Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Kiertävä kasvainsolujen (CTC) voisi olla ei-invasiivisia lähde syöpä solut, joita käytetään pitkittäis- seurantaa kasvaimen mutaation asema koko sairauden kulun. Tavoitteet Esillä oli tutkia havaitsemiseen

KRAS

mutaatioita CTC alkaen Metastasoivassa kolorektaalisyövässä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) ja verrata mutaatiostatus hoidon aikana tai sairauden etenemisen kanssa vastaavan ensisijaisen kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

tunnistetiedot seitsemän yleisintä

KRAS

kodoneissa 12 ja 13 suoritettiin Peptide (PNA) -pohjaisen qPCR menetelmällä. Herkkyys määrityksessä määritettiin eristämisen jälkeen

KRAS

mutantti syöpäsolujen piikkeinä osaksi terveiden luovuttajien verta, käyttämällä CellSearch epiteelisolujen kit. Johdonmukainen havaitseminen

KRAS

mutaatiot saavutettiin näytteissä, jotka sisältävät vähintään 10 kasvainsolujen /7,5 ml verta.

Tulokset

kliininen hyöty, määritys arvioitiin 48 verinäytteet peräisin 31 potilasta metastasoituneen kolorektaalisyövän. Kaikilla potilailla oli

PIK3C

A ja

BRAF

villityypin ensisijainen kasvaimia ja 14

KRAS

mutantti kasvaimia. CTC havaittiin 65% näytteistä saatu 74%: lla potilaista.

KRAS

mutaatio analyysi CTC-rikastettua yksilöitä osoitti, että 45% ja 16,7% potilaista, joilla mutantin ja villityypin primaarikasvaimia vastaavasti oli havaittavissa mutaatiot niiden CTC. Arvioidessaan

KRAS

mutaatioiden sarja verinäytteitä paljasti, että potilaan CTC näytteillä eri mutaatiostatuksesta tilan

KRAS

hoidon aikana.

Johtopäätökset

Nykyinen havainnot tuki perustelut käyttämällä CTC dynaamisena lähteenä kasvainsolujen, arvioimalla uudelleen niiden

KRAS

mutaatiostatus, voisi ennustaa, ehkä tarkemmin, vaste metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaiden täsmähoitoihin.

Citation: Kalikaki A, Politaki H, Souglakos J, APOSTOLAKI S, Papadimitraki E, Georgoulia N, et al. (2014)

KRAS

genotyyppimuutoksia kiertävien kasvainsolujen aikana hoito metastasoituneen peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (8): e104902. doi: 10,1371 /journal.pone.0104902

Editor: Georgia Sotiropoulou, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 29 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2014; Julkaistu: 19 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Kalikaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat tutkimusmäärärahat päässä Kreetan Association for Biomedical Research (CABRin), Helleenien Society of Medical Oncology (HeSMO) ja Toimenpideohjelma ”Kilpailukyky Entrepreneurship”, kansallinen strateginen viitekehys 2007-2013, National Action: ”Yhteistyö”, OncoSeed Diagnostics: Biology of Liikkuva Syöpäsolut, etäpesäkkeiden Kehittäminen Liquid Biopsia Methods; Pääsihteeristölle Research and Technology Kreikassa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: apulaisprofessori John Souglakos toimii tällä hetkellä akateemisen toimittaja. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

välinen yhteys

KRAS

mutaatioiden ja vastaus EGFR: n estäjien on perustettu useita tutkimuksia; Näin ollen,

KRAS

genotyypityksen suositellaan kaikille potilaille, joilla metastasoitunut kolorektaalisyöpä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) ennen hoitoa, joka hyödyntää EGFR kohdistetun monoklonaalisia vasta-aineita, setuksimabi tai panitumumabi [1]. Kuitenkin, etteivät kaikki potilaat, joilla

KRAS

villityypin kasvaimia vastata EGFR-kohdistettuja hoitomuotoja ja suurin osa aluksi vastaavista potilaista sairaus eteni sisällä 5-6 kuukautta [2].

Koska useimmat tutkimukset on tehty käyttäen kudosta saatu primaarikasvaimen taas EGFR monoklonaalisia vasta-aineita on käytetty hoitoon etäpesäkkeitä, on mahdollista, että tehon puuttumisesta ja /tai syntyminen myöhemmin vastus voi johtua geneettisestä monipuolistaminen metastaattinen solut verrattuna niiden primäärikasvain vastineet tai dynaamisia vaihteluita kasvaimen perimän tai ilmiasun ilmeneviin hoidon.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet ristiriitaisia ​​mutaatiostatus välillä ensisijainen kasvaimia ja vastaavia etäpesäke osuutena (5% -30% ) CRC-potilailla [3], [4], [5], [6]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että hankittu resistenssi on osittain saavutettu valinnan ennestään vähäinen osa-kloonien mutaatioita resistenssin EGFR hoitoa [7], [8]. Koska invasiivisia koepaloja metastaasien ei voida aina toteuttaa eikä sitä voida helposti suorittaa toistuvasti, verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) perifeerisessä veressä syöpäpotilaita, joiden ajatellaan välittävän hematogenous tautien leviäminen kaukaisiin sivustoja, voi vaihtoehtoisena of metastasizing syöpäsoluja.

on hyvin dokumentoitu, että CTC määrittelemän FDA-hyväksytty CellSearch System, voisi toimia merkkinä mikrometastaattisessa kasvaimeen aiheutuvan kuorman potilaiden ennustetta ja voi ennustaa tehokkuutta hoidon metastaattisen rintasyövän, peräsuolen, eturauhasen ja keuhkosyöpä [9], [10], [11], [12]. Aiemmat tutkimukset metastasoitunut kolorektaalisyöpä ehdotti, että absoluuttinen määrä ja numeerinen muunnelmia CTC aikana taudin etenemisen tai terapia voi antaa arvokasta tietoa kliiniseen tulokseen ja tehoa annettiin hoitojen [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Kuitenkin, CTC ei aina voida tunnistaa Metastasoitunutta potilailla, korostetaan tarvetta kehittää herkempi ja syöpä tyyppikohtaisia ​​CTC detektiomäärityksiä [19]. Tässä yhteydessä tunnistaminen onkogeenisten mutaatioiden CTC voi osaltaan parantaa nykyisiä analyysimenetelmiä. Lisäksi genotyypitys CTC voisi parantaa valvontaa vastaus kohdennettuja hoitoja tunnistamalla genomista profiileja ennustava taudin uusiutumisen ennen kliinisen taudin etenemiseen [20], [21], [22], [23], [24].

tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, onko mahdollista havaita

KRAS

mutaatioita CTC fraktiolla potilailla metastasoituneen kolorektaalisyövän. Muita tavoitteita oli arvioida, onko

KRAS

mutaatio aseman CTC korreloi että vastaavien primaarikasvaimia ja tutkia geneettinen heterogeenisyys CTC suhteen

KRAS

mutaatiostatus hoidon aikana.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Kolmekymmentäyksi Metastasoivassa kolorektaalisyövän otettiin nykyisessä tutkimuksessa. Kaikkien potilaiden, diagnoosi vahvistettiin histologista tutkimusta primaarikasvaimen ennen aloittamista tahansa systeemisen hoidon. Kaikki paitsi yksi potilas hoidettiin 5-FU-pohjainen ensilinjan yhdistelmä kemoterapian kanssa tai ilman biologisen tekijän (bevasitsumabi tai Panitumumabilla). Yhdeksäntoista (55%) potilaista sai irinotekaania sisältävien yhdistelmä ja 11 (37%) oksaliplatiiniannokselle perustuva hoito-ensilinjan valinta (yksi potilas ei saanut mitään hoitoa). Lisäksi 25 (83%) potilasta sai bevasitsumabi ja kaksi (7%) panitumumabin. Tuolloin analyysin 19 potilaista taudin eteneminen on ensilinjan hoitona ja 12 heistä hoidettiin toisen linjan kemoterapiahoidon; viisi Näistä 12 potilasta sai Panitumumabilla yhdistettynä kemoterapia.

Perifeerisen veren analysoitiin läsnäolon CTC ennen aloittamista ensilinjan hoitoon 12 potilasta, aikaan edennyt ensilinjan kohtelu 9 ja milloin tahansa hoidon aikana 18 potilaalla.

Kaikki potilaat sekä 16 tervettä verenluovuttajia, joilla ei ollut tiedossa sairaus eikä ollut pahanlaatuinen sairaus, testattiin läsnäolon CTC käyttämällä CellSearch epiteelisolujen Kit (Veridex LLC). Perifeerisen veren saatiin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaista (7,5 ml) ja terveiltä luovuttajilta (23 ml, käytettäväksi tippakokeilla) laskimosta erityisissä CellSave putket; jotta vältetään saastuminen näytteiden kanssa epiteelisolujen ensimmäiset 5 ml verta heitettiin pois. Kaikki testit suoritettiin 72 tunnin kuluessa veren piirtää mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut, jotka olivat CK (+) /CD45 (-) ja oli DAPI-positiivinen solunsisäiset tuma luonnehdittiin CTC kokeneet biologien (EP ja SA).

Koska tämä tutkimus oli pilotti toteutettavuustutkimus oli ei tilastollisesti otoskoko arviointi ja näytteenotosta perustui saatavuuteen CellSearch patruunoita.

Ethics selvitys

Kaikki potilaat antoivat kirjallinen lupa osallistua tutkimukseen, joka on hyväksynyt etiikka ja tiedekomiteat yliopiston Heraklionin yleinen sairaala, Kreeta, Kreikka; käsikirjoitus oli laadittu REMARK kriteerien [25].

Solulinjat

Syöpä solulinjoissa kätkeminen

KRAS

mutaatioita [LS174T, ihmisen paksusuolen adenokarsinooma, c.35G A (p.G12D); HCT116, Human paksusuolen adenokarsinooma, c.38G A (p.G13D); HUP-T3, Human haiman adenokarsinooma, c.34G C (p.G12R); KYSE410, Human ruokatorven okasolusyöpä, c.34G T (p.G12C); A549, Human keuhkorakkuloiden adenokarsinooma, c.34G A (p.G12S); SW403, Human paksusuolen adenokarsinooma, c.35G T (p.G12V) ja RPMI8226, Ihmisen myelooma-, c.35G C (p.G12A)] tai villityypin varten

KRAS

(HT-29, Human paksusuolen adenokarsinooma)] peräisin American Type Culture Collection (ATCC, USA) ja ystävällisesti tarjoamia Prof. A. Jung (Institute of Pathology, Ludwig-Maximilian-yliopisto, München, Saksa). Kaikkia solulinjoja viljeltiin pulloissa mukaan toimittajan suositusten ennen seuraavien sadonkorjuuta käyttämällä 0,25% trypsiiniä ja 5 mmol /l EDTA: a (GIBCO-BRL). Authentication tehtiin määrittämällä

KRAS

mutaatiostatuksesta tilan kunkin solulinjan Sangerin sekvensoinnilla. Kaikki solulinjat paitsi SW403 oli heterotsygoottinen

KRAS

mutaatioita ja paljasti odotetun genotyypin.

DNA erillään CTC-fraktiolla ja kudosten

jälkeen CTC laskennan vangitut solut siirrettiin kammiosta 2 ml: n putkeen ja altistettiin proteinaasi K -digestiolla 65 ° C: ssa 2-5 tuntia; DNA eristäminen suoritettiin käyttäen Epicentre MasterPure Täydellinen DNA RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden ja uutettu DNA kvantitoitiin käyttäen NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, USA) ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. Keskituotos DNA ~1.5 ug; kuitenkin, DNA: n kvantifiointiin UV-spektroskopialla ei ole täsmällinen, koska havaitseminen yksijuosteista DNA, vapaa nukleotidia tai RNA näytteessä.

Formaliinifiksoidusta parafinoidut (FFPE) primaarikasvaimen-kudos arvioitiin histologisesti patologi (MT) ja mikro-leikkelyn suoritettiin lisätä prosenttiosuus syöpäsoluja. Kolme 5 um kudosleikkeet deparaffinised mukaan ksyleeniä ja etanolin pesee ja alistettiin proteinaasi K digestio yön yli 56 ° C: ssa DNA puhdistettiin sitten käyttäen QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Saksa).

Mutaatio analyysi ensisijainen kasvaimet

suostumuksensa potilailla, primaarikasvainten arvioitiin mutaatioiden

KRAS

,

PIK3CA

ja

BRAF

sekä Sangerin sekvensoinnilla ja menetelmiä suurella herkkyydellä kuten aiemmin on kuvattu [26].

KRAS

mutaatiokokeessa

mutaatiokokeessa että yhdistetty peptidi (PNA) -välitteisen PCR puristin kanssa TaqMan-MGB alleelinen syrjintää määrityksiä on aiemmin kehitetty tunnistamaan seitsemän yhteistä

KRAS

mutaatioita [6] kantavassa lämpöolosuhteissa PNA välittämien PCR kiinnittämällä kunkin seitsemän

KRAS

mutantti malleja ovat edelleen optimoitu käyttämällä PNA on leimattu fluoresoivalla värillä, koska sekä anturin ja PCR mukaisen pidikkeen Luo JD et ai [27]. Suurin selektiivisyys eli korkea Ct arvon villityypin koetin ja alhainen Ct arvo mutantti koetin saavutettiin 62 ° C: ssa 200 nM PNA varten c.35G A (p.G12D), c.38G (p.G13D) ja c.35G T (p.G12V) ja 150 nM PNA varten c.34G C (p.G12R), c.34G T (p.G12C), c.34G A ( p.G12S) ja c.35G C (p.G12A)

KRAS

mutantti malleja vastaavasti. Reaktiot suoritettiin Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System 384-kuoppalevyille kokonaistilavuudessa 5 ui, joka sisälsi 2 ui (noin 1/8 koko uutettu DNA: CTC-rikastettu näytteet ja 20 ng uutettu DNA FFPEs ) DNA, 2,5 ui 2X TaqMan genotyypin master mix (Applied Biosystems, USA), 0,25 ui genotyypitysmääritys sekoitetaan ja 150 tai 200 nm: n PNA; rinnakkain, ei-PNA-clamp-reaktio suoritettiin. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, jonka jälkeen kaksivaiheista pyöräily: 50 sykliä 92 ° C: ssa 15 s, ja 62 ° C: ssa 90 s. Kaikki näytteet ajettiin ainakin kaksoiskappaleet. Ct-arvoja saatiin välineen reaaliaikainen PCR tiedonkeruun ohjelmistoja käyttämällä 0,2 manuaalista kynnys. Positiivinen kontrolli jokaiselle

KRAS

mutaatio (malli näytteiden koostuu seoksia solulinjojen mutatoitunut /villityypin suhteet 1/100 ja 1/500) ja negatiivinen kontrolli (

KRAS

villityypin solulinja) yhteensä tuloon 50 ng sisällytettiin kussakin ajossa.

ACt = Ct

mut anturi (+ PNA) – Ct

p koetin (-PNA) arvo laskettiin jokaiselle näyte; Ct

mut anturi (+ PNA) ja Ct

p koetin (-PNA) merkitään Ct (syklin kynnys ct, kutsutaan kuin syklin numero, josta signaali havaitaan yli taustan fluoresenssi) arvot mutantti ja p- antureista reaktioiden kanssa ja ilman PNA, vastaavasti. Ct

mut koetin (+ PNA) heijastaa määrä

KRAS

mutantti-DNA-näytteessä, kun taas Ct

paino- koetin (-PNA) heijastaa määrä monistettavan templaatin johdettu vaihteleva määrä kontaminoivista leukosyyttien CTC osa [28].

Pitoisuus voimassaolo

voimassaolo määrityksen tuloksen jokaisesta näytteestä määritettiin Ct

p koetin (-PNA) arvo, joka olisi 24≤Ct

p koetin (-PNA) 32; jos Ct

p koetin (-PNA) näytteessä on suurempi kuin 32, määritys tulos ei ole luotettava, koska pienikin määrä DNA: n tai epäonnistunut tavoite vahvistusta. Tehokas PCR PNA kiristys varmistettiin Ct

wtprobe (+ PNA) arvo 45.

KRAS

mutaatiostatus määritettiin vertaamalla ACt arvojen aiemmin määritellyt ACt raja-arvot kunkin seitsemän yleisempää

KRAS

mutaatioita. Cutoff-arvot kullekin mutaatio koe on määritetty analyysistä 16 terveen luovuttajan verinäytteistä seuraava CellSearch analyysi. Koska raja-arvo määriteltiin ACt vastaa suurinta spesifisyys; eli mutaatio ei havaita 100% (16/16) terveiden luovuttajien (taulukko 1, kuvio 1).

Kuvaajat osoitti ACt-arvoja (

y

akseli) CTC- rikastettu näytteet (

x

akseli) metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden (n = 31), terveiden yksilöiden (n = 16) ja malli näytteitä piikkeinä 100 ja 10 solua solulinjoista (LS174T, SW403, KYSE410 ja HCT116) kätkeminen hotspot

KRAS

mutaatioita c.35G A; p.G12D (A), c.35G T; p.G12V (B), c.38G A; p.G13D (C) ja c.34G T; p.G12C (D). Sulku kynnys edustaa piste-linja; näytteeksi, joista ACt kynnyksen alapuolella pidetään mutantti; ACt = Ct

mut anturi (+ PNA) – Ct

p koetin (-PNA); NVD, ei muunnos havaita.

Analyyttinen spesifisyys ja herkkyys

analyyttinen spesifisyys seitsemästä määritysten erikseen arvioitiin käyttämällä genomista DNA (gDNA) eristetty

KRAS

villityypin solulinjan (HT29) tai positiivisia erityisistä

KRAS

mutaatioita; alaraja havaitsemisen kaikkiin määrityksiin oli 0,015 ng. Arvioida analyyttisen herkkyyden, kunkin seitsemän

KRAS

mutantin solulinjan gDNA laimennettiin sarjoittain laajalla kolme eri pitoisuuksina (100 ng, 50 ng ja 20 ng) villityypin gDNA antamat HT 29-solulinja saatiin mutaation /villityypin suhde 100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ja 0%. Kaikki määritykset on herkkyys 0,1%, pitäen koko panos vakiona 20 ng, paitsi määrityksissä havaitsemiseksi p.G13D ja p.G12V, että herkkyys on 0,5% (taulukko 1).

ristireaktiivisuus

ristireagoivuus suoritettiin kaikille mutaation määrityksiä, jotka mahdollisesti tunnistaa toisen määrityksen malliin johtuen epätäydellisestä emäspariutumisvuorovaikutusten ja lukea läpi. Tulokset osoittavat, että G12D määritys osoittaa merkittäviä ristireaktiivisuutta kanssa G12V ja G12A mutantti malleja, The G13D määrityksessä G12S mutantti mallia, G12R määrityksessä G12C ja G12S mutantti malleja ja G12C määrityksessä G12S mutantti malli (taulukko 2).

sisäiset ja määritysten välinen tarkkuus

määrityksen sisäinen tarkkuus on arvioitu analysoimalla mallin näytteitä suoritettiin kolminkertaisina samassa kokeessa käyttäen sarjalaimennokselle (100%, 50%, 10%, 2%, 1%, 0,5% ja 0,1%) on

KRAS

mutantti-DNA: iden, kuten edellä mainittiin, 20 ng tausta

KRAS

villityypin DNA: ta. ACt variaatiokertoimet

KRAS

mutatoitunut DNA vaihteli 0,3% ja 2,5%. Määritysten välinen toistettavuus on samalla mitataan laskemalla ACt variaatiokertoimet kolmesta näytteestä ajaa eri päivinä käyttäen samaa sarjalaimennoksia mutatoidun DNA: ta. ACt variaatiokertoimet

KRAS

mutatoitunut DNA vaihteli 0,4% ja 2,5%. Lisäksi malli näytteitä mutatoitunut /villityypin suhde 0,5%, yleinen mutaatio koe vika oli 0%.

Tulokset

mutaatiokokeessa optimointi

herkkyys kokeellinen lähestymistapa määrätä täsmällisesti

KRAS

mutaatiostatusta rajoitettu määrä CTC läsnä joukossa normaaleja verisoluja verenkierrossa validoitiin piikittämällä

KRAS

mutantti syöpäsolujen vereen terveiden luovuttajien . Noin 100 ja 10 kasvaimen solut oli lisätty 7,5 ml verta CellSave putkiin ja analysoitiin CellSearch 2 päivän sisällä, vähintään 3 itsenäisen kokeen. Keskimääräinen prosentuaalinen saanto varten 100 ja 10 piikki solua [LS174T, c.35G A (p.G12D), n = 5 kokeet; HCT116, c.38G A (p.G13D), n = 4 kokeet; SW403, c.35G T (p.G12V), n = 4 kokeiluja ja KYSE410, c.34G T (p.G12C), n = 3 kokeita] oli 95% (vaihteluväli 70% -100%) ja 92,5 % (vaihteluväli 25% -130%), tässä järjestyksessä. Laaja valikoima hyödyntämistä voidaan katsoa johtuvan virhe liittyy piikki-alhaisen määrän soluja. Seuraavat CTC luettelointi, jonka CellSearch Epithelial Cell kit, DNA uutettiin jää solut ja näytteet analysoitiin seitsemän

KRAS

mutaatioita. Tällä kokeella,

KRAS

mutaatioita voidaan jatkuvasti tunnistaa 10 piikki kasvainsoluja.

Potilaiden ominaisuudet ja arviointi CTC

Potilaan demografiset, kliiniset ja patologiset ominaisuudet on lueteltu taulukossa 3.

KRAS

mutaatioita tunnistettiin primäärikasvaimissa 45%: lla potilaista; kahdeksan (57%) potilaalla ”primaarisen kasvaimen kanna c.35G A (p.G12D) mutaatio, kolme (21%: lla) c.35G T (p.G12V), yksi (7%: lla) c.38G A (p.G13D), yksi (7%: lla) c.34G T (p.G12C) ja yksi (7%: lla) c.35G C (p.G12A). Kaikki kasvaimet olivat

PIK3CA

ja

BRAF

villityypin. Mediaani aika välillä kirurginen resektio primaarikasvaimen ja analysointi CTC oli 6 kuukautta (vaihteluväli 1-134).

Yhteensä 48 verinäytteitä saatiin 31 potilasta CTC luettelointi käyttäen CellSearch ( Taulukko 4). Kaksitoista (39%) potilaista oli kemoterapiaa saamattomien aikaan ensimmäisen verta piirtää. Kaksitoista (71%) ja 11 (79%) potilailla, joilla on

KRAS

villityypin ja mutantti primaaristen kasvainten, vastaavasti, oli havaittavissa CTC; mediaani 9 (vaihteluväli 2-660) ja 7 (vaihteluväli 1-865) CTC havaittiin potilailla, joilla oli

KRAS

villityypin ja mutantti primaarikasvaimia, vastaavasti. Yhteensä 1 tai enemmän CTC voitiin havaita 31 (65%) verinäytteet saadaan 23 (74%) potilaista (taulukko 4).

KRAS

mutaatio analyysi Kodoneissa 12 ja 13 suoritettiin kaikissa yksilöt havaittavissa CTC (kuva 1).

KRAS

mutaatioita potilaiden CTC-rikastettu näytteiden

KRAS

mutaatioiden voitaisiin yksilöity CTC viidestä (45%) potilaista, joiden ensisijainen kasvaimet olivat mutatoitunut

KRAS

. Erityisesti ennen aloittamista 1

st linjan kemoterapia vain kaksi kuudesta kemoterapiaa saamattomien potilaiden (# 1 ja # 5) kanna CTC kanssa havaittavissa mutaatioita samalla aikaan sairauden etenemisen mutaatiot voidaan tunnistaa yhdellä (# 8) kaksi potilasta; mutaatiot olivat myös havaittavissa aikana seuranta 1

st hoitona kahdella potilaalla (# 6 ja # 10) (taulukko 4).

KRAS

mutaatioita voidaan myös tunnistaa että CTC kahden (17%) potilaalla (# 15 ja # 16), joiden ensisijaisena kasvaimia, ei ollut havaittavissa mutaatioita; sekä potilaiden, CTC kerättiin aikana seuranta 1. rivi kemoterapiaa (taulukko 4).

KRAS

mutaatiostatuksesta tilan CTC sarjaan verinäytteistä

neljä sarja verinäytteitä potilaan # 1 oli havaittavissa CTC;

KRAS

mutaatioita dokumentoitiin vielä annon jälkeen ensimmäisen hoitojakson huolimatta merkittävän alenemisen määrän CTC; lääkityksen jatkamista (jälkeen 3

rd sykli) johti edelleen lasku CTC numeron ja huomaamaton

KRAS

mutaatioita CTC-rikastettua yksilöitä, kun taas arviointi hoitovasteen paljasti osittainen vaste; jälkeen 8

th solunsalpaajasykliä määrä CTC nostettiin ja

KRAS

mutaatioita voitiin havaita uudelleen, kun potilas vielä jäi osittainen vaste (taulukko 4).

potilaalla # 15, joka oli

KRAS

villityypin primaarikasvaimen, ei

KRAS

mutaatioita voitiin havaita CTC-rikastettu näyte, kun potilas oli osittainen vaste ja hoidon aikana huolto Panitumumabilla; kuitenkin 4 kuukauden kuluttua hoidon aikaan taudin etenemisen, minkä osoittivat radiologista pahenemista maksan vaurioiden ja kliininen ulkonäkö askites määrä CTC nostettiin ja

KRAS

mutaatioita pystytty määrittelemään CTC suhteen väkevöityä solufraktio.

KRAS

mutaatiot olivat edelleen havaittavissa jälkeen 2

toinen sykli pelastaa kemoterapiaa vähenemisestä huolimatta CTC numero (taulukko 4).

Keskustelu

Mutaatiot

KRAS

tuloksen konstitutiivisen aktivoitumisen RAS /MAPK-reitin ja ennustaa puute vastaus anti-EGFR monoklonaalisia vasta-aineita. Tähän mennessä hoitopäätöksiä perustuu pääosin

KRAS

mutaatiostatus primaarikasvaimen; kuitenkin, geneettisiä muutoksia aikana esiintyvä taudin etenemistä ja kehittynyt resistenssi hoito voi muuttaa kasvaimen biologiaan. Näin ollen, on tärkeä kysymys koskee mahdollisuutta käyttää CTC ei-invasiivisen vaihtoehdon uuden koepala, joka voisi olla tyypillinen nykyisen biologisesta tilasta kasvainsolujen ja sitä voidaan käyttää biomarkkerina joko herkkyys tai hankittu resistenssi EGFR: ään kohdennettuja terapia.

tulokset nykyisen tutkimuksen osoittavat selvästi toteutettavuutta määrittää

KRAS

mutaatiostatusta CTC-rikastettu verinäytteet yhteydessä rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä seuraavat CTC luettelointi jonka CellSearch järjestelmään. Esitetyt tiedot tukevat vahvasti hypoteesia, että CTC voi edustaa reaaliaikaista lähde nesteen koepala joka voi mahdollistaa dynaamisen genotyypin kasvainsolujen hoidon aikana. Tiedot osoittavat myös, että vahvistettu määritys tarjoaa havaitsemisen herkkyys on noin 10 mutatoitunut solua /7,5 ml verta, ilman tarvetta koko genomin monistamisen, ja tarjoaa mahdollisuuden ei-invasiivisia, nopea ja edullinen sarja seuranta

KRAS

mutaatiostatusta kodoneissa 12 ja 13 aikana hoidon.

KRAS

mutaatioita tunnistettiin myös kliinisistä näytteistä, jotka sisältävät niinkin alhainen kuin 3 CTC /7,5 ml veri; emme voi sulkea pois, että tämä voi johtua läsnäolosta

KRAS

mutaatiot CTC fragmentteja, joita ei pidetä todellisina CTC aikana dokumentointi ja luettelointi CTC jonka CellSearch järjestelmän ja /tai solun vapaa DNA (cfDNA) adsorboitunut pinnalle kontaminoivien leukosyyttien [29]. On huomata, että ennen tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä CTC ja CTC fragmenttien korreloivat hoitotuloksia eturauhassyövässä [30].

Huolimatta pienen otoksen koosta ja heterogeeninen potilasryhmää analysoitiin tässä tutkimuksessa antaa näyttöä, että

KRAS

mutaatio asema CTC voivat olennaisesti erota vastaavasta primaarikasvaimen. CTC ilman havaittavaa

KRAS

mutaatiot saatiin kuusi 11 potilaalla on mutantti primaarikasvaimia; Tämä voitaisiin selittää sisäisten kasvainten heterogeenisuus ja /tai rikastamisen vähäinen ennestään kloonien lisääntynyt metastaattinen potentiaali aikana taudin etenemistä. Kuitenkin kolme kuudesta ristiriitainen tapauksissa resektio ja tarkastus primaarikasvaimen varten

KRAS

mutaatiot tehtiin vain yksi kuukausi ennen analyysiä CTC (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa mahdollisesti malli rinnakkaisen evoluution primaarikasvaimen ja etäpesäkkeiden. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatio aseman CTC ei aina vastaa sitä vastaavan etäpesäkkeiden [31]; Näin ollen vertailu on

KRAS

mutaatiostatus primaarituumorin, vastaavat etäpesäkkeitä ja sarja- CTC-rikastettu verinäytteitä saattaa valaista alkuperä etäpesäkkeitä.

Vaikka olosuhteet ja korko genotyyppi muuntaminen ei ymmärretä hyvin, nykyinen tutkimus osoittaa, että CTC eri mutaation tila voi ilmaantua hoidon samalla potilaalla (potilasta # 1 ja # 15). Itse asiassa se voidaan arveltu, että hoito, kanssa tai ilman kohdennettua aineita, poistamalla joitakin kemoterapiaa herkkien kloonien voi sallia syntyminen muiden matalan taajuuden klooneja, jotka poikkeavat hallitseva tuumorisolut nähden mutaatio aseman. Tämä hypoteesi esittävät vahvasti läsnä

KRAS

mutaatioiden CTC kahden pois 12 potilailla, joilla on

KRAS

villityypin ensisijainen kasvaimia, joita hoidettiin hoito sisältää panitumumabipitoisuus tai bevasitsumabin (potilaat # 15 ja # 16). Kuitenkin epäonnistuminen havaita mutaatioita CTC-rikastettu näytteet voitaisiin myös katsoa johtuvan alhaisen taajuuden CTC mutaatioita sekä menetelmiin liittyvät rajoitukset; FDA hyväksyi CellSearch epiteelisolujen Kit, joka on raportoitu olevan huonompi CellSearch epiteelisolujen Profiili kit kannalta CTC ”molekulaarinen [32]. Kuitenkin on osoitettu, että CTC otettuja CellSearch Epithelial Cell Kit voidaan onnistuneesti analysoida seuraavan sukupolven sekvensointi menetelmiä [33]. Lisäksi alapopulaatio CTC ei voitu havaita CellSearch riittämättömän ilmentymisen EpCAM ja /tai sytokeratiineja; kuitenkin tuoreessa tutkimuksessa vuonna SCLC osoitti, että CTC, ilmentävät EpCAM, taltioinut CellSearch järjestelmä voi muodostaa kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä [34].

Aiemmat tutkimukset ovat käyttäneet eri menetelmiä, jotta voidaan eristää ja molekyylibiologian menetelmiä CTC. Metastasoituneen rintasyövän ja eturauhassyövän, genomista profilointi CTC eristää immunomagneettisen rikastamiseen ja fluoresenssi solulajittelun paljasti uuden genomista muuttuu aikana esiintyvä taudin eteneminen [35], [36]. Käyttämällä mikrofluidistinen CTC kaappauslaitetta,

TMPRSS2-ERG

fuusiota TKI herkistävä

EGFR

aktivoivia mutaatioita ja

EGFR

T790M TKI-mutaatio havaittiin CTC alkaen potilailla, joilla on eturauhasen ja keuhkosyöpää etäpesäkkeitä vastaavasti, kun taas mutaatiot

AR

,

KRAS

ja

BRAF

geenit on tunnistettu CTC-rikastettu näytteistä eristettyjen eturauhasen ja metastasoituneen kolorektaalisyövän lla, käyttäen CellSearch Profiili Kit [24], [37], [38], [39]. Genotyypitys single CTC eristämä CellSearch tai IsoFlux järjestelmä potilailla metastasoituneen kolorektaalisyövän vahvisti sisäistä ja kansainvälistä potilaan heterogeenisyys perustuu

PIK3CA

ja

KRAS

mutaatiostatus [22], [ ,,,0],31]; Lisäksi erilaiset geneettiset muutokset yksittäisistä CTC on jo raportoitu potilailla, joilla on rinta- ja ruokatorven syöpä [23], [40].

Aiemmat raportit ehdotti välisen yhteyden läsnäolo CTC ja solun vapaa DNA (cfDNA ) seerumista tai plasmasta syöpäpotilaiden [41].

KRAS

mutaatioita havaittiin potilaiden seerumissa metastasoituneen kolorektaalisyövän on ehdotettu seurata hoitovasteen ennen kliinistä ilmenemistä sairauden etenemisen taas pienisoluista keuhkosyöpää on raportoitu hyvin herkkiä EGFR-mutaatio havaitsemiseksi cfDNA kuin CTC [7], [8], [42]. Kuitenkin, alkuperä cfDNA ei ymmärretä hyvin, koska se voidaan saada apoptoottisten kasvainsolujen apoptoottisen leukosyyttien tuottama sytotoksisen hoidon sekä eksosomeiksi tai CTC vapautuu kasvainsolujen verenkiertoon. Vaikka eristäminen ja analysointi cfDNA on yksinkertaisempaa ja toistettavissa kuin eristämällä ja genotyyppi CTC, molekyyli luonnehdinta CTC sen lisäksi, että hyödyllisiä valvonnassa hoidon epäonnistuminen tai taudin uusiutumisen voi myös antaa tietoja, jotka ohjaavat optimaalisen hoidon valinnan ja /tai uudenlaisten hoitoja.

Johtopäätöksenä esitetyt tiedot kuvaavat yksinkertaista menetelmää, joka perustuu päivittäiseen käyttöön CellSearch alustan tunnistamiseksi

KRAS

mutaatiostatuksesta tilan CTC potilailta, joilla metastasoitunut kolorektaalisyöpä ja tarjota perusteluna harkitsee uudelleen arviointi

KRAS

mutaatiostatuksesta asema CTC jotta voidaan paremmin ennustaa vaste anti-EGFR hoitoa.