Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime aikoina olemme osoitti, että onkolyyttisten vacciniaviruksen GLV-1h68 on merkittävä terapeuttinen potentiaali hoidettaessa imusolmukemetastaaseja ihmisen PC-3 eturauhasen karsinooman tuumoriksenograftien. Tässä tutkimuksessa, taustalla olevien mekanismien viruksen välittämän etäpesäkkeitä vähentämiseen analysoitiin. Immunohistokemia osoitti, että virus-hoito johti vähentää rajusti verta ja imusuonten, jotka edustavat olennaista reitit PC-3 solujen vaeltamiseen, sekä kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Siten GLV-1h68 rajusti olennaisia ​​reittejä metastaattisen leviämisen PC-3-solut. Lisäksi analyysi viruksen jakautumisen GLV-1h68-ruiskutetaan kasvain hiirillä plakkikokeet, paljasti huomattavasti korkeampi virustiittereitä etäpesäkkeitä verrattuna kiinteitä kasvaimia. Selvittämiseksi olosuhteet mahdollisesti välittävä ensisijaisen virus- kolonisaation ja hävittämiseksi etäpesäkkeitä, microenvironmental komponentit saastumatonta kasvaimia ja etäpesäkkeitä verrattiin mikroskooppisen tutkimuksissa. Nämä analyysit paljastivat, että PC-3 imusolmukemetastaaseja osoittivat lisääntynyttä verisuonten läpäisevyyttä, korkeampi leviämisen tila tuumorisolujen määritettynä BrdU- ja Ki-67 määrityksissä ja vähemmän nekroosia PC-3-soluja kuin kiinteitä kasvaimia. Lisäksi lisääntynyt määrä immuunisolujen (MHCII

+ /CD68

+ makrofagien MHCII

+ /CD19

+ B-lymfosyyttien) yhdistettynä sääteli ilmentymisen proinflammatoristen sytokiinien havaittiin in etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PC-3 kasvaimia. Ehdotamme, että nämä microenvironmental komponentit välittämän metastaattista tropismi GLV-1h68. Näin ollen, vaccinia-virus-pohjaisia ​​onkolyyttinen virotherapy voi tarjota uuden metastaattisen eturauhassyövän karsinoomien ihmisillä.

Citation: Donat U, Weibel S, Hess M, Stritzker J, Härtl B, Sturm JB, et al. (2012) Etuuskohteluun Colonization etäpesäkkeiden mukaan Onkolyyttiset vacciniaviruskannan GLV-1h68 ihmisen PC-3 Eturauhassyöpä Malli nude-hiirissä. PLoS ONE 7 (9): e45942. doi: 10,1371 /journal.pone.0045942

Toimittaja: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 25 syyskuu 2012

Copyright: © Donat et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: Drs. Jochen Stritzker, Nanhai G. Chen, Ivaylo Gentschev ja Aladar A. Szalay ovat työntekijöitä Genelux Corporationin ja taloudellisia etuja Genelux Corporation. Dr. Barbara Härtl on työntekijä Genelux GmbH. Genelux Corporation toimitti myös Service Grant yliopiston Würzburgin. Dr. Ulrike Donat ja tohtori Stephanie Weibelin vastaanottavat jälkeisten apurahan. Dr. Julia Sturm ja Michael Hess vastaanottavat valmistunut apurahan yliopistosta Würzburgin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysit, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ole olemassa patentteja tai tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

mukaan nykyiset tutkimukset, yli 90 % syöpäpotilaiden kuolee suoria tai epäsuoria vaikutuksia etäpesäkkeitä. Potilaan ennuste on näin ollen välittömästi kytketty metastaattisen vaiheen karsinooman [1]. Etäpesäkekasvainten soluja soluttautua terveiden kudosten ja rajat aluksen pääsyn esteiden imusuonten tai verenkiertoa. Taipumus kasvainsolun tulla imusuonten tai verisuonten riippuu kyvystä noudattaa tiettyjä rakenteita, kuten reticular kuitujen kapselinalaisessa sinus on imusolmukkeiden tai endoteelisolujen että linja verisuonissa [2].

Eturauhassyöpä tiedetään etäpesäkkeitä luut, keuhkot ja imusolmukkeet [3], [4]. Se edustaa toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä. Koska eturauhassyöpä etenee oireettomasti, diagnoosi tehdään usein, kun etäpesäkkeitä on jo muodostunut. Nykyinen hoito strategioita etäpesäkkeiden ovat samanlaisia ​​kuin käytetään ensisijaisesti kasvainten [1]. Edenneen eturauhassyövän suoritetaan tavanomaisilla kemo- ja sädehoidon. Valitettavasti nämä hoidot johtavat usein resistenssin kehittymisen kasvaimia ja etäpesäkkeitä [5], [6]. Lisäksi on osoitettu, että pitää kasvua kiinteän kasvaimen loitolla voi edistää sen sijaan muodostumisen estämiseksi etäpesäkkeiden [7]. Torjuminen sekä muodostumista ja kasvua etäpesäkkeiden on siis avain menestykseen syövän hoidossa.

Näin onkolyyttisten virotherapy on yksi lupaavimmista romaanin strategioita taistelussa molemmat: kiinteitä kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Onkolyyttiset virukset voivat replikoitua selektiivisesti syöpäsoluissa, jolloin tuhoutuminen kasvainkudoksen, mutta jättäen terveiden kudosten vahingoittumattomina [8]. Vuonna 2007, Zhang

et al.

Ensin kuvattu heikennetty rekombinantti-vaccinia-virus GLV-1h68 [9], [10]. Onkolyyttisten vaikutus tämän viruksen on osoitettu rinta-, haima- ja eturauhassyöpä tuumoriksenografteja [10] – [12]. Lisäksi Gentschev

et al.

Osoitti, periaatteessa, suuri terapeuttinen potentiaali GLV-1h68 hoidettaessa imusolmukemetastaaseja peräisin eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja PC-3 [11].

tässä tutkimuksessa olemme tunnettu siitä, taustalla olevien mekanismien virus-välitteinen väheneminen etäpesäkkeitä. Tarkempi analyysi, ensin visualisoitiin metastaattisen leviämisen PC-3-solujen imusuoniston nude-hiirten lisäämällä

mRFP1

-geenin, joka koodaa punainen fluoresoiva proteiini valvonnassa CMV-promoottorin kasvaimeen genomiin . Kun viruksen injektio PC-3-RFP on kasvain, osoitimme, että virus hoito dramaattisesti vähensi verisuonten ja imusuonten, jotka ovat välttämättömiä reittejä metastaattisen leviämisen kasvainsolujen, kasvaimissa sekä etäpesäkkeiden [13] , [14]. Lisäksi havaitsimme huomattavasti korkeampi virustiittereitä PC-3 imusolmukemetastaaseja kuin kiinteitä kasvaimia ja osoitimme, että munuaisten imusolmukemetastaaseja olivat asuttaneet vieläkin suuremmassa määrin kuin lannerangan niistä. Tietääksemme tämä virus tropismi on etäpesäkkeitä on toistaiseksi ei ole kuvattu kirjallisuudessa. Siksi ryhdyimme analysoimaan johtavien mekanismien etuuskohteluun viruksen kolonisaation. Tässä yhteydessä useat microenvironmental näkökohtia, kuten kasvain ja etäpesäkkeitä verisuonistoon ja perfuusio, proliferatiivinen tila ja laajuus PC-3 solujen nekroosi, immuunisolujen taakka sekä sytokiinien ilmentyminen ensisijainen kasvaimia ja imusolmukemetastaaseja analysoitiin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

ihmisen eturauhasen karsinoomasolulinja PC-3 (DSMZ ACC465) viljeltiin RPMI 1640: ssä (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa) ja 1% penisilliini-streptomysiiniliuosta (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa). PC-3-RFP soluja viljeltiin samoissa olosuhteissa, paitsi lisäämällä 10 ug /ml blastisidiinia. Afrikkalainen vihreän apinan munuaisen fibroblastisolulinjaa CV-1, saatu American Type Culture Collection (ATCC CCL-70), viljeltiin DMEM korkea glukoosi (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 1% penisilliini- streptomysiiniä ratkaisu. Ihmisen epiteelisolujen munuaissolut (293FT) ystävällisesti toimittanut P. Hill (University of Nottingham, alun perin saatu Invitrogen) ja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS: ää ja 2 mM L-glutamiinia (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa).

Generation PC-3-RFP Cells

cDNA-sekvenssi punainen fluoresoiva proteiini (

mRFP1

) insertoitiin PC-3-solujen genomiin käyttäen Vira Virta ™ Lentivirusvektorikonstruktit Expression System Kit (Invitrogen GmbH, Saksa) noudattaen valmistajan ohjeita.

mRFP1

koodittavan plasmidin pCR-TK-SEL-MRFP saatiin Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) ja käytettiin tuottamaan

mRFP1-

sisältävät lentivirusvektoreita kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Replikaatiokyvyttömäksi

mRFP1

-koodauksella lentivirukset tuotettiin 293FT soluissa kotransfektoimalla plasmidit pLP1, pLP2, PLP /VSVG, jotka toimittavat lentiviruksen rakenne- ja replikaation proteiinien ja pLENTI6 /V5-DEST-MRFP ilmentymisen plasmidia käyttäen Lipofectamine

TM2000. Transduktion jälkeen PC-3-solujen MRFP-koodaus lentivirukset ja blastisidiinia (10 ug /ml) valinta, yhtä stabiili RFP-ilmentävät PC-3-klooni valittiin ja RFP-ilmentymisen 98% kaikkien solujen varmistettiin virtaussytometrillä .

viruskannan

heikennetty vacciniaviruskanta GLV-1h68 rakennettiin, kuten on kuvattu aiemmin Zhang

et al.

[10]. Kolme ekspressiokasetteja, jotka koodaavat

Renilla

lusiferaasi-GFP-fuusioproteiini, β-galaktosidaasi, tai β-glukuronidaasi rekombinoitiin

F14.5L

,

J2R

ja

A56R

loci, vastaavasti, vanhempien LIVP viruksen genomin. GLV-1h68 kasvatettiin CV-1-soluissa ja puhdistettiin sakkaroosigradientteja.

kasvaimen istutuksen ja Virus Administration

Kasvaimet syntyvät istuttamalla 2 x 10

6 PC-3 tai PC -3-RFP solua 100 ul: ssa PBS: ää ihonalaisesti oikeaan vatsan kylki 6-8 viikkoa vanha nainen kateenkorvattomien nude

Foxn1

nu

hiiriä (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Saksa). Kerta-annos 1 x 10

7 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) GLV-1h68 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin laskimonsisäisesti (i.v.). Tutkimiseen viruksen asuttaminen PC-3-RFP etäpesäkkeitä, GLV-1h68 oli ylläpitäjä vatsan imusolmukemetastaaseja oli käsin kosketeltava; yleensä 45-60 päivää sen jälkeen, kun PC-3-RFP soluistutusryhmä, jäljittelemään pitkälle eturauhasen syöpä. Koska pitkälle edennyt tauti liittyy laihtuminen riippumaton virusinfektio, paino mitattiin kahdesti viikossa ja hiiret tapettiin ennen vakiomääräiset ylitettiin. Analysoidut Hoitojaksot ei ylittänyt 14 päivää. Sen jälkeen virus injektion terveydentilaa hiiret eivät muuttuneet.

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin hallituksen Unterfranken, Saksa (protokolla numero AZ 55.2-2531.01-17 /08) ja /tai Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja Explora Biolabs, joka sijaitsee San Diego Science Center (San Diego, USA) (protokolla numero: EB08-003; EB11-25).

Detection of Human PC-3 solut Lymph solmujen kautta RT-PCR

läsnäolo ihmisen PC-3-solujen laajentuneessa lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen alukkeita ihmisen β-aktiini, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Imusolmuke määriteltiin laajenee, kun maksimaalinen halkaisija ylitti 2 mm.

fluoresenssikuvantamisella Tuumorien ja imusolmukemetastaaseja

Kuvia GLV-1h68 tai PBS-käsitellyt PC-3-RFP kasvain -pitoista hiiret otettiin joko Maestro EX Imaging System (Etu, Hopkinton, MA, USA) kanssa tai MZ16 FA Stereo-fluoresenssi mikroskooppi (Leica, Wetzlar, Saksa). Kuvantaminen hiirien Maestro EX Imaging System, eläimet nukutettiin käyttäen 2-3% isofluraania. Digitaaliset kuvat prosessoitiin Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, USA).

Analyysi virustiittereitä kasvaimissa ja etäpesäkkeitä

määrä viruspartikkelien kasvaimen ja metastaasien lysaatit määritettiin standardi plakkikokeet. Näin ollen PC-3 kasvaimia ja etäpesäkkeitä leikattiin 3, 7 ja 14 päivää sen jälkeen, kun GLV-1h68 injektio, jauhettu ja 2 tilavuudella lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA, pH 7,4), jota oli täydennetty 2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja proteinaasinestäjä cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Saksa) lisättiin. Homogenisoitiin käyttäen Fastprep Shredder (Thermo Scientific, Karslruhe). Kun 3 jäädytys ja sulatus sykliä sonikoimalla sarjalaimennoksia titrattiin konfluentteja CV-1-soluja 24-kuoppalevyillä. Kaikki näytteet mitattiin kahtena kappaleena.

immunohistokemia

histologian, kasvaimet ja etäpesäkkeet irrotettiin ja kiinteät 16 h 4% paraformaldehydi /PBS, pH 7,4. Valmistaminen 100 um: n leikkeitä ja merkintämenettelyjä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16] käyttämällä Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Sveitsi). Sen jälkeen merkintöjä, kudosleikkeet asennettu Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa). Kudosnäytteet leikattiin (10 um paksu), jossa kryostaatista 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Saksa). Sen jälkeen nestehukka 10% ja 30% sakkaroosia (Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) näytteet upotettiin Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Alankomaat). Kryoleikkeet säilytettiin -80 ° C: ssa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 1 tunti. PBS-pesun jälkeen, leikkeet värjättiin 1 tunnin ajan johdetun vasta-aineiden ja lopuksi asennetaan Mowiol 4-88.

Vasta-aineet ja reagenssit

endoteelisolujen verisuonten värjättiin hamsterin monoklonaalista CD31 vasta-aineella (Chemicon International, Temecula, USA; MAB1398Z) ja endoteelin imusuonten kanin polyklonaalisella anti-Lyve-1 vasta-aineella (Abcam, Cambridge, UK; ab14917). Epäspesifinen rotan-IgG (Jackson Immuno-, Pennsylvania, USA; 01200003) käytettiin analysoimaan läpäisevyyttä verisuonten PC-3-RFP kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Sen vuoksi, 10 mg /kg rotta-IgG: tä injektoitiin laskimonsisäisesti (i.v.) osaksi PC-3-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä. Kuusi tuntia injektion hiiret tapettiin ja 100 um: n osat kasvaimia ja etäpesäkkeitä valmistettiin. Merkintöjä antigeeniä esittelevien solujen suoritettiin monoklonaalisella rotan anti-MHC-luokan II (I-A /I-E) vasta-aine (eBioscience, San Diego, USA; 14-5321). B-solut värjättiin rotan monoklonaalinen anti-CD19-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK; ab25232), makrofagien rotan monoklonaalinen anti-CD68-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, Iso-Britannia, ab53444). Leviämisen markkeri Ki-67 leimattiin kanin polyklonaalisella anti-Ki-67-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK; ab15580). Analysoimiseksi BrdU DNA: han PC-3-RFP solujen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, 120 mg /kg BrdU: ta ruiskutettiin intraperitoneaalisesti (i.p.). Kolme tuntia myöhemmin, kasvaimet ja etäpesäkkeet leikattiin irti ja 10 um: n leikkeitä valmistettiin. Leimaus suoritettiin käyttämällä rotan monoklonaalista anti-BrdU-vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK; ab6326) 30 min inkubaation 2 M HCl: lla ja pesu PBS: ssä. Tumat Hoechst 33342-leimattua (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Saksa). DyLight488-, DyLight549- ja DyLight 649-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (aasi) saatiin Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). Kaikki ensimmäisen ja toisen vasta-aineet laimennettiin 1:100 PBS, kun kyseessä on 10 um: n osia tai PBS /0,3% Triton-X-100, kun kyseessä on 100 um: n leikkeitä.

fluoresenssimikroskopiaan

Mikroskooppiset tutkimukset käytettiin vertaamaan kasvaimen verisuoniston, solujen lisääntymistä tila ja im- solupopulaatioiden kasvainten sekä etäpesäkkeitä. Tutkia fluoresenssileimattuja kasvain ja etäpesäke kohdat, seuraavat mikroskoopit käytettiin: Stereo-fluoresenssi mikroskooppi MZ16 FA (Leica) varustettu digitaalisella CCD-kamera ja Leica IM1000 4.0 ohjelmisto (1300 x 1030 pikselin RGB-värikuvia), televisiokamerajärjestelmän SP2 AOBS konfokaali laser mikroskooppi (Leica) varustettu LCS 2,16 ohjelmisto (1024 1024 pikselin RGB-värikuvia) ja Axiovert 200 M (Zeiss) kanssa Axiovision 4.5 ohjelmisto (1388 x 1040 pikselin harmaasävy kuvia). Digitaaliset kuvat prosessoitiin Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) ja yhdistettiin, jolloin saatiin pseudo-värikuvia.

Analyysit Digital fluoresenssikuvia

analyysejä digitaalisia kuvia kasvain, LN ja RN osaan, on tärkeää huomata, että kyseessä on yksi kasvain hiirtä kohti, mutta määrä lannerangan ja munuaisten imusolmukemetastaaseja erosi hiiren hiiri. Useimmissa tapauksissa 2 LNS ja 2 RNS olivat läsnä hiirtä kohti. Per kasvain tai etäpesäkkeitä kuvia 2 osat analysoitiin, jolloin saadut tiedot kaikista lannerangan imusolmukemetastaaseja yhdistettiin LN ja saatuja tietoja kaikista munuaisten imusolmukkeet fuusioitiin RN.

Measurement imusolmukkeiden ja verisuonitiheyttä .

Imuneste ja verisuonten tiheys mitattiin vuonna digitaalisten kuvien (× 80 ja x 100 suurennus) anti-Lyve-1 ja anti-CD31 värjätään 100 um: n leikkeitä. Kahdeksan kuvaa per kasvain, LN ja RN analysoitiin kohti värjäystä. Valotusajan yksittäisten kuvien säädettiin varmistaa näkyvyys kaikkien havaittavissa verisuonten ja imusuonten ja koristeltu 8 tasaisin vaakaviivoja Photoshop 7.0. Kaikki imusolmukkeiden tai verisuonten ylittävät näitä linjoja laskettiin saamiseksi suonitiheys per jakso.

Measurement verisuonten halkaisijat.

Verisuonten läpimitan mittaus suoritettiin käyttäen digitaalisia kuvia (x 100 suurennus) 100 um: n leikkeet värjättiin anti-CD31 käyttäen Leica IM1000 4.0 ohjelmisto. Kuviin kasvaimista ja imusolmukemetastaaseja saatiin yksittäisen vastuun kertaa saada optimaalisen CD31-signaalien ne sisällä signaali riippuva vaihtelevuus suonen halkaisijan. Yksittäiset kuvat peitettiin kolmella tasavälein vaakaviivoja ja halkaisijat kaikkien verisuonten ylittävät näitä rivejä mitattiin. Verisuoni halkaisijat määritettiin 4 kuvaa per kasvain, LN ja RN.

kvantifiointi jakson merkintöjä.

määrällisesti läpäisevyyttä verisuonten, digitaalisten kuvien (x 160 suurennus) 100 um histologia osat kasvaimia ja etäpesäkkeitä analysoitiin. Kokonaispinta-ala positiivinen IgG (leimattu anti-rotta-DyLight488) määritettiin 16 eri alueilla näytettä kohti. Määrä nekroottisen kudoksen PC-3 kasvaimet tai etäpesäkkeiden määritettiin digitaalisia kuvia 100 um: n leikkeitä. Tumat leimattiin Hoechst 33342. jae osa ei värjätty Hoechstin vuoksi ytimiä hajoaminen määriteltiin nekroottisen alue. Tällöin kuvia 2 kokonaisia ​​per näyte analysoitiin. Määrän MHC-II, CD19 ja CD68-positiivisten solujen PC-3 kasvaimia ja etäpesäkkeitä mitattiin digitaalisia kuvia 10 um: n leikkeitä. Kaksi koko jakso kuvaa per näyte analysoitiin. Analyysit määrästä IgG, nekroottisen kudoksen ja MHC-II-, CD19- ja CD68-positiivisten solujen digitaalisia kuvia suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (https://rsbweb.nih.gov/ij) jälkeen RGB-kuvia, 8 bittinen harmaasävy kuvien Photoshop 7.0.

mittaus fluoresenssin voimakkuus.

mittaaminen CD31 ja Ki-67-intensiteetti tehtiin digitaalisia kuvia 100 pm ja 10 um osat PC- 3 kasvaimia ja etäpesäkkeitä. Kutakin värjäystä kohti 8 eri kuvia per näyte hankittiin identtisillä asetuksia. RGB-kuvat muutettiin 8-bittinen harmaasävy intensiteetti alueella 0-255. Fluoresenssin voimakkuus CD31 ja Ki-67 värjäykset edustaa keskimääräinen kirkkaus kaikki värjäystä liittyvien pikseliä ja mitattiin käyttäen ImageJ. Kuvia CD31-värjäys otettiin 100x, kuvia Ki-67 400x suurennuksella.

Protein eristäminen ja karakterisointi

Protein lysaatit PC-3-RFP kasvaimia, lanne ja munuaisten imusolmukemetastaaseja 3 hiirillä 49 päivää kasvainsolujen istutuksen analysoitiin immuuni liittyvä proteiini antigeenin profilointi (RodentMAP® v2.0, Rules Based Medicine, Austin, USA) käyttämällä vasta liitetty helmiä. Lysaatit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Tulokset normalisoitiin perustuen kokonaisproteiinipitoisuus.

Tilastollinen analyysi

kaksitahoiset Opiskelijan

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin.

P

arvot ≤0.05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tähdet osoittavat merkittävää eroa kokeellista ryhmien (* tarkoittaa p≤0.05; ** osoittaa p≤0.01; *** osoittaa p≤0.001).

Tulokset

visualisointi Metastasoitunut leviäminen PC-3-RFP tuumorisoluissa kautta imunestejärjestelmän nude-hiirissä

analysoimiseksi metastaattisen leviämisen PC-3 solujen nude-hiirissä, oli tarpeen vahvistaa primaarikasvainten istuttamalla 2 x 10

6 RFP-ilmentävät PC-3-solujen ihonalaisesti oikeaan kylkeen nude-hiirten. Noin 70 päivää istutuksen jälkeen olemme visualisoitiin etäpesäkkeitä kasvainsolujen lannerangan (LN) ja munuaisten (RN) imusolmukkeet olo PC-3-RFP kasvainta kantavissa hiirissä (kuva 1a). Lisäksi havaitseminen lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet, PC-3-RFP soluja myös visualisoida alukset yhdistävät imusolmuke parit (kuva 1b). Selvittää, ovatko nämä alukset ovat imusuonten tai verisuonten immunohistologisilla värjäykset tehtiin. Merkintöjä Lyve-1 (imusuonten markkeri) ja CD31 (verisuoneen markkeri) kudosleikkeiden selvästi paljasti imusuonten alkuperä näistä kasvainsolun sisältävä alus kaltaisia ​​rakenteita (kuva 1c).

2 x 10

6 PC-3 tai PC-3-RFP soluja istutettiin oikeaan kylkeen nude-hiirten. (A) Reaaliaikainen kuvantaminen elävän nude hiiri, jossa on PC-3-RFP kasvain 70 päivää implantaation selkä ja vatsanpuoleinen näkymä. T, kasvain; LN, ristiselän imusolmukemetastaaseja; RN, munuaisten imusolmukemetastaaseja. (B) ristiselän (LN1, LN2) ja munuaisten (RN1, RN2) imusolmukemetastaaseja vatsan PC-3-RFP kiinteä kasvain hiiri 65 päivää implantaation jälkeen. Oikea kuva: muuttoa PC-3-RFP solujen LN- ja RN. (C) 100 um poikkileikkauksia välisen osan LNS ja RNS värjättiin anti-CD31 ja anti-Lyve-1-vasta-aine, vastaavasti. (D) ihmisen β-aktiini-positiivisia imusolmukkeiden 21, 28, 35 ja 42 päivää implantaation jälkeinen PC-3-solut ja (e) tiheys imusuonten vastaavan ensisijaisen PC-3 kasvaimia. Kasvaimet, lannerangan ja munuaisten imusolmukkeet 4 hiiret analysoitiin aikapistettä kohti. Määrittää lymph aluksen tiheys, 100 um: n osia PC-3-tuumorien valmistettiin ja 2 leikkeet värjättiin anti-Lyve-1-vasta-aine. Neljä kuvaa (x 80 suurennus) kappaleessa analysoitiin kuvatulla tavalla materiaalin ja menetelmät. Scale pylväät edustavat 2 mm (b ja vasen kuva c) ja 200 um (oikealla kuvaa c). Kaikki kuvat ovat edustavia esimerkkejä.

Yhdessä me visualisoida metastaattisen leviämisen PC-3-RFP syöpäsolujen määritetyistä primaarikasvaimen sivusto oikeaan kylkeen alueelliseen lannerangan ja etäinen munuaisten imusolmukkeet nude-hiirissä.

Lisäksi, aikaperusteinen korrelaatio muodostumista imusolmukemetastaaseja ja tiheys imusuonten vastaavan PC-3-kasvainten esitetty. Ajan jatkuva kasvu imusolmukkeiden positiivisia metastasized PC-3-solujen havaittiin (kuvio 1 d). Samanaikaisesti imusolmukkeiden suonitiheys PC-3 kasvaimet kasvoivat (kuva 1e) osoittaa johdonmukaisuus määrän imusuonten kiinteitä kasvaimia ja imusolmukemetastaaseja muodostumista.

GLV-1h68 Hoito dramaattisesti Vähentää Blood and Lymph suonitiheys PC-3-RFP kasvaimet ja etäpesäkkeitä

Viime aikoina on osoitettu, että GLV-1h68 hoito PC-3 on kasvain johtaa huomattavaan vähenemiseen imusolmukemetastaaseja [11]. Lisäksi osoitimme, että GLV-1h68 on myös tehokas aine hoidettaessa PC-3 keuhkometastaaseista, joka pääasiassa syntyivät jonka metastaattinen leviäminen PC-3-solujen kautta hematogenous reittiä (kuva S1). Ymmärtää terapeuttista potentiaalia GLV-1h68, analysoimme vaikutus viruksen hoidon kasvaimeen liittyvien verisuonten ja imusuonten koska nämä ovat keskeisessä asemassa kuin reittejä metastaaseja kaukaisiin elinten ja imusolmukkeiden [13], [14].

CD31-positiivinen veri sekä Lyve-1-positiivisten imusuonten merkittävä väheneminen aluksen tiheys PC-3 kasvaimia, LNS, ja RNS havaittiin johtuu suonensisäisten (iv) injektio GLV -1h68 (kuvio 2). Verisuonten tiheyden mittaukset osoittivat tiheyden alentaminen 46% kasvaimia ja LNS ja 60% RNS vacciniaviruksessa-hiiriin on injektoitu, vastaavasti (kuvio 2a ja b). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin imusolmukkeiden aluksen tiheys (kuvio 2c ja d) osoittaa, että vaikutus GLV-1h68 oli voimakkainta munuaisten imusolmukemetastaaseja.

Analyysi suoritettiin 57 päivää implantaation jälkeen 2 x 10

6 PC-3-solujen ja 7 päivää injektion jälkeen 1 x 10

7 pfu GLV-1h68. Määrittämään veren ja lymph suonitiheys, 100 um: n osat kasvaimia, LNS ja RNS 5 PBS: llä ja 5 GLV-1h68-käsitellyistä hiiristä värjättiin anti-CD31 tai anti-Lyve-1 vasta-aineella. Verisuonten ja imusuonten laskettiin 4 kuvaa (x 100 suurennus) kustakin 2 osaan näytettä kohti. (A) Verisuonten tiheys PC-3 kasvainten /metastaasien ja (b) edustavat kuvat anti-CD31 värjätyt leikkeet. Verisuonet näkyvät harmaasävyinä, jonka GLV-1h68 ilmaistu GFP vihreänä. (C) Lymph aluksen tiheys PC-3 kasvainten /metastaasien ja (d) edustavat kuvat anti-Lyve-1 värjätyt leikkeet. Imusuonten näkyvät harmaasävyinä, jonka GLV-1h68 ilmaistu GFP vihreänä. Mittaviivat edustaa 500 um.

Yhteenvetona tulokset osoittavat selvästi, että onkolyyttisten kasvainkudoksen tuhoa PC-3 kasvaimia ja etäpesäkkeitä on merkittävästi parannettu hävittämiseksi kasvaimen verisuoniston sekä imusuonten.

Etuuskohteluun kolonisaatio imusolmukemetastaaseja verrattuna Primary PC-3 kasvaimet by GLV-1h68

Koska olemme havainneet vahvempi vähentäminen veren ja lymph aluksen tiheydet munuaisten imusolmukemetastaaseja verrattuna primaarikasvaimia ryhdyimme tutkimaan viruksen kolonisaation kuviot primaarikasvainten, LNS ja RNS. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, PC-3-RFP kasvain hiiriin ruiskutettiin i.v. 1 x 10

7 plakkia muodostavaa yksikköä (pfu) GLV-1h68. Matkia tilanne myöhäisvaiheen syöpäpotilaiden ja läsnäolon varmistamiseksi etäpesäkkeitä imusolmukkeissa me ruiskutetaan vacciniaviruksen loppuvaiheessa taudin 55 päivää kasvaimen solujen implantaation. Multispektrikuvaussensoreita kasvaimia ja etäpesäkkeitä paljasti selkeitä GFP signaaleja kasvaimissa, LNS ja RNS jo kolme päivää lähettää viruksen injektio (dpi). Yllättäen GFP-intensiteetti oli korkein RNS, minkä jälkeen LNS ja kiinteitä kasvaimia (kuvio 3a). Näiden tulosten perusteella oletamme tehokkaampi kolonisaatiota imusolmukemetastaaseja by GLV-1h68 verrattuna ensisijainen PC-3 kasvaimia.

1 x 10

7 pfu GLV-1h68 oli i.v. ruiskutetaan PC-3-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä. (A) PC-3-RFP kasvain hiiri 3 päivän kuluttua injektion GLV-1h68. (B) Virustiitterit PC-3-RFP kasvaimia, LNS ja RNS 3, 7 ja 14 päivää injektion jälkeen GLV-1h68. Virus injektio suoritettiin 55 päivää post kasvainsolun istutuksen. Kasvaimia ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa 6 hiiren analysoitiin per ryhmä (n = 6). (C) 100 um: n osat PC-3-RFP kasvain ja munuaisten imusolmuke etäpesäke 77 päivää postitse istutuksen ja 7 päivän kuluttua virus injektion. PC-3-RFP solut näkyvät punaisina, jonka GLV-1h68 ilmaistu GFP vihreänä. Kaikki kuvat ovat edustavia esimerkkejä. Mittaviivat edustavat 1 mm (b) ja 2 mm (c).

Lisäanalyysiä, virus- kolonisaatio kaavoja kasvaimia, LNS ja RNS tutkittiin ajan kurssin päivänä 3, 7 ja 14 kun virus injektion plakkikokeet. Itse asiassa on osoitettu, että siellä oli merkittävästi korkeammat viruksen tiitterit imusolmukemetastaaseja verrattuna ensisijaisen PC-3-RFP kasvaimia kaikki kolmena ajankohtana (kuvio 3b). Mielenkiintoista, 3 ja 7 dpi RNS oli asuttaneet vuonna korkeampi kuin LNS. Päivänä 7 post virus injektion 1,4 × 10

9 pfu GLV-1h68 grammassa kudosta määritettiin RNS. Sitä vastoin vain 28% RN viruksen pitoisuuden havaittiin LNS ja niin vähän kuin 2% ensisijaisesti kasvaimia. Kahden viikon kuluttua alkuperäisestä erot virusten tiitterit välillä LNS ja RNS ei enää ollut havaittavissa.

Lisäksi, mikroskooppinen analyysi PC-3-RFP kasvain ja etäpesäkkeitä ilmeni, kuten odotettavissa suurempi virustiittereitä, myös korkeampi GFP signaaleja etäpesäkkeitä verrattuna kiinteitä kasvaimia 7 päivää post GLV-1h68 injektio (kuvio 3c). Lisäksi osoitimme, että edulliset kolonisaatiota etäpesäkkeitä verrattuna kiinteiden kasvainten GLV-1h68 ei rajoitu lannerangan ja munuaisten imusolmukemetastaaseja. Korkeampi GFP signaaleja ja virustiittereitä havaittiin myös imusolmukkeet (IN) ja iskias (SN) imusolmukemetastaaseja (kuva S2). Lisäksi tutkimus eri reittiä viruksen injektio osoittivat samanlaisia ​​GLV-1h68 kolonisaation kuviot 7 päivää sisäisen kasvaimen (se) injektiona (kuva S3).

Yhdessä nämä tulokset osoittivat hyvin valikoiva kolonisaatio etäpesäkkeet by GLV-1h68 verrattuna ensisijainen kasvaimia.

Analyysi Microenvironmental tekijät ensisijainen kasvaimet ja etäpesäkkeitä Tarpeen Enhanced Viral pitoisuudet imusolmukemetastaaseja

löytää syitä parannetun viruksen asuttamisen imusolmukemetastaaseja, olemme analysoineet tilan PC-3 kasvaimia ja etäpesäkkeitä ennen kuin vacciniavirus injektio on tapahtunut. Eri erot microenvironment kasvaimia ja etäpesäkkeitä, jotka saattavat olla ratkaisevia virus asuttaa etäpesäkkeitä korkeampi kuin kasvaimia oli pidetty. Näin ollen, verisuoniston, proliferatiivinen tila PC-3-solut, laajuus kuolion, immuunisolujen ja sytokiinien ilmentyminen kasvaimissa, LNS ja RNS analysoitiin terveillä PC-3-RFP tuumoreita kantavaa hiirtä. Matkia tilanne myöhäisvaiheen syöpäpotilailla, kun syövän diagnoosi tapahtuu yleensä, olemme analysoineet microenvironmental parametrit loppuvaiheessa taudin välillä 45-60 päivää kasvaimen soluistutusryhmä.

Verisuonten läpäisevyyden lisääntyminen imusolmuke etäpesäkkeitä.

Ensinnäkin, analysoimme myös eroja esiintyy verisuonistossa tiheyden suhteen ja läpäisevyys alusten välillä kasvaimia ja etäpesäkkeitä, mikä johtaa suuremman alkuperäisen määrän viruspartikkelien sisällä eri tuumorikudoksissa. Histologia PC-3-RFP kasvaimia, LNS ja RNS suoritettiin ja verisuonet leimattiin CD31. Vaikka ei ole eroja verisuonten tiheyden välillä kasvaimia ja etäpesäkkeitä havaittiin 57 päivää post kasvainsolun istutuksen (kuvio 2a PBS-ryhmään), fluoresenssin intensiteetti CD31 värjäytyminen oli huomattavasti korkeampi LNS ja RNS verrattuna kiinteitä kasvaimia (kuvio 4a) . Yleisesti, verisuonten markkeri CD31 on erittäin säädelty endoteelisoluissa tulehtuneissa kudoksissa tai kohtiin käynnissä leukosyyttien transmigraatiota ja liittyy korkeampi verisuonten läpäisevyyttä [17]. Siksi yksityiskohtainen mikroskooppinen tutkimus verisuonten koskevat suonen halkaisijan ja verisuonten läpäisevyyttä tuumoreissa verrattuna vuonna etäpesäkkeiden suoritettiin. Merkittävää on, LNS ja RNS paljasti korkeampi verisuonen halkaisijan (keskimääräinen halkaisija 15 nm) kuin kiinteä PC-3-RFP kasvaimet (keskimääräinen halkaisija 10 nm) (kuvio 4b). Selvittää nämä laajentuneet verisuonet todellakin osaltaan kasvattaa verisuonten läpäisevyyttä imusolmukemetastaaseja, ekstravasaatio kuviot ruiskutettiin laskimoon rotan-IgG: t analysoitiin histologisesti. Mielenkiintoista, merkittäviä suurempia määriä extravasated IgG havaittiin etäpesäkkeitä (keskimääräinen IgG-positiivinen alue noin 60%) verrattuna kasvaimiin (keskimääräinen IgG-positiivinen alue 25%).