Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagic solukuoleman tai epäonnistuneen autophagy on ehdotettu eliminoimiseksi vaurioitunut sekä syöpäsoluja, mutta on edelleen kriittinen aukko tietomme miten tämä prosessi on säännelty. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa modulaattorit autophagic solukuolemareittiin ja selvittää niiden vaikutuksia solun signalointi ja toiminta. Tulos meidän siRNA kirjaston seulonnat osoittavat, että ehjä coatomer monimutkainen I (copi) on pakollinen tuottaviin autophagy. Ehtyminen copi monimutkaisten jäsenten laski solujen eloonjäämistä ja heikentynyt tuottava autophagy edeltäneessä Endoplasmakalvosto stressiä. Edelleen abortive autophagy provosoi copi ehtyminen muuttunut merkittävästi kasvutekijän signalointi useita syövän solulinjoissa. Lopuksi käy ilmi, että copi monimutkaisia ​​jäsenet yliekspressoituvat joukko syöpäsolulinjoista ja useiden syöpätyyppien kudoksiin verrattuna normaaliin solulinjoja tai kudoksissa. Syövän kudoksissa, yliekspressio copi jäsenten liittyy huonoon ennusteeseen. Tuloksemme osoittavat, että coatomer kompleksi on välttämätöntä tuottavaan autophagy ja solujen selviytymisen, ja siten estämällä copi jäsenet voivat edistää solukuolemaa syöpäsoluissa, kun apoptoosi on heikentynyt.

Citation: Claerhout S, Dutta B, Bossuyt W Zhang F, Nguyen-Charles C, Dennison JB, et al. (2012) epäonnistuneen Autophagy indusoi Endoplasmakalvosto Stressi ja solukuolema syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (6): e39400. doi: 10,1371 /journal.pone.0039400

Editor: Gordon Langsley, Institut national de la Sante et de la Recherche médicale – Institut Kochi, Ranska

vastaanotettu: 22 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 21 toukokuu 2012; Julkaistu: 26 kesäkuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain avustusta Komen Foundation (KG 081694 ja FAS0703849), Cancer Prevention and Research Institute of Texas, ja Munasarjojen Cancer Research Fund GBM, ja jonka MD Anderson Cancer Center Support Grant CA016672. SC tukevat Odyssey ohjelma ja Theodore N. lain Endowment for Scientific Achievement The University of Texas MD Anderson Cancer Center. JBD tukee MD Anderson GlaxoSmithKline TRIUMPH jatkokoulutussopimuksen ja BD National Institutes of Health siRNA konsortion terapeuttisten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpäsolut kohtaavat useita esteitä, kuten pH: n muutoksia ja rajoitettu ravinteita ja happea aikana syöpä aloittamisen, eteneminen, ja levitys [1]. Palauttamaan oikea solujen toiminnan ja homeostaasille niukassa kohtalaiseen stressiä, syöpäsolujen aktivoida suojaava solun prosessit, kuten autophagy. Autophagy on erittäin konservoitunut prosessi havaittu hiivasta nisäkkäisiin. Se on ainutlaatuinen huonontumisprosessi ominaista takavarikoimista irtotavarana soluliman lukien proteiinit ja soluelimiin, jotka toimitetaan lysosomaalisen järjestelmän lopullista ruoansulatus [2]. Poistaminen ja hajoaminen näiden solun komponenttien tuottaa energiaa ja rakennusaineita tarpeen eloonjäämisen syöpäsolujen aikana metabolisen stressin. Päätökseen tämän prosessin nimetty tuottava autophagy tai autophagic flux [2]. Kuitenkin tuottamattomia, hallitsematon, tai pitkittynyt autophagy johtaa mitä on nimetty ”autophagic solukuolemaa” [3], [4] tai kuten me kutsumme ”epäonnistuneen autophagy” [5].

syövän, prosessi autophagy on ehdotettu edistää sekä kasvaimen suppression ja etenemiseen. Toisaalta, autophagy tukahduttaa kasvainten rajoittamalla aloittamista ja etenemistä. Ilmentymisen Beclin 1, nisäkkään homologi hiivan autophagy geenin Atg6, joka on kriittinen induktio autophagy, on vähentynyt monissa syövän kudoksissa ja syöpäsolulinjoissa [6]. Lisäksi, UV-säteilyn kestävyys liittyvän geenin (

UVRAG

), joka on tarpeen tuumorisuppressorigeenin funktio Beclin 1, on myös monoallelically mutatoitunut monissa ihmisen syövissä, [7]. Lisäksi autophagy myös estää kasvaimen kehittymisen antamalla ATP tarvitaan DNA: n korjaukseen [8] tai poistamalla pitkäikäisten proteiini p62 [9]. Toisaalta, autophagy voi edistää kasvaimen kehittymisen poistamalla stressiä herättämän puute ravinteita ja happea pre-invasiivisia ja nopeasti kasvava kasvaimia. Meidän lab on osoittanut, että LKB1-AMPK reittiin riippuvainen fosforylaatio p27 treoniini 198 stabiloi P27 ja sallii solujen hengissä kasvutekijää peruuttamista ja metabolisen stressin indusoimalla autophagy [10]. Tämä autophagic vaste voi myötävaikuttaa kasvaimeen solujen eloonjäämistä aikana kasvutekijää puutteen tai häiriintyy ravinteiden ja energia-aineenvaihduntaa. Siten riippuen Matkapuhelinyhteydessä ja voimakkuus ja kesto stressiä signaaleja, autophagy joko estää tai edistää syövän syntymistä.

Lisäksi rooliaan Karsinogeneesin autophagy moduloi myös tehokkuutta lääkeaineet. Induktio ”tuottava” autophagic prosessi kemoterapiaa ja säteily mahdollistaa selviytymisen syöpäsolujen [11]. Tämä viittaa siihen, että autophagy modulaattorit voivat herkistää kasvainsolut tavanomaisten syövän hoitomuotoja [11], [12]. Kohdistamalla avain proteiineja tuottavia autophagy, solut voivat läpikäydä ”abortive autophagy”, vaihtoehtoista kuoleman mekanismi syöpäsoluissa resistenttejä apoptoosia indusoivat aineet [11], [13]. Vaikka prosessi tuottava autophagy on tutkittu laajasti, on epäselvää, mitkä tekijät säätelevät epäonnistuneen autophagy. Tunnistaminen nämä modulaattorit voisi tehostaa tavanomaista hoitoa ja edistää löytö uusien hoitojen syöpäpotilaille.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa säätelijöinä epäonnistuneen autophagy ja selvittää niiden vaikutus viestinvälitystekniikoita ja solujen eloonjääminen syöpäsoluissa. Meillä työskentelee Sirna (siRNA) näytöt yhdistettynä validointi ja toiminnalliset tutkimukset. Jäsenet coatomer monimutkainen I (copi), jotka ovat mukana soluliikennöinti-, nousi top osumia meidän näytöt moduloiva autophagy ja solukuolemaa syöpäsoluissa. Abortive autophagy ja solulimakalvostoon (ER) stressi jälkeen havaittiin knockdovvn copi komponentteja. Lisäksi copi ehtyminen vaikuttaa fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) /AKT signalointireitin. Kaikkiaan vaikutukset copi solukuolemaan, autophagy ja ER stressiä oli nopeampaa syöpäsoluissa kuin normaaleissa soluissa. Tämä on sopusoinnussa yliekspressio copi proteiinien ja geenien nähdään syöpäsolulinjoissa ja potilaan näytteestä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines ja reagenssit

Ihmisen rintasyöpäsolujen MDA-MB-231 [10], MDA-MB-468 [10], BT549 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), T47D [10], SKBR3 (ATCC), HCC1428 (ATCC) ja MCF7 [10], munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 (ATCC), ja OVCAR3 (ATCC) ylläpidettiin RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 5% FBS: ää. MDA-MB-231, MDA-MD468 ja SKOV3 pysyvästi transfektoitujen solujen GFP-LC3 kasvatettiin samassa väliaineessa. Luusarkoomasolulinja U2OS (ATCC) ja U2OS GFP-LC3 [10] viljeltiin DMEM ja 10% FBS. MCF10A (ATCC) viljeltiin DMEM /F12 ja 5% hevosen seerumia, jossa on 20 ng /ml EGF: ää, 0,5 mg /ml hydrokortisonia, 100 ng /ml koleratoksiinia, ja 10 ug /ml insuliinia. GFP-LC3 stabiileja solulinjoja, kuten on kuvattu [10]. Solulinjat todensi STR DNA-sormenjälkien avulla AmpFℓSTR Identifiler pakki valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems cat 4322288). STR-profiilit verrattiin tunnettuihin ATCC sormenjälkiä (ATCC.org), jotta Cell Line Integrated Molecular Authentication tietokanta (CLIMA) versio 0.1.200808 [14] ja MD Anderson sormenjälkitietokanta. Imatinibi, ystävällinen lahja tri S. Kondo MD Anderson Cancer Center, ja bafilomysiini A1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuotettiin DMSO: hon. Brefeldin A (Sigma-Aldrich) ja rapamysiini (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) liuotettiin metanoliin.

siRNA näytöt

Accell siRNA näytön autophagy modulaattorit.

MDA-MB-231, U2OS, ja SKOV3 pysyvästi transfektoitujen solujen GFP-LC3 ympättiin 96-kuoppalevyille 2500 solua /kuoppa ja MDA-MB-231 ja SKOV3-soluja tai 1000 solua /kuoppa U2OS soluja. 24 tunnin kuluttua väliaine vaihdettiin Accell väliaineeseen, joka sisälsi 0,05% FBS: ää (80 ul /kuoppa) (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Accell siRNA (G-201000 Human RNAi Global, Lot 08103, 96-kuoppaisilla levyillä) liuotettiin 10 ul: aan 1x siRNA-puskuria ja inkuboitiin ravistelijassa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Accell media (200 ui), joka sisälsi 0,05% FBS: ää lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin pipetoimalla viisi kertaa. Liuennut siRNA (20 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan, jotta lopullinen siRNA konsentraatio 1 uM (100 ul /kuoppa). Soluja inkuboitiin siRNA 48 tuntia. Lääkkeet laimennettiin kymmenen kertaa työpäivän konsentraatioon ja lisättiin kuhunkin kuoppaan kuten (11 ul /kuoppa) lopullisten konsentraatioiden 2 mM 2-deoksi-D-glukoosia (2DG), 100 nM rapamysiini, ja 10 uM imatinibi. Solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä, ytimet värjättiin Hoechst 33342: ssa 5 minuutin ajan ja pestiin kerran PBS: llä, ja 250 ui PBS: ää, lisättiin soluihin. Autophagosome muodostuminen määritettiin IN Cell Analyzer 1000 Cellular Imaging and Analysis järjestelmä (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey). Tulokset on esitetty% autophagy. Lisäksi kaikki geenit yhdistettiin yhteen z-pisteet laskenta. Z-pisteet geenin

i

laskettiin kuten

z

i

= (

x

i

–

μ

) /

σ

, jossa

x

i

on% autophagy päässä autophagy näytössä, ja

μ

ja

σ

ovat keskiarvo ja vakiopoikkeamat perustuu kaikkien geenien läsnä näytöllä.

siRNA näytön kannattavuuden modulaattorit.

Käytimme puettu kirjaston 779 siRNA altaat (https://www.dharmacon.com/product /Productlandingtemplate.aspx?id=225 tab=1 geenien luettelo), joka kattaa ihmisen kinome ja kinaasia liittyvät geenit (Dharmacon SMARTpool kirjasto, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) on MDA-MB-231, MDA-MB-468 , SKOV3, ja OVCAR3 solulinjat. Jokainen pooli synteettisten siRNA: iden oli puettu 96-kuoppainen formaatti ja transfektiot suoritettiin kolmena kappaleena levyillä käyttäen 25 nM siRNA toimittama DharmaFECT I (Dharmacon). Kuusi rinnakkaisnäytettä RISC-vapaa ei-kohdistuksen siRNA ja siRNA vastaan ​​PLK (myrkyllistä kontrolli) kussakin levy, negatiiviset ja positiiviset kontrollit solukuolemaan koko näytöllä, vastaavasti. Lyhyesti, DharmaFECT minä levitettiin 0,15 ul /kuoppa 25 nM siRNA toimitus käänteinen transfektion tilassa. Kolmen päivän kuluttua, solujen elävyys määritettiin kanssa Cell Titer Blue solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Madison, WI). Cell titraaminen Blue reagenssia (resatsuriinia 5 ul /kuoppa) sisällytettiin viimeisten 3 h inkubaation. Elävät solut vähentävät Resatsuriini osaksi resorufiini, joka on erittäin fluoresoiva. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa viritysaallonpituudella 530 nm ja emissio aallonpituudella 604 nm. Interplate bias poistettiin normalisoimalla solujen elävyys arvojen keskiarvo keskitys ja skaalata on yhtä suuri varianssi ja muunnetaan sitten vastaavaksi z-arvoja kullekin kolmeen rinnakkaiseen kokeissa. Z-geenin

’i’

kaksoiskappaleanalyysiä

”j”

laatassa

”k”

laskettiin

z

ij

= (

x

ij

–

μ

jk

) /

σ

jk

, jossa

x

ij

on raaka intensiteetti arvo, ja

μ

jk

ja

σ

jk

ovat keskiarvo ja keskihajonta intensiteettien kaikki näytteet levy

k

, vastaavasti. Seuraavaksi mediaani z-pisteet laskettiin kaikkien rinnakkaisnäytettä kustakin geenistä kussakin solulinjassa, ja siRNA: t, joissa

z

i

ave

arvot ovat alle -2 katsottiin merkittävästi estävä ”osumia ”vastaavalle solulinjan.

transfektio ja siRNA reagenssit

siRNA (Dharmacon; Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) transfektoitiin DharmaFECT I (Dharmacon) tai Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) käyttäen valmistajien protokollia. Sekvenssit siRNA: t ovat seuraavat: ohjaus RISC-free nontargeting siRNA (D-001220-01-05), COPAn (L-011835-00), COPB1 (L-017940-01), COPB2 (L-019847-00 ), COPG1 (L-019138-00), COPG2 (L-019988-01), COPD (L-013063-01), COPE (L-017632-01), COPZ1 (L-020293-01) PLK1 (M -003290-01) BIP1 (L-008198-00-0005), Atg5 (L-004374-00), ja Atg12 (L-010212-00).

transmissioelektronimikroskopia

Cell näytteet kiinnitettiin liuoksella, joka sisälsi 3% glutaraldehydiä ja 2% paraformaldehydiä 0,1 M kakodylaattipuskurissa, pH 7,3, 1 tunnin ajan. Kiinnityksen jälkeen näytteet pestiin ja käsiteltiin 0,1%: Millipore-suodatettua dylaatissa puskuroitu parkkihappo, jälkikiinnitettiin 1% puskuroidussa osmiumtetroksidissa 30 minuuttia ja värjättiin en bloc 1% Millipore-suodatettua uranyyliasetaatilla. Näytteet poistettiin vesi oli kasvavia määriä etanolia, suodattunut, ja upotettu LX-112 väliaineessa. Näytteet polymeroitiin 70 ° C: ssa uunissa 2 päivää. Ultraohuet leikkeet leikattiin Leica Ultracut mikrotomi (Leica, Deerfield, IL), värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijusitraatilla on Leica EM stainer, ja tutkitaan JEM 1010 lähetyksen (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) kiihtyvällä jännitteellä 80 kV. Digitaaliset kuvat saatiin käyttämällä AMT Imaging System (Advanced Microscopy Techniques Corp, Danvers, MA).

SDS-PAGE ja Western blot -analyysi

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: p62 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), LC3 (Novus Biologicals, Littleton, CO), IRE1α, BiP, kalneksiini, Atg5, Atg12, pSer473AKT, pThr308AKT, AKT, pSer235 /236 S6, pSer65 4EBP ja 4EBP (kaikki Cell Signaling Technology, Beverly, MA), COPB1 (Fisher Scientific, Lafayette, CO), ja β-aktiini (Sigma-Aldrich). Vasta-aineet COPA, COPB2, COPD, COPG1 ja COPG2 olivat ystävällinen lahja Dr. Wieland (University of Heidelberg, Heidelberg, Saksa). Kvantifiointi bändi intensiteetti suoritettiin Un-Scan-It geeli (versio 5.1, Silk Scientific Corporation) ja ilmaistaan ​​kertainen ohjaus.

konfokaali ja fluoresenssimikroskopiaan

Konfokaalimikroskopia .

immuunivärjäytyminen LAMP2 (BD Biosciences, 1/200) tai COPB2 (1/1000) suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Sillä tfLC3 määritystä soluja, jotka ekspressoivat väliaikaisesti tfLC3 [15] kasvatettiin yön yli ja käsiteltiin, kuten on kuvattu. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin 4′-6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Anneksiini-V-Alexa 568 värjäystä solut jotka ilmentävät pysyvästi GFP-LC3 viljeltiin kahdeksassa Kaivokammio dioja (BD Biosciences) ja käsiteltiin kuten on ilmoitettu. Anneksiini-V-Alexa 568 (Roche, Mannheim, Saksa) värjäys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki kuvat otettiin Olympus FV1000 mikroskoopilla 100X linssi (N.A. 1,30). Kuvat otettiin ja käsiteltiin käyttäen Fluoview ohjelmiston ja ImageJ.

Fluoresenssimikroskopia.

Immunofluoresenssikoe kuvia p62 (BD Biosciences, 1/200) hankittiin käyttämällä Nikon Eclipse TE200-E mikroskoopilla ja IPLab kuvankäsittelyohjelma (BioVision Technologies, Exton, PA).

Crystal Violet solunelinkykyisyysmääritys

elinkelpoisuus määritys (kristalliviolettia) suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä.

klonogeeninen jatkomaljausta Assay

soluja kasvatettiin eri olosuhteissa, ja kaikki solut kerättiin trypsinisaatiolla ja maljattiin 100-400 solua kuoppaa kohti kuuden kuopan kudosviljelylevyille. Pesäkkeitä kasvatettiin 11-14 päivä täydellisessä kasvualustassa ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla liuosta (80% dH

2O, 20% metanoli, 0,5% kristalliviolettia). Kuvia pesäkkeet otettiin käyttäen FluorChemE kuvantamisjärjestelmä (Cell Biosciences, Inc.), ja pesäkkeiden määrä analysoitiin käyttämällä AlphaVIEW SA (versio 3.2.3.0, Cell Biosciences, Inc.). Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vielä kaksi kertaa.

RPPA Analyysi

RPPA menettelyt vasta-aineen värjäyksen ja signaalin havaitseminen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10], [16].

Oncomine tietokantaan

Bittner multicancer aineisto on saatavilla julkista at https://www.oncomine.org/main/index.jsp [17], ja siksi ei IRB hyväksyntää edellytettiin. Kudoksia ero ilmaus copi kompleksin jäsentä (P≤10

-6) valittiin.

Tilastot ja data-analyysin

Kaikki tiedot analysoitiin käyttämällä GraphPad Prism 5 ohjelmisto (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA, USA). Vertailut ryhmien välillä arvioitiin tilastollisesti kahden tailed parillista t-testiä. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Verrata geeni-ilmentymisen tasot hyvänlaatuinen ja syöpä ryhmät, kahden näytteen Studentin t-testiä käytettiin. Käytimme Coxin suhteellinen vaara regressiomallin yksiulotteista selviytymisen analyysiä. Cutoffs korkean ja matalan ilmaisun ryhmät optimaalisesti alimman p-arvo. Kaikki tilastolliset analyysit, rasiakuvaajien, ja Kaplan-Meier selviytymisen tontteja suoritettiin käyttäen R Software (https://www.r-project.org).

Tulokset

siRNA Screening Osoittaa Coatomer Complex jäsenet kuten modulaattorit elinkelpoisuus ja Autophagy

tunnistaa uusia molekyylitason toimijoiden valvonnassa autophagic solukuoleman, teimme kaksi RNA-interferenssin (RNAi) näytöt löytää geenejä, kun pudotti johti molemmissa vähentynyt solujen elinkelpoisuuden ja muodostuminen autophagosomes. Ensin seulottiin ihmisen kinome koska kinaasien ja kinaasi liittyvät geenit ovat keskeisiä säätelijöitä monimutkaisten solutoiminnoille kuten autophagy. siRNA: t transfektoitiin neljässä eri solulinjoissa: kaksi munasarjasyövän solulinjoissa (SKOV3 [

HER2

monistetaan;

CDKN2A

,

PIK3CA

, ja

TP53

mutantit] ja OVCAR3 [

PIK3R1

ja

TP53

mutantit]) ja kaksi rintasyövän solulinjoissa (MDA-MB-231 [

BRAF

,

CDKN2A

,

KRAS

, ja

TP53

mutantteja] ja MDA-MB-468 [

EGFR

monistetaan;

PTEN

,

RB1 ​​

,

TP53

, ja

Smad4

mutantit]) eri geneettisiä taustoja. Kaikkiaan tunnistimme 67 geenejä, 9% kinome, että kun pudotti vähensi solujen elinkelpoisuuden (z-pisteet alle -2) (taulukko S1). Näiden 67 positiivinen osumia, pudotus 12 geenien vähensi elinkelpoisuus vähintään kahden testatuissa solulinjoissa. Nämä geenit olivat

AKT2

,

CHEK1

,

COPB2

,

PRKAR2B, RPS6KA2

ja

WEE1-

(kolmessa neljästä solulinjoja) ja

AVPR1B

,

CNKSR1

,

DGUOK, INSRR

,

JAK2, TAF1L

(kahdessa neljästä solulinjojen).

geenien tunnistamiseen myös mukana sääntelyn autophagy syöpäsoluissa, teimme kuvapohjaiseen pieni RNAi kirjasto (Accell, taulukko S2) näytön autophagosome muodostumista päätepisteenä. MDA-MB-231, SKOV3- ja U2OS syöpäsolulinjoissa transfektoitiin stabiilisti vihreän fluoresoivan proteiinin, mikrotubulukseen liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (GFP-LC3) reportteri vektori [18], [19]. Koska LC3 hajoaa loppuvaiheessa tuottavaa autophagy [20], jatkuva kertyminen LC3 vuonna pistekeratopatiaa rakkulat käytettiin merkkiaineena heikentynyt tai epäonnistuneen autophagy. Rapamysiini, 2-deoksi-D-glukoosia (2DG), ja imatinibi olivat positiivisia kontrolleja autophagosome muodostumista. Non-kohdistaminen salattu siRNA: t, käytettiin negatiivisina kontrolleina, eivät johtaneet autophagy (Fig. S1A-C). Kaikissa testatuissa solulinjoissa, havaitsimme, että ehtyminen coatomer proteiini-kompleksin alayksikön beeta 1 (COPB1) aiheutti kertymistä LC3-positiivisia pilkkuja, jotka ovat viittaavia autophagy (Fig. S1A-C; taulukko S3), joka osoittaa, että autophagy mekanismi on konservoitunut eri kasvain suvusta. Lopuksi, käyttäen siRNA näytöt olemme määritelleet COPB2 ja COPB1 modulaattoreina vastaavasti solujen elinkelpoisuuden ja autophagy.

Coatomer proteiinit moduloivat elinkykyyn

COPB1 ja COPB2, komponentit copi monimutkainen, katsottiin houkuttelevia ehdokkaita lisätutkimusta varten perusteella merkittävä vaikutus syöpäsoluissa molemmilla solujen elinkykyä ja autophagosome muodostumiseen (taulukko S1 ja S3, Fig. S1). Vuonna toissijainen näyttö, me validoitu ja analysoi vaikutukset solujen kasvuun ja autophagosome muodostumisen jälkeen kaatamalla riippumattomia jäseniä tämän monimutkaisen kolmessa syöpäsolulinjoissa (MDA-MB-231, MDA-MB-468 ja SKOV3). Kuten kuviossa S2, siRNA: t alennettu ilmentyminen useiden copi komponentteja. Vastaa meidän havainnot siRNA näytössä, ehtyminen COPA, COPB1, COPB2, COPG1, COPD, ja COPZ1 vähensi solujen kasvua (Fig. 1A ja C). Sitä vastoin solujen elävyys ei ollut vaikutusta käsitellyissä soluissa ei-kohdistuksen siRNA (Fig. 1A ja B) tai vain hieman vaikuttaa MCF10A, normaali kaltainen rinnan solulinja, kun COPB2 pudotus (kuvio. S9B). Lisäämällä pan-kaspaasi-inhibiittori zVAD ei pelastaa solukuolemaa (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että solukuolema oli kaspaasi-riippumaton. Sen vahvistamiseksi, että syöpäsolut ovat sitoutuneet kuolema kun copi on heikentynyt, päätimme klonogeeniset toipuminen 72 h siRNA hoidon MDA-MB-231 (Kuva. 1 D) ja U2OS (Fig. 1 E) syöpäsoluja. Molemmissa solulinjoissa, jatkomaljausta tehokkuus ei vähentää, kun COPG2 väheneminen kontrolliin verrattuna, vahvistaen tulokset. Sitä vastoin vähentää ilmentymistä COPA tai COPB2 lähes kokonaan poistetaan klonogeenisten talteenotto (Fig. 1 D ja E), joka on johdonmukainen elinkelpoisuuden tuloksia (Fig. 1A). Erityisesti jatkomaljausta tehokkuus ei lyhentynyt U2OS käsitellyissä soluissa rapamysiini (Fig. 1 F), sopusoinnussa kyky rapamysiini aiheuttaa tuottava autophagy kuin selviytymisen prosessi. Solukuolemaa jälkeen copi Knockdown oli edelleen Visualized ja vahvistettu käyttämällä anneksiini V värjäystä (kuvio. S3). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että suurin osa copi osat moduloivat elinkelpoisuuden syöpäsoluja.

(A) MDA-MB-231, MDA-MB-468, ja SKOV3-solut transfektoitiin siRNA: lla kohdistaminen riippumattomien jäsenten copi. Pudotus on PLK1 käytettiin positiivisena kontrollina solukuolemaa. Solujen lukumäärä 72 tunnin jälkeen mitattiin kristalliviolettia värjäystä. (B, C) edustaja valomikroskoopilla kuvaa MDA-MB-231-soluja käsiteltiin RF tai siRNA vastaan ​​COPB2. (D) klonogeeninen jatkomaljausta tehokkuutta MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen jälkeen vähentynyt ilmentyminen COPA, COPB2 tai COPG2 verrattuna soluihin, käsiteltiin RISC-free (RF). Tulokset ovat keskiarvo ± keskihajonta kolmena kappaleena kahden itsenäisen kokeen. Klonogeenisten jatkomaljausta tehokkuutta U2OS syöpäsolujen käsittelyn jälkeen siRNA vastaan ​​COPB2 tai COPG2 (E) tai rapamysiini (F). Tulokset ovat keskiarvo ± keskihajonta kolmena kappaleena kahden itsenäisen kokeen. **, P 0,01; ***, P 0,001.

Coatomer proteiinit moduloivat Autophagy

Seuraavaksi, me testasimme ovatko ehtyminen eri riippumattomien copi monimutkaisia ​​proteiineja aloitetaan autophagy, käyttäen pistemäinen GFP-LC3 muodostus lukea ääneen. Alennettu ilmentyminen COPA, COPB1, COPB2, COPG1, COPD, ja COPZ1 indusoi pistemäinen GFP-LC3 muodostumista MDA-MB-231, MDA-MB-468 ja SKOV3 syöpäsolulinjoissa (Fig. 2A). Nämä tulokset olivat verrattavissa nähdä, kun soluja käsiteltiin imatinibin, positiivisena kontrollina autophagosome induktion (Fig. 2A-C). Autophagosome muodostuminen arvioitiin myös konversio endogeenisen LC3-I LC3-II käyttäen immunoblottausta, koska määrä LC3-II korreloi määrän autophagic kalvoja merkitty LC3-II [19]. Yhdenmukainen saatuja tietoja syöpäsoluissa eksogeenisesti yli-ilmentävät GFP-LC3 (Fig. 2A-C), ja lukuun ottamatta COPG2, vähentää ilmentymistä coatomer alayksiköiden johti kertyminen endogeenisen LC3-II MDA-MB-231-soluja (Fig. 2D). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin MDA-MB-468 ja U2OS syöpäsolujen (Fig. 2E). Olemme edelleen validoitu pysyvyys LC3-II lisäys jälkeen copi ehtyminen laajennetulla aika kurssin analyysi (kuvio. 2F). Kestävällä alennettu ilmaus copi yllä LC3-II ilmentymistä ilman näkyvää hajoamista LC3-II, viittaavien heikentynyt autophagy. Elektronimikroskopia-analyysi (Fig. 3A, C ja E, lisää Fig. 3B, D ja F) vahvisti muodostuminen ja merkittävä lisäys (Fig. 3G) autophagosomes jälkeen COPB2 loppuminen (Fig. 3C ja D) ja imatinibihoitoa (Fig. 3E ja F) on Mikroskooppitutkimus tasolla läsnäolo kaksinkertainen kalvo soluelimiin sisältävä pilkkoutumattomiin sytoplasmisen sisällön [18]. Sen sijaan ohjata siRNA (RF) (Fig. 3A ja B) ei edistänyt autophagosome muodostumista. Vaikka kasvu autophagosomes oli samanlainen MDA-MB-231-soluja käsiteltiin COPB2 siRNA ja imatinibin, olemme havainneet, että autophagosomes aiheuttama COPB2 siRNA oli merkittävästi suurempi verrattuna autophagosomes aiheuttamaa imatinibi arvioituna määrällisesti autophagosomal /sytoplasma-alue elektronin mikroskopia kuvat (Fig. 3H). Tämä havainto varmistettiin edelleen määrittämällä koko GFP-LC3 positiivinen organelles MDA-MB-231-soluja käsiteltiin COPB2 siRNA tai ohjata siRNA (Fig. S4A). Koko autophagosomes aiheuttama siCOPB2 on myös suurempi kuin nälkään aiheuttama autophagosomes (Fig. S4b ja S4C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että copi ehtyminen johtaa kertymistä LC3-positiivisten pilkkuja syöpäsoluissa.

(A) MDA-MB-231, MDA-MB-468, ja SKOV3- solut stabiilisti yli-ilmentävät GFP-LC3 olivat transfektoitiin siRNA kohdistaminen riippumattomat jäsenet copi 72 tuntia, ja autophagosome muodostuminen analysoitiin käyttäen IN Cell analysaattori 1000-järjestelmä. Imatinibi käytettiin positiivisena kontrollina autophagosome muodostumista. Tulokset ovat keskiarvo ± SD alkaen kolmen rinnakkaisen. Edustavia kuvaaja kahdessa riippumattomassa kokeessa näytetään. (B, C) edustaja epifluorescent mikroskopialla kuvia (IN Cell Analyzer 1000) GFP-LC3-positiivisia rakkuloiden hallinnassa MDA-MB-231-soluja tai jälkeen COPB2 ehtyminen. (D) immunoblottianalyysi LC3 MDA-MB-231-solujen 72 tunnin kuluttua siRNA välittämää ehtyminen riippumattomien jäsenten copi. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (E) MDA-MB-468 ja U2OS soluja käsiteltiin RF tai COPB2 siRNA analysoitiin proteiinin tasot LC3. (F) MDA-MB-231-solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​COPB2, COPG2 tai RISC-free (RF) ja kasvatettiin osoitetut ajat, hajotettiin, ja immunoblotattiin vasta-LC3, COPB2, COPG2 ja β-aktiini. *, Epäspesifinen bändi.

(A-F) Transmissioelektronimikroskopia analyysi autophagy MDA-MB-231-solujen käsitelty RF tai siRNA vastaan ​​COPB2 48 tuntia tai imatinibia 24 tuntia. Valkoinen arrowheads osoittaa autophagosomes näkyvät paneelit C ja E. (B, D, F) Voimakas suurennos kuvia boxed alueilla. Scale palkit osoittavat 2 um (A, C, E) ja 500 nm (B, D, F). (G) määrä autophagosomes solua kohden laskettiin laskemalla kaksinkertaisen kalvon soluelimiin 20 tai enemmän yksittäisiä soluja. (H) prosentuaalinen autophagosomal ala laskettiin mittaamalla kattama alue kaksinkertainen kalvo soluelimiin sytoplasmassa on 20 tai enemmän yksittäisiä soluja. **, P 0,01; ****, P 0,0001

Häiriöt copi indusoi epäonnistuneen Autophagy

Koska ehtyminen copi monimutkaisten jäsenten aiheutti solukuolemaa ja autophagosome muodostumista, ryhdyimme testata onko epäonnistuneen autophagy oli mekanismi. Erottamaan epäonnistuneen ja tuottava autophagy analysoitiin p62, joka on ensisijaisesti heikkene autophagy, mutta arvot pysyvät vakiona tai kasvaa kun induktion epäonnistuneen autophagy [21]. Kuten määritettiin immunoblot-analyysi eri syöpäsolulinjojen (Fig. 4A) ja immunofluoresenssianalyysillä MDA-MB-231-soluja (Fig. 4B, C), siCOPB2 ei vähentänyt p62 tasoja, kuten voisi odottaa tuottavan autophagy, mutta kasvoi tasot p62 verrattuna kontrolliin tasolle. Sen sijaan, p62-tasot laskivat MCF10A (Fig. S9D), vaikka COPB2 proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentyneet (Fig. S9C). Lisäksi, käytimme bafilomysiini A1 (BafA1), lysosomiin-spesifinen inhibiittori proteiinien hajoaminen ja loppuun vaiheissa autophagy prosessin inhiboimiseksi autophagic flux [18], [22]. BafA1 hoito on osoitettu lisäävän LC3-II-tasoja soluissa, joille tehdään tuottava autophagy mutta on rajallinen vaikutus LC3-II-tasoja soluissa olevien epäonnistuneen autophagy [20]. MDA-MB-231-solujen knockdovvn COPB2, BafA1 hoito ei entisestään LC3-II-tasoja (Fig. 4D) toisin kuin COPG2 loppuun tai kontrollisoluja, osoittaa heikentynyt hajoaminen autophagosomal sisältöä lysosomeihin jälkeen COPB2 ehtyminen . Me vahvisti tämän havainnon U2OS syöpäsolujen käsitelty joko BafA1 tai rapamysiini (Fig. S5). Heikentynyt hajoaminen sisemmän luminal sisältöä autophagosomes by lysosomeihin voi johtua: 1) epäonnistui autophagosome /lysosomifuusio; 2) heikentynyt hajoaminen; tai 3) epätäydellinen kierrätykseen autolysosomal osia [18], [23]. Sen määrittämiseksi, mitkä näistä mahdollisuuksista vastasi kasvu LC3-II ja p62 soluissa kanssa copi ehtyminen, ensin analysoidaan fuusio autophagosomes (GFP-LC3) ja lysosomeihin (LAMP2) jälkeen knockdovvn copi MDA-MB-231-solujen stabiilisti transfektoitu GFP-LC3 (Fig. 5A). Konfokaaliset analyysi paljasti rinnakkaispaikantumisen GFP-LC3 ja LAMP2 syöpäsoluissa käsitelty siRNA vastaan ​​COPB2 (Kuva. 5A), mikä viittaa siihen, fuusio ei täysin estänyt ehtyminen copi. Testasimme lisäksi vaikutus COPB2 siRNA on autophagosomal hajoamista käyttäen MRFP-GFP tandem fluoresoiva merkitty LC3 (tfLC3; [15]). Soluissa transfektoitu tilapäisesti tfLC3, GFP- /RFP-positiivinen puncta edustavat autophagosomes ei fuusioitunut lysosomeihin, kun taas RFP-positiivisia /GFP-negatiivisten puncta edustavat autolysosomes kuin GFP nopeammin sammutetaan alhainen lysosomaalisen pH [15]. MDA-MB-231-soluja transfektoitiin ohimenevästi tfLC3 osoitti rinnakkais- ja MRFP ja GFP-signaalin jälkeen copi väheneminen tai BafA1 hoitoa (kuvio. 5B, rivi 2 ja 3), joka ilmaisee heikentynyt kypsymisen autophagosomes. Hoito MDA-MB-231-solujen imatinibin johti RFP-positiivisia /GFP-negatiivisten puncta edustava läsnäolo autolysosomes ja siten autophagic flux (Fig. 5B, viimeinen rivi). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin U2OS syöpäsoluja (Fig. S6). Lisäksi COPB2 köyhdytettyä solut osoittivat suurta LAMP2 positiivinen organelles (Fig. S4d). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että häiriöt copi indusoi heikentynyt, epäonnistuneen autophagy mahdollisesti epäonnistuminen kypsymisen ja kierrätetään.

(A) osoitti syövän solulinjat käsiteltiin ohjaus siRNA (RF) tai COPB2 siRNA varten