Krooninen sairaus

tiivistelmä

konstitutiivisen aktivaation transkriptiotekijän tumatekijä-KB: n (NF-KB) on mukana tuumorigeneesiin ja chemo-vastus. Koska avainsäätelijä NF-KB, IKKβ on tärkeä terapeuttinen kohde erilaisiin syöpiin. Trichothecin (TCN) on metaboliitti eristetty endofyyttisenä sieni on yrttikasvi

Maytenus hookeri Loes.

Tässä tutkimuksessa arvioimme antituumorivaikutuksen of TCN ja totesi, että TCN selvästi estää syöpäsolujen kasvua konstitutiivisesti aktivoitua NF-KB. TCN indusoi G0 /G1 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin syöpäsoluissa, aktivoivat pro-apoptoottisia proteiineja, mukaan lukien kaspaasi-3, -8 ja PARP-1, ja vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-x L, ja surviviini. Reportteri toiminnan määritys ja kohde- geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että TCN toimii voimakas estäjä NF-KB-signalointireitin. TCN estää fosforylaatiota ja hajoamista IκBα ja estää tumaansiirtymiseen p65, ja siten estää ilmentymistä NF-KB kohdegeenien XIAP, sykliini D1, ja Bcl-xL. Vaikka TCN ei suoraan häiritse IKKβ kinaasi, se tukahduttaa fosforylaatiota IKKβ. Yliekspressio konstitutiivisesti aktivoitua IKKβ keskeytetty TCN indusoi syöpäsolujen apoptoosin, kun taas pudotus endogeenisen IKKβ siRNA herkistyneet syöpäsoluja kohti indusoiman apoptoosin TCN. Lisäksi TCN osoitti selvästi heikompaa vaikutusta normaaleihin soluihin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että TCN voi olla potentiaalinen terapeuttinen ehdokas syövän hoitoon, kohdistaminen NF-KB: n signalointi.

Citation: Su J, Zhao P, Kong L, Li X, Yan J, Zeng Y, et al. (2013) Trichothecin indusoi solukuoleman NF-KB konstitutiivisesti aktivoitu ihmisen syöpäsoluja kautta esto IKKβ-fosforylaation. PLoS ONE 8 (8): e71333. doi: 10,1371 /journal.pone.0071333

Editor: Linda Bendall, Westmead Millennium Institute, University of Sydney, Australia

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2013; Hyväksytty: Kesäkuu 27 2013. Julkaistu: 01 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Su et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat 100 Talents ohjelma Kiinan Academy of Sciences (Y. Li), Major valtion Basic Research Development Program of China (nro 2009CB522300), Natural Science Foundation of China (No.81173076), ja Recruited Top Talent of Sciences and Technology Yunnanin maakunnassa (2009CI120). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

NF-KB transkriptiotekijöiden koostuvat viidestä homologisten alayksiköiden: RelA (p65), RelB, cRel (Rel), NF-κB1 (P50 ja sen esiaste p105) ja NF-κB2 (P52 ja sen esiaste P100) , jotka toimivat eri homodimeerejä ja heterodimeerejä [1], [2]. Kanonisessa NF-KB-reitin, solut voidaan stimuloida eri ärsykkeiden, kuten reaktiivisen hapen, tuumorinekroositekijä-alfan, interleukiini-1-beeta, bakteerien lipopolysakkarideja, jne. Kun aktivointi, inhiboiva alayksikkö IκBα fosforyloituu että IKB-kinaasin ( IKK) kompleksi, joka sitten ubikitinoituja vajaatoiminnan kautta proteasomin reaktiotien, edistää translokaatiota p65 /p50-kompleksin tumaan ja aktivoi ilmentymistä myötävirran geeneistä [3], [4].

NF-KB signalointi on tärkeä rooli säätelyssä tulehduksen, kasvaimen kehittymisen ja syövän kehittymisessä [5] – [7]. Monenlaisia ​​syöpiä-lukien hematogenous pahanlaatuisia kasvaimia (esimerkiksi leukemia, lymfooma, multippeli myelooma ja), ja kiinteitä kasvaimia (esimerkiksi keuhkojen, rinnan ja haiman) -NF-KB: n on jatkuvasti aktivoitu [8], [9]. NF-KB: n up-säätelee ilmentymistä anti-apoptoottisten geenejä, jotka koodaavat Bcl-xL: n, XIAP, cIAP1 ja cIAP2, samoin kuin proliferatiivinen geenejä, kuten sykliini D1: n ja IL-6 [10] – [13]. NF-KB: n aktiivisuus liittyy läheisesti myös kasvaimen etäpesäkkeiden ja syövän chemo-vastus. NF-KB: n aktivaation aiheuttaa geenien transkriptiota mukana angiogeneesin, joka on kriittinen prosessi kasvaimen muodostumisessa ja metastaasissa [14]. Lisäksi NF-KB: n estäjät parantaa herkkyyttä syöpien kemoterapeuttisten aineiden, kuten Paclitaxol, TNF-α ja KOKEILU [15] – [17]. Koska yhteys NF-KB ja syövän, kehittäminen NF-KB estäjä valtavat mahdollisuudet tukahduttamaan tietyntyyppisten syövän leviämisen sekä parantaa nykyisiä syöpähoitojen [18], [19].

Maytenus hookeri Loes.

on käytetty folk korjata pitkään Lounais Kiinassa, koska sen syövän vastaisia ​​ja tulehdusta toimintaa. Aiemmin maytansiini tunnistettiin sen syövän vastaisen vaikutuksen häiritsemällä mikrotubuleiksi [20], [21]. Derivaatta maytansiini, DM1, on käytetty trastutsumabilla emtansine (T-DM1), uusi lääke on kehitetty hoitoon HER2-positiivisen rintasyövän [22]. Kuitenkin kemialliset ainesosat vastuussa syövän vastaisen toiminnan tämän kasvin ansaitsevat lisätutkimusta.

Trichothecin (TCN) eristetään endofyyttisten sieni

Maytenus hookeri Loes

. Aiemmat raportit meidän ja muiden osoitettu, että TCN on mukana joitakin anti-kasvain toimintaa, mutta anti-kasvain profilointi tai taustalla mekanismeja näistä toimista puuttuvat [23] – [25]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TCN estää niiden kasvun ihmisen syöpäsoluja estämällä NF-KB: n signalointia. Tuloksemme osoittivat, että TCN vaimentaa aktivointi IKKβ tukahduttamalla sen fosforylaatio, estää ilmentymistä NF-KB kohdegeenien, ja indusoi solusyklin pysähtymiseen ja syöpäsolun apoptoosin. Uutena estäjä NF-KB-reitin, TCN voi osoittautua mahdollisesti lupaava lääke-ehdokas kehittämään uusia syöpähoitojen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen syövän solulinjat, HepG2, A549, PANC-1 ja HL-60, ihmisen sikiön munuaisen solulinjan HEK 293T, ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS-2B ja ihmisen munuaisen proksimaalisen tubuluksen epiteelisolulinja HK-2 hankittiin ATCC: ltä. Ihmisen paksusuolen epiteelisolujen linja (CCD-841-Con) oli ystävällisesti lahjakas tohtori Lin, Li instituutin Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina) [26]. Soluja viljeltiin 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI-1640, MEM tai DMEM, joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, UT).

Reagenssit

monoklonaalisia vasta-aineita NF-KB: n P65, PARP-1, kaspaasi-8, Bcl-x L, kaspaasi-3, sykliini D1, Bcl-2, surviviini, fosfo-IKKβ (Ser177) ja β-aktiini sekä polyklonaalisia vasta-aineita IκBα, fosfo-IκBα (pS32 /pS36) ostettiin Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). XIAP polyklonaalinen vasta-aine saatiin Proteintech (Chicago, IL). Monoklonaalinen vasta-aine fosfo-NF-KB: n p65: n ja polyklonaalinen vasta-aine kokonais IKKβ hankittiin Cell Signaling Technologies (Boston, MA). NF-KB: n p65 lusiferaasireportteriplasmidi (PNF-KB-Luc) hankittiin Beyotime Institute for Biotechnology (Kiina). Plasmidi pCMV-SPORT6 Lisätään ihmisen RelA sekvenssi ajo ilmentymistä p65 saatiin Thermo Scientific (Rockford, IL). Alexa Fluor 546 konjugoitu sekundaarinen vasta-aine, Lipofectamine 2000, Z’-LYTE ™ kinaasimääritys kit ja IKKβ rekombinantti ihmisen proteiini saatiin Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Dual-Luciferase Reporter Assay Kit saatiin Promega (Madison, WI). Duplex siRNA: t, joissa kaksi tymidiinillä jäämiä (dTdT) 3′-pään sekvenssin syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Rekombinantti ihmisen TNF-α hankittiin PeproTech (Rocky Hill, NJ). Ellei toisin mainita, kaikki muut reagenssit saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

yhdisteet

TCN ja muut testatut yhdisteet uutettiin

Trichothecium roseum

LZ93, endofyyttisenä sieni eristetty

Maytenus hookeri Loes.

, kuten aiemmin on kuvattu [24] (rakenteet nimetty kuviossa 1A ja kuviossa S1A).

(A) kemiallinen rakenne trichothecin. (B) Cell sytotoksisia vaikutuksia trichothecin peräkkäisissä pitoisuuksina. 48 tunnin kuluttua hoidon, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. (C) anneksiini V-FITC /PI-analyysi apoptoosin soluissa, joita käsiteltiin TCN 24 tuntia. (D) HL-60, HepG2, A549 ja PANC-1-soluja käsiteltiin TCN 24 tuntia ja solulysaateista tehtiin Western blot-analyysi vasta-aineiden kanssa osoitti. p-aktiini käytettiin lastaus valvontaa. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmena rinnakkaisena kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Sytotoksisuusmääritys ja IC

50 määritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Soluja käsiteltiin osoitetuilla yhdisteillä pitoisuuksina 0,064, 0,32, 1,6, 8 ja 40 uM 96-kuoppaisilla levyillä. 48 tunnin kuluttua, 0,1 mg MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja lopullinen konsentraatio on 20%. Sitten soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h ja absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä spektrofotometrillä. IC

50-arvot määritettiin ei-lineaarisella regressioanalyysillä käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston (GraphPad, Inc., San Diego, CA).

Luciferase Reporter Assay

HEK 293T-soluja transfektoitu tilapäisesti PNF-KB-Luc ja PRL-TK (Promega, Madison, WI) plasmideja käyttäen Lipofectamine 2000: ssa 4 h 96-kuoppalevylle. Soluja esi-inkuboidaan sitten eri pitoisuuksilla yhdisteiden 1 h, ja sen jälkeen aktivoitu 25 ng /ml TNF-α: ssa 18 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay kit.

Western-blottaus

Yhteensä solulysaatteja valmistettiin suoraan lyysi 2 x Laemmli-puskuria (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% glyserolia, 10% β-merkaptoetanolia, ja 0,004% bromifenolisinistä). Sitten näytteet fraktioitiin 12% akryyliamidigeelillä, siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad), ja niitä inkuboitiin erityisiä primaarisilla vasta-aineilla, jota seuraa vastaava peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Proteiinit kohteisiin visualisoitiin kemiluminesenssiosoitusta koskevasta ImageQuant LAS mini4000 (GE Healthcare).

Immunofluoresenssivärjäys

p65 translokaatio koetta, HepG2-soluja kasvatettiin kammio dioja 24 h ja valmiiksi inkuboidaan TCN 37 ° C: ssa 1 h, minkä jälkeen TNF-α stimulaatio 20 min. Sillä IKKβ fosforylaation havaitsemiseen, soluja esi-inkuboitiin TCN 37 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi TNF-α stimulaatio 10 min. Solut kiinnitettiin sitten fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen 4% paraformaldehydillä 20 min ajan, ja tämän jälkeen tehtiin läpäiseviksi fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jossa oli 0,1% Triton X-100. Jos haluat tarkkailla lokalisoinnin p65-alayksikön, soluja inkuboitiin anti-p65-vasta-aineen ja vastaavien FITC konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ennen värjäystä ytimien kanssa DAPI. Sillä IKKβ fosforylaation havaitsemiseen, soluja inkuboitiin anti-fosfo-IKKβ-vasta-aine ja vastaava Alexa Fluor 546 sekundäärinen vasta-aine. Kuvat myöhemmin havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Eclipse Ti, Nikon).

solukuoleman määritys

Cell apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis kit (BD Biosciences, Franklin Lakes , NJ) mukaan valmistajan protokollia. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,2 x 10

6 solua /kuoppa. 24 tunnin kuluttua yhdisteen käsittely ilmoitettuina pitoisuuksina, solut kerättiin ja pestiin sitten kahdesti kylmällä PBS: llä, ja sitten suspendoitiin uudelleen sitoutumispuskuriin, joka käsittää anneksiini V-FITC: llä ja propi- jodia (PI). Kun oli inkuboitu 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä, fluoresoiva intensiteetti mitattiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).

Cell Cycle Analysis

HepG2-soluissa ( 5 x 10

5cells /kuoppa 12-kuoppaisilla levyillä) inkuboitiin TCN ja ilmoitettuina ajankohtina (8, 16 ja 24 h) ja pitoisuudet (1,25, 2,5 ja 5 uM). Solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä, ja inkuboitiin sitten 20 ui RNaasi A: lla (1 mg /ml) 30 minuutin ajan ja värjättiin propidiumjodidilla (PI) liuosta (50 ug /ml lopullinen konsentraatio) pimeässä 1 tunti. Fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Prosenttiosuudet solujen jaetaan eri vaiheissa solusyklin määritettiin käyttäen FlowJo 7.6.1.

yli-ilmentyminen IKKβ CA

konstrukti ajo ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisen IKKβ (S177E, S181E) (IKKβ CA) saatiin Addgene (Catalog No.11105) [27]. HepG2-solut transfektoitiin plasmideilla käyttäen Lipofectamine 2000: Noin 12 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin TCN vielä 24 h.

RNA Interference

HepG2-soluja transfektoitiin ohimenevästi sekoitetun ohjaus siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ’) ja IKKβ-siRNA (5′-GGUGGAAGAGGUGGUGAGCTT -3’) [28], vastaavasti, jonka pitoisuus on 150 pmol /60 mm malja käyttäen Lipofectamine 2000: saatu testattava yhdiste lisätään myöhemmin ja transfektoituja soluja 48 h transfektion jälkeen.

IKKβ Kinase Activity Assay

IKKβ kinaasimääritys suoritettiin Z’-LYTE ™ Kinase Assay kit valmistajan ohjeiden protokollia. Lyhyesti, rekombinantti ihmisen IKKβ proteiineja inkuboitiin kinaasireaktioseosta kasvavia määriä TCN tai staurosporiinin, kinaasi-inhibiittori, 1 tunti. Sitten reaktio pysäytettiin pysäytys- reagenssin ja fluoresenssi havaittiin virityksen ollessa 400 nm ja päästöt 445 nm ja 520 nm käyttäen EnVision Multimode Plate Reader.

Tulokset

TCN Estää Cell kasvu ja indusoi apoptoosia NF-KB konstitutiivisesti aktivoitu Syöpäsolut

Tässä tutkimuksessa selvitettiin syövän vastaisen aktiivisuuden TCN MTT solunelinkykyisyysmääritys neljässä syöpäsolulinjoissa kätkeminen konstitutiivisesti aktivoitua NF-KB [29] – [32]. Kaikilla testatuilla solulinjoilla, TCN näytteillä ilmeinen kasvun estäminen (kuvio 1 B). IC

50 arvoja HL-60, HepG2, A549 ja PANC-1 solut olivat 0,18, 0,82, 0,39, ja 0,28 uM. Anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen analysoitiin edelleen solun apoptoosin virtaussytometrialla. Käsiteltiin 5 uM TCN 24 tuntia, solu- apoptoosin HL-60, HepG2, A549 ja PANC-1-soluissa huomattavasti kohotettu 61,13%, 44,03%, 34,93%, ja 24,47%: lla. Samaan aikaan apoptoosin ihmisen normaalia solulinjoissa BEAS-2B, HK-2 ja CCD-841-con ei vaikuttanut TCN hoitoa, jopa korkein pitoisuus 5 uM, mikä viittaa TCN hallussaan selektiivisyyttä syöpäsoluja (kuvio 1 C). Western blot-analyysi osoitti myös, että TCN merkittävästi indusoi kaspaasi-8 ja kaspaasi-3, sekä pilkkominen PARP-1 neljän syöpäsolulinjoissa. Proteiini taso Bcl-2, keskeinen säätelijä luontaisen apoptoottisen reitin, oli myös alas-säädellä TCN hoitoa. Lisäksi taso surviviinin, antiapoptoottisena proteiini, laski rajusti vuonna TCN käsitellyissä soluissa, erityisesti HL-60 ja HepG2-soluissa (kuvio 1 D).

TCN Estää NF-KB: n signaloinnin ja indusoi solukierron pysähtymisen at G0 /G1

vaikutus TCN NF-KB signalointi testattiin HEK 293T-soluissa ohimenevästi transfektoitu NF-KB-reportterin (PNF-KB-Luc) kantavassa reportterigeenin ilmentyminen oli selvästi aktivoitiin TNF -α, joka estää tehokkaasti TCN (kuvio 2A). Voit tarkistaa, onko TCN estää luontainen NF-KB syöpäsoluissa, tutkimme ilmentymistä NF-KB kohdegeenien neljän NF-KB aktivoituu syöpäsolulinjoissa käsitelty TCN. Proteiini tasot p65, XIAP, sykliini D1, ja Bcl-x L selvästi säädellä vähentävästi TCN käsitellyissä soluissa (kuvio 2B). Koska sykliini D1 tarvitaan G1 /S solusyklin etenemisen, tutkimme vaikutus TCN on solusyklin pysähtymiseen. HepG2-soluja käsiteltiin 2,5 uM TCN. Ilmeinen G0 /G1 solukierron pysähtymisen havaittiin jo 8h. Kuitenkin pidentää hoidon, kasvua solujen Sub-G1-vaiheessa havaittiin, mikä osoittaa solujen indusoimaa apoptoosia TCN (kuvio 2C).

(A) HEK 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi PNF-κB- luc plasmidit seuraa käsittely TCN 1 h ennen kuin se stimuloitiin 25 ng /ml TNF-α: ssa 18 tuntia. (B) lysaatit fromcells käsitelty TCN 24 tunnin alistettiin western blot analyysin kanssa p65, XIAP, sykliini D1 ja Bcl-x L-vasta-aineita. (C) HepG2-soluja käsiteltiin 2,5 uM TCN 8, 16 ja 24 h. Solut kerättiin ja alistettiin solusyklin analyysi. Prosenttiosuus soluja eri vaiheiden solusyklin analysoitiin FlowJo. Kokeet tehdään itsenäisesti kolmena kappaleena, tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat. Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin Yksisuuntainen ANOVA, ** p 0,01.

tutki tarkemmin vaikutukset trichothecolone, johdannainen TCN, solujen kasvuun ja NF-KB: n aktiivisuutta. Trichothecolone on toinen metaboliitti eristetty endofyyttisten sieni

Maytenus hookeri Loes.

, Joka on sama vanhempi ydin kanssa TCN, poikkeuksena erilaisen substituentin 4-OH [24]. Kuten TCN, trichothecolone esti myös solujen kasvun ja NF-KB: n reportteri aktiivisuus (kuvio S1), mutta molemmat toimet ovat paljon heikompia, mikä viittaa siihen, että substituentti 4-OH tämän luokan yhdisteitä on kriittinen niiden biologisia vaikutuksia.

TCN Estää fosforylaatio ja Hajoaminen IκBα ja Blocks p65 tumaansiirtymiseen

tarkistanut vaikutus TCN on tumaansiirtymiseen p65, yksi tunnusmerkki NF-KB: n signalointi. TNF-α indusoi translokaatio NF-KB sytoplasmasta tumaan, ja TCN merkittävästi esti translokaatio prosessi HepG2-soluissa (kuvio 3A). Yli-ilmentyminen p65 merkittävästi käänteinen inhiboiva vaikutus TCN on transkription NF-KB-reportterin (kuvio 3B). Sitten testattiin vaikutus TCN on IκBα fosforylaatioon ja hajoamista. TCN inhiboi TNF-α indusoimaa IκBα fosforylaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla, ja merkittävästi estää hajoamista IκBα. Enemmän poignantly, olemme huomanneet, että TCN esti p65 fosforylaation Ser536 (kuvio 3C), mikä edistää hajoamista IκBα ja NF-KB: n signaloinnin [33], [34].

(A) HepG2 solut esikäsiteltiin 2,5 uM TCN stimuloitiin 25 ng /ml TNF-α: ssa 20 minuuttia ja käsiteltiin immunovärjäys anti-p65-vasta-ainetta. Tumat solut värjättiin DAPI (sininen) ja p65 tehtiin näkyväksi vihreän fluoresenssin. (B) HEK293T-solut transfektoitiin ohimenevästi PNF-KB-Luc ja p65 ekspressioplasmidien minkä jälkeen esikäsittely 0,3 uM TCN ja stimulaation 25 ng /ml TNF-α. Reportteri aktiivisuus mitattiin sitten. (C) HepG2-solut esikäsiteltiin TCN kerättiin sen jälkeen, kun on stimuloitu 25 ng /ml TNF-α: ssa 10 minuuttia. Solulysaatit analysoitiin sitten Western blot käyttämällä vasta-aineita vastaan, fosfo-IκBα, fosfo-p65 ja IκBα. Kokeet tehdään itsenäisesti kolmena kappaleena ja tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat. Tilastollinen analyysi oli suorittaa Studentin t-testi, * p 0,05.

TCN Estää fosforylaatio IKKβ indusoima TNF-α

IκBα ja p65 ovat substraatteja IKKβ kinaasi, joka aktivoituu käynnissä fosforylaation (Ser 177 ja Ser 181) ja sen jälkeen fosforyloi IκBα [35], [36], tarkastetaan fosforylaatiota IKKβ TNF-α käsiteltyjen HepG2-solujen immunofluoresenssilla ja western blot -analyysillä. Huomasimme, että taso fosforyloidun IKKβ laski rajusti seuraavien TCN hoidon yhteenlasketun IKKβ proteiinin taso muuttumattomana (kuvio 4A ja B). Sen määrittämiseksi, onko TCN häiritsee IKKβ kinaasiaktiivisuuden suoraan, kinaasin aktiivisuuden määritys suoritettiin käyttämällä puhdistettua ihmisen IKKβ rekombinanttiproteiini käyttäen staurosporiini, voimakas estäjä, positiivisena kontrollina. Tulos osoitti, että TCN ei vaikuttanut kinaasiaktiivisuutta rekombinantti IKKβ (kuvio 4C). Nämä tiedot osoittivat, että TCN estää NF-KB signalointi tukahduttamalla aktivoituminen IKKβ kautta estämällä sen fosforylaatio.

(A) IKKβ fosforylaatio havaittiin fosfo-IKKβ vasta-aineen HepG2-soluissa stimuloidaan 25 ng /ml TNF a 10 min. Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja tutkittiin fluoresenssimikroskooppiin. (B) Western blot-analyysi osoittaa inhibition IKKβ fosforylaation soluissa käsiteltiin 2,5 uM TCN. Solut kerättiin sen jälkeen, kun on stimuloitu 25 ng /ml TNF-α: ssa 10 minuuttia. (C) IKKβ kinaasiaktiivisuutta analysoitiin rekombinantilla IKKβ käyttäen Z’-LYTE ™ kinaasianalyysiä kit. Fluoresenssi havaittiin 400 nm varten viritysaallonpituuksia ja 445 nm: n ja 520 nm päästöjen aallonpituuksilla. Kokeet tehdään itsenäisesti kolmena kappaleena ja tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat.

TCN aiheuttama syöpä solukuoleman välittyy esto IKKβ-fosforylaation

TCN solukuolema tutkittiin soluissa yliekspressoivat konstitutiivisesti aktiivinen (CA) muodossa IKKβ [27], [28]. Kuten on esitetty kuviossa 5A, yliekspressio IKKβ CA HepG2-soluissa riittävän aktivoitu NF-KB: n signaloinnin lusiferaasiaktiivisuuden määrityksessä. TCN hoito vastavaikuttavina TNF-α in NF-KB: n signalointia, kun taas IKKβ CA transfektion tehokkaasti päinvastaiseksi estävää vaikutusta TCN. Tasaisen, yliekspressio IKKβ CA keskeyttänyt TCN indusoi solujen apoptoosia HepG2-soluissa (kuvio 5B). Samaan aikaan, Western blot-analyysi osoitti, että deaktivointi kaspaasi-3, PARP-1 ja säätelyä surviviinin mukaan IKKβ CA (kuvio 5C).

(A) HEK 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi IKKβ CA tai tyhjä vektori 12 h, sitten esikäsiteltiin 2,5 uM TCN ja stimuloitiin 25 ng /ml TNF-α: ssa 18 tuntia. Solut altistettiin analyysi lusiferaasiaktiivisuuden. (B) HepG2-solut transfektoitiin ohimenevästi IKKβ CA tai tyhjän vektorin 12 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin 2,5 uM TCN 24 tuntia. Solut altistettiin apoptoosin analyysillä. (C) HepG2-solut transfektoitiin IKKβ CA tai tyhjän vektorin 12 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin 2,5 uM TCN 24 tuntia. Solut altistettiin Western blot analyysi ekspression ilmoitettu proteiineja. (D) HepG2-solut transfektoitiin väliaikaisesti salattua siRNA tai IKKβ-siRNA 48 h, käsiteltiin 2,5 uM TCN 24 tuntia ja niille suoritettiin apoptoosin analyysillä. (E) HepG2-soluja transfektoitiin ohimenevästi salattu siRNA tai IKKβ-siRNA käsiteltiin 2,5 uM TCN 24 tuntia. Solulysaatit kerättiin ja alistettiin western blot analyysin kanssa erityisistä vasta. Kokeet tehdään itsenäisesti kolmena kappaleena ja tulokset raportoidaan keskiarvot ja keskihajonnat. Tilastollinen analyysi suorittaa Studentin t-testi, * p 0,05.

Seuraavaksi tarkastetaan vaikutus IKKβ Knockdown on apoptoottista aktiivisuutta TCN. Verrattuna hoidon TCN yksin, knockdovvn IKKβ siRNA herkistyneet HepG2 solut TCN indusoiman apoptoosin, apoptoottisten suhde nostamisesta 43.11% (18,17% vuonna TCN hoito yksinään) (kuvio 5D). Kuten on esitetty kuviossa 5E, ilmentymisen IKKβ HepG2 osittain pieneni hoidon IKKβ siRNA. Yhdenmukainen lisääntynyt solujen apoptoosin induktio, alas-säätely anti-apoptoottiset proteiinit (surviviinin, XIAP ja Bcl-2) by TCN parannettiin IKKβ Knockdown soluissa, ja lohkaisu kaspaasi-3 nostettiin samoin (kuva 5E) . Samaan aikaan, transfektio ohjaus salattu siRNA ei ollut vaikutusta vasteen HepG2 solujen TCN hoitoon (kuvio 5D, 5E).

Keskustelu

Koska yhteys NF-KB: n ja syövän, kehittäminen NF-KB estäjä valtavat mahdollisuudet tukahduttamaan tietyntyyppisten syövän leviämisen sekä parantaa nykyisiä syöpähoitojen. Viimeisten vuosikymmenten aikana, monipuolinen erilaisia ​​luonnon ja synteettisiä yhdisteitä on löydetty pystyvät ehkäisemään NF-KB signalointia, vaan erilaisia ​​mekanismeja. PS-341, proteasomin estäjä, on ollut ensilinjan lääke hoidettaessa multippelin myelooman yli vuosikymmenen ajan, joka toimii estämällä luontainen NF-KB: n aktiivisuutta estämällä IκBα hajoaminen [37]. Samaan aikaan Eriocalyxin B, joka on ent-Kauranoid eristetty

Isodon eriocalyx

, estää NF-KB: n aktivaation häiritsemällä sitova sekä p65 ja p50 sitoutuminen vaste-elementtiin [38].

IKKβ näyttelee keskeistä roolia aktivointi sekä kanonisen ja ei-kanoninen NF-KB: n signalointireitin. Kun aktivointi, NF-KB: n signalointi johtaa automaattisesti polyubiquitination tuumorinekroositekijän reseptori liittyy tekijä 6 (TRAF6). Ubikitinoituja TRAF6 sitten rekrytoi transformoivan kasvutekijä-β-aktivoitu kinaasi 1 (TAK1) ja IKB-kinaasi (IKK) kompleksi, joka koostuu kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä, IKK1 (IKKα) ja IKK2 (IKKβ), ja säätelyalayksikön, NEMO (NF-KB: n keskeisiä modulaattori, IKKγ), niin että TAK1 voidaan fosforyloida ja aktivoida IKKβ. Automaattinen fosforylaatio oli myös raportoitu olevan osallisena aktivaatioon IKKβ [39], [40]. Johtuen havaitaan usein roolia että aktivointi IKKβ pelaa syöpä sukupolven, leviämisen ja etäpesäkkeitä, IKKβ on pidetty lupaavana lääke kohde syöpähoitojen [41], [42]. FDA: n hyväksymä harvinaislääkekäyttöaihe hoitoon haimasyöpä, CDDO-Me, joka tunnetaan myös nimellä RTA 402, estää NF-KB-reitin kautta suoraan estämällä IKKβ on Cys-179 [43].

Nykyisessä tutkimuksessa, me kuvattu TCN, tehokas NF-KB-inhibiittori, esti IKKβ aktivaation estämällä sen fosforylaatio ja sen jälkeen esti ilmentymistä kohdegeenien NF-KB: n signalointireitin lukien XIAP, sykliini D1: n ja Bcl-xL: n, jotka säätelevät solujen eloonjäämistä ja solujen leviämisen. Tämän seurauksena, TCN indusoi apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen NF-KB: n konstitutiivisesti aktivoitujen ihmisen syöpäsoluja, vaikuttamatta normaaleihin soluihin, joilla on alhainen perustason NF-KB: n aktiivisuuden (kuvio S2). Kun otetaan huomioon monimutkainen tapahtumia liittämällä aktivointi IKKβ, tarkat mekanismit kuinka TCN heikentää fosforylaatiota IKKβ ansaitsevat lisätutkimuksia.

metaboliitteja endofyyttisten sienten asuttamistoiminnan kasviperäisten lääkeaineiden on havaittu olevan eri bioaktiivisuuksiin [44 ], [45]. Syöpälääkkeiden monien isäntäkasvien löytyy aineenvaihduntatuotteet endofyyttisten sienten, kuten Taxol, joka eristettiin endofyyttisten sieni

Taxomyces andreanae

in

Taxus brevifolia

[46]. Esillä olevassa tutkimuksessa, TCN, yhdessä 6β-hydroxyrosenonolactone, trichothecolone, roseocardin ja roseotoxin B eristettiin endofyyttisten sieni LZ93 on

Maytenus hookeri Loes.

Ja testattiin niiden syövänvastainen toiminnan (kuvio S1). Niiden yhdisteiden joukossa me eristetty, TCN osoittautui voimakkain. Nämä havainnot osoittavat, että ominaisuudet TCN saattaa olla yksi mahdollisista mekanismeista tehoa ja syövän toimintaa

Maytenus hookeri Loes.

Otettu koko, havaintomme viittaavat siihen, että TCN, niin voimakas estäjä NF-KB: n signalointia, on lupaava terapeuttinen arvo syövän hoitoon ja ansaitsee edelleen etsintä.

tukeminen Information

Kuva S1. Bio-toimintaa yhdisteiden eristetyn endofyyttisten sieni LZ93 on

Maytenus hookeri Loes.

(A) kemiallinen rakenteet 6β-hydroxyrosenonolactone (6β-HRL), trichothecolone, roseocardin ja roseotoxin B. (B) Sytotoksinen aiheuttamia vaikutuksia trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin ja roseotoxin B 40 uM HL-60, HepG2, A549 ja PANC-1-soluissa 48 tunnin jälkeen hoidon. (C) vaikutus trichothecin, trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin ja roseotoxin B TNF-α-indusoidun NF-KB: n aktivaation. HEK 293T-solut transfektoitiin ohimenevästi PNF-KB-Luc ja PRL-TK plasmidit seurasi esikäsittely DMSO, tai 0,3, 0,6, 1,25 uM TCN, tai peräkkäisiä pitoisuudet 2,5, 5, 10 uM trichothecolone, 6β-hydroxyrosenonolactone, roseocardin tai roseotoxin B 1 h ennen 25 ng /ml TNF-α stimulaatio 18 h. Asteittain tummempi varjostus jokaisen palkki tarkoittaa korkeampia pitoisuuksia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071333.s001

(JPG) B Kuva S2. Kaaviokuva TCN inhibition IKKβ ja NF-KB-reitin kautta.

Kun stimuloida TNF-α, paneeli kinaasien menossa ubikitinaation ja fosforylaatio, joka johtaa NF-KB: n välityksellä IKKβ lääkkeitä hajoamista IκBα ja translokaation p65. TCN estää fosforylaatiota IKKβ, mikä puolestaan ​​johtaa apoptoosin ja kasvun esto syöpäsoluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0071333.s002

(TIF) B