutta yhdistysten havaittu. Neljä molekyyli- alatyyppejä (C1, C2, C4, C5) korkealaatuisesta serous munasarjojen syöpiä vahvasti edustettuna kaikissa aineisto ja osoitti samanlaista mallia potilaan selviytymisen. Löysimme erittäin spesifinen aktivaatio reitti, johon liittyy

MYCN

,

LIN28B

,

Anna-7

ja

HMGA2

että C5 molekyyli- alatyypin määritelty

MYCN

vahvistusta ja yli-ilmentyminen, yli-ilmentyminen

MYCN

tavoitteet, mukaan luettuina

Anna-7

repressori

LIN28B

menetys

Let -7

ilmaisun ja

HMGA2

vahvistusta ja yli-ilmentyminen.

DICER1

, tunnettu

Let 7

kohde, ja

RNASEN

oli yli-ilmentynyt C5 kasvaimia. Emme nähneet todisteita translokaation klo

LIN28B

lokuksessa C5 kasvaimia. Raportoitiin vuorovaikutus

LIN28B

ja

Anna-7

oli toisteta siRNA Knockdown munasarjasyövän solulinjoissa. Tuloksemme associate vapautuminen

MYCN

ja loppupään tavoitteita, mukaan lukien

Anna-7

ja onkofetaalinen geenejä, joissa vakavien munasarjasyöpä. Määrittelemme ensimmäistä kertaa, miten elementtejä onkogeenisessä koulutusjakson, johon sisältyy useita geenejä, jotka edistävät kantasolujen uusimista, on nimenomaan muuttunut molekyyli- alatyypin vakavasta munasarjasyöpä. Määrittelemällä kuljettajien molekyylitasolla alatyypin vakavasta munasarjojen syöpien tarjoamme uusi strategia kohdennettuja terapeuttisesta.

Citation: Helland Å, Anglesio MS, George J, Cowin PA, Johnstone CN, House CM, et al . (2011) Puretaan

MYCN

,

LIN28B

ja

LET7

Molecular alalaji Aggressiivinen High-Grade seroosit munasarjasyöpiä. PLoS ONE 6 (4): e18064. doi: 10,1371 /journal.pone.0018064

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 18 marraskuu 2010; Hyväksytty: 18 helmikuu 2011; Julkaistu: 13 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Helland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AOCS oli tukee Yhdysvaltain armeijan Medical Research ja Materiaalilaitoksen Esikunta alle DAMD17-01-1-0729, The Cancer neuvosto Tasmania, The Cancer Foundation Länsi-Australian ja National Health ja Medical Research Council of Australia. Tämä tutkimus tukivat Victorian Life Sciences Computation Initiative (VLSCI) avustus sen Peak tietokonekeskuksessa yliopistossa Melbourne, aloitteesta Victorian hallituksen ja myös avustusta Radium Hospital Foundation ja Fredriksen säätiö Munasarjojen Cancer Research . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hallinnointi munasarjasyövän on siirtymävaiheessa. On yhä selvempää, että munasarjasyöpä on monimutkainen sarja erillisiä kasvaintyypeille [1], joka edellyttää hoitoja että tavoite molekyyli ominaisuuksia yhteinen taudin alalajeja. Korkeatasoinen vakavien munasarjasyöpiä (HG-SOC) muodostavat suurimman osan sairauteen liittyviä kuolemia. Vaikka vastaus hinnat ovat korkeita platina-taksaania kemoterapiaa liitännäishoitona, ei ole juurikaan parannusta elossaololuku viime vuosikymmenen aikana tai enemmän, vaikka laaja kliinisen tutkimuksen [2]. PARP-inhibiittorit, jotka hyödyntävät puutteet homologisen rekombinaation korjaus [3], [4] ovat osoittaneet huomattavaa lupaus, erityisesti naisilla, joilla on ituradan

BRCA1

tai

BRCA2

mutaatioita. HG-SOC parhaillaan käsitellään yhtenä kokonaisuutena. Syvempi ymmärrys molekyylitason kuljettajien tämä tauti on välttämätöntä tehokkaampaa hoitomuotoja kehitetään [2]. Äskettäin geeniekspressioprofilointi paljasti unappreciated monimuotoisuutta HG-SOC hahmotellessaan neljä erillistä molekyylien alatyyppiä. Yksi alaryhmä (C1) oli määritelty reaktiivinen strooman allekirjoitusta, korreloi laaja desmoplasia tällaisissa näytteissä. Kasvaimet kanssa C2 allekirjoitus oli ominaista sisäinen kasvaimia immuunisolujen soluttautumista, kun taas C4 kasvaimia oli suhteellisen pieni ilmaus strooman geenien ja korkea kiertävä CA125. C5-alatyyppi heijasti mesenkyymisolun geeniekspression allekirjoitus, ja nämä kasvaimet olivat harvassa immuunisolujen infiltraatio ja olivat yhteydessä alhainen verenkierrossa CA125 [5]. Geneettinen tapahtumia, jotka aiheuttavat kukin molekyyli alatyyppi HG-SOC ja valvoa niiden kliininen käyttäytyminen ei toistaiseksi tunneta.

Anna-7

s ovat perheen kaksitoista sekvenssin liittyvien mikro (mi ) RNA: t jaettu kahdeksaan genomista klustereita, jotka usein alassäädetty syövässä [6], [7], [8].

Anna-7

on tullut osaksi monimutkaista ja tärkeä sääntelyn verkosto syövässä, jonka suhteellinen ilmentyminen johtaa uudelleen ilmentymisen erilaisia ​​onkofetaalinen proteiinien [6], [9]. Kuten muidenkin miRNA,

Anna-7

molekyylit tunnistavat ja sitoutuvat niiden kohdesekvenssien, johtaa sekä translaation tukahduttamisen ja mRNA rappeutuminen [10], [11], [12]. Solutasolla,

Anna-7

on laajalle levinnyt vaikutuksia erilaistumiseen ja itseuudistumisen [13].

HMGA2

geeni on laajalti tunnettu kohde

Anna-7

perheen miRNA [6], [9], [11], [14] ja koodaa DNA: ta sitovan ja chromatin muuttamalla proteiini, joka säätelee sekä erilaistumista ja kantasolujen uusimista [15]. Korkean tason ilmentymistä HMGA2 on myös yhdistetty huonoon lopputulokseen eri kiinteiden syöpien, mukaan lukien munasarjasyöpä [16]. Tasapaino

HMGA2

ja

Anna-7

ilmentyminen on sidottu ylläpitoon erilaistumattomaan valtion syöpäsoluissa [9], [14]. Negatiivinen palaute silmukka, johon korkean tason ilmentymisen

Anna-7

repressors,

LIN28

ja

LIN28B

, on liittynyt useita pahanlaatuisia kasvaimia [14], [17 ], [18]. Onkogeenit c-Myc ja N-Myc ovat positiivisia säätelijöitä

LIN28

ja

LIN28B

vastaavasti [19], [20]. Sen vuoksi sääntelyn purkamista eri puolia reitti, johon liittyy MYC proteiineja,

Anna-7

repressors

LIN28

ja

LIN28B

, erilaiset

Anna-7

alleelien ja onkofetaalinen tavoitteita kuten

HMGA2

on raportoitu erilaisia ​​syöpäsairauksia.

Olemme hyödyntäneet genomista aineistoja yli 900 HG-SOC tulkita polkuja, jotka ohjaavat tätä tautia. Osoitamme, että C5 alatyypin HG-SOC on määritelty

Let7

ja

MYCN

de-sääntelyn, esittelee uuden mahdollisuuden kohdentaa terapeuttisia väliintulon munasarjasyöpä.

menetelmät

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksyttiin Tutkijavoimavarojen eettiset komiteat Peter MacCallum Cancer Center, Queensland Institute of Medical Research, University of Melbourne ja kaikkien osallistuvien sairaaloiden. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta Tutkimukseen osallistui.

Perimän aineistot

Microarray geenien ilmentyminen tietoja saatiin neljä ikäluokat, kutsutaan AOCS, TCGA, NCI ja Norjassa. AOCS aineisto (n = 285) synnytettiin käyttäen Affymetrix U133 2.0 taulukot ja on saatavana Gene Expression Omnibus (GEO). Cancer Genome Atlas aineisto (TCGA, n = 476) synnytettiin käyttäen Affymetrix HTHGU133a paneelit, ja saatu TCGA data portaalin. NCI aineisto (n = 185) synnytettiin Affymetrix U133a paneelit ja saadut Michael Birrer, Massachusetts General Hospital. Norjan aineisto [21], [22] (n = 64) tuli muokatuilla cDNA taulukot ja saatu laboratoriossa yksi meistä (A.H.). Kliiniset tiedot kustakin aineisto on koottu taulukkoon S1.

Potilaat ja näytteet

Näytteet immunohistokemiaan ja RNA validointitutkimusten saatiin Australian munasarjasyöpä Study (AOCS), väestöpohjaisen kohortti naisten epiteelin munasarjasyövän palvelukseen välillä 2002-2006 [5]. Kaikki potilaat allekirjoitti institutionaalisesti-hyväksytty potilastietojen ja suostumus asiakirjan. Tiedot prosessien potilaan karttuminen, kokoelma kliinistä seurantaa tiedot, patologinen tarkastelu, eristäminen nukleiinihappojen, ja valmistelu kudossiruina on kuvattu aiemmin [5].

bioinformatiikka- analysoi

Yksityiskohtainen kuvaus useista bioinformatiikan analyysit, joita tässä raportissa annetaan täydentävä Methods S1.

Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (Q-RT-PCR) B

Measurement ilmentymisen koodaus geenien suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], käyttämällä joko TaqMan geeniekspression määrityksiä (Applied Biosystems) tai SYBR vihreä (Applied Biosystems). PCR-monistus suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle. Endogeeninen valvonta

HPRT1

ja

ACTB

olivat mukana kaikki määritykset ja suhteellinen kvantifiointiin mRNA ilmaisun laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [24]. Ilmaisu kypsä miRNA varten

Anna-7

alleelien määritettiin käyttäen TaqMan miRNA Assay (Applied Biosystems) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Muita yksityiskohtia, kuten pohja- ja työkierrosajat annetaan Täydentävä Methods S1.

immunohistokemia ja fluoresenssi in situ hybridisaatio

HMGA2 proteiinin ilmentyminen mitattiin HG-SOC näytteitä kudoksen microarray (n = 127) kuvatulla täydentävä Methods S1. Pisteytys oli seuraava: 0 – ei /heikko tai kohtalainen ydinaseiden ilmaisua, 1 – alle 10% kasvainsoluja vahvojen tumavärjäystä, 2 – 10-50% kasvainsoluja vahvojen tumavärjäystä, 3 – yli 50% kasvainsolujen vahva tumavärjäystä. Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC), koettimina metafaasissa ytimiä oli kuten aikaisemmin on kuvattu [17].

Funktionaaliset määritykset solulinjoissa

pudotus (KD) ja kohde-mRNA: iden saavutettiin käyttämällä Dharmacon on-Target Plus Smartpools (Dharmacon, Thermo-Scientific) kaikkien geenien paitsi

MYCN

, joka oli kohdistettu käyttäen Qiagen siRNA Hs_MYCN_3 (Qiagen). Kontrollit mukana Dharmafect1 yksin, Dharmacon ei-vaientaminen ohjaus allas,

GAPDH

smartpool, ja All-Stars negatiivinen kontrolli (Qiagen) ja

MYCN

määrityksiä. Tiedot soluviljelmän ja KD transfektio olosuhteista tarjotaan Täydentävä Methods S1.

Tulokset

Molecular alatyyppejä HG-SOC

Olemme kehittäneet luokittelija perustuu molekyylien alatyyppejä (C1, C2, C4, C5) tunnistettu edellisessä tutkimuksessa 215 kasvainten Australian munasarjasyöpä Study (AOCS) [5]. Käyttäen luokittelija ja valvottu oppiminen menettely, näytteet jaettiin johonkin neljästä molekyylitason alatyyppien aineistoja The Cancer Genome Atlas (TCGA) (n = 476), Norja (n = 64) [21], [22] ja National Cancer Institute (n = 185) [25] (kuvio 1A, taulukko S1). Johdonmukainen malleja geenin ilmentymisen ja kliinisten tulosten havaittiin poikki aineistot. C5 kasvaimia jatkuvasti yhteydessä huonoon tulokseen verrattuna C2 alatyypin (kuvio 1 B-D). Toteamme, että siellä oli jonkin verran vaihtelua suhteellisen taajuuden molekyylitason alatyyppien eri aineistojen ja tämä voi liittyä eroihin mukaanottokriteerinä käytetty jokaisessa tutkimuksessa.

(A) Heatmap geeniekspression data otettu alkaen AOCS, TCGA, NCI ja Norja aineistoja osoittaa, että kasvaimia on luokiteltu 4 molekyyli alatyyppeihin. Geenit ovat ryhmittyneet Pearson korrelaatio ja näytteet tilata molekyylien alatyyppi. Vaikka alkuperäinen K-means klusterointi päässä Tothill et al. on esitetty AOCS kohortin valvottu oppiminen menettelyä käytettiin luokitteluun kasvaimia muissa aineistot (katso Täydentävät Methods S1). (B) Kaplan-Meier eloonjäämiskäyristä näytteistä on piirretty. Kokonaiselossaoloaika käytetään päätepisteenä kaikissa neljässä aineistoja. Coxin suhteellisen riskin malliin käytetään laskemaan tilastollista merkitystä eron eloonjäämisen välillä kaikki neljä ryhmää. Log-rank testi p-arvo ilmoitetaan. (C) näytteet kaikista aineistoja yhdistettiin arvioida eloonjäämisen ominaisuudet. Alatyyppejä verrattiin C5 ja log rank testi p-arvo annetaan taulukossa. (D) Kaplan-Meier käyrät on piirretty kuvaamaan selviytymisen toiminto näytteiden neljän eri alatyyppiä yhdistämisen jälkeen näytteet.

HMGA2 yli-ilmentyminen ja Anna-7 alas sääntelyn

tunnistamiseksi alatyypin erityisiä reittejä olemme keskittyneet C5 kasvaimia, joille on ominaista alennetaan kierrättämällä CA125 immunoreaktiivisuus, rajoitettu immuunisolujen infiltraatio, erilaistumattomaan fenotyyppi [5], ja yleensä ottaen heikkoa potilaiden eloonjäämisen (kuvio 1 B).

HMGA2

on vahvimmin yli ilmaistu C5-geenistä (AOCS p 0,0001; TCGA p 0,0001; NCI p 0,0001, kaksi puolinen Mann-Whitneyn testi, kuvio 2A, taulukko S2). Muut merkkiaineet erilaistumattomaan fenotyyppi, jotka ovat erittäin C5-erityisiä sisältävät

DACH1

,

PAX2

,

LAMA1

,

MYCN

,

SOX11

, sekä korkean liikkuvuuden ryhmän jäsenet

TOX

ja

TCF7L1

.

Anna-7

kohdegeenien, kuten

HMGA2

ovat nimenomaan vapautettiin C5 molekyyli alatyypin korkealaatuisesta vakavasta syöpiä. (A) mRNA: n ekspressiota

HMGA2

on huomattavasti korkeampi C5 molekyyli-alatyypin. (B) immunohistokemiallinen analyysi HMGA2 ilmentymisen munasarjasyövän näytteissä osoittaa johdonmukaisesti yli-ilmentyminen C5 kasvaimia. Esimerkki vahva (3+) värjäys (ylhäällä) ja mitään värjäytymistä (alhaalla) paneeli. (C) Ydin joukko

Anna-7

säänneltyä kohdegeenien (onkofetaalinen geenit) tunnistetaan Boyerinas et al [6] ovat yliedustettuina C5 geenissä allekirjoitus. (D)

Anna-7

kohdegeenien saadut TargetScan5.0 rikastuvat C5 kasvaimia. Merkitys päällekkäistä C5-erityisiä ja

Anna-7

kohdegeenin sarjaa määritettiin yksipuolinen Fisherin testiä. Bar juoni kuvaa yhdistyksen näytetään. (* Osoittaa p 0,0001).

immunohistokemiallinen analyysi osoitti myös, että C5 kasvaimet jatkuvasti ilmentävät korkeita HMGA2 proteiinia (~95% at 3+; p = 0,02, kaksipuolinen Fisherin testiä Kuvio 2B ja taulukko S3). Proteiinitasolla voimakkaasti ilmentäviä kasvaimia olivat läsnä myös muihin alatyyppeihin, joskin harvemmin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tietty mekanismi säännellä

HMGA2

mRNA ilmaisu tai vakautta toimii vallitsevasti C5 kasvaimia, ja että transkription jälkeisiin mekanismit voivat vaikuttaa HMGA2 proteiinin ilmentymistä muihin alatyyppeihin.

HMGA2

vahvistus oli yleisempää C5 kasvaimet (p = 0,005, Mann-Whitney testi; Taulukko S4). Kuitenkin tämä ei muodostavat suurimman näytteiden osoittaa C5-erityinen yli-ilmentyminen, kuten

HMGA2

on huomattavasti ilmaistu C5 näytteitä ilman monistamiseen

HMGA2

lokuksen (kuva S1). Sen vuoksi, kun taas

HMGA2

vahvistus on yleisempää C5 kasvaimia, vahvistus-riippumaton mekanismi (t) täytyy ottaa huomioon C5-specific over-mRNA: n ja proteiinin.

HMGA2

on pisimmälle ennustettu tavoite

Anna-7

perheen mikroRNA (miRNA) genomissa [6], [9], [11], [14], mikä viittaa siihen, alentunutta

Let -7

ilmaisu vaihtoehtona selitys rakenteessa

HMGA2

ilmaisun C5 kasvaimia. Tämän mukaisesti, havaitsimme C5-erityinen yli-ilmentyminen muiden geenin normaalisti tukahdutettu

Anna-7

, kuten ydinjoukko kaksitoista onkofetaalinen geenien määritelty Boyerinas

et al.

[6 ] (kuvio 2C; p = 4,8 × 10

-8, kaksi puolinen Fisherin tarkka testi). Itsenäisesti johdettu geenistä joukko 100 korkeimmin rankattu

Anna-7

kohdegeenien ennustaa käyttämällä miRNA tavoite ennustemallin [26] oli myös merkitsevästi rikastuneet C5 alatyyppi (p 0,0001, yksipuolinen Fisherin testi) (kuvio 2D).

sitten mitata suoraan ilmaus

Anna-7

perheen AOCS näytteitä TaqMan määritystä ja verrattiin tuloksia miRNA microarray tietoja TCGA aineisto. Huomasimme, että

Anna-7b

,

-7d

, ja

-7i

olivat merkittävästi alle ilmaistu C5 kasvaimissa verrattuna muihin alatyyppeihin sekä AOCS ja TCGA kohortteja ( Pöytä 1).

Anna-7c

,

-7e

ja

-7f

myös merkittävästi alle ilmaistu C5 joko TCGA tai AOCS aineistoja. Ero kahden ikäluokat näiden alleelien voivat koskea herkkyyden alustan mukaan miRNA mikrosiruja varten TCGA ja TaqMan määrityksiä varten AOCS näytteiden.

vapautuminen Let-7

Tutkimme mahdollisia syitä matalan tason ilmentymistä

Anna-7

alleeleja. Genominen poistot, analysoitiin SNP-pohjainen taulukot on TCGA aineisto osoitti, että tappio joihin geenivirhe 22q13.31, joka käsittää

Anna-7b

ja

Anna-7A3

, oli yleisempää C5 kasvaimet (p = 0,018) (taulukko S5). Vaikka menetys 22q13.31 voi selittää pienentää ilmentymisen

Anna-7b

joissakin kasvaimissa, se ei selittämään havaitut vaikutukset muihin

Anna-7

alleelit, jotka jakautuvat 8 loci ja ovat todennäköisemmin de-säädellään

trans

. Viat miRNA koneet, kuten kevyemmästä Dicer (

DICER1

) ja Drosha (

RNASEN

), on yhteydessä heikkoon lopputulokseen HG-SOC [27], mutta korkeampi lauseke on

DICER1

havaittiin C5-alatyypin (kuva S2).

DICER1

tasojen on osoitettu olevan säätelee negatiivisesti

Anna-7b

[28], [29], mahdollisesti selittää C5-spesifinen yli-ilmentyminen

DICER1

.

Lin28 ja Lin28B säätelemään negatiivisesti

Anna-7

tasoa sitoutumalla terminaalin silmukat prekursoreiden

Anna-7

perheen miRNA, siten estäen jalostamiseksi kypsä miRNA [17], [30], [31], [32]. Huomasimme, että ilmaus

LIN28B

, mutta ei

LIN28

, oli hyvin rikastettu C5 kasvaimissa (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, kaksi puolinen Mann Whitneyn testi, kuvio 3A ja Kuva S2). Translokaatio välillä

HACE1

ja

LIN28B

on ehdotettu johtavan de-sääntelyn

LIN28B

ja aiheuttaa alensi

Anna-7

tasoa [17 ]. FISH on TMA 239 munasarjakasvainten, joista 73 tunnettujen molekyylien alatyypin löydetty todisteita uudelleenjärjestely välillä

HACE1

ja

LIN28B

vain yhden ytimen peräisin HG-SOC kasvain tuntematon molekyyli alatyypin (taulukko S6), mikä viittaa siihen, tämä mekanismi

LIN28B

ylössäätöä on harvinaista munasarjasyöpäpotilailla.

(A) Boxplots kuvaavat ero ilmaus

LIN28B

ja

MYCN

eri molekyyli- alatyyppiä vakavien munasarjojen syöpien AOCS aineisto. (B) DNA kopiomäärä tasoja ja ekspressiotasot

MYCN

ovat korreloi. C5 näytteet (koodattu punaisella) ovat pääasiassa jaettu oikeassa yläkulmassa kuvaajan. Näytteitä segmentoitu kopiomäärä log-suhde on suurempi kuin 0,3 katsottiin olevan voitto

MYCN

ja näytteet segmentoitu log-suhde pienempi kuin -0.3 katsottiin olevan tappiota. Fisherin testiä käytettiin laskea tilastollinen merkitys yhdistyksen. (C) välistä assosiaatiota

MYCN

tavoitteet ja C5-geenin sarjaa.

MYCN

tavoitteita ekstrapoloitiin risteyksessä kahden geenin luetteloita, (1) geenit sitovat N-myc hiiren alkion solulinjoissa ja (2) geenien 2-kertainen ilmaisun transfektion jälkeen N-myc hiiren alkion soluista (katso Täydentävät Methods S1). Käyttämällä dataa AOCS tai TCGA geeniekspression asettaa geenejä luokiteltiin korkea tai matala C5 kasvaimissa verrattuna kaikki muut kasvaimet (C1-C4) arvolla p 0.001 kaksipuolinen t-testiä. Merkitys päällekkäistä C5 geenin sarjaa ja

MYCN

geenin sarjaa määritettiin yksipuolisen Fisherin testiä. Bar juoni kuvaa yhdistyksen näkyy.

vapautuminen

MYCN

Äskettäin sekä c-Myc ja N-myc on osoitettu positiivisesti säädellä

LIN28

ja

LIN28B

ilmaisun [19], [20], mutta emme löytäneet mitään eroa ilmaus

MYC

välillä C5 ja ei-C5 kasvaimia. Mielenkiintoista, voitto

MYC

oli yleisempää kuin C5 kasvaimet (p 0,01) (taulukko S4). Sen sijaan

MYCN

oli merkittävästi yli ilmaistu C5 kasvaimissa (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, kaksi puolinen Mann Whitneyn testi, kuvio 3A). Vuonna TCGA aineisto, jossa sekä kopiomäärä ja ilmaisun tietoja oli saatavissa,

MYCN

kopioi vahvistuksenkertojan oli hyvin rikastettu C5 alatyyppi (p 0,0001, kaksi puolinen Mann-Whitneyn testi, kuvio 3B). Vaikka oli merkittävä korrelaatio

MYCN

kopioluvun ja geenien ilmentymisen, jotkut C5 näytteitä yli ilmaistaan ​​

MYCN

ilman geenimonistuksen, mikä viittaa muiden mekanismien alatyypin sääntelyn. Lisänäyttöä N-Myc aktiivisuus saatiin tutkimalla ilmaus tunnetaan kohdegeenien AOCS ja TCGA kohortteja [33]. Molemmissa aineistot havaitsimme merkittävää rikastumista ilmentymisen N-Myc kohdegeenien C5 kasvaimet (AOCS p 0,0001, TCGA p 0,0001, yksipuolinen Fisherin testiä, kuvio 3C), mukaan lukien trans-aktivoitumisen

LIN28B

.

MYCN

ja

HMGA2

ilme oli myös hyvin korreloi merkitsevästi (kuva S3). Havaitsimme erittäin spesifinen vapautuminen yksittäisten jäsenten

MYCN-Lin28B-Let7

väylän C5 kasvaimissa, sekä laajempi joukko

MYCN

ja

Let7

transkription tavoitteet . Ymmärtää, missä määrin

Let7

polku määrittelee C5 kasvaimia, käytimme äskettäin kuvattu signalointireitin vaikutusten arviointia (SPIA) [34] koetin muut signalointireittiin riippuvuudet. Joukossa 87 signalointireittien testattu,

Let7

oli kaikkein merkittävästi säännelty väylän C5 kasvaimia (taulukko S7). Allekirjoitus geenit kaikki alalajit on esitetty taulukossa S8.

toiminnallinen analyysi koulutusjakson yhdistysten

tutkia toiminnallinen merkitys meidän havaintojen primaarikasvaimia etsittiin genomista tietoja 40 munasarjojen solulinjoista. A2780 ja CH1 arviolta C5 kasvaimia eniten, sillä molemmat ilmaistu alhainen

Anna-7

alleelit, ja korkea

HMGA2

ja

LIN28B

(kuvio S4A, S4b ). Kuitenkin vain CH1 ilmaisi

MYCN

kumpikaan linja osoitti monistamisen

MYCN

lokuksen, ja molemmat voimakkaasti ilmaisseet

LIN28

, The paralogi on

LIN28B

(Kuva S4b, S4C). Sen jälkeen systemaattisesti knock-down on

LIN28

,

LIN28B

ja

MYCN

seurasimme ilmaus

Anna-7

alleeleja. Sekä A2780 ja CH1 soluja yhdistettynä siRNA knock-down (KD) sekä

LIN28

ja

LIN28B

johti säätely ylöspäin lähes kaikki Olkoon-7 perheenjäsenet (kuva S5a-B ), yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [17], [31]. KD on

LIN28B

oli yleisesti ottaen ole yhtä merkittävä kuin

LIN28

(maksimi saavutettiin 70% KD verrattuna 90% KD) ja liittyi vähemmän vaikutusta

Anna-7

ilme. Erityisesti on huomattava,

Anna-7

ylössäätöä seuraavat

LIN28 /LIN28B

KD ei ollut välitöntä; vaikka

LIN28

ja

LIN28B

mRNA tukahdutetaan 48 tunnin kuluessa,

Anna-7

ylössäätöä ollut havaittavissa vasta 96 tuntia. KD on

MYCN

RNA oli vaikea saada (täydentävä Methods S1) CH1 solulinjassa. Parhaimmillaan vähennystä 60% mRNA ilmentyminen saavutettiin (kuvio S5B) ja vähän vaikutusta

LIN28B

tai

Anna-7

ilmentymistä havaittiin. Kumpikaan KD

LIN28

,

LIN28B

, eikä

MYCN

ollut merkittävä vaikutus HMGA2 proteiinin tai mRNA: n ilmentymisen (kuvio S5c). Kuitenkin, kuten joissakin C5 kasvaimissa, CH1 solut ovat monistaminen

HMGA2

(kuvio S4b), mikä viittaa tässä solulinjassa on vaihtoehtoinen mekanismi HMGA2 yli-ilmentyminen.

Keskustelu

laaja sarja vahvistus- ja menettämisestä toiminnon kokeita solulinjoissa ovat osoittaneet toiminnallinen vuorovaikutus N-myc ja Lin28B [20]; Lin28B ja Anna-7 [17], [30], [31], [32]; ja Anna-7 ja HMGA2 ja muut onkofetaalinen proteiinit [6]. Tässä olemme osoittaneet, että jokainen polku elementti on nimenomaan ilmaistaan ​​tavalla, joka voisi selittää syvällinen yli-ilmentyminen HMGA2 ja muiden onkofetaalinen proteiinien suuren osan C5 kasvaimia (kuvio 4, taulukko S9). Saavuttaa tai yli-ilmentyminen

MYCN

ei ole aikaisemmin liittynyt vakavien munasarjasyöpä. Vaikka taso vahvistus ei ole niin korkea kuin tyypillisesti kuvattu neuroblastooma [35], huomaamme merkittävä yli-ilmentyminen N-myc kohdegeenien C5 kasvaimissa tukee käsitystä se on toiminnallisesti aktiivinen. Viimeaikaiset tiedot osoittavat, että jopa matalan tason kopioluvun voitto

MYCN

voivat vaikuttaa merkittävästi potilaan lopputulokseen medulloblastoma [36].

MYCN

yli-ilmentyminen oli erittäin C5-erityisiä ja mekanismien lisäksi vahvistus todennäköisesti myötävaikuttaa tähän.

Jokainen tapahtuma on merkittävästi rikastettu C5 vs. ei-C5 korkealuokkaisesta serous kasvaimet:

MYCN

vahvistus p 0,0001;

MYCN

yli-ilmentyminen p 0,0001; yli-ilmentyminen

MYCN

kohteena p 0,0001;

LIN28B

yli-ilmentyminen p 0,0001; alle-ilmaisun

Anna-7

alleelit p ,01-,0001;

HMGA2

vahvistus p 0,001,

HMGA2

yli-ilmentyminen p 0,0001 (TCGA data). Kumulatiivisesti menetys Let-7b, ja /tai voitto HMGA2, ja /tai voitto MYCN esiintyy 77,8% näytteistä C5 alatyyppi (p 0,0001, kaksipuolinen Fisherin testiä; Taulukko S4).

on todennäköistä, että useat mekanismit johtavat

HMGA2

alatyypin erityisilmaus lukien

MYCN

vahvistus, menetys erityisiä

Anna-7

alleelit mukaan lukien

Let -7b

, ja monistaminen

HMGA2

itse. Esimerkiksi CH1 soluissa

LIN28

ja

LIN28B

ovat molemmat yli ilmaisseet ja tukahduttaa

Anna-7

ilme, mutta nämä solut osoittavat myös

HMGA2

vahvistusta. Olemme myös löytäneet merkittävän assosiaation C5 molekyyli- fenotyyppi ja menetys

Anna-7b

. Ilmaisu on

Anna-7b

pienennettiin molemmissa AOCS ja TCGA aineistoja, ja on huomionarvoista, että joukossa

Anna-7

alleeleja,

Anna-7b

on ollut aiemmin raportoitu olevan alle ilmaistaan ​​HG-SOC [37]. Vaikka eri alleelien

Let 7

näyttävät kohdistaa hyvin samanlaisten sekvenssien läsnäolo useita toisistaan ​​riippumattomia geenejä, niiden erilainen ekspressio kehityksen aikana [7] ja myös tietojen merkitse ne suorittavat valikoivan rooleja.

yli-ilmentyminen

MYCN

ja

Anna-7

tavoitteet C5 kasvaimissa lisää painoa toiminnallista merkitystä vahvistusta ja yli-ilmentyminen

MYCN

ja vähennetään merkittävästi ilmaus

Anna-7

alleeleja. Knockdovvn

LIN28

ja

LIN28B

ilmaus johti uudelleen ilmentymisen

Anna-7

tarjoaa lisätodiste ketjun vuorovaikutusten munasarjojen kasvaimia. Kuitenkin muita vakiintuneita yhteisvaikutuksia ei havaittu munasarjasyövän solulinjoissa testattu täällä. Vaikka esimerkiksi

HMGA2

on hyvin määritelty tavoite

Anna-7

[6], sekä voitto ja tappio-of-function kokeissa palauttaminen

Anna-7

ilme ei havaittavasti vaikuta

HMGA2

ilme. Nämä havainnot voidaan selittää rajallinen kokeellinen tukahduttaminen

LIN28B

ja

MYCN

, että kumpikaan CH1 eikä A2780 solulinjat uskollisesti phenocopy kaikki molekyyli- vikojen nähnyt C5 kasvaimia, ja monistaminen

HMGA2

in CH1 soluissa. Toteamme myös, että

Anna-7

ilmentyminen palautui vasta pidemmän aikaa (96 h) siRNA-välitteisen knockdovvn

LIN28

ja

LIN28B

, mikä viittaa siihen, että se on vaikea aloittaa uudelleen polku, kun se on alassäädetty. Vahvistaa edelleen havaintoja vaatii johdetut solulinjat C5 kasvaimista lähemmin jakavat molekyylitason ominaisuudet ensisijaisen kollegansa.

Vaikka osia tämän reitin on aiemmin osoitettu de-säädellään munasarjasyöpä [37 ], [38], meidän raportti on ensimmäinen näyttää täydellisen reitin häiriöt ja sen yhteydessä erityinen alatyyppi HG-SOC. Analyysimme osoittaa, että

Anna-7

polku on ainutlaatuisen merkittävä keskuudessa signalointi tapahtumien keskeytyksiä C5 kasvaimissa, ja näyttää veistää niiden transkription profiilia. Tunnistaminen molekyylitason alatyyppien rintasyövän [39], [40] ja tiettyjen hematologisten syöpien, kuten hajanainen suuri B-solujen lymfooma [41], [42], [43] ovat tarjonneet voimakas lähtökohdat löytää alatyypin erityisiä kuljettajia sairaus. Samanaikainen säätelyä alaspäin

Anna-7

ja täydennettiin

HMGA2

ilmaisu johtaa vähemmän eriytetty kasvaimia kantasolun kaltainen ominaisuuksiltaan [6], [9], [13], [14], [15]. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa heikkoa ilmentymistä erilaistumisen merkkiaineiden C5 kasvaimissa [5], kuten

MUC16

, tavoite ca125 vasta-käytetään kliinisesti munasarjasyöpää diagnoosin ja ennusteen. Meidän työmme ensimmäistä kertaa määrittelee väylän HG-SOC, joka liittyy ja näyttää ajaa biologista ja kliinistä käyttäytymistä erillinen molekyyli alatyypin munasarjasyöpä, mikä viittaa kohdennettua terapeuttista lähestymistapaa tässä potilasryhmässä.

tukeminen Information

Kuva S1.

HMGA2 geeni on merkittävästi säädellään ylöspäin C5 kasvaimia TCGA. (A) mRNA: n ekspressiota

HMGA2

perustuvat kaikki näytteet TCGA (B) HMGA2 yli-ilmentyy näytteistä ilman monistamisen HMGA2 lokukseen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0018064.s001

(TIF) B Kuva S2.

Expression useita C5 spesifisten geenien mitataan qRT-PCR: ää. Tämä tehdään vahvistamaan microarray ilmaisun tietoja AOCS kohortissa. Boxplots kuvaa suhdetta ekspressiotasot näiden geenien ja molekyylien alatyyppi (C5 tai Non-C5) on esitetty, p-arvot lasketaan käyttämällä Wilcox sijalla summa testi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0018064.s002

(TIF) B Kuva S3.

HMGA2 ja MYCN ekspressiotasot. (A) HMGA2 ja MYCN ekspressiotasot korreloivat in TCGA näytteissä.