Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Parempi toimitus järjestelmiä tarvitaan rutiininomaisesti rokotteita, jotta parantaa rokotteen käyttöönottoa. Monet rokotteet sisältävät alunan tai alunaa apuaineita. Täällä tutkimme uudenlainen kuiva päällystetty tiheään pakattujen mikro-projektio array laastarilappuun (Nanopatch ™) varajäsenen toimitus järjestelmä lihakseen tuottaa alunaa adjuvanttia ihmisen papilloomaviruksen (HPV) rokote (Gardasil®) yleisesti käytetty ehkäisevää rokotetta kohdunkaulan syöpää.

Menetelmät /Principal havainnot

Micro-projektio taulukot kuiva-pinnoitettu rokotteella materiaalia (Gardasil®) toimitetaan C57BL /6 hiiren korvan ihon vapautuu rokote 5 minuutin kuluessa. Arvioida rokotteen immunogeenisuus, annokset vastaavat HPV-16 komponentin rokotteen välillä 0,43 ± 0,084 ng ja 300 ± 120 ng (keskiarvo ± SD) annettiin hiirille päivänä 0 ja päivänä 14. annos 55 ± 6,0 ng toimitetaan ihonsisäisesti mikro-projektio array riitti tuottamaan maksimaalinen viruksen neutraloiva seerumin vasta-vaste päivänä 28 rokottamisen jälkeen. Neutraloivien vasta-ainetitterit pysyivät ulos 16 viikon kuluttua rokotuksesta, ja, vertailukelpoisia rokoteannosta, hieman korkeampi tiitterit havaittiin intrakutaaninen laastari toimituksen kuin lihakseen toimitusta neula ja ruisku tänä ajankohtana.

Johtopäätökset /merkitys

Käytä kuivaa mikro-projektio paneelit (Nanopatch ™) on potentiaalia voittaa tarve rokotteen kylmäketjun yhteisiä rokotteet toimitetaan neulojen ja ruiskujen ja vähentää riskiä neulojen vamma ja rokote välttäminen takia pelko neulan erityisesti lasten keskuudessa.

Citation: Corbett HJ, Fernando GJP, Chen X, Frazer IH, Kendall MAF (2010) Skin Rokottaminen Kohdunkaulan syöpä Associated HPV kanssa Novel mikro -projektio Array hiirimallissa. PLoS ONE 5 (10): e13460. doi: 10,1371 /journal.pone.0013460

Editor: Sotirios Koutsopoulos, Massachusetts Institute of Technology, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 16 elokuu 2010; Julkaistu: 18 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Corbett et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Syöpä neuvosto Queenslandin yliopiston Queenslandin, National Health ja Medical Research Council (Australia) Avustukset ID # 569726, ID # 456150, Australian Research Council Grant ID # DP077464 ja Queenslandin Smart State Scheme rahoitetaan tätä tutkimusta. Professori Mark A. F. Kendall oli vastaanottaja Australian Research Council Future Fellowship. Professori Ian H. Frazer oli vastaanottajaa Queenslandin hallituksen Premier Fellowship. The University of Queenslandin ja professori Ian H. Frazer saavat rojaltitulonsa myynnistä HPV VLP rokotteita. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat rokotteet toimitetaan tällä hetkellä neulalla ja ruiskulla. Kuitenkin rokotteena annosteluväline, neula ja ruisku on monia tärkeitä puutteita. Näitä ovat mahdollisia siirto veren välityksellä tarttuvien tautien kautta neulanpistotapaturmaa [1] ja neulojen uudelleenkäytön – noin 30% injektioista varten rokotuksen kehitysmaissa eivät ole turvallisia [2], ja että neulanpistotapaturmaa aiheuttavat yli 500000 kuolemantapausta vuodessa [3]. Neula-fobia ja kivun lihakseen myös haittoja – On arvioitu, että neula fobia on läsnä vähintään 10% [4] väestöstä, tai korkeampi [5]. Lihaksen on myös erittäin tehoton sivuston rokotukseen, koska se ei ole suuri tiheys antigeeniä esittelevien solujen. Sen sijaan iho on houkutteleva vaihtoehto sivuston rokotukseen koska sen tiheä voimakas antigeeniä esittelevien solujen (APC: t), mukaan lukien Langerhansin solut (LC) [6], ja monia osa-sarjaa ihon dendriittisolut (DDCS) [7] . Läheisyys näiden solujen ihon pinnalle merkitsee se voisi olla mahdollista kohdentaa niitä tavoilla, jotka saattavat vähentää kipua ja mahdollisia lähetyksen veren välityksellä taudinaiheuttajia. Vaikka ihon toimitus on paljon potentiaalia, lähinnä käytetty menetelmä nykyisin klinikalla – intradermaalinen injektio – on teknisesti vaikeaa, edellyttää kehittyneiden kohdistustavoista kuin tarkistettava [8], [9].

Tässä tutkimuksessa novel laastarilappuun nimeltään Nanopatch ™ käytetään kohdistaa näihin ihon immuunijärjestelmän soluja. Nanopatch ™ on mikro-projektio array yksilöllisesti tiheä projektio pakkaus ( 20000 /cm

2) ja lyhyet ulokkeet (110 um pitkiä). Tämä neula tiheys suunniteltiin niin, että toimitettu rokote on tehnyt yhteistyötä lokalisoitu 50% ihon immuunijärjestelmän solut – sekä orvaskeden ja verinahan – upon Ihon kautta turvautumatta diffuusio (katso kuva 1) [10].

kaksiulotteinen joukko ulokkeita paikantuu kuiva päällystetty rokotteita nahkaan runsaasti immuunijärjestelmän soluissa. Sen jälkeen kun rokote hydraatit, se diffundoituu epidermis ja dermis.

Aiemmat tutkimukset Nanopatch ™ immunisointi ovat käyttäneet ovalbumiinia ja split influenssarokotteen antigeenejä lisäämättä adjuvanttia. Crichton et. al [11] osoitti korkean vasta-ainetiittereitä kuluttua immunisaation alle 2 ug kautta Nanopatch ™ mallin antigeeni ovalbumiinin C57BL /6-hiirten ilman vauhtia käyttäen 65 um pitkiä Nanopatch ennusteisiin. Fernando et. al. [10] osoittivat, induktio suojaavien toiminnallisia vasta-aineita influenssaa vastaan ​​hiirissä 110 um pitkän Nanopatch ™ ulokkeet (samoja, joita käytettiin tässä tutkimuksessa) käyttämällä split-virus, adjuvanttia kolmenarvoista influenssarokote (Fluvax 2008®); kertoimella 100 toimitetun annoksesta sparingin verrattuna neula ja ruisku. Näissä aiemmissa tutkimuksissa, rokotteet toimitetaan ilman adjuvanttia.

Nykyisessä tutkimuksessa laajennamme tutkia hyödyllisyyttä Nanopatch ™ kun pyritään aluna adjuvanttia. Tämä on tärkeää, koska monet rokotteet adjuvanttia – aluna laajimmin käytetty [12].

Itse kunnes viime lisenssiä ja AS04, aluna oli ainoa adjuvantti lupaansa FDA [13] . AS04 on alunaa, johon on lisätty lipidejä, joka perustuu toll-like-reseptori 4 agonisti 3-O-desasyyli-4′-monofosforyylilipidi A (MPL) [14]. ”Alum” on kemiallisesti joko alumiini oxyhydroxide tai alumiinihydroksifosfaattisulfaattiadjuvanttiin. Jotta uutta teknologiaa hyödyntää tällä hetkellä lisensoitu rokotteiden, mieluiten yksi pitäisi toimia aluna-adjuvanttia sisältävien rokotteiden. Toistaiseksi kiinteä formulaatio työtä on tehty alunalla adjuvantin orvaskeden jauhe immunisaatiota (EPI) hepatiitti B [15], [16], [17], ja kurkkumätä ja tetanustoksoidit [17]. Laaja aluna geeli hyytyminen kuivauksen aikana epäillään estävän vapautumista antigeenin siten, että se ei voi palauttaa uudelleenkostutuksen [16], ja menetykset tehoa on raportoitu jälkeen kylmäkuivaamalla tai pakastamalla [18], [19], [20]. Näiden häviöiden minimoimiseksi ilman vähentää merkittävästi alunaa koko kiinteä aine ( 1% [18]), nopea jäädyttäminen käytetään estämään jäädyttää liuottei- yhdessä lasia muodostavan täyteaineita.

Kuitenkin, meidän mikro-projektio pinnoite, jäädyttäminen vaihe ei ole pelkästään teknisesti vaativia, mutta on mahdollista vähentää mekaanista eheyttä päällystetty kerros. Päällysteen on oltava mekaanisesti riittävän vahva jäävät kiinni puikoille levinneisyys, ja erilaiset lämpölaajenemisominaisuudet ulokkeiden ja rokote voi aiheuttaa halkeilua tai kalvon päällystetyn kerroksista, kun laite tuodaan ympäristön lämpötilaan.

Ilmakuivaus alunaa sisältävien formulaatioiden tutkittiin Maa et ai [17], ja sen havaittiin aiheuttavan laajan hyytymisen vaikka läsnä trehaloosia ja /tai mannitolin ja /tai dekstraani. Koska nykyinen pinnoite protokollat ​​ovat lähempänä ilmakuivaus kuvattuja protokollia [17] eikä lyofilisointia tai kylmäkuivauksen on odotettavissa, että rokotus mikro-ennusteiden kuiva päällystetty alunan sisältävä formulaatio johtaisi huonon immuunivasteen. Tässä tutkimuksessa käytämme liukoinen polymeeri metyyli-selluloosa vähentämään hyytymisen geeliä kuivuminen, ja tukiin liukenemista annetun nesteytyksen hakemuksesta.

tauti koetinkivi tätä tutkimusta varten on ihmisen papilloomaviruksen (HPV), koska – syrjään yhteiskunnallisen merkityksen rokotteen – määrityksissä mittaamaan virusneutralisaatiokokeella ovat vakiintuneita. Antigeenin rakenne on tärkeää nostaa viruksen neutraloiva vasta-ainevaste [19], joten järjestelmä on herkkä häiriöiden antigeenin rakennetta, joka voi johtua aluna nestehukka aikana kuivaa päällystettä.

HPV-infektio on aiheuttava lähes kaikissa tapauksissa, joissa kohdunkaulan syöpä – HPV-DNA läsnä 99,7% kohdunkaulan karsinoomien [20]. Rokotus on mahdollistanut nykyaikainen rekombinanttiproteiiniekspressiota järjestelmiä ja havainto, että ilmaus L1 pääkapsidiproteiini proteiini yksinään oli riittävä tuottamaan itsejärjestyvien viruksen kaltaisia ​​partikkeleita (VLP) [21], [22]. VLP on tyhjä viruspartikkeli – niin se ei sisällä virus- genomin, joka koodaa onkogeenisten proteiinien, jotka aiheuttavat maligniteetti [23], [24], [25] on luonnollinen infektio.

Kaupallisesti saatavilla rokotteita Gardasil® [Merckin] ja Cervarix® [GlaxoSmithKline] osoitti erinomaista ennalta ehkäisevää toimintaa kliinisissä tutkimuksissa, estää ennalta maligniteetit ja myöhemmin syövät lähes 100% vuoden mukaisesti-to-protokollan analyysit [26], [27], [28]. Molemmat rokotteet sisältävät muodossa aluna adjuvanttia. Immunisaatiota kolmena annoksena aikana kuusi kuukautta. Nämä rokotteet ovat profylaktisia. HPV on yleisin sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden [29], ja kumulatiivinen infektio ilmaantuvuus yli 2 vuotta post ensimmäinen yhdyntä on noin 30%, ja kondomin käyttö ei näy merkittävää suojaava vaikutus [30]. Immunisaatio täytyy tapahtua ennen ensimmäistä yhdyntää olevan täysin suojaava. Monet kansat nyt kansallisia rokotusohjelmia kohdistuvat 11 ja 12-vuotias tyttöjä. Tämä ei ole ollut ilman ongelmia. Massa pyörtyminen ja päänsärkyä uskotaan johtuvan neulalla fobia ja joukkohysteriaan [31], ja rokotus ilman neuloja voi parantaa rokotteiden käytön ja hyväksymisen.

Pitkäaikaisvaikutusta HPV-rokotteiden on tärkeää. Vaikka esiintyvyys vaihtelee iän, yleisyydestä myös naisilla ikävälillä 40 ja 49 on arviolta 25,2% [32], joten mahdollisuudet infektio jatkuu koko eliniän ajan. Suojan kesto on merkittävä tekijä kustannustehokkuuden HPV-rokotteiden [33], ja kaikki toisen sukupolven rokotteita on osoitettava pitkäaikaisen suojan.

intradermiseen injektion Canine Oral papilloomaviruksen (COPV) L1-glutathione- S-transferaasi fuusio pentameereja – samanlainen HPV pentameereja – on osoitettu olevan suojaavia beagle 400 ng /koira [33]. Suzich, J.A., et ai. [34] osoittivat, että koottu COPV-VLP johti täydellistä suojaa klo 50 ng annostasolla, ja osittainen suoja 0,125 ng käyttäen sisäistä ihon kautta in beagle.

HPV VLP kootaan 72 pentameereja of L1-proteiini [35], [36]. Purkaminen VLP: t voidaan palautuvasti suorittaa

in-vitro

korkeassa pH: ssa, alhainen suolapitoisuus, ja johon on lisätty pelkistäviä aineita (esimerkiksi pH 8,2, 0.166M NaCl, 2 mM DTT). Dialyysillä puskurissa pH 6,8, jossa suolapitoisuus on 0,5-1 M tuloksia kokoonpano hiukkasten [37]. Lenz, P., et ai. [38] osoittaa, että HPV16L1-VLP yksin, mutta ei niihin kuuluvia L1-pentameereja indusoivat dendriittisolujen kypsyminen

in vitro

. Thônes et. al. [39] arvioivat, että immunisaatio L1-pentameereja vaatii myös 20-40-kertaisesti enemmän proteiinia annetaan saada samanlainen vasta-ainevaste. Denaturoitu L1-proteiini ei anna virusta neutraloiva vasta-ainevaste [19], ja vaikka kuivaformulaatioita voi tarkoittaa säilyy kauemmin korkeammassa lämpötilassa, huono muotoilu voi aiheuttaa merkittävää hajoamista proteiinituotteiden. Sopivat nestemäiset valmisteet HPV-VLP vakaus on määritelty molemmille Gardasil [40] ja Cervarix [41]. Koska muotoilu vaikuttaa kokoamisen VLP (ja mahdollisesti rakenne Kapsomeerien itse) ja VLP ovat enemmän immunogeenisiä kuin Kapsomeerien, muotoilu on tärkeää teho kuiva päällystetty rokotetta. Molemmat rokotteet komponentti aluna adjuvantti – Gardasil sisältää alumiinihydroksifosfaattisulfaattiadjuvanttiin. Tietääksemme tutkimukset käytetään kiinteitä formulaatioita ei ole julkaistu HPV tai HPV adsorboida alum.

Nanopatch ™ muotoilu käytettiin tässä tutkimuksessa hyödyntää 58 × 58 joukko mikro-ulokkeiden 110 pm korkea, ja 30 um pohjan halkaisija, joiden välinen etäisyys on 70 um välillä ulokkeen keskusten (katso kuvio 2). Rokote kuiva päällystetään mikro-ennusteet kuvatulla [42], ja Nanopatches ™ levitetään 2 ms

-1. Tämä kokoonpano tarjoaa materiaalia orvaskeden ja ihon kerrokset hiiren korvan iho tunkeutumissyvyys 42 mikrometriä (SD = 9,9, N = 365), määritettynä kuvantaminen loisteputki merkkiaineen kylmäpresipitaattien leikattuna hiiren korvat kuvatulla [11] , mutta joilla on samanlaiset ennusteet kuin hyödynnetään [10].

Toissijainen elektroni kuvat osoittavat pinta morfologiaa kun takaisinsiroavaa elektroni kuvat osoittavat koostumus – alhainen atomimassa elementtejä antaa matalan signaalin – eli päällystetty alue näkyy tumma verrattuna päällystämättömän Nanopatch ™. Mikro-ulokkeet maalataan b) 800 ng, c) 80 ng, d) 8 ng ja e) 0,8 ng HPV-16-proteiinia per laastari. Vaikka jotkut -menetelmää esiintyviä 800 ng ryhmä (paneeli b – valkoinen nuoli), pinnoite on nähty kapenevan osan ulokkeiden kaikissa annosryhmissä.

Tässä artikkelissa osoitamme kuivan päällysteen ja vapautumista aluna adjuvanttia HPV-VLP-rokotteen kanssa Nanopatch ™. Sitten osoittaa myöhemmän immuunivasteen, joka on pitkäikäinen ja neutraloi viruksen tasolle verrattavissa lihaksensisäisen injektion neula ja ruisku.

Tulokset

projektio morfologia kuiva päällystetty Nanopatches ™ sopii for neulatunkeuma

päällystetty laikkuja tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) avulla toissijainen elektroni ja takaisinsiroavaa tilat (kuva 2) tutkimaan jakeluun päällystetyn rokotteen pitkin ennusteet. Toissijainen elektroni tilassa osoitti pinnan muoto päällystetyn neuloja, kun taas takaisinsiroavaa elektronin tilassa käytettiin kvalitatiivisesti vahvistaa pinnoitteen paksuus johtuu eroista atomimassa kullan Nanopatch ™ pinnan ja päällysteen. Yritykset kuivua takki aluna adjuvanttia ilman täyteainetta johti minimaalinen rokotteen pinnoite puikoille vihjeitä, ja kiteytyminen aluna adjuvanttia (kuva S1). Sen vuoksi lisäsimme metyyli-selluloosa vakauttamiseksi rokotteen ja parantaa pinnoitteen morfologian (kuvio 2). Merkittävä osa päällysteen paikallistettiin kapenevan osan ulokkeiden. Tämä voidaan nähdä toisen elektronin kuvia ero morfologian ennen ja jälkeen pinnoite, ja takaisinsiroavaa elektroni kuvia pimeässä signaali projektio vihjeitä. 800 ng: n ryhmällä, jotkut sillan välillä ulokkeiden havaittiin tietyillä alueilla Nanopatches ™ (nuolella kuviossa 2b), mikä johtui todennäköisesti suuremman pitoisuuden rokotteiden kuin muissa ryhmissä.

Vaccine on vapautuu projektio vihjeitä, ja kertatoimitusta tehokkuus vastaa odotuksia perustuu pinnoitteen morfologiaan ja levinneisyys tietojen

kymmenkertaiseksi sarjalaimennoksia Gardasil® valmistettiin ja 14C-merkittyä ovalbumiini lisätty merkkiainetta jokaiseen näytteeseen, päällystetty Nanopatches ™ ja sovelletaan ventral korvannipukka C57BL /6-hiiriä (n = 5 annosta kohti ryhmä) jotka on esitetty materiaalit ja menetelmät. Mass balance käyttäen radioleimattuja merkkiainetta suoritettiin välillä koko päällystetyn määrä, ja että joka annettiin korvaan ihoon, vasemmalle Nanopatch ™, tai kerrostettu ihon pintaan. Tehokkuus julkaisu oli: 19% (SD = 7,5), 34% (SD = 4,7), 36% (SD = 10), ja 27% (SD = 5.2) 800 ng, 80 ng, 8 ng ja 0,8 ng päällystettyjen HPV-16 vastaavasti (katso kuva 3).

Vapauta määritettiin massataseen, ja vaihtelivat päällystetyn määrien keskiarvon ollessa 19%, 34%, 36%, ja 27% formulaatioihin käytetyt 800 ng, 80 ng, 8 ng ja 0,8 ng päällystettyjen HPV-16 per Nanopatch ™.

Delivery prosenttiosuuksia käytettiin sitten laskemaan tehokkaina annoksina kertomalla toimituksen tehokkuutta päällystettyyn määrällä. Toimitus määrät olivat arviolta 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5,7 ng (SD = 1,6), ja 0,43 ng (SD = 0,084) HPV-16L1.

Nanopatches ™ post-sovellus myös näkyviksi SEM onko mitään päällystysliuosta oli edelleen ennusteisiin. Pienimolekyylimassaisia ​​materiaali havaittiin pohjan joissakin tapauksissa, mutta harvoin on projektio vihjeitä (kuva S3) B

Nanopatch ™ rokotus saa aikaan pitkäkestoisen virusta tuhoavien immuunivasteen, verrattavissa lihakseen

Nanopatch ™ annokset jaettiin yli kumpaankin korvaan (eli yksi laastari per korva), ja annettiin päivänä 0 ja jälleen päivänä 14. Seerumit kerättiin päivänä 28 ja päivänä 112 rokottamisen jälkeen tutkia välitöntä vastausta, ja pidemmällä aikavälillä vasta-aineiden pysyvyydestä post rokotus. Seerumit analysoitiin kyky neutraloida HPV-virus pseudoviruspartikkeliin perustuvaan neutralisaatiomenetelmään (PBNA) (kuvio 4). Ei-inferiority-analyysiä käytettiin (materiaalit ja menetelmät) edellisiin HPV immunisaatio vertailevia tutkimuksia [43].

Nanopatch ™ annokset olivat 300 ng (SD = 120), 55 ng (SD = 6,0), 5.7 ng (SD = 1,6) ja 0,43 ng (SD = 0,084). Lihakseen annokset olivat 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng ja 1 ng. Päivänä 28, Nanopatch ™ 300 ng ja 55 ng annoksen ryhmät ovat saavuttaneet verrattavissa virusta neutraloivat tiitterit kaikille lihaksensisäistä injektiota ryhmissä (p 0,05). Päivällä 112, kaikki Nanopatch ™ annokset ovat saavuttaneet verrattavissa neutraloiva ainepitoisuuksia kaikille injektio lihakseen ryhmät (p 0,05). Rinnakkaisnäytettä porrastetaan x-akselilla tukiin visualisointi. Immunisoimattomat piirretään annoksella 0,05 ng johtuu log mittakaavassa.

Päivänä 28 immunisaation jälkeen, ainetiitterit 300 ± 120 ng ja 55 ± 6,0 ng annosta Nanopatch ™ ryhmät olivat tilastollisesti huonompia kaikille lihakseen annoksina (p 0,001) kanssa tiitterin geometrinen keskiarvo (GMT) ja 30500 ja 26000 vastaavasti (kuva 4). Kussakin 5,7 ± 1,6 ng ja 0,43 ± 0,084 ng annostaso Nanopatch ™ ryhmiä, kaksi hiirtä ei seroconvert.

neutraloivat vasta-aineet titrattiin päivänä 112 immunisaation (kuva 4) vahvistaa pitkän aikavälin tehokkuus. Päivänä 112 immunisaation, kaikki Nanopatch ™ ryhmät osoittivat 100% serokonversiota. Päivänä 112, kaikki Nanopatch ™ annokset olivat tilastollisesti huonompia kaikille lihakseen annoksina (p 0,05).

Verrattaessa vastetta päivä 112 ja päivä 28 kussakin ryhmässä (kuvio 4), päivä 112 tiitteri ei täyttänyt yhdenvertaisuutta kriteerit vastaan ​​päivä 28 tiitteri sekä 100 ng ja 1 ng lihakseen ryhmien (suhde tiitterit: 100 ng 90% CI (0,40, 1,2), ja 1 ng 90% CI (0.39,1.2) ). Sitä vastoin sisällä ryhmä Nanopatch ™ tiitteri vertailuja osoittivat tiittereitä päivänä 112 oli pitkäaikaista huonompi kaikissa tapauksissa, ja superior klo 0.43 ± 0,084 ng annostaso, jossa päivä 112 tiitteri oli 1,2-5,8 kertaa suurempi kuin päivän 28 tiitteri ( p 0,05) samalla annostuksella.

keskustelu

Tämä paperi osoittaa tehokas pinnoite ja vapautumista alunaa sisältävän rokotteen Gardasil® romaanista mikro-projektio array patch (Nanopatch ™) on suunniteltu toimittaa rokote suoraan noin 50% runsas ihon antigeenia tarjoavien solujen [10], tehokkaaseen induktio viruksen neutraloiva vasta-ainevaste.

Release tehokkuus vaihteli annosryhmässä. On ennustettu, että tämä on ensisijaisesti riippuvainen pinnoitteen morfologiaan. Tätä tukee myös teoreettinen toimitus odotukset (kuva S2). Meidän ennustettu julkaisut (kuva S2) verrattuna mitattuun vapautuminen oli tarkin pienin annos ryhmiä. Olemme yli-ennusti vapautumista suurimmilla annoksilla. Tämä ero on todennäköisesti johtuu siltana ulokkeiden ja liiallinen päällyste pohjan Nanopatches ™ (kuvio 2b), mikä johtaa tuhlausta päällystysliuoksen. Koska pinnoite pohjaan ja sillan ulokkeita ei huomioitu laskelmissa, kun nämä määrät ovat merkittäviä, se johtaisi liian suureksi toimitetun määrän kuin teoreettiset laskelmat olivat perustuu ainoastaan ​​pinnoite ratkaisun ennusteisiin. Tämä siltana todennäköisesti lievittää lisäämällä pinta-aktiivista myöhemmissä formulaatioissa. Näiden tietojen ja post sovellus kuvien osoittavat, että vapautuminen ulokkeiden on valmis, ja siten kehitys pinnoite teknologia eristää pinnoite ainoastaan ​​osia projektioita, jotka tunkeutuvat ihon, täydellinen vapautuminen 100% hyötysuhde on mahdollista näitä muotoiluja.

Nopea vapautuminen todennäköisesti tukea varmistamaan yhdenmukainen rokoteannos toimitetaan, koska se on helpompi varmistaa, että noudatetaan immunisointitoimenpiteillä. Havainto ajan 15-20 minuutin jälkeen standardin lihakseen immunisointi on yleisesti suositellaan useimmat anafylaktinen sokki tapahtuu tämän ajan kuluessa [44]. Vapauta kuivan päällystetyn rokote päässä Nanopatch ™ tapahtunut viiden minuutin – näin helposti täyttävät tarkkailujakson aikana ohjeita.

Sen osoittamiseksi, että virusta neutraloivia vasta-aineita on esitetty, seerumia seulottiin pseudoviruspartikkeliin perustuvaan neutralisaatiomenetelmään (PBNA) – pidetään ”kultaisena standardina” in WHO HPV-rokotteille [45], [46]. Tämä määritys mittaa tehokkuutta vasta-aineiden tai muiden yhdisteiden estää pääsyn HPV viruksen 293TT soluihin [47]. Tämä on merkittävää, koska suoja uskotaan olevan seurausta vasta-aineen välittämä viruksen neutralointi [48], [49]. Menetelmä lisäksi poistaa bias käyttäen samaa materiaalia sekä immunisointia ja immunologisen määrityksen, joka tapahtuu, kun ELISA-testiä käytetään. Pitoisuus signaali vain syntyy ehjä pseudovirions, jotka matkivat natiivin virus, mikä tahansa immuunivasteen esiin taudinaiheuttajia vastaan ​​tai denaturoitua proteiinia ei vaikuta tulokset neutraloinnin määrityksen. Nanopatch ™ immunisaatio 0,43 ± 0,084 ng HPV-16 johti virusta tuhoavien vastauksena päivänä 112 rokotuksen jälkeen. Tämä merkitsee sitä, että kuiva päällystetty L1-proteiini säilyttää osan natiivi virus kaltainen rakenne. Me spekuloida, että jonkinasteista purkaminen VLP osaksi pentameerien voinut tapahtua. Tämä väite perustuu meidän vastaavia tutkimuksia käyttämällä virusvektoreita (julkaisematon data). Lisääntyneen immunogeenisyyden VLP verrattuna pentameereja, jos purkaminen tulee pentameereja parhaillaan esiintyvä aikana kuiva-pinnoite, suuri aktiivisuuden kasvu on todennäköisesti kautta muotoiltuna se säilyttäisi VLP rakenne.

Varhaiset tulokset osoittivat vain 50% serokonversiota vuonna 5,7 ± 1,6 ng ja 0,43 ± 0,084 ng Nanopatch ™ ryhmien edut selviävät terminaalissa bleed kun kaikille hiirille on sero-muunnetaan. Tällä pienemmillä annoksilla lihakseen alkoi horjua, jossa tiitterit kaksi hiirtä pudottamalla alle määritysrajan. On mahdollista, että Nanopatch ™ immunisaatio, alunan sisältävien rokotteiden, on hitaampi vapautuskinetiikka verrattuna lihakseen annon – johtuen eri antokohdan ja suurempi depot alkaen kuivattu alum. Vaikka erittäin pienet annokset HPV-VLP näkyvät immunogeeninen lihakseen hiirillä, annoksilla ihmisille hyväksytyssä rokotteet ovat 20-40 ug alue per alatyyppi. Hitaasti vapautuvat kinetiikka voi suotuisasti muuttaa immunologisia tuloksia ja auttaa saavuttamaan optimaalisen aktivoinnin APC-solujen ilman tarvetta fyysisesti hakea useamman annoksen. Lisätyötä tarvitaan tutkimaan tätä.

Aiemmat tutkimukset ihonsisäinen immunisaation COPV [33], [34] käytetään ELISA-määritystä niin suora vertailu tuloksemme ei ole mahdollista. Suzich ym [34] tutki intradermaalisesti koottavien COPV-VLP ja sai osittaisen suojan alemmilla nanogrammaa annostasolla. Vertailun vuoksi myöhemmässä tutkimuksessa Yuan, et. al. [33] kanssa ihonsisäistä antoa COPV-L1-GST-fuusioproteiinia (pysty kokoontumaan VLP) ei osoittanut mitään havaittavaa vastetta ELISA alle 400 ng annosta. Tämä työ keskittyi kokoonpanoon epäpätevä pentameereja kuin edullinen vaihtoehto VLP. Molemmissa tapauksissa osittainen suoja todettiin altistusta vastaan ​​jopa silloin, kun vasta-aineita ei havaittu. Nanopatch ™ immunisaatio virusfragmentti influenssarokotteen ylivertainen annoksen pienentämistä vastaan ​​lihakseen [10] verrattuna, mitä on osoitettu intradermaaliseen [50]. Jos purkaminen HPV-VLP tapahtuu meidän Nanopatch ™ kuivaa päällystettä, lähinnä tehokas annos verrattuna on työhön Yuan et al. Tämä viittaisi siihen, että Nanopatch ™ immunisaatio voidaan antaa lisääntynyt immunogeenisyys vertaamalla suoraan intradermaaliseen (ja siten oletettavasti lihaksensisäinen anto) L1-pentameerien. Koska tällä hetkellä lisensoitu rokotteet VLP perustuvat, muotoiltuna säilyttämiseksi VLP eheys tulee keskittyä tulevan työn.

julkaisu määrityksissä mittaamaan päällysteen osalle, joka vapautuu ihoon – ne eivät mittaa mitä osuus antigeenin tehokkaasti vapautuu aluna, eikä sen konformaatio vapauduttuaan. Jos alunan geeli koaguloidaan mukaisesti aikaisempien tutkimusten [17], antigeeni voi paeta romahti aluna matriisi – mikä vähentää tehokasta annosta. Tämä vaikutus saattaa itse asiassa tyhjäksi tahansa adjuvanttia etuja alunaa toisin määrätä, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään missä määrin aluna matriisi heikentää julkaisu, ja sen vaikutusta. Tuleva työ tutkii proteiinien rakennetta ja hyytymiseen alunaa sekä apuaineita vähentää sitä. Koska HPV-L1-VLP ovat erittäin immunogeenisiä ilman adjuvanttia, muotoiluja ilman alunaa ikään tutkitaan. Me spekuloida, että tiiviimmän muotoiluja, Nanopatch ™ immunisaatio voi lopulta tarkoittaa pienempiä annoksia alunaa adjuvanttina VLP voidaan saada aikaan kestävä immuunivasteen ihmisissä.

Tulevaisuudessa keskitytään parantamaan annoksesta sparingin Nanopatch ™ immunisointia ja tutkivat lämpöstabiilisuus. Tätä varten kuiva päällystetty VLP eheys, tutkimalla adjuvanttia VLP ja parantaa formulaatioita tutkitaan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet tehtiin mukaan University of Queensland eläinten eettisen määräyksiä.

Nanopatch ™ Fabrication

Nanopatches ™ oli valmistettu Deep Reactive Ion Etching patentin [51], että Rutherford Appleton Laboratory, Oxford, UK. Nanopatches ™ oli sputteroimalla päällystetty kullalla, jonka paksuus on 100 nm. Uniform morfologia varmistettiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) on Philips XL30. Näytteet on kallistettu 45 ° vahvistaa tarvittaessa projektio profiili.

Nanopatch ™ pinnoite

Gardasil® (Merck, USA) sentrifugoitiin 5000 g: ssä 15 minuuttia pelletoimiseksi alunan kanssa adsorboitu virus kuten hiukkasia. Supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen metyyliselluloosa lopulliseen konsentraatioon 10 ug /ul metyyliselluloosaa, ja 100 ng /ul HPV-16-VLP. Kymmenkertainen sarjalaimennoksia valmistettiin 10 ug /ul metyyliselluloosaa muotoilla eri annoksina. Methocel® 60 HG – metyyli-selluloosa (Cat # 646555) ostettiin Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia).

Nanopatches ™ 110 um pitkän neuloja päällystettiin pipetoimalla 8 ui päällystysliuosta päälle pinnan ja kuivan päällysteen typpi-jet kuten aikaisemmin on kuvattu [42]. Pinnoite morfologia vahvistettiin SEM.

Nanopatch ™ Immunisointi

Neljä ryhmää (N = 5) ja C57BL /6-hiiriä 6 viikkoa vanhoja nukutettiin Ketamil® ja Xylasil®. Sitten hiiret paikattu kerran kussakin korvan ventraalisella puolella käyttäen jousi applikaattorin laastarin 2,0 ms

-1 – nopeus havaittu tuottavan maksimaalisen neulatunkeuma vahingoittamatta kudosta (tuloksia ei ole esitetty). Mainituilla annoksilla tässä asiakirjassa viitataan koko HPV-16 annosta kutakin immunisointia jaetaan kahden Nanopatches ™, ja hiiriä immunisoitiin päivänä 0, ja tehoste 14. päivänä Merkit pidettiin in situ 5 minuuttia. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals National Health ja Medical Research Council (Australia). Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden of Queenslandin yliopistosta (Luvan numero AIBN /020/10 (NF)). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

lihakseen

Gardasil® annokset olivat keskittyneet sentrifugoimalla 5000 g 15 minuutin ajan. Ylimääräinen supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin uudelleen sopiva määrä supernatanttia antaa HPV-16 VLP konsentraatio 0,2 ug /ul. Neljä 10-kertainen valmistettiin sarjalaimennokset osaksi ylimääräisen supernatantista.

Viisi ryhmää (N = 5) ja C57BL /6-hiiriä 6 viikkoa vanha immunisoitiin lihaksensisäisesti päivänä 0 ja tehoste 14. päivänä 25 ui toimitetaan noin 2 mm kuhunkin caudal lihakseen takajalkojen kunkin ryhmän kanssa sai 10 ug, 1 ug, 100 ng, 10 ng tai 1 ng HPV-16 hiirtä kohden immunisaatiota.

Ohjaus Application

Ajankohtainen ohjaus: Yksi ryhmä (N = 5) C57BL /6-hiiriä 6 viikkoa vanha nukutettiin ketamil ja xylasil. Hiiret hillitty kanssa ventraalinen korvan pinnan tasainen, ja 125 ui Gardasil® (joka sisälsi 10 ug HPV-16) levitettiin paikallisesti viisi minuuttia.

Fluvax immunisoiduista ohjaus: Yksi ryhmä (n = 5) C57BL /6 hiirillä 6 viikkoa vanha nukutettiin Ketamil® ja Xylasil® ja immunisoitiin intramuskulaarisesti 6 ug Fluvax 2008® (CSL Ltd., Melbourne, Australia) tilavuudessa 30 ui.

Immunisoimattomat ohjaus : Yksi ryhmä (N = 5) C57BL /6-hiiriä 6 viikkoa nukutettiin Ketamil® ja Xylasil® ja uhrattiin välittömästi loputtua refleksit sydänpistolla.

Sera kokoelma

Veri näytteet saatiin päivänä 28 ja 112 rokotuksen jälkeen retro-orbitaaliverestä, ja seerumin erotettiin. Seerumit säilytettiin -20 ° C: ssa analyysiin asti.

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) B

Näytteet tutkittiin toisen elektronin ja takaisin hajallaan elektroni liikennemuotojen Philips XL30.