Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) on tunnustettu merkittävästi osallisena eturauhassyövän (PCA). Koska androgeenireseptorin (AR) on keskeinen rooli PCA karsinogeneesin ja etenemistä, on välttämätöntä järjestelmällisesti valaista syy-yhteydestä AR ja miRNA keskittyen molekyylitason mekanismeja, joilla miRNA välittävät AR signalointi. Tässä tutkimuksessa, teimme sarjan aika-kurssi mikrosirut tarkkailla dynaamista genominlaajuisten ilmauksia mRNA: iden ja miRNA rinnan hormoniherkän eturauhassyöpä LNCaP kannustanut androgen. Niinpä otimme käyttöön Response Pisteet tunnistaa AR kohde miRNA sekä Modulation Pisteet tunnistaa miRNA kohde-mRNA: iden. Teoreettisesti tunnistamista ja kokeellinen validointi, uusia mekanismeja käsitellään solujen elinkelpoisuus PCA oli unraveled 3 miRNA hiljattain tunnustettu AR tavoitteita. (1) miR-19a on suoraan säädelty AR, ja tukahduttaa SUZ12, RAB13, SC4MOL, PSAP ja ABCA1, vastaavasti. (2) miR-27a on suoraan säädelty AR, ja tukahduttaa ABCA1 ja PDS5B. (3) miR-133b on suoraan säädelty AR, ja tukahduttaa CDC2L5, PTPRK, RB1CC1, ja CPNE3, vastaavasti. Lisäksi löysimme miR-133b on välttämätöntä PCa solujen eloonjäämistä. Tutkimuksemme antaa tiettyjä vihjeitä miRNA välittämän AR signalointi solujen elinkelpoisuuden vaikuttamalla kriittinen reittejä, erityisesti heilahti androgeenien kasvun rajoittaminen vaikutusta normaalin eturauhasen kudosta.

Citation: Mo W, Zhang J, Li X, Meng D Gao Y, Yang S, et al. (2013) tunnistaminen Novel AR-Kohdennettu MikroRNA välittävien Androgeenien Signalling läpi kriittiset polut Säädellä elinkykyyn eturauhassyövässä. PLoS ONE 8 (2): e56592. doi: 10,1371 /journal.pone.0056592

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 07 syyskuu 2012; Hyväksytty: 11 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Mo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat osittain kaksi avustusta 31071142 ja 31171246 National Natural Science Foundation of China, ja Shanghai Key Laboratory of Intelligent Information Processing of China (nro IIPL-2010-002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat 20~24 nt endogeenisiä proteiineja nonencoding RNA: t, ja niistä on tullut tärkeä luokan säätelymolekyyleja mukana nisäkäs alkion kehitykseen synnyssä [1]. Viime aikoina yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA pelata vahvoja rooleja eturauhassyöpä (PCA) aloittaminen, eteneminen ja etäpesäkkeiden [1], [2], [3]. Eturauhasen on riippuvainen androgeenien kasvuun ja kehitykseen, sillä välin sen normaalia kudosta ohjataan tiettyjen kasvu rajoittamismekanismeja välttää androgeenin indusoiman over-kasvua, on välttämätöntä paljastaa kuinka androgeenireseptorin (AR) välittää nämä toimet ja murtaa kasvun rajoittaminen ohjaamiseen PCa syövän synnyn. Niinpä yritimme systemaattisesti tunnistaa miRNA että kuroa tapoja valmistaa AR stimulaatiota solujen fenotyyppisen vaikutuksen PCA.

Tällä hetkellä useita raportteja tunnistettu miRNA AR signalointia eturauhasen syöpä [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. miR-21 oli suoraan ylös-säädellään AR androgeeni-reagoiva PCa soluissa [6], koska AR sitova määritelty promoottori. J. Ribas et al. lisäksi havainneet inhibitio miR-21 voi vähentää androgeenin indusoiman PCa soluproliferaation, ja miR-21 oli riittävä androgeeniriippuvaisissa kasvainten voittamiseksi kastraatio aiheuttama kasvun pysähtymisen [6]. miR-125b oli suoraan kannustanut AR, ja edistänyt androgeenista riippumaton PCa kasvua tukahduttaa ilmaus BAK1 josta säännellään apoptoottinen signalointi PCA [7]. J. Ribas et al. [6] suoritetaan microarray-analyysi miRNA ilmentymistä kahdessa androgeeniriippuvaisissa PCa solulinjojen LNCaP ja LAPC-4 löytää AR-säännelty tavoite miRNA. Kuitenkin, se ei voi selvästi erottaa suorat ja epäsuorat tavoitteet AR koska miRNA ilmentymisprofiilin saatiin 72 tunnin kuluttua androgeenistimulaation. Äskettäin, K. Takayama et ai. On suoritettu genomin laajuinen seulonta AR kohdegeenien integroimalla HÄKIN ja siru-siru analyysi tunnistaa AR sitoutumiskohtiin (ARBSs) ihmisen perimässä LNCaP-soluissa [4]. Ne määritellään genominlaajuisten ARBSs on 100 kb läheisyydessä miRNA geenejä. Perustuen kromosomissa sitova, K. Takayama et al. tiedot hyödyllisiä selvittämiseksi miRNA-välitteisen AR signalointia verkkoon. Mukaan kuitenkin erityiset biologiset olosuhteet, ei kaikki tavoitteet tunnistetaan chip siru analyysi ovat todellisia tavoitteita AR; joukossa kaikki AR kohdistetun miRNA, kriittinen miRNA edistää AR signalointi, ei saa selville vain kromosomi-sitova analyysi.

Toisaalta, tutkia miten miRNA välittää AR signalointi, on tarpeen tunnistamaan miRNA tavoite mRNA: iden. Seed-sekvenssi-pohjainen ennusteet miRNA kohde, kuten TargetScanS, Miranda ja miRDB tietokannat, tarpeelliset informatiivinen vihjeitä; soveltaa näitä ennustuksen tietokannan erityistilanteessa voidaan tunnistaa miRNA todelliset tavoitteet. Useimmissa tapauksissa eläimille, vaikka miRNA ja kohde-mRNA: eivät ole täysin base-sovitettu, miRNA voi silti aiheuttaa kohde-mRNA: n hajoamisen kautta eksonukleaasien tai P-body [8]. Nimittäin ilmaisua muutos kohde-mRNA voi heijastaa pääasiassa miRNA: n sääntelyä. Siksi on ihanteellinen samanaikaisesti tarkkailla ilmaisuja sekä miRNA ja mRNA: t on aika-sarjan tavalla voidakseen tehokkaasti tunnistaa miRNA: n asetus tavoite kudosspesifisellä yhteydessä. Äskettäin V. Jayaswal et ai. [9] ovat tarjonneet dynaamista dataa samanaikaisesti tarkkailla miRNA ja mRNA ilmaisuja myelooma U266. Perustuen sovitetun miRNA-mRNA aika-kurssi data, ne lasketaan kertoimet tilastollinen [9] kullekin miRNA-mRNA pari saatu sekvenssi perustuva ennuste. Lisäksi miRNA ilme muutos ei välttämättä tuota hetkellinen muutos kohde-mRNA ilmaisun [9], tätä viivettä vaikutus olisi harkittava määritettäessä miRNA sääntelyä. V. Jayaswal et al.: N menetelmä [9], merkitys kertoimet tilastoa ei arvioida vääriä löytö korko, joka on standardi arvioitaessa merkitystä, ja viiveet eri väliajoin edustaa miRNA: n viiveellä oli kohdeltu tasapuolisesti, että ei vastaa todellista seikka. Siksi parannettu algoritmi tunnistaa tarkasti miRNA tavoite tietyssä tilanteessa on pohjimmiltaan vaaditaan.

Periaatteessa kriittinen miRNA joka pelaa vahva rooli välittäjänä AR väyliä androgeeniriippuvaisissa PCa solut ovat merkittävästi sääteli jälkeen androgeenistimulaation, ja luultavasti pitää korkealla ilmaisuja suhteellisen pitkän aikaa. Tässä tutkimuksessa, teimme aikasarjoja microarray samanaikaisesti tarkkailla genominlaajuisten miRNA ja mRNA ilmauksia alla dihydrotestosteroni (DHT, tyypillinen androgeeni) stimulaation LNCaP joita androgeeniriippuvaisen. Sen määrittämiseksi miRNA roolit AR signalointi toimme Response Pisteet tunnistaa AR kohde miRNA sekä Modulation Pisteet tunnistaa miRNA kohde-mRNA: iden. Sen jälkeen kun biologinen kokeellinen validointi, useita mielenkiintoisia mekanismeja miRNA ’välittävä AR signalointi ovat hiljattain paljastui, joka huomattavasti edistää PCa solujen eloonjäämistä ja patogeneesi, sekä tutkimus paljasti myös joitakin mahdollisia mekanismi murtaa androgen n kasvun rajoittamista.

materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja Androgeenien hoito

hormoni-herkkä ihmisen eturauhassyövän LNCaP-solulinja saatiin ATCC: stä ja ylläpidettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliiniä (100 yksikköä /ml) -streptomycin (100 g /ml) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO 2 soluinkubaattorissa. LNCaP-soluja viljeltiin fenolipunaista vapaata RPMI 1640 (GIBCO /BRL), jota oli täydennetty 10% hiili-dekstraani-FBS ja 3 päivää ennen androgen hoidon, sitten indusoitiin DHT pitoisuus on 10 nM. Genomin-laaja dynaaminen vaste DHT analysoitiin kymmenen ajankohtina – 0 h, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h ja 48 h, jossa ”0 h ’ edustaa tilassa ennen androgeenisesti toimia. Tässä tutkimuksessa 10 Aikapisteitä numeroitu kuten

k

= 0, 1, 2, … 9. Kunakin ajankohtana kokonais-RNA uutettiin ja puhdistettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

Genominlaajuiset Expression Profile Illumina BeadArray

Yhteensä-RNA: t kunakin ajankohtana hybridisoitiin Illumina Sentrix Human WG-6_V2 ilmaisu BeadChip paneelit (mRNA) ja MicroRNAExpression Profilointi paneelit (for miRNA) erikseen. Raaka microarray tietoja ladataan Gene Expression Omnibus julkisen arkistoon (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; Gene Expression Omnibus sarja no. GSE21245).

Data Pre-processing

normalisoidaan microarray dataa kvantiiliesti- menetelmää, ja käsitellyt unauthentic tiedot. Jotta geeni, ”Detection

P

arvo” arvioi aitoutta ilmaistun signaalin datan. Jos ”Detection

P

arvo ’ 0,01, signaali pidetään aito; muuten on unauthentic. Ehdotimme kriteeri muuttamista unauthentic tietoja. Kussakin mikrosirun, minimiarvo aitoja signaali on asetettu kynnys, ja merkitään Min

au. Jotta unauthentic signaalitiedoissa,

on alkuperäinen arvo, ja muutetun arvo = max {a, Min

au}. Geenejä, joissa on enemmän kuin 5 unauthentic signaalit pois. Myöhemmin koko tietoja pitää uskottavina.

tunnistaminen AR Candidate pääkohteita

1) androgeenisesti vastanneilla geenejä.

geeni

g

edustaa sen transkriptio vektori, jossa

N

on määrä ajankohtina ilman 0 h, ja

N

= 9 tässä tutkimuksessa. (

k

= 0, 1, 2, …,

N

) tarkoittaa transkriptin arvo aika

k

, ja toimii kontrollina DHT ärsykkeitä. Geenien kullakin ajanhetkellä, ”Diffscore” edustaa ero ilme merkitys verrattuna 0 h. Pidämme vaimentua, ja kuten voimistunut, vastaten. tarkoittaa mRNA: n diskretoidaan ekspressiovektoriin, eli (

k

= 1, 2, …,

N

) = 1, -1 tai 0, koska säätelyä, downregulation tai undifferentiation hetkellä

k

; ja tarkoittaa miRNA: n diskretoidaan ekspressiovektoriin. Jos geeni on merkittävästi ekspressoidaan eri ajanhetkellä verrattuna 0 h, on määritelty ”androgeeni-reagoiva geenin” tässä tutkimuksessa.

2) Aika syrjivä varten alku- ja myöhään-vasteen.

järjestelmällisesti tunnistamaan AR suoraan säännelty tavoitteet, me kehittää strategia tunnistaa kuluttua erottelija ”joka pääasiassa erottaa alku- ja myöhään-vasteen vaiheissa. Kunakin ajankohtana, määrä ero ilmentyvien geenien (verrattuna 0 h) laskettiin. Vedämme käyrä differentiaalisesti ilmaisi miRNA geeni numero pitkin aikaa kurssin. Kuten määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien myöhäisessä vaiheessa on varmasti paljon suurempi kuin varhaisessa vaiheessa, koska Cascade vahvistus vaikutus [10], määritellään aika erottelija kun ajankohtana, kun toinen puhkeamisen ero geenin numero tulee näkyviin, eli, tasauspyörästön ilme on vasta myöhäisessä vaiheessa.

3) Response pisteet mittaamiseksi geenin androgen-vastaus.

on yleisesti katsotaan, että välitön tavoite AR pitäisi olla varhaisessa ilmaus vastauksena androgen hoitoon; Lisäksi geenit varhaisen ja durative androgen-vaste todennäköisesti paitsi suoraan säädellä AR, mutta myös pelata olennainen rooli AR signalointi. Näin ollen jotta voidaan tunnistaa miRNA jotka ovat sekä varhainen ja myöhäinen vaste, eli varhaisen ja durative androgen-vaste, ehdotamme tilastollinen Response Score (RS) mittaamaan geenin ilmentymisen vastaus androgen ärsykkeitä: (1) missä

yhtälössä. (1), on komponentti diskretoidaan ekspressiovektorin geenin, on ensimmäinen nollasta elementti peräkkäinen sarja;

I

(

x

=

y

) on 1, jos ehto täyttyy ja 0, toisin; Int (

x

) vie kiinteä osa

x

olla arvonsa. Ensimmäinen termi yhtälössä. (1) on kumulatiivinen vaikutus androgeenireseptorin-vasteen yksilöityihin painokerroin

N

+ 1-

k

, eli ero ilmaisu tapahtui aikaisemmin on suurempi panos roolin . Toinen termi yhtälössä. (1) on rangaistus usein muuttamista ero suuntaan, koska geenien kanssa värähtelevän suunnan muutos on vähemmän tärkeää signaalin johtuminen. Heijastuu, sitä rangaistaan ​​raskaampi suunnan muutos tapahtui varhaisessa vaiheessa, ja rangaistaan ​​slighter varten myöhäisessä vaiheessa, koska varhainen reaktio on tärkeämpää AR ensisijaisen sääntelyä. Perustuen RS määritelmästä, geenejä enemmän RS arvot ovat taipuvaisia ​​suoraan säädellä AR, ja ovat taipuvaisia ​​pelaamaan keskeisiä rooleja kuljettavat AR: n solujen vaikutuksia. Tässä tutkimuksessa top 10% geeneistä lajiteltu RS teoreettisesti tunnistetaan AR ehdokas pääkohteita.

tunnistaminen tavoitteet Huomattavasti moduloida miRNA

1) TAI-tilaston.

Voit tarkastella miRNA ”globaali modulaatiota mRNA: t, huomaamme ekspressioprofiileja ajan tietysti ja keskittyä onko muutos ilmaisun sijasta muutoksen suuntaa. Let.where

M

on kokonaislukumäärä miRNA, on määrä sekvenssin perustuvan ennustetun tavoitteet miRNA

i

, ja ilmaisemaan ilmaisun erilaistumista aika

k

varten miRNA

i

ja mRNA

j

vastaavasti. Parittomat suhde (OR) =

ilmoitus Twitter /

bc

. Jos OR 1, miRNA pidetään maailmanlaajuisesti moduloimalla ilmentymiä ennakoi maalin mRNA: iden.

2) Modulation sijoituksen sekvenssin perustuvan ennustetun miRNA-mRNA paria.

ennustetun miRNA -mRNA pari jonka jäsenet ovat androgen-reagoiva, on tarpeen määrittää, onko mRNA merkittävästi moduloidaan miRNA siinä erityisessä yhteydessä. Pearson kerroin mikä yhdistys jatkuvalla tavalla käytetään yleisesti mittaamaan ilmentymisen korrelaatio miRNA ja mRNA [11], kun taas mRNA: n ero ilme kuvastaa miRNA: n diskreetti modulointiefekti kunakin ajankohtana tulisi myös harkita. Lisäksi muutos miRNA ilmaisua ei tuota hetkellinen ilmaus muutoksen kohde-mRNA, The ’viive ”vaikutus on pidettävä. Siksi ehdotamme tilastotieto – Modulation Score (MS) – mitata miRNA asetus sekvenssi-pohjainen ennustettu kohde-mRNA. Ennustettua miRNA-mRNA paria, (2) kun

J

= 1, 2, …,

N

, ja

k

= 2, 3, …

N

.

yhtälössä. (2),

r

on Pearsonin korrelaatiokerroin laskettu ilmentyminen tietoja miRNA ja mRNA: n, (

k

= 1, 2, 3, …,

N

) edustavat

N

ajankohtina, ja,,, …, tässä tutkimuksessa. Eq. (2) näyttää samanlainen Fisherin

r

-to-

z

muunnos, joka on normaalisti jakautunut [12]; Mutta Eq. (2) on kehittynyt kanssa painokerroin

E

kuvataan miRNA ja mRNA: n diskreetti differentiaalikaavojen kirjeenvaihtoa. toimenpiteet differentiaalikaavojen kirjeenvaihto ilman viivettä; kun taas täydentää mukauttamista viiveellä johtuen eri viiveitä. Merkitys MS arvioi nimellinen

p

arvoa ja säätää

q

arvo (Supplement). Tässä tutkimuksessa

q

= 0,2 asetetaan kynnys merkityksen tunnistamista, eli jos

q

0,2, mRNA tunnistetaan suora tavoite merkittävästi moduloidaan miRNA erityisissä yhteydessä.

Quantitative Reaaliaikainen RT-PCR miRNA ja mRNA

Kun määritellään miRNA suoritettiin käyttämällä Bulge-LoopTM miRNA qPCR (ribo-). Pieni ydinaseiden RNA U6 oli endogeeninen kontrolli. MRNA: n määrän, cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta käyttäen PrimerScript ™ RT reagenssipakkauksen (Takara). RT-PCR suoritettiin käyttäen SYBR premia Ex Taq ™ (Takara) on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Alukkeet taulukossa S5 File S1. Kaikki näytteen arvot normalisoitiin GAPDH. 2

– ΔΔCt menetelmää käytettiin suhteellista kvantifiointia mittana differentiaalikaavojen.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritys

ChIP määritykset suoritettiin kuvatulla ref. [13]. Lyhyesti, solut sen jälkeen, kun haluttu hoito fiksoitiin 1% formaldehydiä, 37 ° C: ssa 7 min, minkä jälkeen solut otettiin talteen SDS lyysipuskuria [50 mM Tris.Cl, pH 8,1, 10 mM EDTA, 1% SDS] ja sonikoitiin leikkausvoima chromatin (200~500 bp). Kunkin ChIP, liukoinen fraktio 2 x 10

6 solua kerättiin talteen ja inkuboitiin 4 ug kanin anti-AR-vasta-aine (PG-21, Upstate) tai kontrollina normaalia kanin seerumia (IgG) 4 ° C: ssa yön yli. Immuunikompleksien pyydystettiin 20 ui proteiini A /G plus-agaroosijyväsiä (Santa Cruz). Perusteellisen pesemisen jälkeen sitoutunut DNA-fragmentit eluoitiin ja puhdistettiin. Alukkeet qPCR analyysi DNA-fragmentteja, jotka sisältävät ARE lueteltiin taulukossa S3 ja Taulukko S4 File S1, erityisesti KLK3 (PSA) tehostajana toimii positiivisena kontrollina, kun taas XBP-1 promoottori toimii negatiivisena kontrollina. Kukin ChIP määritys biologisesti toistettiin kolme kertaa.

miRNA transfektio

yli vaikuttava-ilmentyminen miRNA, matkivat miRNA prekursorimolekyylit ja negatiivinen kontrolli (Ambion) transfektoitiin LNCaP käyttäen Neon ™ transfektion järjestelmä (Invitrogen) pitoisuus on 30 nM. Transfektioon alle nälkään tilanteessa, LNCaP pantiin hormoni-riisuttu väliaine 3 vuorokautta ennen transfektiota.

Cell Proliferation /elinkelpoisuus Pitoisuus

Voit testata miRNA osuus PCA solujen lisääntymistä, LNCaP jälkeen ohimenevän transfektion ympättiin 24-kuoppalevylle pitoisuutena 15000 solua /kuoppa. 1, 2, 3, 4 päivää transfektion 80 ui MTT: tä (5 mg /ml kantaliuos) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Käsiteltyjä soluja lysised DMSO ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin. Jokainen transfektio on joka päivä toistettiin 3 kertaa.

Western-blottaus

Western blot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14] käyttämällä vasta-aineita AR (Millipore), PSAP (Santa Cruz) ja aktiinin ( Sigma). Ydin- proteiinin uuttamalla, LNCaP-solut lysised puskurilla A (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 0,1 mM EDTA, 0,1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Tumat kerättiin sentrifugoimalla ja lysised puskurilla C (20 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Nuclear lysaattia otettiin talteen linkoamalla ja määrällisesti.

Luciferase Assay

reportteri plasmidi, joka sisältää otaksutun miRNA sidoskohdan 3′-UTR: kohde-mRNA kloonattiin pGL3-promoottorin Luciferase vektori. Käytetyt alukkeet esitetään taulukossa S6 File S1. Plasmidi varmistettiin sekvensoimalla DNA. Lusiferaasin määritys, LNCaP-soluja (7,5 x 10

4 per kuoppa) ympättiin 24-kuoppalevyille ja viljeltiin 2 päivää. Sitten solut kotransfektoitiin miRNA, pGL3-promoottorilusiferaasivektorissa ja PRL-TK Renilla lusiferaasi-plasmidia (Promega) käyttäen X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen dual lusiferaasireportterista iinianalyysikitissä (Promega).

Tulokset

Strategia rakentamiseksi miRNA-välitteisen AR signalointiverkolla tässä tutkimuksessa on esitetty kuvassa . 1. vaiheittainen tulokset esitetään seuraavasti.

Tämä on ääriviivat koko menettely analysoimiseksi microarray tietojen rakentaa AR verkkoon tässä tutkimuksessa. Yksityiskohtaiset vaiheet annetaan menetelmien ja tulos kohdat.

Seulonta androgeenisesti vastanneilla miRNA

tunnistamiseksi AR kohdistettuja miRNA vahvistuksella-of-function lähestymistapa, suoritimme aika- tietenkin microarray samanaikaisesti tarkkailla miRNA ja mRNA: n lausekkeita androgeeniriippuvaisissa LNCaP-soluilla DHT stimulaatiota aikasarjan 0 h, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h, 24 h ja 48 h, vastaavasti. The ’0 h’ toimii valvonta edustaa solun tila ennen DHT stimulaatiota. LNCaP-soluja viljeltiin hormoni-köyhdytettyä väliaineessa 72 tuntia, ennen kuin DHT stimulaatiota. Sen jälkeen kun esi-prosessi alkuperäisen datan, oli 16172-mRNA: iden ja 241 miRNA säilyi. Ensin seulotaan tämä tieto löytää ”androgeenireseptorin reagoiva geenin” ( ’ARG): Jos geeni on merkittävä ilmentymisen muutos ajanhetkellä verrattuna 0 h, se kutsutaan ”androgen-reagoiva”. Differentiaalinen ilme verrattuna 0 h mitataan ”DiffScore”, joka edustaa merkitys differentiaalikaavojen. Vastaavasti 5203-mRNA: ja 137 miRNA olivat androgen-reagoiva. On huomattava, että koska androgeenireseptorin reagoiva ei keinoja ole suoraan säädellä AR; sen sijaan, jotkut geenit voidaan säädellä tiettyjen välittäjien AR reittejä. Suurimmat tavoitteena on poimia miRNA suoraan säädellä AR, joka on tärkeä merkitys välittämisessä AR verkossa säätelemällä kohde-mRNA:.

Niistä 137 androgen-reagoiva miRNA, 22 miRNA olivat hyvin dokumentoitu PCa [11 ], [15], [16] [17]. Siinä miR-101, miR-145, miR-34a, miR-182, miR-375, miR-181a miR-92b ja miR-125a ovat up-säännellään DHT stimulaatiota. Nämä miRNA ilmoitettiin erittäin yli-ilmentynyt PCA [11], [17], [18], [19]. miR-16, miR-126 *, miR-23b, miR-100, miR-222, miR-133a-1, miR-499 ja miR-340 alassäädetty, jotka ovat linjassa aikaisempien raporttien [11], [15], [16].

androgen-reagoiva mRNA: t löytyy tässä tutkimuksessa ovat erittäin yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien. Olemme aiemmin perustettu tiettyyn tietokantaan kutsutaan ARGDB tietokanta [20], jossa keskityttiin AR geenien integroimalla kirjallisuuden jopa vuoteen 2009. 5203 androgen-reagoiva mRNA: t löytyy Tässä tutkimuksessa 80% osui androgeenisäädellyn reagoiva geenien ARGDB tietokannassa . Vaatimustenmukaisuutta merkitsee oikeellisuutta meidän kokeellisen suorituskyvyn tarkkailuun genomin dynaaminen ilmaisuja LNCaP solussa alle DHT stimulaatiota. Mielenkiintoista, jotkut geenit liittyvät miRNA käsittelyyn oli voimistuvan androgeenien (Kuva S1 File S1). Esimerkiksi

Dicer

, RNA-sitovaa proteiinia, joka käsittelee ennalta miRNA kypsiksi miRNA määrä lisääntyy. Tämä on sopusoinnussa aiemmin raportoitu säätelyyn ylöspäin PCa [21].

DGCR8

, kumppani ydinvoiman RNaasi III Drosha, joka pilkkoo varsi-liu’utetaan pri-miRNA osaksi reunustavan vapaa pre-miRNA, on myös merkittävästi säädelty.

tunnistaminen aika Syrjivä varhaiselle – ja Late-vasteen

Geenien ilmentyminen vastauksena androgeenistimulaation voi tapahtua milloin tahansa pisteen jälkeen DHT hoidon; Näin riippuen vasta androgeeniresponsiivinen voi antaa enemmän pohdintaa mitkä reagoiva geeni on kriittinen. Me spekuloida, että geenit merkittäviä ilme muutos tapahtuu aikaisemmassa vaiheessa saattaa olla enemmän keskeinen rooli välittäjänä AR signalointi, ja saattaa olla paremmat mahdollisuudet olla välittömänä kohteena AR. Näin ollen, jotta tunnistaa kriittiset miRNA jotka ovat luultavasti AR kohteita, me luokitellaan miRNA vasteen varhaiselle ja loppuvaiheissa tässä tutkimuksessa määrittämällä aika erottelija

τ

, joka alku hidasta vastausta. Määrä ilmentyvät eri miRNA ulottuu ajan myötä piirrettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2A,

τ

= 6, jotka vastaavat ajankohtana 8 tuntia on tunnistettu, mikä tarkoittaa, että miRNA ”ilmaisun vastaukset androgeenin, [20 min, 8 h) on varhaisessa vaiheessa, kun taas [8 h, 48 h] on myöhäisessä vaiheessa.

Kuva 2A. Aika kurssi profiilia ilmentyvät eri miRNA numero. Katkoviiva tarkoittaa aikaa diskriminaattoriin erottamiseksi aikaisin ja myöhään vastaus vaiheissa. Kuvio 2B. Expression profiilia miRNA ”varhaisen ja myöhäisen-vaste DHT ärsykkeisiin. Differentiaalikaavojen suhteessa 0 h edustaa. erottaa miRNA vaste varhaiselle ja loppuvaiheissa. miRNA ovat ryhmittyneet 4 ryhmään: varhainen voimistunut (1), myöhäinen upregulated (2), varhainen vaimentua (3) ja myöhäinen vaimentua (4). Kuva 2C. Venn-kaavio Numeron jakelua varhain reagoiva miRNA ja myöhään reagoiva miRNA. Punainen osa tarkoittaa androgeenisäädellyn resonsive miRNA kanssa vaste tapahtui ainoastaan ​​alkuvaiheessa, sininen osa tarkoittaa miRNA kanssa vaste yksinomaan loppuvaiheessa, ja violetti osa tarkoittaa miRNA kanssa vaste sekä varhaisen ja loppuvaiheissa. Kuva 2D. Ennustettu ARE rikastus alussa ja lopussa reagoiva miRNA geenejä. ARE ovat ± 10 kb sekvenssejä reunustavat 5′-start site ennalta miRNA.

luotettavuuden arvioimiseksi ajan syrjivä

τ

, tutkimme miRNA ”ero mentymisprofiili ja analysoitiin ARE rikastamiseen ero aikaisin ja myöhään reagoiva miRNA. Profiilia androgen reagoiva miRNA ”ero ilmentymistä havaitaan käyttämällä ei-konservatiivinen kriteeri havainnollistaa erilainen ekspressio. Kuviossa. 2B, aika syrjivä ”8 h ’erotetaan selkeästi alku- ja late- vastaus vaiheissa. Niinpä me ryhmittyneet miRNA 4 ryhmään: varhainen säädelty, myöhään säädelty, varhainen alassäädetty ja myöhäinen alassäädetty (Fig. 2B osoituksena). Jotkut androgeeniresponsiivinen miRNA on ero ilmaisuja sekä varhaisen ja myöhäisen vaiheen, ja toiset vain ero ilmaisuja joko aikaisin tai myöhään yksin. Kuva. 2C osoitti jakelun varhaisen reagoivat 83 miRNA (11 miRNA punaisella yksinomaan on varhaisen reagoinnin), myöhäinen reagoiva 126 miRNA (54 miRNA sinisellä yksinomaan olla hidasta vastausta), sekä 72 miRNA ovat risteys (violetilla). Luku on muodossa Venn-kaavio [22]. Sitten analysoitiin ARE rikastusta varten varhaisen ja myöhäisen vasteen miRNA. On luonnollista olettaa, että geenit suoraan säätelee AR (esimerkiksi varhaisen reagoiva geenit) on korkeammat OVAT rikastamiseen. Ylävirran 10 kb ja loppupään 10 kb 5’-aloituspaikasta ennalta miRNA tutkittiin etsiä AR-sitoutumiskohtia (ARBSs). Genomatix tietokanta [23] käytettiin havaitsemaan ARE myös otaksuttu ja validoitu androgen reseptori (AR) ja glukokortikoidi reseptori (GR) reagoivat elementit, kuten on esitetty taulukossa S1 File S1. Otaksutun ARE määrä androgen reagoiva miRNA on esitetty kuviossa. 2D. On selvää, että ARE rikastusta varhaisen reagoivaa miRNA ovat huomattavasti suuremmat kuin myöhään reagoiva niistä (

p

0,01, Suppl.1), joka perustelee rationaalisuutta ajan syrjivä

τ

.

tunnistaminen Candidate miRNA että AR ensisijaisesti Target

tunnistaa miRNA jotka luultavasti suoraan säätelevät AR, sekä niillä on keskeinen merkitys välittämisessä AR verkossa, ehdotimme ja lasketaan uusi tilastollinen , Response Score (RS) kunkin androgen-reagoiva miRNA. Kuvio 3A esittää RS jakautuminen androgeenin reagoiva miRNA. miRNA RS arvoja top 10% ovat teoreettisesti tunnistetaan AR pääkohteita. RS kynnys miRNA on 22, siis 15 miRNA (8 tukahdutettu ja 7 aiheuttama) on teoreettisesti tunnistettiin ehdokkaaksi.

Kuva 3A. RS jakelu androgeenin reagoiva miRNA. miRNA numeroita mukaan eri RS arvot esitetään, katkoviiva merkitsee kynnystä tunnistamiseksi AR ehdokas ensisijainen tavoite miRNA. Kuvio 3B. RT-PCR-analyysi tunnistaa AR ehdokasta tavoite miRNA. Kertainen muutos DHT-käsiteltyjen LNCaP yli kontrollinäytteitä esiteltiin merkitystä arviointi (tässä tutkimuksessa, *: p 0,05; **: p 0,01, ***: p 0,001). Kertainen muutos kontrollinäytteiden katsottiin kuin 1 kaikille RT-PCR-analyysit tässä tutkimuksessa. Tämä luku on RT-PCR-analyysi miRNA 40 min DHT stimulaatiota. Kuva 3C. Kaavakuva miR-133b, miR-19a, ja miR-27a: n ARE sijainti 5′- ja 3′-alueille. Vaakasuorat nuolet osoittavat suunnilleen OVAT paikoissa. Kuva 3D. ChIP määritys AR-sitova ehdokas tavoitteista miR133b, miR19a, miR27a. ”IgG” toimii negatiivisena kontrollina siru määrityksessä.

Valitse miRNA kanssa uusia biologisia merkitys seuraavien syväyksen tutkimuksessa käytimme GenMAPP analysoida vaikuttivat väyliä kunkin ehdokkaan, riippuen polku rikastuminen ennakoi maalin t, jotka olivat myös androgeenin reagoiva. Tässä tutkimuksessa miRNA ”ennusti tavoitteet toimittanut miRDB tietokantaan [24], jonka genominlaajuisten miRNA tavoite ennustus suoritettiin äskettäin kehitetty bioinformatiikan työkalu, MirTarget2 [25]. MirTarget2 algoritmi perustuu tukivektorikoneet (SVMs) ja mikrosirujen koulutus aineistoja, se osoitti suurempi selektiivisyys tunnistamaan vaimentua geenejä verrattuna muita algoritmeja. Kun suoritetaan GenMAPP, polut kanssa z≥1.96 pidettiin merkittävänä. Niistä tunnistettu ehdokas AR ensisijainen tavoite miRNA, miR-19a, miR-27a ja miR-133b, havaittiin merkittäviä polku rikastusta kriittisissä soluprosesseissa (taulukko S2 File S1). Nämä 3 miRNA jatkuva merkittävä ylössäätö koko ajan kurssin mukaan microarray tietojen ja me validoitu niiden ilmentyminen tietoja RT-PCR-analyysillä. Valitsimme microarray näytettä 40 min miRNA RT-PCR-analyysi, koska 3 miRNA osoitti ekspressoitumista muutos jo 40 min microarray kokeilu. RT-PCR-tulos oli yhtäpitävä microarray tiedot (Fig. 3B). Seuraavassa tutkimme mekanismeja miR-19a, miR-27a ja miR-133b välittämisessä AR signalointi PCA karsinogeneesiin.

tarkistaminen AR: n sitoutuminen miR-19a, miR-27a ja miR-133b

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritykset suoritettiin tarkistaa AR-sitova ennustettua ARE valitun 3 miRNA. Käytimme Genomatix tietokantaa [23] havaitsemiseksi ARE alkupään ja loppupään 15 kb ennalta miRNA: n 5′-aloituskohdasta. ARE kanssa ”Core Samankaltaisuus = 1 ’valittiin sirujen määritystä validointi, joka edustaa korkeinta ottelua DNA-sekvenssin ja ARE: n säilyneitä emäksiä. ARE: havaitaan alku- ja loppupään alueilla miR-19a, miR-27a ja miR-133b, vastaavasti, kuviossa. 3C. Perustuen ChIP määrityksen tulokset, huomasimme, että hoito 10 nM DHT LNCaP 4 h, johti merkittävään AR-sitoutumisesta chromatin ennustetun ARE: in miR-19a, miR-27a ja miR-133b, verrattuna säätimet (Fig. 3d). QPCR analyysi KLK3 promoottori (toimii positiivisena kontrollina AR-sitova), ja XBP-1 promoottori (toimii negatiivisena kontrollina AR-sitova) on esitetty kuvassa S2 File S1. Kuva. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.