Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen ja validointi biomarkkereita kliinisiä sovelluksia on edelleen tärkeä kysymys parantamiseksi diagnostiikan ja hoidon monia sairauksia, mukaan lukien eturauhassyöpä. Geeniekspressioprofiilien rutiininomaisten tunnistamaan diagnostisten ja ennakoivan biomarkkerit tai uusia kohteita syövän. Kuitenkin vain harvat ennustava merkkiaineiden tunnistettu

in silico

on myös validoitu kliinisiin, toiminnallista tai mekanistinen merkitystä taudin etenemistä. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet laajaa, bioinformatiikan lähestymistapa tunnistaa tällaiset biomarkkerit poikki spektrin etenemisen vaiheista, sisältää normaalit ja kasvaimen vieressä, syöpää edeltäviin, ensisijainen ja myöhäisessä vaiheessa vaurioita. Bioinformatiikan data mining yhdistetään kliininen validointi biomarkkereiden herkkien, kvantitatiivinen Käänteiskopiointia PCR (qRT-PCR), jota seurasi toiminnallinen arviointi kandidaattigeenejä sairauteen asiaan liittyvien prosessien, kuten syövän solujen lisääntymistä, liikkuvuuteen ja hyökkäystä. 300 alkuperäisen ehdokkaita, kahdeksan geenit valittiin tehtävän hyväksynnän useita kerroksia data mining ja suodatus. Kliinisen validointi, ero mRNA-ekspressiota valittujen geenien mitattiin qRT-PCR 197 kliinisessä eturauhasen kudosnäytteitä kuten normaalissa eturauhasessa, verrataan histologisesti hyvänlaatuinen ja syöpäkudokset. Joka perustuu qRT-PCR-tuloksiin, merkittävästi erilaiset mRNA: n ekspressio vahvistettiin normaalissa eturauhasessa verrattuna pahanlaatuisten PCa näytteitä (kaikki kahdeksan geenejä), mutta myös syöpään viereisiin kudoksiin, jopa ilman havaittavaa syöpäsoluja, mikä osoittaa mahdollisuuden of lausutaan kentän vaikutuksia eturauhasen vaurioita. Sillä validointi funktionaalisia ominaisuuksia näiden geenien, ja osoittamaan otaksuttu merkitystä taudista asiaan liittyviä prosesseja, siRNA knock-down tutkimukset suoritettiin sekä 2D- että 3D-organotyyppisiä soluviljelymalleissa. Hiljentäminen kolme geeniä (

DLX1

,

PLA2G7

ja

RHOU) B on eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3 ja VCAP siRNA aiheutti selvästi kasvun pysähtymisen ja sytotoksisuutta, erityisesti 3D organotyyppisiä soluviljelmässä olosuhteissa. Lisäksi vaimentaminen

PLA2G7

,

RHOU

,

ACSM1

,

LAMB1

ja

CACNA1D

myös johti pienentyneeseen kasvainsolun invaasio PC3 organoidikappaleen kulttuureissa. Sillä

PLA2G7

ja

RHOU

vaikutukset siRNA hiljentäminen proliferaatioon ja solu-liikkuvuus voitaisiin vahvistaa 2D yksikerrosviljelmissä. Lopuksi DLX1 ja RHOU voimakkaimmin potentiaalia hyödyllinen kliininen biomarkkereita PCA diagnoosin lisäksi vahvistanut niiden toiminnallisten roolien PCA etenemistä. Nämä ehdokkaat voivat olla hyödyllisiä luotettavamman tunnistamisen pahenemisvaiheiden tai hoidon epäonnistumisia ennen uusiutumisen paikalliseen tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä.

Citation: Alinezhad S, Väänänen RM, Mattsson J, Li Y, Tallgren T, Tong Ochoa N, et ai. (2016) validointi uusien biomarkkereiden eturauhassyövän etenemistä yhdistämällä bioinformatiikan, Clinical and Functional Studies. PLoS ONE 11 (5): e0155901. doi: 10,1371 /journal.pone.0155901

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 14 lokakuu 2015; Hyväksytty: 05 toukokuu 2016; Julkaistu: 19. toukokuuta 2016

Copyright: © 2016 Alinezhad et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki Marie Curie (FP-7) Prostate Research Organizations-verkosto alkuvaiheen Training (PRO-NEST, projekti viite 238278) , ja Suomen Akatemia (Kasvain mikroympäristölle etäpesäke kastraatio hylkivät Eturauhassyöpä, projekti numerot 267326 Matthias Nees ja 267326 Malin Åkerfelt). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma kaikissa länsimaissa. Eturauhassyövän edustaa yleisimmin diagnosoitu kasvain kokonaisuus jälkeen ihosyöpä miehillä, ja se on toiseksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa. Yhdysvalloissa 233000 uutta tapausta Eturauhassyövän diagnosoitiin, ja 29480 miestä kuoli taudin vuonna 2014 [1]. Yksi seitsemästä miehillä voi invasiivisen eturauhassyövän elinaikanaan [1]. Mittaamalla seerumin prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot, jonka jälkeen eturauhasen (DRE) ja histologinen tutkimus eturauhasen koepaloja, ovat edelleen yleisimmin käytetty rutiini diagnostisten menetelmien PCA. Vuonna 1986 PSA hyväksyttiin biomarkkerina valvontaan ja seurantaan Eturauhassyövän potilaiden Yhdysvaltain Food and Drug Administration [2]. Varhaiset tutkimukset ovat raportoineet merkittävä lasku kuolleisuus Eturauhassyövän potilaiden [3] jälkeen laajan käyttöönoton PSA testit laajamittaisia ​​väestön seulontaa. Kuitenkin enemmän viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että PSA seulonta voi johtaa laajoihin yli-diagnoosin ja kallis yli-potilaiden hoitoon veltto syöpiä [4]. PSA on kudosspesifinen, mutta ei ole syöpä-spesifinen markkeri eturauhassyövän, kohonneita PSA aikana ja kemoterapian jälkeen tai eturauhasen rikkoutumisen osoittamiseksi hoidon, ja näennäinen taudin uusiutumista. Vaikka kiistaton kliinisen seurannan markkeri, PSA-arvot vasta nousta jälkeen PCa remission ja kun etenemisen on jo tapahtunut. Niinpä PSA on pieni diagnostinen ja käytännössä mitään ennustearvo taudin etenemistä paikallisesti edennyt syöpä ( 10%: lla potilaista), tai jopa metastaattisen PCa. Viime aikoina on kuitenkin, paneeli neljä kallikreiinien yhdessä PSA-aided riski kerrostumista, osoitettiin olevan käyttökelpoisia tunnistamaan ihmisiä heidän fifties erittäin lisääntynyt riski taudin etenemisen ja kehittämisen etäpesäkkeiden. Tämä tarjoaa keinon vähentää yli-diagnoosin veltto tauti [5]. Herkempi, informatiivinen, taudista ja syöpää erityisiä biomarkkerit olisi tarpeen, jotta voidaan erottaa potilaat on suuri riski, joilla on veltto syövät tai jopa syöpää edeltävä esiasteleesioita. Tämä voi myös markkereita, jotka osoittavat syöpään liittyvän ”kentän vaikutuksia”, jotka vasta äskettäin kuvattu eturauhassyövän [6], mutta on nyt tullut toistuva havainto, joka on todennäköisesti tullut tärkeitä diagnostisia tarkoituksia varten. Tissue-pohjainen markkeripaneelit voi olla mahdollista merkittävästi parantaa diagnostiikkaa, mikä lisää tarkkuutta ja aiemmin havaita, tai ne voivat osoittaa usein havaittu multifokaalisen taudin luonne [7]. Kehittyvät sovellukset eri omiikka-teknologiat, kuten genomiikka, transkriptomiikan proteomiikka ja metabolomiikka ovat edistäneet alan biomarkkereiden löytö merkittävästi. Markkereita, jotka ovat toiminnallisesti mukana eri vaiheissa taudin etenemisen tai metastaaseja saattaisi olla suurimmat mahdollisuudet onnistuneesti ennustaa epäonnistumisia säteilyn ja anti-hormoni hoitojen, jotka johtavat erittäin aggressiivinen ja metastaattinen, kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC). Tällaiset mekaanisesti mukana markkereita voi paitsi merkittävästi parantaa PCa hallintaa kliinisissä käytännöissä; ne voivat myös edustaa uusia kohteita terapeuttiselle interventiolle. Kliinisessä käytössä soveltaminen enemmän ennakoivaa, kudoksista markkereita voidaan mielekkäästi yhdistää muihin korkean riskin parametreja kuten positiivinen ekstrakapsulaarinen tai rakkularauhanen invaasio, kehittynyt kasvain vaiheessa ( T2c, T3 ja T4), korkea Gleason laadut ( 8), tai korkea erittäin korkeat PSA ( 20 ng /ml); ja olisi edelleen tuettava valokuvaamisen teknologioita, kuten MRI.

Viime vuosina molekyylitekniikoiden kuten microarray geeniekspressioprofilointi ja seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) ovat helpottaneet genominlaajuisten tutkimuksissa kasvaimen geeniekspression profiilit. Vastaavasti microarray ja NGS-pohjainen geeniekspressioprofilointi on laajalti käytetty tunnistamiseen paneelien prognoosi- [8] ja ennakoivan biomarkkereiden lukien sellaiset, jotka saattavat viitata PCA uusiutumisen [9,10], varhainen ja loppuvaiheen syövän etenemisessä, tai kenttään vaikutuksia. Tunnistaminen romaani, informatiivinen biomarkkereita keuhko- ja peräsuolen syövän järjestelmällisen kaivos julkisen geeniekspression aineistoja kuten The Cancer Genome Atlas (TCGA) on raportoitu [11,12] muualla. TCGA tietokanta sisältää useita laajoja geeniekspressiotutkimuksissa perustuu kliinisiin PCa koepaloja [13,14,15], jotka ovat peräisin julkisesti rahoitetun tutkimuksen ja avoimesti saatavilla aineistoja. CBio Cancer Genomics portaali [16] (https://www.cbioportal.org) on ​​tärkein avoin pääsy voimavara kaivos TCGA syöpä genomiikka aineistoja, ja tällä hetkellä isännöi yli 21.000 kasvain näytteet 20 eri syövän yhteisöjä ja 91 tutkimuksissa. Olemme valinneet yksi suurimmista ja kattavin näistä microarray ilmaisun tutkimuksia PCa n, suoritetaan pääasiassa kliinisistä koepaloja, suoritti Taylor et al. Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) [13] vuonna 2010. Tutkimukseen kuuluu 181 ensisijainen PCa näytteitä, 37 metastaattinen PCa näytteitä, 12 PCa solulinjojen ja ksenografteissa, ja 29 normaalissa eturauhasessa kudoksissa tervettä verrokkia. Suuri määrä patologisten ja kliinisten parametrien kuten Gleason laadut, TNM vaiheissa, positiivinen kirurgiset marginaalit, aseman paikallisen invaasion syöpäsolujen imusolmukkeisiin, rakkularauhaset tai ekstrakapsulaarinen tila, tai kaukana etäpesäke ovat selityksin. Nämä parametrit ovat tärkeimpiä arvioida PCa aggressiivisuus, ja ennustaa luotettavasti huono tulos tauti. Meidän erityinen tavoite tiedon louhintaan oli hyödyntää avoimen, puolueeton lähestymistapa, jossa käsitellään laaja kirjo normaaleissa kudoksissa, primaarisyöpien, ja myöhäisen vaiheen, kehittynyt leesioita. Koska tavoitteena ei ollut ennustaa kliininen tulos tai arvioi yksittäisen riskin potilaille tai potilasalaryhmissä perustuen mRNA ekspressiotietojen, ja joita ei ole jaettu koulutusta ja testi asettaa rajat validointi. Myös ei tähdätä arviointiin ”ennakoiva merkki allekirjoitus”, jota käytetään kaikilla muilla, itsenäinen mRNA geeniekspressiotutkimuksissa. Cross validointi ei näin ollen ollut välttämätöntä, jotta voidaan vahvistaa, kuinka tilastollisesti tarkka joukko ennustavan biomarkkereita hoitaisi ylimääräisiä aineistoja. Sen sijaan tavoitteenamme oli löytää aiemmin ilmoittamatta biomarkkereita ja validoida niitä koko kirjon kliinisiä koepaloja saatavilla PCA. Lähestymistapamme perustuu analyysiin ero mRNA ilmaisun tunnistamisesta biomarkkereiden ehdokkaista, minkä jälkeen niiden kokeellinen korrelaatio kriittisin kliinisten parametrien itsenäisissä näytekokoelmia, jotka olivat usein hyvin eri alkuperää verrattuna microarray data. Pääpaino oli toiminnallinen validointi biomarkkereiden suhteen PCA taudin alkamisen ja etenemisen, mieluiten yhdistettynä arvioida niiden mahdollisia diagnostista arvoa.

riippumaton validointi ensimmäiset havainnot, me louhitaan lisäresursseja, kuten

in silico

transkriptomiikka (IST) tietokanta [17] (https://ist.medisapiens.com). Tämä tietokanta sisältää mRNA geenien ilmentyminen tietoja yli 20.000 Affymetrix mikrosiruja, jotka kattavat 60 terveiden kudosten, 104 pahanlaatuinen ja 64 muu sairaus tyyppejä. Tiedonlouhintaan olemme hyödynnetty Ingenuity Pathway Analysis (IPA), joka tarjoaa geeni yhdistys ja ontologian tietoa, ja sallii suodattamisen geenien perustuvat toiminnalliset näkökohdat. Viimeinen ei vähäisimpänä, käytimme PubMed kirjallisuutta tietojärjestelmän suodattaa biomarkkerit, jotka on toistuvasti kuvattu ennen kuin niihin liittyviä PCA. Erän tila tekstinlouhintaa työkalu (https://pmid.us) käytettiin, mikä mahdollisti sca1nning läpi koko kirjallisuuden verkon otsakkeen ”eturauhassyöpä”, vastaan ​​co-esiintyminen satojen kandidaattigeenejä merkitty ”geeni symboleja”. Tämän strategian, joukko 300 otaksuttu biomarkkereiden ehdokkaiden tärkeysjärjestykseen askel askeleelta, yhdistämällä eri tiedon- ja tekstinlouhintavälineissä tai suodatusta lähestymistapoja, korostaen markkereita, jotka voimakkaimmin korreloivat yleisiä näkökohtia PCa etenemisen, hoidon epäonnistuminen, tai eteneminen metastaattinen CRPC, mutta ei aikaisemmin kuulunut suuri määrä tieteellistä raportteja. Kahdeksan geenit valittiin kliinisen ja toiminnallinen validointi. Tätä tarkoitusta varten, kvantitatiivinen, sisäisiä standardeja reaaliaikainen käänteistranskriptiotuotteiden PCR (RT-PCR) levitettiin hyödyntäen neljä itsenäistä kudosnäytteestä kokoelmia eturauhasen ja cystoprostatectomy. Nämä sisälsivät normaalia cystoprostatectomy näytteitä, histologisesti hyvänlaatuinen kudosta cystoprostatectomy näytteeksi, joista satunnaisista eturauhasen syöpä, lisäksi histologisesti hyvänlaatuinen kudoksiin, ja pahanlaatuisten syövän eturauhasen yksilöitä.

Viimeaikaiset edistysaskeleet solubiologian ovat helpottaneet systemaattinen toiminnallinen validointitutkimuksiin ( toiminnallinen genetiikka) on biomarkkereiden ehdokkaita, jotka perustuvat tehokkaita toimintamalleja kuten pienten interferenssi-RNA (siRNA tai RNAi), CRISPR /Cas9 ja Talen teknologioita. Näistä siRNA tutkimukset ovat edelleen helpoimmin, edullinen ja nopein teknologioiden koekäytännöllä, ja edustaa ensisijainen lähestymistapa toiminnallisessa tavoite validointi. Jotta tutkia funktionaalisia vaikutuksia valittujen geenien kasvuun, leviämisen ja invasiivisia ominaisuuksia eturauhassyöpäsolujen, siRNA knock-down -tutkimukset Valittujen geenien tehtiin sekä 2D ja organotypic 3D-mallien (organotypic soluviljelmissä) käyttäen huonosti invasiivisia VCAP ja erittäin aggressiivinen PC3 solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

analyysi geenien ilmentymisen profilointi tunnistaa ehdokas biomarkkerit

paneeli erilaisia ​​bioinformatiikan analyysi ja suodatus menetelmiä on sovellettu minun iso mittakaavaisia ​​geeniekspressioprofilointi aineistoja, ja valita parhaiten informatiivinen, otaksuttu biomarkkereita ennustetta ja /tai seurantaan sairauden etenemisen (koottu kuvioon 1). Käytimme Bioconductor /R-pohjainen datan normalisointi ja RMA (Robust Multi-chip keskiarvo) paketti käsittelyä ja normalisointia Affymetrix kokeen sarjaa poimittu TCGA /cBio portaali. Seuraavaksi geenejä luokiteltu ero geeniekspressiota poikki tärkein näyte ryhmät (N, normaali T, ensisijainen PCa, ja M, metastaattisen PCA). Tätä varten käytimme useita tilastollisia testejä merkitsevyys (ANOVA, T-testiä tai Z-score sekä U-testi, ja sitten suodatetaan ehdokkaat useiden testaus korjaukset (Bonferroni). Samanaikaisesti, käytimme SAM tai ” merkitys Analyysit mikrosirut ”ohjelmassa käytetään False Discovery Rate (FDR) perusteet geenin valintaa. Tämä lähestymistapa johti päällekkäisiä, samankaltainen geeni sarjaa (tuloksia ei ole esitetty). Poistimme analyysimme suuresta MSKCC aineisto (218 kasvain profiilit, mukaan lukien 37 etäpesäkkeitä, 12 PCa solulinjat, ja 29 normaalissa eturauhasessa kudokset). Differential ilmentymisen kunkin geenin yli 181 ensisijaista syövän näytteitä verrattiin 29 normaalin näytteet (

T versus N vertailu

). Vastaavasti, ekspressiota 37 metastaattinen näytteitä verrattiin 181 ensisijaisen PCa näytteet (

M vs. T

). keskimääräinen kertainen muutos mRNA ilmaisun ja tilastollista merkittävyyttä kaikissa näytteissä laskettiin, ja geenit rankattiin mukaan vahvin eroja mRNA geenissä lauseke (fold muutos, katso S1 ja S2-tiedostot). Top 300 hits kussakin ryhmässä (T vs. N ja M vs. T) asetettaisiin tämän jälkeen lisätietoja suodatus: Vain ne geenit valittiin seurata, että osoitti tilastollisesti merkittävimpiä, vankka ja toistettavia eroja normaalin, ensisijaisen Eturauhassyövän ja metastaattinen PCa näytteet (perustuen FDR arvioihin tai Bonferronin-suodatin). Olemme käyttäneet myös kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) työkalu ylimääräisiä suodatustapoja alkuperäisen geenin luettelot, joka perustuu sekä tilastollisia tunnuslukuja sekä toiminnallinen ”geeni ontologian” ja mekanistinen polku merkinnät. Hyödynsimme sijoittui ehdokaslistan tuottaman IPA ylimääräisiä korrelaatio kliinisten parametrien (Kaplan-Meier koealojen), arviointi kudosspesifisiä ilmaisun ja kirjallisuuden tekstinlouhintaan (seuraava kappale). Syövän-geenit tunnistettu ilmennetty eri välillä N- ja T-ryhmät, sijoitus oli korkeampi, jos ero mRNA geenin ilmentymistä havaittiin myös välillä T ja M alaluokkia.

Jokaisen valitun geenin, laatikko -kuvaajaksi ilme kaaviot luotiin käyttäen in-house html-pohjaisiin visualisointityökalu (R-suoritettavia (REX)). Tämä mahdollistaa järjestelmällisen, käyttäjälähtöinen data mining tietokokonaisuuksien mukaan kliinisten parametrien (esim. Kasvain alaryhmiä kuten ensisijaisena vs. metastaattinen syövät, imusolmuke ja ekstrakapsulaarinen hyökkäys, tunkeutumisen kirurgisten marginaalit, ja kaukainen etäpesäke). Lisäksi differentiaalikaavojen välillä alhainen (4-6), keskitason (7) ja korkea (8-10) Gleason tulokset, tai eri vaiheissa taudin ( T2, T3 ja T4), ja tauti luokkia kuten ensisijainen vs. imusolmuke etäpesäke, järjestelmällisesti arvioitiin (kuvio 2A). Seuraavaksi etusijalle geenejä, jotka olivat nimenomaan, edullisesti tai voimakkaasti ilmaistu eturauhasen verrattuna kaikkiin muihin ihmisen kudoksissa, mukaan lukien muut kasvain yhteisöjä. Tätä tarkoitusta varten, kudosspesifisen ilmentymisen tulokset antamat IST online-tietokannasta käytettiin (kuvio 2C). Kudosspesifisesta ilmaisun tulokset ja laatikko-juoni ilmaisun kaaviot muiden valittujen geenien esitetään yhteenveto S3 File.

A) Dot juoni kaavio, joka kuvaa yhdistyksen mRNA geenin ilmentymisen CACNA1D normaaleissa ja syövän näytteitä paneeli kaikkein informatiivinen kliinis-patologinen parametreja. B) Kaplan- Meier analyysit, osoittaa korrelaatio korkeita mRNA ilmaisun CACNA1D pienemmällä eloonjäämiseen analyysi PCA potilaille. C) Suhteellinen ilmentyminen CACNA1D koko paneelin 60 + normaali ja syöpään liittyvien ihmisen kudostyypeistä ja sairauksia.

Seuraavaksi käsitellään kliinisistä tuloksista, mutta käytetään muiden tietokokonaisuuksien lisäksi MSKCC microarray data. Kunkin valitun geenin, Kaplan-Meier potilaiden hoitotuloksiin juoni perustuu riippumattomaan, laajamittainen kliinisessä tutkimuksessa julkisesti saatavilla [15] luotiin. Tätä tarkoitusta varten olemme keskittyneet koko selviytymisen ja taudista vapaan välein käyttäen epäparametrinen tilastojen syrjiä elossaololuku toimintoja kliinisistä eliniän datasta (Kuva 2B). Koska noin 85-90%: lla potilaista jopa paikallisesti edennyt PCa osoittavat pitkäaikaista selviytymistä ( 5 tai 10 vuotta) ja useimmiten hyvä kliinisistä tuloksista, ja vain 10-15% näistä potilaista edetä CRPC, olemme valinneet vastaava numerot myös Kaplan-Meier analyysit. Vastaavasti 85%: lla potilaista ryhmiteltiin ”alhaisen riskin /hyvä kliininen tulos” kategoriaan, verrattuna 15% korkean riskin potilailla, jotka edetä kehittyneitä Eturauhassyövän.

Lopuksi priorisoida uusia ehdokas biomarkkereita myöhemmät toiminnallinen ja kliininen validointi, lista biomarkkereiden ehdokkaista suodatettiin vastaan ​​koko PubMed kirjallisuuden tietokanta. Co-esiintyminen kandidaattigeenifragmenttikloonien nimiä ja Hugo symboleja termin ”eturauhassyöpä” in PubMed tietokantamerkintöjen seulottiin systemaattisesti, käyttäen PubMed erän-haku työkalu (https://pmid.us). Geenit, jotka mainittiin yli viisi kertaa indeksoitu tieteellisiä julkaisuja olivat automaattisesti sulkea pois ”on kuvattu yksityiskohtaisesti aikaisemmin” (tila kirjallisuudesta: syyskuu 2012). Nämä viimeiset suodatus vaiheet johti kahdeksan geenejä kokeellisiin validointi. Geenien ilmentyminen tonteista IST tietokannasta ja pistekuvioita päässä MSKCC datasarjan esitetty yhteenvetona S3 tiedosto. Meidän tavoitteena oli tunnistaa ja vahvistaa yleistä PCa erityisiä biomarkkerit (diagnostiset merkkiaineet), mukaan lukien biomarkkerit jotka voivat osoittaa varhain ja multifokaalinen sairaus vaiheita tai ”kenttä vaikutuksia”. Lisäksi halusimme vahvistaa mahdollisia PCa etenemisen markkereita (ennustetekijöitä markkereita), jotka viittaavat kehitystä uusiutumisen, CRPC ja etäpesäkeleesioita jälkeen hoidon epäonnistumisen.

kudosnäytteitä kliiniseen biomarker validointi

eettisen komitean sairaanhoitopiirin Varsinais-Suomen hyväksyi tutkimussuunnitelman. Se oli mukaisesti Helsingin julistuksen 1975, uudistettu 1996, jolloin kirjallinen lupa saatu kullekin osallistujalle. Kaksi toisistaan ​​riippumatonta eturauhasen liittyviä kudosnäytteitä käytettiin kliinistä validointia. Ensimmäinen koostui 180 eturauhasen kudosnäytteitä saadaan yhteensä 90 ensisijaisen PCa potilaita, hoitaa eturauhasen (HE) Turun yliopistollisen sairaalan (TYKS). 90 potilasta, vain 2 potilasta oli saanut HKK-analogeja ennen leikkausta kuin ennen leikkausta hoitoa. Kunkin eturauhasen, kaksi kudosnäytteet otettiin. Yksi oli peräisin epäillään syöpä tilassa muista viereisestä alue, epäillään olevan hyvänlaatuinen. Histo-patologia puolet kummastakin kudosnäyte tutkittiin TYKS patologit, kun taas toinen puoli tallennetaan välittömästi guanidiini-isotiosyanaatti (GITC) puskuri RNA. Tutkimus osoitti, että 30: lla potilaista, molemmat näytteet otettiin hyvänlaatuinen alueella; 15 potilasta, molemmat näytteet otettiin syöpä alueella; ja 45 potilasta, yksi näyte otettiin hyvänlaatuinen ja toinen syöpä alalla (kuten alun perin). Vain kaksi tarvittavat näytteet suljetaan pois, koska teknisten ongelmien kanssa RNA. Lopuksi, 178 näytettä (104 hyvänlaatuinen näytteet ja 74 syöpäsolujen näytettä) jätettiin geenin ilmentymisen analyysi qRT-PCR: llä. Kliiniset ja patologisia piirteitä kaikista 90 PCa asiat on esitetty taulukossa 1.

Toinen ryhmä koostui 19 eturauhasen kudosnäytteitä, saatu virtsarakon syöpä ilman kliinisiä oireita PCa. Nämä liikennöi cystoprostatectomy (CP) at Skåne yliopistollisessa sairaalassa Malmössä. Kokenut patologit käyttäen samaa protokollaa kuin aiemmin kuvattu RP yksilöitä, tutki kaikki eturauhasnäytteissä. 12 19 eturauhasnäytteissä tästä kokoelmasta oli satunnaisia ​​PCa (IPCA), kun taas seitsemän oli vailla havaittavaa syöpä pesäkkeitä. Kun kyseessä on IPCA, kudosnäytteiden geeniekspressioanalyysiä varten otettiin hyvänlaatuinen alueella.

Extraction ja käänteistranskriptio ja RNA

RNA: n kudosnäytteistä on kuvattu aiemmin [18] . Lyhyesti, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Saksa) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aikana RNA, ja sen jälkeen alustavan solun hajoamiseen vaiheessa tunnettu määrä RNA keinotekoisesti mutatoituja

KLK3

geeni, kutsutaan mmPSA, lisättiin näytteeseen sisäisenä kontrollina ja absoluuttisia ekspressiotasoja. Laatu saatua mRNA: ta varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla, ja lopullinen RNA-pitoisuus mitattiin NanoDrop N2000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technology, LTD Lab). Käänteiskopioitua cDNA luotiin käyttäen High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, USA), seuraten valmistajan ohjeita.

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR

aiemmin kuvattu protokolla [19] hydrolyysimenetelmän tehostettu luminescent kelaattia kemia, joka perustuu aikaerotteisessa fluorometriassa, käytettiin myös tässä kvantitatiivista tosiaikaista RT-PCR. Kullekin geenille, pari spesifisiä alukkeita, ja vastaavia toimittaja ja sammuttaja alukkeet suunniteltiin ja hankittiin Thermo Fisher (Saksa) (S1 taulukko). Merkitä toimittaja antureista tehokkaasti kanssa nonadentate europium kelaatti, joka on aiemmin kuvattu menettely [20] käytettiin. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi 2,5 ui templaatti-cDNA, jossa Hotmaster

™ Taq-DNA-polymeraasia (5 Prime, Saksa) tai AmpliTaq

® Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, USA) . Näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena. Korjaamaan mahdollisia RNA: n hajoamisen määrän ja RNA menetetty uuton aikana ja käänteistranskriptiolle, saatu transkriptio tason tietojen täytyy normalisoida. Housekeeping geenit (esim.

GAPDH

) oletetaan puhtaaksi vakiona eri kudoksissa ja kaikissa olosuhteissa, ja käytetään laajalti normalisointia RT-PCR-tulokset suhteellisessa kvantifiointimenetelmät [21]. Kuitenkin luotettavuuden taloudenhoito geenien normalisointia on usein kyseenalaistettu, koska niiden epävakauden varastoinnin aikana ja epäjohdonmukaisia ​​ilmaisun muutoksia eri tautitiloissa [22,23]. Lisäksi kiinteän määrän keinotekoisen RNA, joka ei ilmenny näytteet luonnostaan ​​sisäisenä viitteenä RNA-näytteisiin (ennen uuttoa) pidetään luotettavampi vaihtoehto normalisointia [24,25]. Tässä tutkimuksessa olemme ottaneet etuja käyttämällä keinotekoista RNA (mmPSA) normalisoinnin ja etuja käyttämällä leimatut lantanidikelaateilla sijasta Taqman, jotka mahdollistavat aikaerotteista fluorometriaa varten qRT-PCR-määrityksissä.

Tilastolliset analyysit

qRT-PCR-analyysit, näytteet katsotaan positiiviseksi, jos kaikki kolme toistoa ylittivät alimman toteamisrajan (LDL). Absoluuttinen, numeerinen määrä geenin ilmentymistä tahansa geeni on laskettu käyttäen sisäisen standardin arvoja, normalisoidaan määrä kokonais-RNA: Näissä määrityksissä käytetty. Testaamiseksi eroja transkriptipitoisuuksissa kandidaattigeenien välillä tapaus ja kontrollinäytteiden sekä eri näytteen luokkien, ei-parametrinen Mannin-Whitneyn

U

testiä sovellettiin. Toiminnan arvioinnissa kunkin ehdokkaan geenin diagnostinen ympäristössä, vastaanotin toimineelle (ROC) käyrä analyysi suoritettiin ja käyrän alapuolinen alue (AUC) käytetään arvioimaan herkkyys ja määritysten spesifisyyttä. Tunnistaa yhdistys mRNA transkriptin tasot tiettyä ehdokasta geenin kasvaimen etenemistä (mitattuna PSA uusiutumisen klinikoilla), RP näytteet jaettiin kahteen ryhmään, mikä PSA uusiutuminen ja nro uusiutuminen, vastaavasti; mukaan kliinisen seurantatietoja. Yhteenliittymää välillä ehdokas geeniekspressiotasot ja kliinisiä tai patologisia parametreja kuten Gleason luokalla, Gleason pisteet, osuus syövän versus strooman solujen kudoskoepaloihin ja kliininen T luokka (T-vaihe) oli käsitelty ei-parametrinen Mannin-Whitneyn

U

testi, jotta voidaan tunnistaa tilastollisesti merkitseviä eroja (p 0,05). Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS-ohjelmiston, versio 22 (IBM, USA).

Functional gene knock-down tutkimuksissa siRNA

PC-3 androgeenista riippumaton ihmisen eturauhasen syöpäsolujen luu- etäpesäkkeitä eturauhasen adenokarsinooma hankittiin ATCC (USA) [18], ja niitä kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa 37 ° C: ssa standardeissa soluviljelyolosuhteissa (95%: n kosteudessa ja 5% CO2). SiRNA knock-down -tutkimukset, yhteensä 31 eri siRNA: ita tilattiin Qiagen (Saksa) (kolme eri siRNA varten

ACSM1

ja neljä eri siRNA kullekin seitsemästä muusta geenejä). Käytimme useita PCa solulinjoissa, mukaan lukien PC-3, VCAP ja LNCaP, näiden toiminnallinen validointi kokeita. Jotta saavutetaan tehokkain mahdollinen knock-down kullekin geeni, useat siRNA: t testattiin sekä erikseen sekä yhdistettiin seoksia, jotka sisältävät kaikki kolme tai neljä siRNA tasaisin pitoisuuksina. ALLSTARS Hs solukuoleman ohjaus siRNA (Qiagen, Saksa) käytettiin positiivisena kontrollina arvioida tehoa transfektion kussakin kokeessa. SiRNA: t esi-ladattiin kuoppiin, Hiperfect transfektio ainetta (Qiagen, Saksa) Opti-MEM-alustassa (Invitrogen, USA) lisättiin, ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lopuksi, 2000-5000 PC-3, LNCaP tai Vcap-soluja lisättiin kuhunkin kaivoon. Lopulliset pitoisuudet siRNA ja Hiperfect kussakin reaktiossa olivat 4 nM ja 8 nM, vastaavasti. Arvioida tehokkuuden RNA-häirintää kunkin geenin eri siRNA: t, kokonais-RNA uutettiin transfektoiduista soluista viiden päivän kuluttua siRNA transfektion ja erityisten mRNA: n ilmentymisen kohdegeenien mitattiin qRT-PCR: llä. Valita ne siRNA-molekyylejä, jotka johtavat tehokkain knock-down, normalisoitu ilmaisu arvot jokaiselle käsitellylle näytteelle jaettuna ilmentymistason ehdokas geenin käsittelemätön kontrolli soluissa ( ”salattu ohjaus”). Jotta poistetaan kaikki mahdolliset vaikutukset tämän menettelyn kohdegeenin ilmentymisen, mock-transfektoituja soluja (käyttäen vain transfektion agentti) sisällytettiin toisena ohjaus.

fluoresenssimäärityksissä apoptoosin mittaamiseksi ja kasvun esto VCAP organoids jälkeen siRNA transfektion

VCAP soluja ei kasvanut 3D olosuhteissa, jos suoraan upottaa matrigeelin tai kollageenin kulttuureissa. Näin ollen, Vcap-solut transfektoitiin siRNA: illa, kuten on kuvattu PC3. Seuraavaksi transfektoidut VCAP soluja kasvatettiin kierroksella pohjaisten levyjen. Solujen annettiin aggregoitua ja muodostaa pallosia seitsemän päivää transfektion jälkeen. Pieni määrä pallosia (1-6) siirrettiin 3D kulttuuriin kuoppiin. Tällaiset VCAP organoids osoitti muutaman fenotyyppivaikutukset, mutta näytetä muuttunut organoidikappaleen kasvun ja eri apoptoottisten, kuolleen tai kuolevan solujen 3D kulttuuri vastauksena siRNA: ita, mikä katsottiin informatiivinen. Solujen elinkyky määritettiin CellTiter-Glo mukainen määritys valmistajan ohjeiden (Promega, USA). Lyhyesti, CellTiter-Glo puskuria ja lyofilisoitiin alustan yhdistettiin 100 ui mainittua liuosta lisättiin kuhunkin näytteeseen kuoppaan ja levyä ravistellaan 30 minuuttia. Luminesenssi joka johtuu solun hajoamista ja jotka ovat oikeassa suhteessa määrään Adenosiinitrifosfaatti (ATP), mitattiin EnVision Multilabel levylukijaa (Wallac, Suomi). Lisäksi NucView kaspaasi 3/7 määritystä on käytetty, joka havaitsee soluja aktiivisesti käynnissä ohjelmoidun solukuoleman (kuvattu yksityiskohtaisesti [26,27,28].

2D solumigraatioon ja invaasiomääritys

Euroopan invasiivisia tai vaeltavien potentiaalia PCA solujen tutkittiin kanssa ”tyhjästä haava” tai haavan paranemista määrityksessä suoritettiin 96 kuopan ImageLock levyille (Essen Bioscience, USA). sekä VCAP ja LNCaP puuttui invasiivisia tai liikkuvia ominaisuuksia 2D tai 3D-olosuhteissa. Nämä solulinjat eivät osoittaneet haavansulkemiseen ominaisuuksia, eivätkä hyödyllisiä tyhjästä haava määrityksissä. tästä syystä käytimme PC3-solut, jotka myös ilmaisivat seitsemän kahdeksasta kandidaattigeeneihin merkittävillä tasoilla, oli suoraviivainen transfektoimaan by