Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nykyinen hoitovaihtoehtoja castration- ja hoitoresistenteille eturauhassyövän rajoittuvat ja uusia lähestymistapoja tarvitaan kipeästi. Viimeaikaiset tulokset systemaattisesti kemiallisen biologian herkkyyden näyttö kattaa useimmat tunnetut huumeiden ja niiden kaltaiset molekyylit osoittivat, että aldehydidehydrogenaasille estäjä disulfiraami on yksi voimakkaimmista syöpää erityisiä inhibiittorit eturauhasen syöpäsolujen kasvua, mukaan lukien TMPRSS2-ERG fuusio positiivisia syöpiä. Tulokset kuitenkin osoittivat, että disulfiraami yksin ei estä kasvaimen kasvua

in vivo

eikä indusoi apoptoosin

in vitro

, mikä osoittaa, että kombinatorinen lähestymistapoja voidaan tarvita parantaa anti-neoplastisia vaikutuksia.

menetelmät ja havainnot

tässä tutkimuksessa käytimme kemiallisen biologian huumeiden herkkyys näytön tutkia disulfiraami mekanistisiin yksityiskohtia ja tunnistamiseen yhdisteitä voimistavan vaikutuksen disulfiraamin in TMPRSS2-ERG fuusio positiivisia syöpäsolujen. Kaikkiaan 3357 yhdisteet mukaan lukien nykyinen kemoterapia-aineiden sekä huumeiden kaltaisia ​​pieniä molekyyliyhdisteitä seulottiin yksin ja yhdessä disulfiraamin. Mielenkiintoista, tulokset osoittivat, että androgeeni ja antioksidanttisia yhdisteitä antagonisoivat disulfiraami vaikutus taas estäjät reseptorityrosiinikinaasi, proteasomin, topoisomeraasi II glukosyyliseramidisyntaasi tai solusykliä olivat yhdisteiden herkistävät eturauhasen syöpäsolujen disulfiraami. Yhdistelmä disulfiraamin ja angiogeneesin vastaista ainetta sunitinibille tutkittiin tarkemmin, koska molemmat ovat jo kliinisessä käytössä ihmisillä. Disulfiraamin sunitinibin yhdistelmä indusoi apoptoosia ja vähentää androgeenireseptorin proteiinin ilmentyminen enemmän kuin kumpikaan yhdisteiden yksin. Lisäksi kombinatorinen altistus vähensi metastaattisen ominaisuuksia, kuten solujen vaeltamiseen ja 3D soluinvaasiota sekä indusoi epiteelisolujen erilaistumisen esitetty kohonnut E-kadheriinin ilmentymisen.

Johtopäätökset

Yhteenvetona tuloksemme ehdottavat novel kombinatorisista lähestymistapoja estämään eturauhassyöpäsolujen kasvua. Disulfiraamin sunitinibin yhdistelmä tunnistettiin yhdeksi voimakas synergistinen lähestymistapoja. Koska Sunitinibin yksin on raportoitu puuttuvan tehokkuus eturauhassyövän kliinisissä tutkimuksissa, meidän tulokset antavat perusteet uusi kombinatorisista lähestymistapa kohdistaa eturauhassyövän tehokkaammin.

Citation: Ketola K, Kallioniemi O, Iljin K (2012) Chemical Biology Drug Sensitivity Screen Osoittaa Sunitinibi kuin Tehostemateriaalit Agent Disulfiraami eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (12): e51470. doi: 10,1371 /journal.pone.0051470

Editor: Jun Liu, Johns Hopkins School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2012; Hyväksytty: 06 marraskuu 2012; Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Ketola et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia EU-PRIMA hanke (sopimus # LSHC-CT-204-504587), Cancer organisaatiot, Suomen, Sigrid Juseliuksen säätiö ja Suomen Akatemia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista miesväestöstä länsimaissa [1]. Koska useimmat eturauhassyöpäpotilaalla lopulta vastustuskykyisiä tällä hetkellä olemassa olevien lääkkeiden, kuten anti-androgeenien ja myöhemmin myös sytotoksisten aineiden, uusia lääkkeitä ja kombinatorisista lähestymistapoja tarvitaan. Olemme äskettäin suoritettu kemiallisen biologian yhdiste näytön systeemisesti testata herkkyyttä 4910 tunnettujen lääkkeiden ja huumeiden kaltaisia ​​pieniä molekyylejä ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhas- syöpäsolujen [2]. Aldehydi (ALDH) estäjä disulfiraami kuului neljä syöpä selektiivisiä tunnistettu estää kasvun viljeltyjen TMPRSS2-ERG fuusio positiivisia VCAP soluja nanomolaarisilla pitoisuus sekä vähentää VCAP ksenografti kasvu

in vivo

[2]. Äskettäin kasvua estävän potentiaalin disulfiraamin eturauhassyövässä on varmistettava erillisellä suuren suorituskyvyn yhdiste näytön

in vitro

ja ksenografti tutkimukset

in vivo

[3], [4].

Disulfiraami on ALDH estäjä, joka on ollut pitkäaikainen käyttää alkoholia pelotteena klinikoilla. Lisäksi eturauhassyövän, disulfiraami on myös osoitettu olevan syövänvastainen vaikutus rinta-, myelooma, leukemia, keuhkosyöpä, kohdunkaulan adenokarsinooma, melanooma, neuroblastooma ja peräsuolen syöpä [5] – [11]. Nykyisin disulfiraamin on faasin I kliinisissä kokeissa etäispesäkemelanoomassa, hormonin tulenkestävät syöpiä keuhko ja maksametastaaseista (www.clinicaltrials.gov, tunnisteet NCT00256230 ja NCT00742911) sekä eturauhassyövän (tunniste: NCT01118741). Viljellyissä eturauhasen syöpäsoluja, disulfiraami indusoi oksidatiivista stressiä, vähentää ALDH ja DNA metyylitransferaasi (DNMT) toimintaa sekä estää DNA: n replikaatiota [2], [4], [12]. Rintasyövän, disulfiraami ja kupari samanaikainen altistuminen inhiboi NF-kB toimintaa, lisää reaktiivisen hapen määrä ja syövän kantasoluja (CSC) [13]. Lisäksi esto ALDH toiminnan on ehdotettu mahdollisena tarkoittaa vähentää syövän kantasoluja ja voittaa lääkeresistenssin [14]. Aikaisemmat tulokset osoittivat, että vaikka disulfiraami vähensi VCAP solujen ksenografti kasvua noin 40%, se ei voi estää sitä [2]. Samanlaisia ​​tuloksia on saatu ihmisen luun metastaattisen LNCaP C4-2B ksenografteissa [4]. Lisäksi, disulfiraami altistus yksinään ei ollut riittävä aiheuttamaan apoptoosin eturauhassyövän soluissa [2]. Näin ollen tässä tutkimuksessa, suoritimme kombinatorinen herkkyys näytön ERG positiiviset eturauhasen syöpäsolujen tutkia disulfiraami vaikutusmekanismia tarkemmin. Lisäksi tavoitteena oli tunnistaa mahdolliset toimijat synergizing disulfiraamia eturauhasen syöpäsoluja. Kaikkiaan 3357 yhdisteet mukaan lukien nykyinen kemoterapia-aineiden ja huumeiden kaltaisia ​​pieniä molekyyliyhdisteitä tutkittiin yksinään ja yhdessä disulfiraamin. Molekyyli- ja fenotyyppisiä muutoksia tutkittiin yksi voimakkaimmista disulfiraami herkistävä, sunitinibi.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

TMPRSS2-ERG

geeni fuusio ja AR positiivinen eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja VCAP saatiin Drs. Adrie van Bokhoven (University of Colorado Health Sciences Center, Denver, Colorado) ja Kenneth pientä (University of Michigan, Michigan) ja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen väliaine [15]. Eturauhassyövän PC-3-solut hankittiin American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Ruotsi) ja kasvatettiin mukaan palveluntarjoajan ohjeita.

lössi-normalisoitu CellTiter-Glo tuloksia 3357 yhdisteiden seulotaan puuttuessa ( y-akseli) ja läsnäolo (x-akseli) disulfiraamin (EY

50 90 nM) VCAP eturauhasen syöpäsoluja. Jokainen piste edustaa tulos yhdellä yhdisteellä. Datapisteet täyttävien disulfiraamin herkistävä (neliöt alapuolella trendiviiva) ja pelastaminen (kolmiot edellä trendiviivan) yhdisteiden on osoitettu. Tulos sunitinibilla on merkitty nuolella.

yhdisteet

Disulfiraami hankittiin Fluka (München, Saksa) ja laimennetaan DMSO. Sunitinibi ostettiin LC Laboratories (Woburn, USA) ja laimennetaan DMSO.

Suurikapasiteettinen yhdiste Herkkyys Screen

Korkean suoritustehon yhdiste herkkyys näytön kirjasto 3357 yhdisteiden yksin ja yhdessä disulfiraamin suoritettiin VCAP soluissa. Kirjasto sisältyvät nykyiseen kemoterapeuttisten ja pieni molekyyli yhdisteiden kaupallisen yhdistekirjastoihin LOPAC (1280 nykyisten Food and Drug Administration-hyväksytty lääkkeiden ja muiden yhdisteiden farmakologisesti asianomaisten rakenteiden, 1 ja 0,1 mikromol /l), Microsource Spectrum (2,000 yhdisteitä lukien useimmat tunnetut huumeet ja muut bioaktiiviset yhdisteet ja luonnontuotteet, 1 ja 0,1 mikromol /l), ja inhouse kirjasto (77 koeyhdisteiksi, 10, 1 ja 0,1 mikromol /l). Vuonna näytössä EY

50 arvo disulfiraamin (90 nM) käytettiin. Solujen elinkelpoisuus määritettiin sen jälkeen, kun 3-päivän inkuboinnin käyttämällä CellTiter-Glo (CTG) fluoresoivien solujen elinkelpoisuuden määritys (Promega, Inc.). Solujen elävyys Tulokset normalisoitiin käyttäen lössi menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [2]. Yhdisteet, että pätevyys osuu esti solujen elinkelpoisuus vähintään kolme standardipoikkeamaa alkaen mediaani DMSO valvontaa.

elinkykyyn ja apoptoosi Analyysit

Solun elinkelpoisuus ja apoptoosin määritykset suoritettiin on 384-kuoppalevyillä (Falcon). 2000 solua per kuoppa maljattiin 35 ui niiden kasvualustaa ja annettiin kiinnittyä yön yli. Yhdisteet laimennettiin lisättiin soluihin 15 ul: ssa ja inkuboitiin 48 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttäen CTG solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Inc.). Induktio kaspaasi-3 ja 7 toimintaa havaittiin homogeeninen Apo-ONE määritystä (Promega, Madison, WI). Solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin määrityksiä sitten suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solujen elinkyvyn, 25 ui aktivoitua CTG reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, levyä inkuboitiin 30 minuutin ajan RT: ssä /150 rpm ja luminesenssi signaali (700 nm) kvantifioitiin käyttäen Envision Multilabel Plate Reader (Perkin- Elmer, Massachusetts, MA). Sillä apoptoosimäärityksessä, 25 ui elatusainetta otettiin kustakin kuopasta ja 25 ui ApoONE reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja fluorimetrisessä signaalin (heräte FITC 499 nm, emissio FITC 521 nm) kvantifioitiin käyttäen Kuvitella Multilabel Plate Reader. Keskimääräinen luminesenssi tai fluorometrisen signaalin kuudesta rinnakkaisten yhdistettä käsitellään kuoppiin jaettiin keskimääräisellä signaali kuusi DMSO ajoneuvon hallinnan käsitelty kaivoja määrittää kertaiseksi muutoksia.

Suhteellinen solujen elävyys tulokset A) VCAP ja B) PC- 3 eturauhasen syöpäsolujen sekä ei-pahanlaatuisia C) RWPE-1 ja D) EP156T soluja. Tähdellä ilmaisevat tilastollisen merkittävyyden: *, P 0,05; **, P 0,01; ja ***, P 0,005.

TILASTOANALYYSI

Osuma kriteerit yhdiste näyttö (tulos on pienempi kuin -3 SD päässä mediaani) vastaavat P-arvo on 0,05; **, P 0,01; ja ***, P 0,005.

määritys Kombinatoriset Drug Effects

luonne vuorovaikutus ja synergia välillä disulfiraamin ja sunitinibille analysoitiin käyttämällä yhdistelmäindeksiä menetelmä [16]. Pitoisuus riippuvuus antiproliferatiivisia vaikutuksia määritettiin molempien yhdisteiden, joko yksin tai yhdistelmänä. Fraktion (Fa) on määritelty osa-solujen vaikuttaa tietyllä pitoisuudella yhdisteiden yksin tai yhdistelmänä. Fa = 0 määritettiin perustuen DMSO-kontrollin ja fa = 1 staurosporiinille (1 uM) vaste (ei elävät solut vasemmalla). Aineisto analysoitiin CalcuSyn- ohjelmisto (Biosoft, Cambridge, UK), ja yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin mediaanivaikutusyhtälöstä tontteja yhtälön CI = (D) 1 /(DX) 1+ (D) 2 /( DX) 2, missä (DX) 1 ja (DX) 2 ovat yhdisteiden konsentraatiot D1 ja D2 tarvitaan tuottamaan tietty taso antiproliferatiivinen vaikutus yksin käytettynä, kun taas (D) 1 ja (D) 2 ovat niiden pitoisuudet, jotka tuottavat sama vaikutus, kun sitä käytetään yhdistelmänä. Yhdistelmä indeksi 0,9-1,1 osoittaa lisäaineen vuorovaikutus, arvot alle 0,9 osoittavat synergiaa ja arvot yli 1,1 osoittaa antagonismia.

A) Solujen morfologia vastauksena disulfiraami (1 uM) ja sunitinibin (5 uM) vastuut yksin ja yhdistelmänä. B) esittäminen yhdistelmän indeksi (CI) ja vahingoittuneiden solujen fraktion (Fa) yhdisteellä valotuksen eri pitoisuuksina (500 nM, 1 uM, 5 uM ja 10 uM) in VCAP eturauhasen syöpäsoluja. CI-arvot kullekin pitoisuus: 500 uM: 0,92, 1 uM: 0,19, 5 uM: 0,21, 10 uM: 0,40. C) Caspase 3/7 toiminta vastauksena yhdiste vastuita. Asteriskit osoittavat tilastollinen merkitsevyys: ***, P 0,005.

RNA uuttaminen ja määrälliset käänteistranskriptaasia PCR

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä RNeasy-(Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Käänteinen transkriptio käyttäen 500 ng kokonais-RNA: ta suoritettiin käyttämällä Applied Biosystems cDNA-synteesi kit. TaqMan geenien ilmentymisen ja -alukkeita päässä Universal Probe Kirjasto (Roche Diagnostics, Espoo, Suomi) käytettiin tutkimaan androgeenireseptorin (AR), prostataspesifisen antigeenin (PSA), ERG, MYC ja β-aktiinin mRNA ilmaisun. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä

ΔΔCT menetelmällä RQ Manager 1.2 ohjelmisto (Applied Biosystems). β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus. Keskimääräinen ilmentyminen DMSO alttiina vertailunäytteet pidettiin laskettaessa kertaiseksi muutoksia. Kahdesta neljään samanlaiset näytteet tutkittiin kvantitoimiseksi mRNA: n ilmentymisen.

Western Blot analyysi ja Subsellulaariset Proteome Extraction

proteiiniuutto ja Western blot-analyysi, VCAP solut maljattiin 70% konfluenssiin ja vasen kiinnittyä yön ennen hoitoja. Kokosolulysaateista valmistettiin käyttäen lyysipuskuria (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-merkaptoetanolia, 10% glyserolia ja bromifenolisinistä). Kolme replikatiivista näytettä tutkittiin kvantitoimiseksi proteiinin ilmentymisen. Spesifisten vasta-aineiden tunnustaa AR (1:1000 laimennus, hiiri monoklonaalinen, Labvision, Fremont, CA) tai PSA (1:1000, kanin polyklonaalinen, DakoCytomation, Tanska) käytettiin. β-aktiinin (1:4000, hiiren monoklonaalinen, Sigma) käytettiin latauskontrollina. Signaalit detektoitiin 1:4000 laimennosten asianmukaisia ​​HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (kaikki Invitrogen Molecular Probes, Carlsbad, CA), jota seurasi visualisointi parannetun kemiluminesenssi-reagenssia (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Saadut signaalit densitometrisesti analysoitiin GeneTools ohjelmisto (SynGene, Synoptics Ltd, Cambridge, UK).

ilmaus) AR, B) PSA, C) ERG, D) MYC mRNA vastauksena disulfiraami ( DSF) ja sunitinibin (Su) vastuut yksinään ja yhdistelmänä. E) AR ja PSA-proteiinin ilmentymistä reaktiona yhdiste vastuisiin yksinään ja yhdistelmänä. F) kvantifiointi AR proteiinin ilmentymistä reaktiona 6- ja 24 h yhdisteen vastuita. Tähdellä ilmaisevat tilastollisen merkittävyyden: *, P 0,05; **, P 0,01; ja ***, P 0,005.

E-kadheriinin (punainen) ja F-aktiini (keltainen) ilmaisuja vastauksena yhdiste hoitoja. DNA värjättiin DAPI (sininen).

Immunofluoresenssi

immunofluoresenssi Vcap solujen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kuvat otettiin 63-kertainen suurennus käyttäen Zeiss Axiovert 200 M fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

haavan paraneminen Pitoisuus

Vaikutus disulfiraamin (1 uM) ja sunitinibin (5 uM) yksinään ja yhdistelmänä eturauhassyövän solumigraatiota tutkittiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. PC-3-solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (Essen ImageLock, Essen Instruments, Birmingham, Iso-Britannia) ja haava oli naarmuuntunut haavan scratcher (Essen Instruments). Yhdisteet ja asianmukaista valvontaa lisättiin heti haavan naarmuuntumista ja haavan yhtymäkohdassa seurattiin Incucyte live-Cell Imaging System ja ohjelmistot (Essen Instruments). Haavan mitattiin tunnin välein 24 tunnin vertaamalla keskimääräinen suhteellinen haavan tiheys kolmen biologisen toistolla jokaisessa kokeessa.

Solut automaattisesti kuvattiin tunnin välein sen jälkeen, kun haava naarmuuntumista. Haavan vaikutus laskettiin haavan yhtymäkohdassa vastauksena 6-, 12- ja 24 tunnin altistus yhdisteiden A) Haavojen paraneminen vastauksena yhdiste vastuiden 24 tuntia. Musta alue edustaa haavan reunat alussa määrityksen. B) kvantifiointi solujen päästä haava-alueen. Tähdellä ilmaisevat tilastollisen merkittävyyden: *, P 0,05; **, P 0,01; ja ***, P 0,005.

A) Solujen morfologia 3D sferoidiviljelmiä määrityksessä vastauksena yhdiste vastuita. B) pinta-ala solujen Incucyte kuvia (% kokonaispinta-alasta) vastauksena yhdiste hoitoja. Tähdellä ilmaisevat tilastollisen merkittävyyden: *, P 0,05.

3D-määritys

Soluja viljeltiin 3D Matrigelillä päällystämättömän Angiogeneesi μ-diat (Ibidi Gmbh, Saksa). Pohja kuopat täytettiin 10 ui Matrigel (50%) kasvatusväliaineeseen ja inkuboidaan 30 min 37 ° C: ssa. Solut (1000 solua /kuoppa) maljattiin sitten ja sen annetaan kiinnittyä 1-2 tuntia 37 ° C: ssa. Toinen kerros Matrigel viljelyväliaineessa (25%) lisättiin ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa. Disulfiraami (1 uM), sunitinibia (5 uM) tai disulfiraamin sunitinibia yhdistelmä lisättiin 4 päivän kuluttua inkubaation ja säilyy jopa 7 päivää. Sferoidit seurattiin reaaliajassa elävien solujen kuvantamiseen (Incucyte, Essen Instruments; 10 × tavoite), ostamalla 1 kuva /h. Alueella 3D rakenteiden kuvia verrattiin koko kuva-alue (prosentteina) kvantifioimiseksi mahdolliset vaikutukset yhdisteiden solun kasvuun.

Tulokset

Chemical Biology yhdiste Herkkyys Screen Osoittaa Tehostemateriaalit agents kanssa disulfiraami

Chemical biologia yhdiste näytön lähestymistapaa käytettiin tutkimaan mekanismi disulfiraamin vähensi solujen elinkelpoisuuden eturauhasen syöpäsolujen ja tutkia mahdolliset synergistiset vuorovaikutukset disulfiraamin ja seulotaan yhdisteitä. Kirjasto 3357 yhdisteiden kuten useimmat tunnetut huumeiden ja niiden kaltaiset pienet molekyyliyhdisteitä seulottiin yksin ja yhdessä disulfiraamin in VCAP eturauhasen syöpäsoluja. Solun elinkelpoisuus Tulokset puuttuessa (DMSO kontrolli) tai läsnä disulfiraamin (EY

50, 90 nM) verrattiin. Kuten odotettua, useat yhdisteet estivät Vcap solujen kasvua (Fig. 1). Kuitenkin vain 15 yhdisteet osoittivat yhdistelmä vaikutus disulfiraamin. Kaikkiaan kuusi yhdisteet herkistyneet Vcap solujen disulfiraamin: treo-1-fenyyli-2-decanoylamino-3-morfolino-1-propanoli-hydrokloridi, bortetsomibilla, CGP-74514A, epirubisiinihydrokloridi, forboli-12-myristaatti-13-asetaattia ja sunitinibia ( Pöytä 1). Sitä vastoin 9 yhdisteet pelastettiin disulfiraami indusoi antiproliferatiivinen vaikutus (taulukko 2). Mielenkiintoista on, että nämä yhdisteet sisältyvät androgeeni yhdisteet 4-androsteeni-3,17-dioni, 5-alfa-androstaani-3-alfa, 17-beeta-dioli ja androsterone sekä antioksidanttina astaksantiinia. Täten tulokset osoittavat, että disulfiraamin vähensi solujen lisääntymistä voidaan vastavaikuttavina androgeenireseptorin aktivointia tai antioksidantteja. Lisäksi PKC aktivaattori forboli 12-myristaatti 13-asetaattia joukossa huumeiden herkistävä disulfiraami vaikutus ja PKC inaktivaattorin dequaliniumkloridi analoginen, C-14 linkkeri, kuului huumeita pelastaminen disulfiraami vaikutus, mikä osoittaa, että PKC voi olla rooli disulfiraami vastausta. Lisäksi disulfiraami vaikutus saattaa voimistua eston kautta reseptorityrosiinikinaasien, proteasomin, topoisomeraasi II: n, glukosyyliseramidisyntaasi tai solusyklin (taulukko 1), kun taas inhibitiota epidermaalisen kasvutekijän reseptori ei näytä olevan tehokas strategia voimistaa disulfiraamin (taulukko 2).

Sunitinibi ja disulfiraami yhteiskäsittely Näytä Synergism

Mielenkiintoista, sunitinibi, anti-angiogeeninen aine, voimisti disulfiraamin aiheuttama kasvua estävä vaikutus. Sunitinibi inhiboi useiden tyrosiini- kinaasien, kuten VEGFR-1, -2 ja -3, PDGFR-α ja -β, c-Kit, Ret ja Flt-3 [17]. On osoitettu, että anti-neoplastisia toimintaa eri pahanlaatuisten kasvainten, kuten hepatosellulaarinen syöpä, haimasyöpä neuroendokriinisten kasvainten ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Sunitinibi lisensoitu mRCC ja ruoansulatuskanavan kasvaimet [18] – [20]. Eturauhassyövän, sunitinibia vähentää merkittävästi kasvua kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä sekä prekliinisen ja kliinisen asetukset [21], [22]. Kuitenkin viime vaiheen III tutkimuksessa Sunitinibin eturauhassyövässä epäonnistui, koska tehon puutteen kastraatio kestävä eturauhassyövän (tunniste: NCT00676650). Koska Sunitinibin on jo tutkittu kliinisissä tutkimuksissa eturauhassyöpäpotilailla sunitinibi-disulfiraami yhdistelmä valittiin edelleen

in vitro

tutkimuksissa.

validoimiseksi kombinatorinen antiproliferatiivinen vaikutus Sunitinibin eturauhasen syöpäsolut, vaikutus disulfiraamin ja sunitinibin yksinään ja yhdistelmänä tutkittiin VCAP ja PC-3 syöpäsolujen. Tulokset osoittivat, että disulfiraami ja sunitinibin samanaikainen altistuminen vähennetään VCAP solujen elinkelpoisuus enemmän kuin kumpikaan yhdisteiden yksinään (Fig. 2A). PC-3-solut, anti-proliferatiivinen vaikutus havaittiin vain suurilla pitoisuuksilla vastauksena sunitinibille tai disulfiraamin sunitinibia samanaikainen altistuminen (Kuva. 2B). Sen selvittämiseksi synergistisyyttä VCAP soluissa johtuu yksinkertaisesti kasvaneen sytotoksisuuden, vaikutus disulfiraami, sunitinibin tai disulfiraamin sunitinibia samanaikainen altistuminen tutkittiin hyvänlaatuisen RWPE-1 ja EP156T eturauhasen epiteelisolujen. Tulokset osoittivat, että solujen elinkelpoisuus väheni vain korkeimmalla (10 uM) pitoisuus RWPE-1 ja EP156T solut (Fig. 2C ja D), mikä osoittaa, että kasvu koko solusta toksisuutta ei selitä kombinatorinen vaste Vcap soluissa.

Jos haluat vertailla vaikutuksia disulfiraamin (1 uM) ja sunitinibin (5 uM) yksin ja yhdessä on VCAP solumorfologiaan, Incucyte elävien solujen analyysi. Solut altistettiin yhdisteiden 48 tuntia. Kirkas morfologisia muutoksia havaittiin vastaus kaikkiin yhdisteen annokset (Fig. 3A). Erityisesti sunitinibin aiheutti solujen liittää toisiinsa koska minkään yksittäisen soluja nähdään sunitinibi altistuksen soluissa. Vastauksena disulfiraamin sunitinibia co-hoidon, solut myös kiinnitetty toisiinsa, mutta oli selvästi vähemmän elävien solujen vasemmalle (Fig. 3A). Yhdistelmä-indeksi (CI) määritettiin eri lääkeainepitoisuuksien (500 nM, 1 uM, 5 uM ja 10 uM), joka perustuu solujen elinkelpoisuuden tuloksia VCAP soluissa. Tulokset osoittivat, että disulfiraami ja sunitinibi osoitti synergiaa yhdelläkään testatulla pitoisuudella (CI 1) (Fig. 3B). Pienin CI-arvot näkyivät pitoisuuksissa 1 uM ja 5 uM (CI 0,19 ja 0,21). Sunitinibi pitoisuus 5 uM valittiin edelleen yhdistelmä kokeita perustuen CI ja solujen elinkelpoisuuden tuloksista sekä edellinen sunitinibille

in vitro

tutkimukset eturauhassyövän soluissa [23] – [25].

Sunitinibi ja disulfiraami yhteiskäsittely indusoi apoptoosia syöpäsolujen

tunnistaa, onko disulfiraami ja sunitinibille altistuminen indusoi apoptoosia, kaspaasi 3 ja 7 toiminta määritettiin kvantitatiivisen fluorometrisellä määritys. Kaspaasiaktiivisuus mitattiin vastauksena disulfiraami (1 uM) ja sunitinibin (5 uM) valotus 48 tuntia yksinään ja yhdistelminä VCAP soluissa. Mielenkiintoista, ei disulfiraami eikä sunitinibille yksin kykeni indusoimaan apoptoosin. Kuitenkin merkittävä apoptoosin induktio havaittiin vasteena disulfiraamin sunitinibia yhdistelmähoitona (Fig. 3C). Yhdessä sunitinibille osoittaa synergististä kasvua inhiboivia vaikutuksia disulfiraamin ja näiden kahden yhdisteet apoptoosin enemmän kuin kumpikaan yhdisteiden yksin.

Sunitinibi Vähentää Expression androgeenireseptorin (AR), prostataspesifisen antigeenin (PSA ), ERG ja MYC in ERG positiiviset eturauhasen syöpäsolujen

identifioivat ensimmäisen molekyylitason muutoksia vastauksena disulfiraami ja sunitinibin, mRNA: n ilmentymisen eturauhassyövän onkogeenien AR, PSA, ERG ja MYC tutkittiin disulfiraami (1 uM ), sunitinibin (5 uM) tai disulfiraamin sunitinibia co-alttiina VCAP solujen 3-tunnin kohdalla. Mielenkiintoista, tulokset osoittivat, että sunitinibi vähensi AR, PSA, ERG ja MYC tasolla (noin 40%) kun taas disulfiraami yksinään ei ollut suurta vaikutusta (Fig. 4A, B, C ja D). Tulokset disulfiraamin ovat sopusoinnussa edellisessä tutkimuksessa [2]. Kuitenkaan ei ollut viitteitä varten kombinatorinen vaikutus disulfiraamin ja Sunitinibin vähentämiseen ilmentymistä näiden onkogeenien mRNA tasolla.

Voit selvittää, onko muutoksia voidaan havaita proteiinin tasolla, AR tutkittiin vastauksena pidempään vastuut (6 ja 24 tuntia) disulfiraamin ja sunitinibin yksinään ja yhdistelmänä. Mielenkiintoista, vain lievää laskua AR havaittiin vastauksena sunitinibille yksin, eikä laskua AR proteiinin ilmentyminen nähtiin vastauksena disulfiraami yksin. Kuitenkin selkeä väheneminen AR proteiinin ilmentymisen (20 ja 50%) todettiin vastauksena yhdistelmä altistumista disulfiraamin ja sunitinibin klo 6 ja 24 tunnin ajankohtina (Fig. 4E ja F). Lisäksi samanlainen lasku AR säänneltyjen PSA-proteiinin tasot havaittiin (Kuva. 4E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sunitinibi vähentää androgeeni signalointi eturauhassyöpäsoluissa varsinkin yhdistettynä disulfiraamin. Kuitenkin varten tarvitaan lisätutkimuksia sen selvittämiseksi, disulfiraami ja sunitinibille toimivat synergistisesti kautta androgen signalointi.

Disulfiraami ja Sunitinibi yhteiskäsittely indusoi E-kadheriinin Expression

Tulokset mikroskooppisen solumorfologiaan analyysi ehdotti, että VCAP solut oli enemmän kiinnitetty toisiinsa vastauksena joko sunitinibia tai disulfiraami ja sunitinibin samanaikainen altistuminen verrattuna disulfiraami altistumisen yksin (Fig. 3A). Tunnistaa, ovatko nämä fenotyypit johtuivat induktion solunkiinnitysmolekyyli E-kadheriinin, immunokemiallinen värjäys suoritettiin. Tulokset osoittivat, että disulfiraami ja sunitinibi yhteiskäsittely indusoi E-kadheriinin ilmentymisen enemmän kuin kumpikaan yhdisteistä yksinään (Fig. 5). E-kadheriinin on yleisesti tunnettu markkeri syövän solujen erilaistumista ja sitä säädeltiin vähentävästi invasiivisessa eturauhassyöpä [26]. Olemme aiemmin osoittaneet, että induktio E-kadheriinin ilmentyminen liittyy vähentää soluproliferaatiota ERG positiivinen Vcap syöpäsolujen [27], [28]. Nämä tulokset osoittavat, että morfologiset fenotyyppi nähty vastauksena sunitinibille-disulfiraami yhteiskäsittely korreloi kohonneisiin E-kadheriinin ilmentymisen VCAP eturauhasen syöpäsoluja.

Disulfiraami ja Sunitinibi yhteiskäsittely Vähentää Eturauhassyöpä Cell Migration

Tutkia onko disulfiraami ja sunitinibille yhteiskäsittely vaikuttaa eturauhassyövän solumigraatio, elävien solujen solujen migraatiokokeessa tehtiin. Määrityksessä, PC-3-soluja käytettiin eturauhassyövän malli, koska Vcap solut eivät siirry tässä määrityksessä. Tulokset osoittivat, että disulfiraamin sunitinibin samanaikainen altistuminen vähentää solumigraation enemmän kuin kumpikaan yhdisteistä yksinään (Fig. 6). Siirtyminen vähennettiin merkittävästi disulfiraami ja sunitinibin yhteistyössä alttiina eturauhassyövän solut 12- ja 24-tunnin ajankohtina (20 ja 30% verrattuna DMSO-kontrollin). Merkittävä lasku solujen vaeltamiseen nähtiin myös disulfiraami ja sunitinibin alttiina solujen 24 tunnin kohdalla (kuvio. 6B). PC-3-solujen konfluenssiin ei merkittävästi vähentynyt näinä ajankohtina, mikä osoittaa, että väheneminen solumigraation ei johda alentuneen solujen lisääntymistä (kuvio S1). Siten tulokset osoittivat, että disulfiraamin sunitinibin samanaikainen altistuminen vähentää eturauhassyövän solujen vaeltamiseen enemmän kuin kumpikaan yhdisteiden yksin.

Disulfiraami ja Sunitinibi Yhdistelmä Vähentää Eturauhassyöpä Cell Invasion 3D Culture

vaikutus disulfiraamin ja sunitinibin yhteiskäsittely tutkittiin PC-3 3D sferoidiviljelmiä malli [29]. Palloset kasvatettiin Matrigelillä ja 4 päivää ja disulfiraami (1 uM) ja sunitinibipitoisuutta (5 uM) yksin ja yhdistelmänä, lisättiin soluihin ja solujen morfologiaa seurattiin 7 päivää käyttämällä elävien solujen kuvantamiseen. Tulokset on esitetty kuviossa 7. Disulfiraamia yksin pystyi vähentämään solut tunkeutuvat 3D-rakenteen, mutta se ei kyennyt vähentämään solujen kasvua sisällä ontelon (Fig. 7A). Sen sijaan sunitinibille käsitelty pallosia olivat pienempiä, kun soluinvaasiota ollut tukossa. Mielenkiintoista on, että yhdistelmähoito vähensi invasiivisen ulkonemia sekä koko palloset. Alueella soluja kuvia (% kokonaispinta-alasta) vastauksena yhdiste hoitoja 7 päivää 3D on esitetty kuvassa 7B. Yhdessä disulfiraamin sunitinibia yhteiskäsittely pienentää eturauhasen syöpäsolujen invaasiota ja kasvua 3D sferoidiviljelmiä mallissa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme kemiallisen biologian yhdiste herkistäviä näytön tutkia aldehydi (ALDH ) estäjä disulfiraami vaikutusmekanismi ja tunnistaa mahdolliset synergistiset aineet disulfiraamin in TMPRSS2-ERG positiivisia syöpäsolujen. Yhteensä 3357 yhdisteiden kuten nykyinen kemoterapeuttisten ja pienet molekyyliyhdisteitä seulottiin yksin ja yhdessä disulfiraamin ja synergistinen mekanismi disulfiraami herkistävä sunitinibia tutkittiin tarkemmin.

Tulokset suurikapasiteettisten kombinatorinen näyttö osoitti, että useita androgeeni yhdisteitä sekä antioksidanttina astaksantiinia olivat yhdisteiden pelastamiseen disulfiraamin indusoi anti-proliferatiivinen vaikutus eturauhasen syöpäsoluja. Edellisessä tulokset osoittivat, että disulfiraami indusoi oksidatiivista stressiä eturauhassyövän soluissa [2]. Disulfiraami lisää ROS tasoilla myös rintasyövän soluissa [13]. Niinpä pelastus vaikutus antioksidantti astaksantiinin disulfiraami alttiina soluissa tukee aiempia tuloksia osoittaa, että disulfiraamin vähensi solujen lisääntymistä välittyy kautta induktion oksidatiivisen stressin. Seulonta Tulokset ehdotti myös, että PKC on rooli disulfiraami vastauksena koska PKC aktivaattori forboli 12-myristaatti 13-asetaattia joukossa huumeiden herkistävä disulfiraami vaikutus taas PKC inaktivaattorin dequaliniumkloridi analoginen, C-14 linkkeri pelastettu disulfiraamia vaikutus näytön. Lisäksi esto reseptorityrosiinikinaasien, proteasomin, topoisomeraasi II: n, glukosyyliseramidisyntaasi voi olla vaihtoehtoisia tapoja parantaa disulfiraami vaikutusta kun taas inhibitiota epidermaalisen kasvutekijän reseptori on päinvastainen vaikutus. Yksi kuudesta yhdisteiden herkistävät Vcap solujen disulfiraamin indusoi anti-proliferatiivinen vaikutus oli antiangiogeeninen aine, tyrosiini-proteiinikinaasi-reseptorin estäjä sunitinibin. Sunitinibi on syöpälääkkeen, joka on kliinisesti käytetään hoitoon mRCC ja ruoansulatuskanavan syöpäpotilailla. Se on myös osoitettu olevan anti-neoplastisen aktiivisuuden hepatosellulaarinen syöpä, haimasyöpä neuroendokriinisten kasvainten ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [18] – [20].