Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

, jonka tarkoituksena tutkia ennusteen arvioinnissa on RRM1 GC potilaita.

Methods

yhteensä arvioitavissa 389 GC potilaalla on kliinis ja selviytymisen tiedot otettiin vuodesta City of Hope (COH, n = 67) ja Zhejiangin yliopisto (ZJU, n = 322) . RRM1 proteiinin ilmentyminen määritettiin immunohistokemialla FFPE kudosnäytteistä. Kaplan-Meier ja Cox analyysejä käytettiin mittaamaan selviytymistä. Ras /Raf aktiivisuutta ja invaasio määrityksiä käytettiin arvioimaan roolia RRM1 GC solulinjoissa.

Tulokset

In vitro

kokeet osoittivat RRM1 aktivoitu Ras /Raf /MAPK signaalitransduktion ja edistettävä GC solujen lisääntymistä. Samaan aikaan, RRM1 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä imusolmuke osallistumista, kasvaimen koon, Ki67 ilme, histologisia alatyyppi ja histologisia arvosana GC kudosnäytteistä (

p

0,05). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että korkea RRM1 ilmaisu ennustettu huono selviytymisen GC potilasta COH ja ZJU kohortteja (log-rank

p

0,01). Vuonna Coxin monimuuttuja-analyysi, vaarojen suhde RRM1 varten kokonaiselossaolo olivat 2,55 (95%: n luottamusväli 1,27-5,15) ja 1,51 (95% CI 1,07-2,13) ​​on COH ja ZJU asettaa vastaavasti. Erityisesti RRM1 nimenomaan ennustettu lopputulos kehittynyt GC huono erilaistumista ja korkea proliferatiivinen kyky. Lisäksi esto RRM1 siRNA vähensi dNTP allas, Ras /Raf ja MMP-9 toimintaa ja tasot p-MEK, p-ERK ja NF-KB, hidastaa kasvua ja vähentää hyökkäyksen AGS ja NCI-N87 soluja.

Johtopäätökset

RRM1 yliekspressio ennustaa huono hengissä GC joilla on pitkälle edennyt TNM vaiheessa. RRM1 saattaisi toimia ennustetekijöitä biologisten merkkiaineiden ja terapeuttinen kohde GC.

Citation: Wang Q, Liu X, Zhou J, Huang Y, Zhang S, Shen J, et al. (2013) ribonukleotidireduktaasia suuri alayksikkö M1 ennustaa Huono Survival johtuen modulaatio proliferatiivisen ja invasiivinen kyky mahasyövän. PLoS ONE 8 (7): e70191. doi: 10,1371 /journal.pone.0070191

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 29 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu National Institutes of Health (NIH) avustukset (R01, CA127541), National Nature Science Foundation of China (NSFC) 81101659 /H1609, Nature Science Foundation Zhejiangin maakunnassa, Kiina (NSFZ) Y2110073. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mahalaukun adenokarsinooma (mahalaukun syöpä, GC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, erityisesti Aasian ja kehitysmaissa, joissa noin miljoona tapausta diagnosoidaan vuosittain [1] – [2]. Korkeimmat kuolleisuus (28,1 per 100000 miehillä, 13,0 prosenttia 100000 naista) GC on raportoitu Itä-Aasiassa, joka sisältää Kiinassa, Japanissa ja Koreassa [2]. Perinteiset hoitomuotoja, kuten leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa, ovat osoittaneet selviytymisen etu GC potilaille [3] – [6]. Kuitenkin 5 vuoden pysyvyys on edelleen pettymys, ja useimmat GC potilaat kuolevat taudin komplikaatioita ja uusiutumisen [3], [7] – [8]. Useat biomarkkerit tutkitaan tavoitteenaan ennustaa selviytymisen ja parantaa tuloksia potilailla, joilla on GC [9]. Toistaiseksi harvat biomarkkereiden käytetään laajalti kliinisesti GC.

Ribonukleotidireduktaasin (RNR) pidetään terapeuttisena kohteena syövän hoitoon. RNR on määräaikainen entsyymi, joka katalysoi ribonukleosidia difosfaatit jotta deoksiribonukleosiditri- difosfaatit kautta

de novo

metabolia endogeenisten nukleotidin [10]. RNR-inhibiittorit, kuten hydroksiurea, on käytetty laajalti leukemian ja kiinteiden kasvainten [11] – [13]. Kuitenkin soveltaminen RNR estäjien on rajoitettu alhaisen tehon, lääkeresistenssin ja sivuvaikutukset [14]. Useimmat rajoituksista RNR-inhibiittorit aiheuttavat ei-tarkan kohdistuksen. Ihmisen RNR koostuu kolmesta alayksiköstä, suurta alayksikköä M1 (RRM1) ja kaksi pientä alayksiköstä M2 ja M2B. Jokainen pieni alayksikkö voi monimutkainen RRM1 muodostamiseksi aktiivisen holoentsyymin [10]. M2 taso ennustaa huonon ennusteen useita syöpiä, kuten keuhkosyövän, haimasyövän ja GC [15] – [18]. M2B näyttää osansa tukahduttamaan maligniteetti ja liittyy paremmin hengissä peräsuolen syöpiä, mukaan edellisessä tutkimuksessa [19] – [20]. Kuitenkin biologinen roolit RRM1 eivät ole identtisiä näistä syövistä. Olemme tutkineet mRNA-tasoja on RRM1 syövän ja vastaavassa normaalissa kudosleikkeiden käyttäen ONCOMINE tietokannan (www.oncomine.com). Valituissa olosuhteissa (

p

0,05, kertaluokkamuutos 2, geeni sijoitus = top 10%, kaikki tietotyypit), The RRM1 mRNA säädellään ylöspäin 39 ainutlaatuinen analyyseihin ja säädellä vähentävästi 11 ainutlaatuista analyysit. RRM1 enimmäkseen lisääntynyt kohdissa virtsarakon, kohdunkaulan, peräsuolen, pään ja kaulan, maksan ja keuhkojen syövät sekä melanooman ja sarkooman. Samaan aikaan RRM1 oli alassäädetty rintasyövän, leukemia ja lymfooma. Nisäkkäiden RNR alayksikkö R1 (samanlainen RRM1 ihmisen) tärkeä rooli maligniteetti tukahduttaminen inaktivoimalla Ras /Raf /MAPK signalointireitille Ras transformoitujen 3T3-soluja (hiiret) [21] – [22]. Lisäksi lopputulos tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat RRM1 lauseke (yhdessä ERCC1 tai PTEN ylössäätöä) on määräävä optimaalisen eloonjäämisen varhaisen vaiheen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [23] – [26]; kuitenkin, muut tutkimukset ovat osoittaneet näennäisesti ristiriitaisia ​​tuloksia [27] – [29]. RRM1 yli-ilmentyminen liittyy vastustuskykyä gemsitabiinin NSCLC ja haimasyövän, mikä johtaa huonon lopputuloksen [30]. Nämä tutkimukset osoittavat, että rooli RRM1 syövän yhä kiistanalainen, jopa samassa syövän tyyppiä eri vaiheissa tai eri hoitojen [31] – [32]. RRM1 on ehdotettu muita biologisia rooleja lisäksi muodostavat RNR holoenzymes muuntaa NDP on dNDP, jotka voivat osittain selittää alhaisen tehon RNR estäjien syövän hoidossa. Siksi laajasti tutkii roolit RRM1 olisi hyödyllistä kehittää uusia RNR estäjät syövän hoitoon nimenomaan. GC on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa, mutta RNR inhibiittorit, kuten hydroksiurea ja gemsitabiini, joita ei ole käytetty yleisesti, koska alhainen teho. Toisaalta, vaikutus RRM1 GC tuloksista ei ole koskaan tutkittu. Siksi olisi aiheellista tutkia biologisen roolin RRM1 GC soluissa ja arvioida kliininen merkitys RRM1 yli-ilmentymisen GC potilailla.

Tässä tutkimuksessa roolit RRM1 säätelyssä solujen lisääntymistä ja invaasiota kautta Ras /Raf signalointireitille GC solulinjoissa tutkittiin. Samaan aikaan RRM1 proteiinin ilmentymisen ja tulos 67 GC potilaita City of Hope National Medical Center (COH) määritettiin myös. Havainnot olivat edelleen validoitu 322 GC potilaita Affiliated Sir Run Run Shaw sairaala Zhejiangin yliopistossa (ZJU). Tulosten perusteella näyttää, että RRM1 ennustaa huono selviytyminen GC ja voisivat mahdollisesti ennustetyövälineenä biomarkkereiden ja terapeuttisena kohteena GC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Protokolla tämän tutkimuksen tarkasteli ja hyväksynyt Institutional Review board (IRB) ja City of Hope National Medical Center ja Zhejiangin yliopisto, vastaavasti. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat osallistuivat tähän tutkimukseen. Tukikelpoiset GC Näytteet otettiin City of Hope National Medical Center (COH set) ja Affiliated Sir Run Run Shaw sairaala, Zhejiangin yliopistossa (ZJU set), tässä järjestyksessä.

Potilaat

kriteereillä osallistujien sisältyivät seuraavat: (i) mahalaukun adenokarsinooman joiden patologinen diagnoosi; (Ii) tietoinen suostumus tai luopuminen suostumuksen, jonka potilas; ja (iii) seurantatiedot käytettävissä. Me ulkopuolelle GC sairastavilla potilailla (i) ei ole toimittanut tietoista suostumusta; (Ii) ei-adenokarsinooma tai useita syöpiä; (Iii) ei kudosnäyte saatu; (Iv) menetys yhteystiedot leikkauksen jälkeen; tai (v) vaihe IV GC ilman lievittävä leikkausta. COH asettaa kuului joukko 67 voivat GC potilailla, jotka saivat leikkauksen R0 (58 tapausta), R1 (8 tapausta) tai R2 (1 tapaus) resektio City of Hope National Medical Center tammikuusta 1989 joulukuuta 2006 osallistujat COH joukko koostui 51 Whites, 2 Afrikkalainen-amerikkalaiset ja 14 aasialaiset. Vuonna ZJU asetettu, voivat 322 GC potilasta (242 tapausta R0 resektio, 67 tapauksia R1 resektion ja 13 tapausta, joissa R2 resektio) otettiin. He olivat saaneet leikkauksen aikana 1997 2001. Kaikki GC potilaille ZJU set olivat Aasian (Chinese). Vuonna ZJU joukko, 153 322 potilaista oli leikkauksen adjuvanttihoitoa. Yhdistelmä kemoterapiahoitojen mukana foolihapon, 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia (FOLFOX6; 73 kotelot); epirubisiini, oksaliplatiinin ja Xeloda (EOX; 12 tapausta); 5-fluorourasiili, epidoksorubisiinin ja mitomysiini C (FEM, 9 tapausta); etoposidi, leukovoriini ja 5-fluorourasiilin (ELF; 38 tapausta); mitomysiini C ja 5-fluorourasiilin (MF; 4 tapausta); ja toiset (suun S-1 /x doketakseli-pohjainen ja muut protokollat, 17 tapausta). Kaikki potilaat seurattiin vasta tammikuussa 2012. yksityiskohdat demografiset ja kliinis tiedot päivitettiin. TNM vaihe tiedot osallistujien saatiin kliiniset ja patologiset diagnooseja ja määritetään NCCN suuntaviivat GC (versio 2, 2011). Ihmisen kudosnäytteitä tarkasteltiin tässä tutkimuksessa saatiin kirurgian ja säilyttää huoneenlämmössä jälkeen formaliinilla kiinnitetyt ja paraffinization. Korrelaatio tuloksen näyttämiseksi varastointiaika ei vaikuttanut RRM1 ilmaisua tilastollista merkitystä (

p

0,05).

Tutkimusasetelma

Tämä oli retrospektiivinen tulos tutkimus. Näytteen koko arvioitiin käyttäen nQuery Advisor 6,01 (Statistical Solutions Ltd, Saugus, MA, USA) ohjelmiston. Tämän laskelman perusteella, näyte koko 300 osallistujaa ei ylitä 95% tutkimuksessa teho (kaksipuolinen α = 0,05). Väestörakenteen ja kliinis tiedot poimittiin huolellisen kaavio tarkastelu. Kaikki potilaat olivat ajoittain seurattiin Eloonjääntitulokset; potilaille, joilla on parantava toimintaa seurattiin myös uusiutumisen elinaikaa. Seuranta-aikana laskettiin alkaen leikkaus päivämäärä viimeinen kosketus. Taudista vapaa eloonjääminen määritettiin aika alkuperäisestä leikkaus kasvaimen uusiutumisen. Etäpesäke tai paikallinen uusiutuminen pidettiin kasvaimen uusiutumisen. Vain kuolemantapauksia GC katsottiin päätepisteessä tautikohtaisia ​​selviytymistä. Muuttujia arvioi mukana syntymäaika, sukupuoli, päivämäärä diagnoosi, päivämäärä ja tyyppi toiminta, kemoterapian, TNM vaiheessa uusiutumisen /etäpesäke asema, jona uusiutumisen /etäpesäke ja kliininen tila viimein seurannassa.

immunohistokemia (IHC), käytettiin määrittämään RRM1 proteiinin ilmentymistä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen kudosnäytteitä. Välttämiseksi systeemistä harhat, vasta-aineet päteviksi ja edellytykset IHC optimoitiin käyttäen kontrollikudoksen aluksella. Normalisoida reaktio-olosuhteissa, kaikki FFPE kudosnäytteitä ZJU joukko oli koota uudelleen useiksi kudosmatriisien. Lisäksi ohjaus FFPE usean kudoksen kartongin sisällytettiin kullekin IHC värjäystä. Pienentää kuvaa lukija bias, automatisoitu kuvantamisjärjestelmä käytettiin saamiseksi digitaalisia kuvia värjätyt leikkeet myöhempää kvantitatiivisia analyysejä. Kukin näyte arvioitiin kahden riippumattoman tutkijat kaksoissokkotutkimuksessa tavalla.

Kaikki väestötiedot, kliinis tietoa, ja IHC tuloksia koodattiin ja tekivät GC tietokantaan. Double tietojen syöttö ja logiikkaa tarkastuksia käytetään virheiden vähentämiseen. Microsoft Office Access® luotiin tietokantoihin. Puuttuva tapaukset merkittävä asianmukaisella ”puuttuva” koodia. JMP 8.0 Software (SAS Institute, Cary, NC, USA) ja GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) käytettiin tilastolliseen analyysiin ja selviytymistä käyrä juoni. Monimuuttuja logistinen regressio malleja käytettiin säätää kovariaattina vaikutuksia kerroinsuhde (OR). Kaplan-Meier-analyysi ja Coxin suhteellisen vaarat mallia sovellettiin yleisestä (OS) ja ilman taudin etenemistä (PFS) analyysit. Monimuuttuja analyysit ja ositus levitettiin vähentää sekoittavia vaikutuksia arviointiin hazard ratio (t).

Quantitative IHC Analyysit

IHC käytettiin tutkittaessa RRM1 proteiinin ilmentymisen. Tarkkuus IHC vahvistivat kvantitatiivisen RT-PCR (qRT-PCR) on kaksi rinnakkaista näytettä. Lyhyesti, kun deparaffinization, endogeeninen Peroksidaasiaktiivisuuden blokattiin 3% H

2O

2 (vetyperoksidi). Array kalvot myöhemmin inkuboitiin normaalissa vuohen seerumissa 20 minuuttia ja sitten primaarinen vasta-aine levitettiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. 7. minuutilla H

2O

2 hoitoa, array dioja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasileimattua vastaavien vasta-aineiden 30 minuutin ajan. DAB (3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia 0,05 g DAB ja 100 ml 30% H

2O

2 100 ml: ssa PBS: ää) levitettiin 5 minuuttia ja jälleen 10 minuuttia. Kukin Sitten levy vasta- värjättiin hematoksyliinillä (DAKO). PBS: ää käytettiin negatiivisena kontrollina.

Vasta-aineet

tuotettu kaupallisesti hiiren monoklonaalista vasta-ainetta käytettiin ihmisen RRM1 tässä tutkimuksessa. RRM1 vasta-ainetuotanto perustuu aiemmille vakioyhteyskäytäntöä [33]. Anti-hRRM1 vasta-ainetta tuottavat hybridoomat ensisijainen seulottiin entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Kloonit valittiin perustuen toimintaansa parafiiniin upotetut ihmiskudokset. RRM1 ilmentyminen kvantifioitiin visuaalinen luokittelu, joka perustuu laajuuden värjäystä. Sekä immunoreaktiivisuus tumassa ja sytoplasmassa arvioitiin. Jokainen kuva pisteytettiin perustuu seuraaviin ryhmiin: Sijainti solussa (esim solulima vs. nucleus), värjäyksen voimakkuus (esim integroitu optinen tiheys), ja /tai prosenttiosuus värjättyjen solujen (esim kokonaispinta-ala tai positiivisten solujen prosenttiosuuden). Joka perustuu signaalin intensiteetti, RRM1 ilmentyminen oli luokiteltu negatiivinen (0), heikosti positiivinen (1), positiivinen (2) tai voimakkaasti positiivinen (3). RRM1 pistemäärä 0 tai 1 nimettiin RRM1-alhainen, ja pisteet 2 tai 3 luokiteltiin RRM1 korkea. Koska tietomme tuotti yhdenmukaisia ​​tuloksia välillä soluliman RRM1 ja ydinvoiman RRM1, me pidetään joko korkea ydin- tai korkean soluliman pisteet kuin RRM1-korkea Kaplan-Meier ja Cox analyysejä.

Vasta-aineita p-MEK, p -ERK, NF-KB, Ras, Sp-1 ja Ki67 saatiin Cell Signaling Technology, Santa Cruz, Invitrogen, Millipore, Abcam ja BD Bioscience, vastaavasti.

plasmidin muodostaminen ja transfektio

Euroopan hRRM1 plasmidi (pEBG-RRM1) rakennettiin ja raportoitu edellisessä tutkimuksessa [34]. Plasmidi transfektoitiin X-treme geenin HP-DNA-transfektio Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa AGS soluja. Lyhyesti, 2 ug plasmidia sekoitettiin 6 ul: X-treme geenin HP 200 ui seerumia sen jälkeen, kun oli inkuboitu huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. Seos lisättiin 2 x 10

5 pre-päällystetty AGS-soluja 6-kuoppalevylle. Transfektion jälkeen 48 tuntia, solut kerättiin.

Soluviljely ja RNA-interferenssi

Ihmisen GC solulinjat AGS ja NCI-N87 saatiin American Type Culture Collection ja viljeltiin F- 12K väliainetta (AGS) tai RPMI-1640-alustassa (NCI-N87) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (MP Biomedicals, Costa mesa, CA, USA) ja 1% penisilliini ja streptomysiiniä kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

RRM1 siRNA (sc-37640) ja sekoituskoodin siRNA (sc-44233) hankittiin Santa Cruz Biotechnology Inc. transfektiot suoritettiin Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

in vitro

proliferaatiotestillä

in vitro

lisääntymisen määritys suoritettiin mukaan edellisessä tutkimuksessa [15]. Lyhyesti, 0,5 x 10

4 AGS ja 2,0 × 10

4 NCI-N87 solut ennalta maljattiin kuoppiin 16-kuoppaisella laite yhteensopiva W200 reaaliaikainen cell elektroninen tunnistus (RT-CES) analysaattori ja 16 × station (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA). ”Solu-indeksi” (normalisoitu impedanssi) laskettiin jaksoittain (yleensä 30 minuutin välein) mukaan solujen kasvua kussakin kuopassa. Ellei toisin mainita, neljä rinnakkaista tehtiin kullekin siRNA hoitoryhmässä. RRM1 estäminen määritettiin western blottauksella.

In vitro

invaasiomääritys

matrigeelin invaasio kammiot hankittiin BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Ensinnäkin, 8-mm-huokoisuus polykarbonaattikalvosuodattimia peitettiin 1 ml seerumitonta alustaa, joka sisälsi 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Sitten maljoja inkuboitiin kemiallis-houkutin (20% FBS: ia) 24 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa. Sitten väliaine poistettiin, ja ei-tunkeutuvat solut raaputettiin hellävaraisesti pois käyttämällä solukaavinta. Suodatin pestiin sitten kahdesti PBS: llä ja värjättiin 0,5% metyleenisiniä 4 tuntia. Solut, jotka suodattimen läpi ja kiinnitetty alapinnan laskettiin käyttäen optista mikroskopiaa.

gelatiinitsymografialla

gelatiinitsymografialla määritys suoritettiin vaikutusten tutkimiseksi RRM1 eritykseen aktiivisen MMP-9. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin, pestiin kahdesti 1 x PBS: ää, ja inkuboitiin seerumivapaassa alustassa. 24 tunnin kuluttua, elatusaine kerättiin ja väkevöitiin keskipako- suodattimella (Millipore, MA, USA) mukaisesti 6000 g: ssä 15 minuutin ajan. Väkevää näytteet valmistettiin ei-pelkistävissä näytepuskuria (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Proteiinit (20 ui /kaista) erotettiin SDS-PAGE-geeleissä, jotka sisältävät 1 mg /ml gelatiinia (Novex 10% gelatiini Gel, Invitrogen). Geelit renaturoitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä 1 x renaturoimalla puskurilla (Invitrogen). Sitten geelejä inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa 1 x kehittämään puskurilla (Invitrogen). Geeli värjättiin Coomassie-sinisellä. Kirkkaus kirkas bändejä, jossa MMP-9 sijaitsi ja gelatiinia hajonnut, analysoitiin densitometrian.

Ras Activity Assay

Ras aktiivisuus mitattiin käyttämällä Ras Activity Assay Kit (Millipore, MA, USA). Ensimmäisessä aktiivisessa Ras (GTP: hen sitoutuneen Ras) on sitoutunut Raf-1-Ras sitovan domeenin (RBD) konjugoituna agaroosihelmiin inkuboimalla solulysaatteja 4 ° C: ssa 45 minuuttia. Sitten aktivoitu Ras vapautui SDS-PAGE-näytepuskurissa laajojen pesu agaroosihelmiä (kolme kertaa) pesupuskurilla (25 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl

2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 1 mM Na

3Vo

4, 10% glyserolia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 10 ug /ml aprotiniinia, ja 25 mM NaF). Määrä Ras havaittiin monoklonaalisella pan-Ras-vasta-ainetta.

mittaus dNTP Pool

Tämä määritys suoritettiin menetelmän mukaisesti Sherman ja Fyfe [35]. Reaktion kokonaistilavuus oli 50 ui. Reaktioseos sisälsi 10 mM MgCl

2, 0,25 uM malli /aluketta, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 5 mM DTT: tä, 1,25 uM [

3H] dATP (ja dCTP, dGTP ja dTTP -määritys) tai [

3H] dTTP (ja dATP-määritys) ja 0,2 yksikköä Sequenase (2,0). Reaktioseos inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, ja sitten reaktio pysäytettiin jään päällä. Reaktion jälkeen 40 ul: n alikvootit poistettiin ja täpläksi pyöreä (halkaisija 2,4 cm) Whatman DE81 ioninvaihto-papereita. Paperit kuivattiin, pestiin (3 x 10 minuuttia) ja 5% Na

2HPO

4, ja huuhdeltiin kerran tislatulla vedellä ja kerran 95% etanolilla. Jokainen paperi kuivattiin ja talletettu pieneen koeputkeen; 7 ml Ecolume lisättiin sitten kuhunkin putkeen. Nestetuikelaskuria (Beckman Coulter, Inc. Brea, CA, USA) käytettiin laskemaan tritium-leimattua dNTP: tä. Standardi Näytteet olivat 0,25, 0,5, 0,75 ja 1,0 pmol.

Tulokset

validointi erityisyys RRM1 Vasta mahalaukun adenokarsinooma Näytteitä

spesifisyyden RRM1 vasta-aineiden validoitu peptidi esto määritys. Vasta-aineet laimennettiin (1:1000), esi-inkuboitiin rekombinantin RRM1 peptidin (1 ug /ml) 4 ° C: ssa yön yli, ja sitten visualisoidaan western-analyysillä. Kuviossa. 1

, yksi hallitseva signaali hyväksymiskelpoinen RRM1 vasta-aine voidaan nähdä western blot ja väheni kanssa RRM1 Knockdown in AGS soluissa. Samaan aikaan signaali oli nimenomaan estänyt yhdistelmä RRM1 peptidi, joka osoittaa spesifisyyden RRM1 vasta-aineita.

. Peptidi estää määritys suoritettiin sen RRM1 vasta-aineiden IHC värjäystä, kaikki vasta-aineet olivat 1:1000 laimennus- ja inkuboitiin rekombinantti RRM1 peptidillä (1 ug /ml) 4 °: ssa yön yli. Vasta-aine # 2 osoitti tarkempi ja vahvempi signaali kuin muut aineet (data ei näytä), siksi käytimme sitä vasta-aineen IHC värjäystä.

B

. Nuclear fraktiointi palveluksessa AGS soluissa. AGS-soluja ilman ravintoa 96 tuntia, ja uudelleen täydennetty normaaliin kasvualustaan ​​12 tuntia. Sitten solut kerättiin ja fractionized ydin- proteiiniin. Western blot levitettiin paljastaa solukomponenttien paikantaminen RRM1, GAPDH ja Sp-1 käytettiin soluliman ja ydin- markkereita.

C

. Translokaatio RRM1 välillä sytoplasmasta tumaan havaittiin Immuno-fluoresenssi sytokemian. AGS-soluja ilman ravintoa 48 tuntia, ja uudelleen täydennetty normaaliin kasvualustaan ​​12 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin ja inkuboitiin ensimmäisen ja toisen vasta-aineita. Translokaatio RRM1 havaittiin alle fluoresenssimikroskopian.

D

. RRM1 oli heterogeenisesti ilmaistiin toistensa naapureina normaalia kudosta ja histologisia alatyyppejä (JGCA luokitus V.2011) lukien papillaarinen, putkimainen, mucinous ja sinettisormus solu- ja erilaistumaton adenokarsinooma.

Koska eri ekspressiomalleja RRM1 on raportoitu lokalisointi RRM1 tutkittiin tarkemmin. Normaaleissa soluissa, RRM1 on ekspressoituu pääasiassa sytoplasmassa (Fig. 1

B

). Fluoresenssin merkintöjä määritys vahvisti myös, että RRM1 proteiini kertynyt sytoplasmassa 48 tunnin kuluttua seerumin nälkään. Kuitenkin RRM1 siirtämisellä tumaan vastauksena seerumin uudelleen täydentäminen 12 tuntia (Kuva. 1

C

). Siksi otimme sekä sytoplasman ja tuman värjäytymisen of RRM1 huomioon tulkittaessa IHC värjäytymistä.

RRM1 oli heterogeenisesti ilmaistiin joukossa alatyyppiä GC kudoksen (Fig. 1

C

). RRM1 oli ilmentyy syöpäkudoksessa (47,0% RRM1-korkea) päälle viereisten normaalin kudosten GC näytteistä (25,4% RRM1-korkea). Mukaan JGCA luokitusta [36], mahalaukun adenokarsinooman luokiteltiin viiteen histologisia alatyyppejä. RRM1 oli hyvin ilmaistu papillaarilihaksessa (61,9%), putkimainen (59,6%) ja erilaistumaton adenokarsinoomat (55,4%), mutta suhteellisesti pienempi mucinous (34,4%) ja sinettisormus adenokarsinooman alatyyppiä (14,3%).

RRM1 edistää solujen kasvua kautta Ras /Raf /MAPK -signalointireitistä GC

nisäkkään RNR suurta alayksikköä R1 (R1) estää pahanlaatuisen Ras transformoituja hiiren 3T3-solut [21]. p-ERK on tärkeä loppupään komponentti säätelee Ras /Raf signaalitransduktion. Siksi tutkittiin suhdetta RRM1 ja GC aggressiivisuus, mittasimme p-ERK 32 GC potilaiden parafiinia näytteitä. IHC värjäys osoitti, että RRM1 ilmentyminen yhtäpitävästi liittynyt p-ERK tasolla GC näytteissä (kuvio 2

,

vasen paneeli

). Korrelaatio oli tilastollisesti merkitsevä (kuvio 2

,

oikea paneeli

). Lisäksi geeni siirtämällä kokeilu osoitti, että suuremmat RRM1 ilmentyminen lisääntyi p-ERK ilmentymisen AGS soluissa (kuvio 2

B

,

yläpaneeli

) ja edistänyt solujen kasvua

in vitro

(kuvio 2

B

,

alempi paneeli

). Sen määrittämiseksi, ovatko RRM1 säätelee Ras /Raf /MAPK signalointi, me alassäädetty RRM1 ilmentyminen siRNA AGS ja NCI-N87 soluissa. Sekoituskoodin siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Western blot-analyysi osoitti, että RRM1 oli nimenomaan pienennetään vastaavalla siRNA (Fig. 2

C

). Yhdessä vähentäminen RRM1, signaalit p-MEK, p-ERK ja NF-KB laskivat merkittävästi; Ras /Raf aktiivisuus laski myös huomattavasti sekä AGS ja NCI-N87 soluissa. Edellä havainnot osoittavat, että RRM1 voivat edistää GC soluproliferaatiota aktivoimalla Ras /Raf /MAPK signalointi.

, RRM1 yliekspressio havaittiin liitettävä korkea ilmentyminen p-ERK GC potilaat (

p

0,01, n = 32), ikkunat 1-4 osoittavat edustaja kuvaa p-ERK ja corresponsive RRM1 värjäytymistä 2 syöpäkudokset kahdesta edustavasta potilaasta (Pic 1-2: GC No1; pic 3-4: GC NO2).

B

, yliekspressio RRM1 (sekä kohdunulkoinen ja endogeenisten RRM1) kautta transfektointi pRRM1 (pEBG-RRM1) edistää AGS solujen kasvua; p-ERK oli myös sääteli myöhemmin.

C

, RRM1 oli alassäädetty siRNA kahdessa GC solulinjoissa, AGS ja NCI-N87. Solut kerättiin ja analysoitiin Western blot ja Ras aktiivisuus Kit (Millipore, MA). Ras-Raf aktiivisuus huomattavasti vähentynyt ja niin olivat loppupään proteiineja p-MEK, p-ERK ja c-NFKB.

RRM1 ilmentyminen liittyy mahasyövän Aggressiivisuus

tutkia edelleen edellä esitettyjen havaintojen RRM1 proteiinin ilmentyminen mitattiin GC näytteissä. Perustuen IHC värjäys, 22 67 GC on COH joukko ja 156 322 GC että ZJU set olivat joko soluliman tai ydinaseiden RRM1-korkea (taulukko 1). Vuonna COH ja ZJU sarjaa, RRM1 korkea oli yleisempää miehillä kuin naisilla, ja todennäköisemmin tilastollisesti merkitys ZJU set (

p

0,01). Siellä oli enemmän proksimaalisen GC (44,8%) on COH asetettu, mutta distaalisemmissa GC (52,5%) kun ZJU asetettu. RRM1 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi proksimaalisen GC (

p

0,05) COH asetettu, ja samanlainen suuntaus havaittiin ZJU set (

p

= 0,31). Samaan aikaan RRM1 liittyi määrä imusolmukkeiden mukana, kasvaimen koon, Ki67 ilme, histologisia alatyyppi ja histologisia arvosana ZJU set (

p

0,05 kullekin). Koska pieni otoskoko, ei tilastollista merkitystä edellä mainittujen tekijöiden havaittiin COH asetettu, mutta samanlaisia ​​suuntauksia voitaisiin tietysti nähdä.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, RRM1 liittyi GC aggressiivisuus, joka on ei-ehdollinen monimuuttuja logistinen analyysi tehtiin. Tässä TNM pidettiin lähtö (vaihe III IV vs. vaiheen I 53 67 GC potilaista kuoli GC liittyvät häiriöt, ja 34 potilaalla oli toistumisen. Vuonna ZJU asetettu, pisin seuranta-aika oli 179 kuukautta; yhteensä 175 322 GC potilaista kuoli GC, ja 87 potilaalla oli toistumisen. Tulokset yhdenmukaisia ​​nähtiin sytoplasman RRM1 (HR = 1,62; 95% CI 1,20-2,20) ja ydinvoiman RRM1 (HR = 1,61; 95% CI 1,19-2,18). Siksi joko korkea soluliman tai ydinvoiman RRM1 ilmentyminen pidettiin seuraavassa analyysissä.

Kaplan-Meier analyysit osoittivat, että RRM1 korkea merkittävästi huonosta OS ja PFS että COH ja ZJU sarjaa (log rank

p

0,01 tai

p

= 0,03) (Fig. 3

–

D

). Keskimääräinen elinaika varten RRM1-low osajoukko oli 28 kuukautta COH joukko ja 42 kuukautta ZJU asetettu. Sillä RRM1 korkea osajoukko, mediaani eloonjäämisaika väheni merkittävästi 12,5 ja 23 kuukautta COH ja ZJU asettaa vastaavasti. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin PFS analyysiin. RRM1-korkea huomattavasti riskiä GC uusiutumisen kummassakin (log rank

p

0,01 vuonna COH set ja

p

= 0.03 siinä ZJU asetettu).

. Kaplan-Meier-analyysi OS näkyi RRM1-korkea

vs.

RRM1-alhainen parantaa tutkimuksen valtaa COH asetettu.

B

, Kaplan-Meier-analyysi OS tehtiin ZJU asetettu. Kaplan-Meier-analyysi PFS suoritettiin

C

(COH set) ja

D

(ZJU sarja). Monimuuttujakalibrointi Cox analyysejä OS GC näytettiin

E

ja

F

varten COH ja ZJU asettaa vastaavasti. Riskisuhde (HR) on RRM1 perustui RRM1 korkea

vs.

RRM1 pieni; Kasvain sijainti oli proksimaalinen

vs

. body

vs

. distaalinen Koko; Ki67 oli positiivinen

vs

. negatiivinen; Kasvain vaihe oli vaihe I II

vs

. III IV; Kasvaimen oli alhainen

vs

. kohtalainen

vs

. korkea; Sukupuoli oli miespuolinen

vs

. naaras; Ikä perustui kohden muutoksista. Merkillä ”*” käytettiin osoittamaan tilastollista merkitystä (

p

0,05).

Jotta sekoitin vaikutukset, Monimuuttuja Cox analyysi tehtiin käyttäen COH ja ZJU asettaa ( Fig. 3

E ja 3F

). Vuonna COH asetettu, tekijät TNM vaiheessa kasvain sijainti, kasvaimen, Ki67 tasolla, sukupuolen ja iän levitettiin säätää HR. Kuten kuvioissa. 3

E ja 3F

, RRM1 ja TNM-luokitus oli merkitsevästi yhteydessä huonoon OS GC potilaista COH ja ZJU sarjaa. HRS varten RRM1 oli 2,55 (95%: n luottamusväli 1,27-5,15) ja 1,51 (95% CI 1,07-2,13) ​​on COH ja ZJU asettaa vastaavasti. Ki67 on laajalti käytetty solujen lisääntymistä biomarkkeri syöpä, mutta se ei ennustaa GC on COH ja ZJU asettaa.

ennustetekijöiden Suorituskyky RRM1 Advanced GC

edelleen arvioida ennustetekijöiden suorituskykyä RRM1 alaryhmissä GC, joka on kerrostuneisuus analyysi tehtiin. Täällä emme kirjaa kerrostuneisuus tulokset COH joukko, koska pienet otoskoko (yhteensä 67 tapausta). Kuviossa.