Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yhden solun analyysi on mahdollistanut kriittisten löytöjä Huumausainetestauksissa Immunobiology ja kantasolututkimus. Lisäksi muutos kahdesta kolmeen kolmiulotteinen kasvuolosuhteiden radikaalisti vaikuttaa solun käyttäytymistä. Tämä jo johtanut uusien havaintojen geenien ilmentymisen ja viestintäverkkojen ja paremmin ennusteita soluvasteita ympäristöönsä. Kuitenkin on edelleen vaikea tutkia koko ja muoto yksittäisistä soluista, jotka ovat vapaasti keskeytetään, kun morfologiset muutokset ovat erittäin merkittäviä. Tässä kuvattu uusi menetelmä kvantitatiivista reaaliaikaista seurantaa solun koko ja morfologia, yksittäisistä elävien keskeytetty syöpäsoluja, löyhän kolmiulotteisesti. Tarkkuus on verrattavissa parhaiten optiset, mutta sen sijaan, ei ole tarpeen rajoittamiseksi solun kuvannustasoa. ’Täällä ensimmäisen kerran käyttöön

solun magnetorotation

(CM) menetelmä on mahdollista

nanohiukkasten indusoi solun magnetoinnin

. Käyttämällä pyörivää magneettikenttää, magneettisesti merkittyjen solun aktiivisesti pyöritetään, ja pyörivä aikana mitataan reaaliaikaisesti. Muutos morfologiassa aiheuttaa muutoksen pyörimisliikkeen aikana suspendoituneiden solujen (esim., Kun solu saa suuremman se pyörii hitaammin). Kyky seurata reaaliaikaisesti, solu- turvotusta tai kuolema, yksisoluvaiheessa tasolla, on osoitettu. Tätä menetelmää voitaisiin siten käyttää Multipleksoituja reaaliaikaisesti yhden solun morfologia analyysi, joilla on vaikutuksia huumetestejä, lääkekehityksen, genomiikka ja kolmiulotteinen viljely.

Citation: Elbez R, McNaughton BH, Patel L, pientä KJ , Kopelman R (2011) Nanoparticle aiheuttama Cell Magneto-kierto: Monitoring Morfologia, Stressi ja Drug herkkyys a Ehdollinen yhden Cancer Cell. PLoS ONE 6 (12): e28475. doi: 10,1371 /journal.pone.0028475

editori: Christina Chan, Michigan State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 08 marraskuu 2011; Julkaistu: 13 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Elbez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH-R01-EB007977 (RK), NIH-R33CA125297-03S1 (RK) ja NIH-R21EB009550 (RK)). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

heterogeenisyys eli epäyhtenäisyyttä, löytyy syöpäsolun väestön ja arjen solujen erilaistumiseen, on lisännyt kiinnostusta yksittäisten solujen tutkimuksissa [1] – [4]. Historiallisesti, kasvain olevan peräisin peräkkäisten osastojen yhden äidin cell ”, mikä johtaa oletukseen, että kaikki solut kasvaimessa oli sama geneettinen koodi. Kuitenkin viime aikoina havainnot ovat muuttaneet tätä teoriaa, korostaen, työkaluja, jotka voivat tarkkailla ja seurata yhden solujen suurikapasiteettisten muoti [5] – [8]. Tällä hetkellä vakio määritykset suoritettiin solupopulaatioiden tehdä yksittäisiä malleja vaikea päästä, koska vaikutukset keskimäärin [9]. Virtaussytometria Esimerkiksi on massiivisesti käytetty viimeisten 20 vuoden aikana, sen kyky suorittaa nopea analyysi on hyvin suuri määrä soluja kerrallaan (10000 solua /s). Ajankohta analyysi voidaan suorittaa myös käyttämällä tätä tekniikkaa, mutta se ei ole mahdollista seurata jokaisen solun erikseen.

Sitten taas, on erityisen tärkeää, että jopa pieni vähemmistö soluja, kuten kantasoluja, joiden käyttäytyminen voitaisiin katsoa olevan tilastollisesti merkityksetön verrattuna suurin osa väestöstä, voi olla kriittinen biologisten ja lääketieteellisten vaikutus. Esimerkiksi käyttö

Imatinibiin

lääke että tavoitteet

BCR-abl

fuusioproteiini sairastavilla potilailla krooninen myelooinen leukemia (KML) ensimmäinen näytti olevan yksi onnistuneen kohdistettuja hoitomuotoja. Kuitenkin hoito ei poista KML kantasoluja, ja peruuttaminen Imatinibin sairauden ilmestyi [10], [11]. Tämän seurauksena keskitytään solu-solu vaihtelua on myös mahdollistanut merkittäviä läpimurtoja ymmärrystä solujen erilaistumisen, lääkevaste, proteiini mekanismeja ja dynamiikkaa sekä tärkeä rooli kantasoluja, erityisesti syövän kantasoluja [12]. Etäpesäke vetoaa syöpäsolujen kiertävän verisuoniverkoston. Solut vastuussa syövän leviämistä toissijaiseen tuumorikohdat ovat äärimmäisen harvinaisia ​​(muutama solua miljoonaa veressä), ja ne menevät läpi kiertävä vaiheessa ennen asuttavat muita kudoksia. Siksi yhdessä yhden solun analyysi, kolmiulotteinen määritykset mahdollistavat myös parempaan ymmärtämiseen solujen dynamiikka [13] – [15], jonka välistä kuilua

in vitro

ja

in vivo

käyttäytymisen [7]. Kuitenkin kaikki edellä mainitut yhden solun analyysitekniikoita rajoitetaan niiden synnytyksen solun kahdessa ulottuvuudessa. Tämän rajoituksen voittamiseksi, käytämme uutta lähestymistapaa käyttäen

keskeytetty cell Magneto-kierto

(CM).

Erityisesti käytämme

nanohiukkasten aiheuttama Cell Magneto-kierto menetelmä

, jossa ajo magneettikenttä ja pyörivän solu on

out-of-synkässä

keskenään. Solut on upotettu 30 nm kaupallista magneettisia nanohiukkasia (Ocean Nanotech®) ja pyöritetään alle ulkoisen magneettikentän noin 1 mT, on about100 Hz. Toteamme, että tuhat kertaa (1000 ×) korkeampi kenttiä, suuruusluokkaa 1T, käytetään MRI. Myös magneettiset nanopartikkelit on käytetty laajalti biologian [16] – [20]. Näin ollen CM menetelmä on suunniteltu bioyhteensopivia ja myrkyttömiä. Elävien solujen pyöritetään

asynkronisesti

(katso Täydentäviä tietoja S1) suspensiossa, ja sen pyörimistaajuus on erittäin herkkä mitään morfologian muutokseen. Kuten raportoitu täällä, Magneto-kierto ei vaikuta solun elinkelpoisuuden, ja mahdollistaa reaaliaikaisen analysoinnista. Solujen muodonmuutokset on merkitty kvantitatiivisesti yksittäisen solun pyörimisen aikana. Trendeistä pyörimisnopeus mahdollistaa syrjiä terveen solun, kuolevan solun tai turvotusta solu. Lisäksi tämä uusi tekniikka on helposti sovitettavissa mihin tahansa mikroskooppi perustaa, on fluoresoiva-label vapaa, ja se on yhteensopiva samanaikainen fluoresenssi ja /tai muita optisen kuvantamisen ja spektroskopian menetelmiä sekä magneettinen erottelu ja rikastamiseen tekniikoita. Muita menetelmiä käytetään seurata morfologiset muutokset yhden biologisen soluista ovat Atomic Force Microscopy [21] (AFM) ja optiset pinsetit [22] (OT). Nämä menetelmät voivat tarjota tarkempia, mutta rajoittavat kiinnittymisen solujen pinnalle (AFM) tai peruuttamatonta aiheuttamien vahinkojen laser ansastusta (OT). Lisäksi OT kutakin solulinjaa, elinkelpoisuutta tutkimukset on tehtävä jokaisen solutyypin estämiseksi valon aiheuttaman vaurion, mikä rajoittaa sen soveltuvuutta [23]. Käyttö ulokkeita on myös raportoitu seurata massan elävien solujen [24], mutta ei ole olemassa julkaisuja vielä yhden syöpäsolujen suspensiossa.

Tulokset

malli kierron magneettisesti leimattujen solujen

Jos haluat varmistaa, että solut voidaan magneettisesti manipuloida, otimme heidät keskelle magneettikäämit magneettikentän amplitudit 1 mT, kuten kuvassa 1b. Kelat itse on sovitettu alustan mikroskoopin voidakseen tallentaa videoita (katso Täydennyskuvio S4 ja täydentävä Video S1). Yksittäinen solut pyörivät taajuuksilla 0,05 Hz 2 Hz tässä setup (paljon pienempi kuin 100 Hz ajo kenttiä, johtuen toimivat

asynkronista järjestelmää

, katso alla). Tarkennus pienitehoisia, 1,45 mW HeNe laser mikroskoopilla, eteenpäin hajallaan signaali tallennetaan kanssa valodiodin [25]. Solun elinkelpoisuus ei vaikuta matalan intensiteetin laser, kuten on esitetty täydentävien kuvassa S3 ja lisätaulukot S1 ja S2. Kun solu pyörii, se tuottaa pyörivä riippuvainen modulaatiota, joka voidaan mitata valodiodin. Reaaliaikainen signaalinkäsittely, kiertoaikana solun ja siksi sen koko /morfologia voidaan seurata reaaliaikaisesti.

a) Kaavio täydellisen asennuksen. Live-Cell Array® levy, jossa on 100 pm kaivot, sijoitetaan alustan mikroskooppia, jolle joukko sähkömagneetteja on mukautettu. Huomaa, että solu ei ole kiinni kaivon pohjalle. Alle 60 × tavoite, lasersäde läpikäy eteenpäin sirontaa pyörivästä solusta (15 20 pm), ja vaihtelut eteenpäin hajallaan valo jää reaaliaikaisesti valokuvien detektori, ja analysoitiin tietokoneella. b) Kaavio pyörivän solun sisälle sijoitettu magneettikäämit: kaksi identtistä sinisignaaleja, jossa vaihesiirto 90 °, läpi kaksi paria kelat. Käytetyn magneettikentän ja magneettinen momentti solun eivät ole kohdakkain, luomalla vääntömomentin, joka ohjaa solun kierto. c) Rotational kuluessa mitattavat fixated solun DMEM. Insertti esittää raaka signaalin valoilmaisimen, joka osoittaa jaksollisuutta tiettynä aikaikkunassa. Hoito signaalin antaa sitten kiertoliikkeen aikana (Katso menetelmät osio Optinen järjestely signaalin käsittely kuvaus). d) Kuvateksti asennusohjelman. Custom Helmoltz kelat kanssa NUNC Liven Kennoryhmä Plate mikroskoopilla vaiheessa.

Solu havaittu omaavan magneettisen pyörintäkäyttäytyminen hyvin samanlainen kuin magneettisen mikrohiukkasten (täydennyskuvio. S1). Kuten alla McNaughton et al. [26], ja laajennettiin tapauksessa superparamagneettisia partikkeleita [27], on olemassa kriittinen taajuus ulkoisen magneettikentän jonka yläpuolella hiukkanen ei pyöri synkronoidusti kentän, eli hiukkanen ei voi pysyä enää kanssa ajo taajuus. Tässä asynkroninen hallinnon, keskiarvo pyörimisnopeutta yksittäinen solu on antanut, jossa on magneettinen momentti ja on vetää johtuu viskositeetin voimia. Täällä,

κ

on sen Einsteinin muotokerroin,

V

tilavuus ja

η

viskositeettiluku. Toteamme, että on suuruuteen verrannollinen magneettikentän, magneettinen momentti solun ja tilavuus magneettisen

sisällön

solun; kuitenkin, kaikki nämä parametrit pidetään vakioina kokeissa. Siksi asynkronisen hallinnon muutoksia solun muotoon tai, toisin sanoen sen tehokkaan määrän, indusoi muutoksen pyörimisnopeus, kuin edellä mainituilla kaavalla. Tämä malli on kehitetty edelleen, että kyseessä on paramagneettipartikkeleita [28], [29], jossa pyörivä aikana, on havaittu olevan verrannollinen tehollisen tilavuuden, (tämä on totta, että asynkroninen pyörivän järjestelmän, täydellinen johtaminen , katso viite. 27 ja yhtälöt Täydentäviä tietoja S1). Kuten voidaan nähdä tästä riippuvuudesta, jos tilavuus kasvaa, kiertoaika kasvaa suhteellisesti. Sama koskee muotokerroin, ja, sen seurauksena, voidaan havaita morfologian muutoksia.

Magneettinen karakterisointi solujen

karakterisoimiseksi edelleen magnetoinnin solujen, katsoimme paikallistaminen nanohiukkasten inkubaation jälkeen, onko ne jäi kiinni pintaan, sai sisäistetty, ja jos he tekivät, jos nanohiukkasten liikkuivat vapaasti sytoplasmassa tai loukkuun rakkulat (endosomeissa). Voit tehdä niin, kiinnitimme HPTS loisteputki dyemolecules (8 – Hydroxypyrene – 1,3,6 – trisulfonihappo, trinatrium suola) meidän nanohiukkasten käyttäen sähköstaattista vetovoimaa voimien välillä hiukkasten ja väriaineita. HPTS on kalvon läpäisemätön väriainetta, ja siten se on vektori saada sisäistää soluja. Sen jälkeen, kun protokollaa inkuboinnin, pesimme solut kolme kertaa PBS: ssä, ja soluja havaittiin alle eksitaatio 450 nm: ssä fluoresenssi tarkistetaan 510 nm. Tulokset on esitetty kuvassa 2a. Kuten näemme, magneettiset nanopartikkelit sisäistetään solun endosytoosin. Lisäksi kumpikaan tuma tai sytoplasmassa osoittaa fluoresenssin, joka osoittaa, että nanopartikkelit pysyvät rakkulat. Lisäksi arvioimme rautapitoisuus solujen induktiivisesti kytkettyä plasma (ICP) mittauksen (katso Menetelmät kohta). Kuten odotettua, rautapitoisuus lisääntyy MNP pitoisuus elatusaineet, ja suuntaus näyttää lineaarinen pitoisuuden ikkunassa käytimme (kuvio 2b). Meidän kierto kokeissa arvioimme, että rautapitoisuus on noin 14 pg /solu. Verrattuna massa nanohiukkasten, tämä tarkoittaa, että keskimäärin vähemmän kuin 20000 nanohiukkaset ovat saaneet soluun. Muita kokoja magneettisia nanohiukkasia testattiin myös (10 nm, 100 nm ja 200 nm), mutta internalisointia on maksimoida hiukkasia, joiden halkaisija on 30 nm (tuloksia ei ole esitetty).

a) Fluoresenssi Kuva (40 x ) on HeLa-solujen kanssa inkuboinnin jälkeen värjätty magneettinen nanohiukkasten ekstrasellulaarinen rautapitoisuus [Fe] = 12,5 ug /ml (0,22 mmol). b) Cellular rautapitoisuus pikogramma solua kohti. Hiukkaspitoisuuksiin tiedotusvälineissä annetaan rautapitoisuus (virhepalkit arvot edustavat keskiarvoa +/- 0.5 * sd, n = 3).

Sytotoksisuusmääritvs ja huumeiden herkkyys

tässä tutkimuksessa syöpäsolujen ladattu nanohiukkasten Magneettierotuskäsitelty ja resuspendoitiin eri medioita, kuten kulttuuri (DMEM), DMEM, jossa 5% etanolia, DMEM 100 ug /ml sisplatiinia tai DMEM, jossa 75%: deionifzed vettä. Kumpaakin kasvualustaa käytetään varmistamaan eri näkökohtia tätä menetelmää: DMEM käytettiin kontrollina, etanolia käytettiin sytotoksisen aineen, sisplatiini mallintamiseen käytettiin lääkkeen määritys; myös, edistää stressiä solujen turvotusta, käytimme suuri osa DI vettä, kääntää ioninen tasapaino sisä- ja ulkopuolelta solun. Huomaa, että suuri pitoisuus suolaa liuoksessa on päinvastainen vaikutus solun, eli kutistuu sitä. Solut suspensiossa sitten pipetoitiin elävien solujen Array ™ levyn (NUNC ™), jossa matriisi on 100 um leveä kuoppiin, jotka tarjoavat riittävän osastoja yksittäisiä soluja pyörittää ja analysoidaan. Optinen sirontasignaalien (pyörivästä soluista) tallennettiin ja muutokset kiertoaikana mitattiin eri median (kuva 3). Magneto-kierto suoritettiin alle lukuisia olosuhteissa, eri solujen näytteitä; seuraavat tulokset osoittavat tyypillisiä esimerkkejä solun käyttäytymistä, joka on toistettu useita kertoja järjestelmä.

a) DMEM agaroosi- kerroksella b) Seokseen, jossa on 75%: ssa DI vettä ja 25% DMEM c) DMEM 5% etanolia ja d) on elävien solujen DMEM (vihreä ympyrä) verrattuna HeLa cell (punaiset neliöt) DMEM, jossa on 100 ug /ml sisplatiinia. Y-akseli on normalisoitu ajan, ja X-akseli on aika sekunteina. Viivat osoittavat suuntauksen välillä liitettyjen pistettä. Kunkin kaavion kuvissa yläpuolella, pohjan kuvissa tilannetietoa käännettyä solun kullakin merkitty kerta, kun kaavamaisen kuvia sen päälle osoittaa vastaavan solun muodot (kiinnittynyt solu ei esitetty). Tumma levyt ovat sytoplasmassa ja kalvo, kun taas harmaa täplät osoittavat vesikkelit on muodostettu pinnalla, jos sellainen on.

Kuviot 3a ja 3b esittävät kahta tapausta solujen turvotusta. Cell turvotus yleensä ilmenee, koska osmoottinen paine on luotu joko ioninen epätasapaino, kuten edellä mainittiin, tai puute ravinteita. Joko niin, solu laajenee selviytyä epätasapaino kemikaalien se tarvitsee säilyttää aineenvaihduntaan. Päästäkseen ioninen eroja, käytimme DI vettä (kuva 3b). Havaitsimme myös, että solut, myös turpoavat, kun ne saatetaan agaroosi- kerroksella (2% agaroosia Dl-vettä) (kuvio 3b). Agaroosigeelillä on huokoinen, ominaisuus, joka käytetään elektroforeesi proteiinien, ja tämä ominaisuus voi olla alkuperästä turvotusta. Todellakin, ravinteet läsnä kasvualustojen, pääasiassa glukoosia, voi diffundoitua agaroosigeelillä, kun solut kiertää sen yläpuolella. Solut siis turpoavat tasapainottaa vähentää saatavilla olevien ravinteiden konsentraatio liuoksessa, havaittuna Goldberg et ai. kuorikerroksen soluissa [29]. Koska solu tilavuus kasvaa, kiertoaikana kasvaa. Vaihtoehtoisesti, solukuolemaan aiheuttanut, kun ne asetetaan liuokseen, jossa oli 5% etanolia (kuva 3c) tai käyttämällä pitoisuutena 100 ug /ml sisplatiinia liuoksessa (kuva 3d, punainen viiva, joka yhdistää potenssiin pistettä). Kuitenkin mekanismeja tällaisten solujen kuolemista ovat erilaisia ​​kuin yllä mainituissa tapauksissa, koska blebs näkyvät solun pinnalla. 5% etanolia, se kestää vain noin 30 minuuttia (kuva 3c) ja blebs näkyvät, kun taas siinä tapauksessa, että käsittely Sisplatiini 100 ug /ml, se kestää useita tunteja. Toisin kuin turvotus tapauksessa on muutoksia muodon solukalvon jotka lisäävät tehollinen tilavuus. Kupliminen ja muodostumista vesikkelien pinnalla solun osoittavat, että solun sisältö eriteltyinä ja useiksi eri rakkulat. Koska kuolema prosessi jatkuu, rakkula koot kasvaa. Tällainen ilmiö ei ainoastaan ​​lisää määrään, mutta se vaikuttaa kriittisesti muotokerroin solun. Näiden kahden parametrin, nimittäin

tehokas tilavuus

, on se, mitä seurataan magnetorotation siten monistamaan kupliminen vaikutus. Lopulta vetää solun tulee niin korkea, verrattuna alkuperäiseen tilaan solun, joka solu kiertoaikana nousee jyrkästi (550%), ei-lineaarisesti (kuvat 3c, punainen viiva kuvassa 3d ja katso kuva 4 vertailun mikroskoopilla mittaukset). Siten molemmat solukuoleman mekanismeja, vaikkakin hyvin erilaisia, voidaan havaita ja eriytetty kanssa Cell Magnetorotation.

a) vertailu herkkyyksiä välillä mikroskoopin ja Magneto-kierto mittaamisessa solukuoleman (HeLasoluista DMEM, 5% etanoli) . Punaisella on normalisoitu ala mitattuna mikroskoopin, ja sininen on normalisoitu tehollisen tilavuuden ajan mitattuna Magneto-Rotation käyttäen Täydentäviä tietoja S1. b) vertailu solukuoleman seurannan avulla Magneto-kierto ja Live /Dead solun määrityksessä.

Meillä on myös suoritettu magnetorotation terveen solun (kuvio 3d, vihreä viiva), kasvatusväliaineessa. Koska myrkyllinen aine, kiertoaikana ei merkittävästi muuttunut (keskihajonta pyörimisen aikana oli 15%). Kiinteä morfologia kontrollikoetulos toteutettiin kiinnittävät soluja 4% formaldehydiä injektiopullossa (1,5 ml) 10 minuuttia, alle end-over-end injektiopullon kierto (katso täydentävä kuva S2, punainen viiva). Koska kalvon ja solun sisältö oli silloitettu, solun morfologia eivät muutu, alle isotoninen olosuhteissa, ja näin ollen, koska odotetaan, kierto ei ole muutettu. Verrattuna fixated soluun, jossa rotaatio aika on hyvin tasainen, eläviä soluja huomaamme, että kiertoaika, ajan myötä, osoittaa merkittäviä lyhyen ajan vaihtelut. Tämä voi olla seurausta solujen aineenvaihduntaa, joka on yhä aktiivinen pyörimisen aikana. Kaiken kaikkiaan tämä osoittaa, että kun kiertoaika on vakio, se vastaa soluun, joka ei merkittävästi muuttuu sen tehollinen tilavuus.

arvioimiseksi menetelmän tarkkuus tehokkaista tilavuus muutoksia, vertasimme suuntaukset tehollinen tilavuus (pyörimiseen verrannollisen aikana) kanssa pinta-alasta, kuten arvioitiin mikroskoopilla kuvia (pinta-ala on vakio osoitin solun morfologia /muotokerroin). Kuvankäsittely- ohjelmistoja (Adobe Photoshop), arvioimme pinta-alat solujen säännöllisin välein. Kuten voidaan nähdä kuvassa 4a, Magneto-kierto on yhtä tehokas kuin optisella mikroskoopilla setup havainnoimalla pieniä muutoksia. Kuitenkin suurempia muutoksia, magneto-kierto vahvistaa vastauksen, verrattuna optisella mikroskoopilla asetukset. Mikä tahansa merkittävä heikkeneminen magneettinen kestää useita päiviä, mukaan Arbab et ai. [30]. Niinpä sen vaikutus tulosten tulkintaa, kun useita tunteja, voidaan jättää huomiotta. Myös tasainen kierto nopeudella magnetoitu säätökenno on omiaan vahvistamaan, että menetys magneettinen sisältö ei ole merkittävää yli aikajänteellä mittauksen. Muussa tapauksessa magneettinen momentti solu kriittisesti vähenee, ja solun hidastaisi merkittävästi, mikä ei pidä paikkaansa (kuvio 3d). Siksi voimme olettaa, että solun tehokas tilavuus on todellakin verrannollinen rotaatio ajan. Magneto-kierto voidaan myös verrata Live /Dead solun määrityksissä. Solut valmistettiin seuraten protokollaa on kuvattu aikaisemmin. Ennen pipetoimalla osaksi mikrokuoppalevyn, lisäsimme 2,0 ul kalseiini ja 5,0 ui propidiumjodidia (PI) ja 1 ml: n näyte, joka sisältää soluja. Solut jätettiin sit inkubaattorissa 10 min, ja sitten suspendoitiin uudelleen DMEM 5% etanolia ja sama määrä värejä, jonka jälkeen ne pipetoitiin ja kiertää. Kuten voidaan nähdä kuvassa 4b, solun läpi morfologian muutokset hyvissä ajoin ennen PI fluoresenssi voidaan nähdä, ja kun solukuolema (PI määritelty) täyttyy, kiertoaika on hidastunut tekijällä noin 2. Tämä ei vain osoittaa että magneto-kierto menetelmä ”hyvin vertailun fluoresenssimäärityksissä, vaan osoittaa myös sen olevan herkempi. Ei ole yllättävää nähdä pyörimisnopeus hidastuu

hyvin ennen

yksi on pystyä havaitsemaan fluoresenssin PI väriaineita. Todellakin, PI väriaineita vain tehdä tiensä sytoplasmaan jälkeen solun seinät ovat tuhoutuneet. Kuitenkin paljon ennen, muut prosessit tapahtuvat, joista yksi on muodostumista blebs pinnalla solun, ilmiö, joka solu Magneto-kierto voi tarkasti seurata, mikä ei ole asianlaita MTT-määritystä esimerkiksi.

Effects of magneto-kierto solujen elinkelpoisuuden ja divisioona

tutkimiseksi kykyä setup seurata solukuoleman aiheuttamatta solukuoleman, teimme useita kannattavuuden testaamiseksi (laseraltistumisen, lyhyellä ja pitkällä aikavälin vaikutukset kierto elinkelpoisuuden solunjakautumisen ja kyky muodostaa klooneja).

testattiin ensin vaikutus oton magneettisten nanohiukkasten [keltainen (oikea asteikko) ja punainen (keskellä) palkit kuvassa 5a], ja läsnäolon magneettikentän, solujen elinkelpoisuuden [punainen (keskellä) ja sininen (vasen asteikko) baareja kuvassa 5a]. Suoritimme elinkelpoisuustesti kolmeen eri HeLa solupopulaatioiden. Tunnin 37 ° C: ssa, jossa kosteus ja CO

2 ohjaus, solulukuun tehtiin käyttäen trypaanisini. Ei ollut mitään merkittävää eroa elinkelpoisuuden kolmesta solun ryhmää (kuvio 5a). Tämä osoittaa, ettei hiukkasten sisällyttäminen eikä kierto alle magneettikentän vaikuttanut solujen elinkelpoisuuden yli aikaskaala tunnissa. Itse asiassa samanlaista magneettista rautaoksidia nanohiukkasten käytetään varsin yleisesti [16], [30] ja magnetophoretically erillisiä tiettyjen solupopulaatioiden heterogeeninen väestö, sekä aikana MRI potilailla (kontrasti lisälaite), aiheuttamatta haittaa soluihin . Yllä kannattavuuden testaamiseksi, kentän voimakkuuden ja magneettinen partikkeli pitoisuudet tarkoituksella asetettu korkeammat arvot (0,5 mT ja 40 ug /ml) kuin on kuvattu tässä paperi magnetorotation (0,1 mT ja 25 ug /ml), jotta pitää turvamarginaali protokollan.

a) HeLa elinkelpoisuus inkubaation jälkeen nanohiukkaset ja kierto alla pyörivän magneettikentän. Kaikki solut ovat peräisin samasta solulinjan, ja viljeltiin samalla, kukin 4 päivää. HeLa-soluja kasvatettiin, kunnes saavutettiin 70% konfluenssiin, ja ensimmäinen näyte muodosti kontrolliryhmä (RHS). Kaksi muuta ryhmää, inkuboitiin magneettiset nanopartikkelit, peräisin saman solun erää, kasvatettujen solujen läsnä ollessa 40 ug /ml DMEM: ssä, kunnes saavutettiin 70%: n konfluenssiin. Kukin ryhmä tehtiin kaksi näytettä, jotka sisältävät 50000 solua kukin. Vaikka toinen näyte ei käännetä, kolmas (kontrolli) oli laittaa alle kentän 0,5 mT ja pyöritettiin ajo taajuudella 100 Hz (vasen asteikko). Kokeen aikana, soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja kosteuden säätö. Jokaista ryhmä, n = 3. Arvot edustavat keskiarvoa +/- S.D. b) Magnetic HeLa elinkelpoisuus ennen ja jälkeen laser altistuksen. HeLa-soluja inkuboitiin magneettisia nanohiukkasia, 48 tuntia, seuraten protokollaa on kuvattu. 96-kuoppalevylle, 150 ui kutakin soluja pipetoitiin. Ohjaus mittaus (sininen) toteutui jälkeen solut pestiin, irrottaa ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen mediassa 37 ° C: ssa. Non-alttiina (punainen) ja altistettiin soluja (vihreä) pidettiin mikroskoopilla vaiheessa 120 min huoneen lämpötilassa. Kukin kuoppa sisälsi 25000 soluja. Arvot edustavat keskiarvoa +/- 0.5 * S.D. n = 3. c) HeLa-solujen elinkelpoisuus aikana magneto-kierto 37 ° C: ssa, jossa kosteus ja 5% CO2-ohjaus. HeLa-solut pipetoitiin live Cell Array (NUNC ™). Solut loukkuun 100 um kaivot laskettiin käyttäen Calcein. Sekä ohjaus- ja pyöritetään solujen ryhmiä, n = 4. Solukuolemaan seurattiin propidiumjodidia. Standardipoikkeamat ovat pisteitä.

Toinen mahdollinen huolenaihe käsittelimme on vaikutusta laseraltistumisen solun elinkelpoisuuden (kuva 5b). Elinkelpoisuus testi ei ole merkittävästi solukuoleman ja mitään merkittävää eroa kahden tunnin kuluttua, välillä ohjaus solujen ja magneettisen solut, jotka olivat altistuneet laser. Sekä vuorovaikutusta solujen valoa ja mahdollinen vuorovaikutus magneettinen nanopartikkelien laser eivät vaikuta solujen elinkykyyn.

Lopuksi tutkittiin mahdollinen vaikutus fyysisen pyörimisen soluja niiden elinkelpoisuus. Todellakin, jotta -sykevyön myrkyllisyyttä, solu kierto on oltava vaarattomia. Kuva 5c osoitteet Jälkimmäisen asian. Vertaamalla kuolleisuus pyörivien solujen ja kuolleisuus ei-magneettinen soluja, löysimme ei tilastollista eroa kaksi suuntausta (n = 4, p = 0,245 0,05, F = 1,65 5,98 = F

crit ). Lisäksi, kuten havaitaan (tuloksia ei ole esitetty), ja, kuten on kuvattu muiden julkaisujen [30], soluja, jotka sisältävät magneettisia nanohiukkasia voidaan alaviljellä. Myös arvioida solujen kyky muodostaa klooneja, teimme klonogeeniset määritys, jossa solut ensin magneettisesti pyöritettiin 24 tuntia inkubaattorissa, ja anna kasvaa agaroosilla kolme viikkoa. Löysimme mitään merkittävää eroa vertailunäytteet sekä kierretyn näytteet (n = 3, t = 1,37 2,77 = t

crit, p = 0,24 0,05 = p

crit, katso täydentävä kuva S3).

Lopuksi testasimme myös vaikutusta magneto-kierto solu- jako. Kysymys oli: ei Magneto-kierto estää välittömästi solunjakautumisen? Tutkia lyhyen aikavälin vaikutuksia, me kääntää solujen agaroosi- 72 tuntia, ja kun solun kasvua kahteen muuhun valvonnat (leimattu ja magneettisesti leimattujen solujen puuttuessa magneettikenttä). Olemme löytäneet mitään eroa näiden kahden eri ryhmien magneettisesti leimattuja soluja (katso täydentävä kuva S4). Tämä myös sulkee pois mahdolliset magneettiset lämmönnousua tapahtuu kierron aikana.

Keskustelu

vaarattomuudesta menetelmän

käyttö magneettisia nanohiukkasia ja vuorotellen magneettikenttien on yleisesti liittyvät lämmönnousua , prosessi, jossa värisevä nanohiukkasten sisällä solut tuottavat lämpöä, lopulta tappaa leimattu solujen läpi lämpötilan nousun. Tämän seurauksena, kyky kääntää soluihin sisäistämisen vastaavia magneettisia nanohiukkasia ja soveltaa pyörivän magneettikentän, eli vuorotellen kahteen suuntaan samanaikaisesti, aiheuttamatta vahinkoa solun on ollut ongelma, vaikka olemme käyttävät paljon pienempi kenttien kertaluokkaa, ja taajuuksien valikoimia muutamia kymmeniä Hz sijaan muutaman 100 kHz [31], [32].

ensimmäinen huolenaihe oli sitten varmistaa, että kierto itsessään ei tappanut soluja. Tuloksemme osoittavat, että solujen elävyys säilyy samalla kun ne pyörivät. Myös altistuminen (heikko) laser (jotta kaapata hajonta signaalin pyörivän solu) ei ole mitään vaikutusta lyhyellä aikavälillä solujen elinkykyä, kuten kuvassa 5b. Kuitenkin, kun läsnä on laser ei ole tarpeen, ja signaali voidaan analysoida myös kameran läpi, poistaa kaikki pitkään riski, että pitkäaikainen altistuminen lasersäteen voi aiheuttaa.

tulokset osoittavat myös, että sisäistämisen magneettinen nanohiukkasten ei aiheuta mitään vaikutusta solujen elinkykyä, ja se vaikuttaa vain solun jakautumisen vähentämällä kasvuvauhti lyhyeksi ajaksi, yli rajoitettu määrä – enintään 3 – solujen sykliä, ennen kuin tavanomainen. Todellakin, meidän magneettisesti merkityt solut on onnistuneesti alaviljellä petrimaljoille, ja havaitsimme eroa elinkelpoisuuden (ks Täydentäviä tietoja S1) tai leviämisen hinnat kolmen jako jaksoa (tuloksia ei ole esitetty). Yhtiön aiemmin julkaistujen tietojen [33], Huomasimme myös, että magneettisesti merkityt solut kasvoivat hitaammin kuin ei-leimatut solut, kunnes kolme jako jaksoa, josta kohta lähtien kasvu oli takaisin normaaliksi (ks Täydentäviä tietoja S1 ). Lisäksi, kuten edellä mainittiin, mukaan Arbab et ai. [30] läsnäolo solun sisäistetty magneettisia nanohiukkasia ei aiheuta haitallisia pitkäaikaisia ​​vaikutuksia solujen elävyys (aikana 5-7 jako sykliä, eli useita viikkoja).

Läsnäolo pyörivä magneettikenttä, ja indusoitu Saharan hertsin taajuus kierroksia indusoitiin magneettisesti merkittyjä soluja ei ole pitkän aikavälin vaikutuksia solunjakautumista, mikä näkyy meidän klonogeeniset määrityksen ja solupitoisuus, kun pyörivä soluja 24-72 tuntia.

Siksi olemme osoittaneet, että magnetorotation mitään solukuolemaa havaittiin oli seurausta tarkoituksella aiheuttaman myrkyllistä ympäristössä. Lisäksi odotamme, että koska solut eivät kuole seurauksena kierto, solujen kasvua, ja jopa kriittinen lepotilamuotoja tutkimukset voitaisiin suorittaa (työn alla). On syytä huomata, että solunjakautumisen on havaittu pyörimisen aikana (ks täydentävä video S3), ja pyörivä solut eivät näytä olevan erilainen jako verrattuna sellaisiin magneettisesti merkityt pyörimätön soluissa (katso Täydentäviä tietoja S1) Kaiken kaikkiaan ero kasvuvauhtiin pyörimisen aikana voidaan varmasti liittyy merkintöjä solujen nanohiukkasia, eikä vaikutusta kierto itse.

Tämä tutkimus esittelee merkittävä ero solujen elinkelpoisuus verrattuna esimerkiksi, että

cell elektro-kierto

menetelmä, joka käyttää cytolplasm epätasaisuus aiheuttaa sähköinen dipoli.