Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lähtökohdat

Uusia lähestymistapoja määritellä taustalla olevat tekijät immunopatogeneesi keuhkosairauksien kuten sarkoidoosi ja tuberkuloosi kehittämiseksi tarvitaan uusia hoitoja ja biomarkkereita. Vertaamalla veri transkription vastaus tuberkuloosin muihin vastaaviin keuhkosairaudet etenee tietoa sairauden reittejä ja auttaa erottamaan sairauksia samanlaisia ​​kliinisiä esityksiä.

Tavoitteet

Voit selvittää taustalla olevia tekijöitä immunopatogeneesi on granulomatoottinen sairaudet, sarkoidoosi ja tuberkuloosi, vertaamalla veren transkription vastauksia näihin ja muihin keuhkosairauksien.

Methods

Vertasimme kokoveren genominlaajuisten transkription profiileja keuhkojen sarkoidoosi, keuhkotuberkuloosi, paikkakunnan hankittu keuhkokuume ja ensisijainen keuhkosyöpää ja terveiden verrokkien, ennen ja jälkeen hoidon ja puhdistettu leukosyyttien populaatioissa.

Mittaukset ja tärkeimmät tulokset

interferoni-indusoituva neutrofiilien perustuva veri transkription allekirjoitus oli läsnä sekä sarkoidoosi ja tuberkuloosi, jolla on korkeampi runsautta ja ilmaisun tuberkuloosi. Heterogeenisyyttä sarkoidoosi allekirjoituksen korreloi merkitsevästi sairauden aktiivisuuden. Transkription profiilit keuhkokuume ja keuhkosyövän paljasti yli-runsaasti tulehduksellisten selostukset. Onnistuneen hoidon jälkeen transkriptionaalisen aktiivisuuden tuberkuloosin ja keuhkokuumeen potilaita väheni merkittävästi. Kuitenkin glukokortikoidien reagoiva tilaiden osoitti merkittävää kasvua transkriptionaalista aktiivisuutta. 144-veri transkriptien pystyivät erottamaan tuberkuloosin muista keuhkosairauksia ja valvontaa.

Johtopäätökset

tuberkuloosin ja sarkoidoosi osoittivat samanlaisia ​​veren transkription profiileja, hallitsevat interferonilla indusoitavissa selostukset, vaikka keuhkokuume ja keuhkosyöpää osoittivat selvästi allekirjoitukset, hallitsee tulehduksellinen geenejä. Siellä oli myös huomattavia eroja tuberkuloosi ja sarkoidoosi suuntaa niiden transkriptionaalisen aktiivisuuden, heterogeenisyys niiden profiilit ja niiden transkription hoitovasteen.

Citation: Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Rozakeas F, Redford PS, Wang Y, et ai. (2013) Transkription Veri allekirjoituksista Erota keuhkotuberkuloosi, keuhkosarkoidoosin, keuhkokuumeet ja keuhkosyövässä. PLoS ONE 8 (8): e70630. doi: 10,1371 /journal.pone.0070630

Editor: Jyothi Rengarajan, Emory University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 05 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Bloom et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AOG, CMG, PSR, Medical Research Council (U117565642), FR Tarvikkeiden, Institute Merieux, SILA, CIB tukemana Medical Research Council Clinical tutkimusapurahahakemuksensa; RJW KAW, MRC U1175.02.002.00014.01, Wellcome Trust 084323 ja 088316, EDCTP (IP.07.32080.0002), ja Euroopan unionin (FP7 IRSES295214). Rekrytointi potilaista: Pariisi (DV, GG, MM ja DB) tuella AP-HP avustus (PHRC AOR-09-085); Lyon Lyon Network (toimet Incitatives Hospices Civils de Lyon). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Robert Wilkinson on PLoS One toimitusneuvosto jäsen mutta tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Muuten kaikki muut kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin yhdeksän miljoonaa uutta tapausta aktiivista tuberkuloosia (TB), ja 1,4 miljoonaa kuolemantapausta tuberkuloosista arvioidaan esiintyvän maailmanlaajuisesti kukin vuosi [1]. Prompt diagnoosi on tärkeää välttää hoidon viivästymisen, joten mahdollisuutta erottamaan TB muista keuhkosairauksia, jotka voivat aiheuttaa samalla tavalla TB, kuten sarkoidoosi, tai on akuutti (hankittu keuhkokuume) tai krooninen (ensisijainen keuhkosyöpä) esitys on tärkeää.

TB ja sarkoidoosi ovat laajalti multisystem sairauksia, jotka ensisijaisesti liittyy keuhkojen ja usein läsnä samanlainen kliininen, radiologisia ja histologiset tavalla. Erottaminen näistä sairauksista siten voi vaatia invasiivisen koepala. Granulooman muodostuminen on olennaista sekä olosuhteet ja vaikka taudinaiheuttaja

Mycobacterium tuberculosis

on tunnustettu etiologinen syy TB, mikä taustalla sarkoidoosi on tuntematon [2]. Polut mukana granulomatoottinen tulehdus ovat myös huonosti ja on vähän ymmärrystä tautikohtaisia ​​eroja. TB ja sarkoidoosi voi myös näyttää samanlainen esitys akuutti keuhkojen tarttuvien tautien, kuten hankittu keuhkokuume ja kroonisten keuhkosairautta kuten ensisijainen keuhkosyöpään.

monimutkaisuuden vuoksi näiden sairauksien järjestelmien biologia lähestymistapa voi auttaa purkamaan pääasiallinen isäntä immuunivasteita. Perifeerisen veren on kyky heijastaa patologisia ja immunologisia muutoksia muualla kehossa, ja tunnistaminen liittyvän sairauden muutokset voidaan määrittää veren transkription allekirjoitus [3]. Tämän tueksi konseptilla viime aikoina osoittaneet interferoni (IFN) indusoitavissa veri allekirjoitus potilaiden keuhkojen TB Lontoosta ja Etelä-Afrikka [4], joka on nyt validoitu kolmessa riippumattomissa tutkimuksissa Afrikassa [5], [6] ja Indonesiassa [7]. Veri geeniekspressioprofilointi on myös sovellettu onnistuneesti muita tarttuvia ja tulehdussairauksiin kuten systeeminen lupus erythematosus (SLE), auttaa ymmärtämään sairauden mekanismeja sekä parantaa diagnosointia ja hoitoa [3]. Kaksi viimeaikaista tutkimuksissa on käytetty veren transkription profilointiin vertailua keuhkojen TB ja sarkoidoosi; Molemmissa tutkimuksissa havaittu sairauksien oli samankaltaiset transkription vasteita, jotka osallistuvat yliekspressio IFN-indusoituvia geenejä [8], [9]. Kuitenkin näissä tutkimuksissa ei tarkastella muita vastaavia keuhkosairaudet herättää kysymyksen, onko näitä transkription allekirjoitukset heijastuu myös muita keuhkosairaudet.

päätavoitteena Tutkimuksemme oli parantaa ymmärrystä immunopatogeneesi taustalla sarkoidoosi ja tuberkuloosi vertaamalla veri transkription vasteita keuhkojen TB potilailla todettua keuhkojen sarkoidoosi, keuhkokuume ja keuhkosyöpäpotilaita. Vertasimme myös veren transkription vasteet ennen ja jälkeen hoidon jokaisen sairaus, ja tutki transkription vasteita nähty eri leukosyyttien populaatiot granulomatoottinen sairauksia. Lisäksi olemme tutkineet yhdistyksen sarkoidoosi välillä kliinisen aktiivisuuden ja havaitun veren transkription epäyhtenäisyys.

Methods

Tutkimus väestö- ja Sisällyttämiskriteerit

Suurin osa TB potilasta rekrytoitiin Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, Lontoo. Tilaiden rekrytoitiin Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, St Maryn sairaalassa Imperial College NHS Trust, Barnet ja Chase Farm NHS Trust Lontoossa, Oxford Sarkoidoosi Clinic, Churchill Hospital Oxford, ja AVICENNE sairaalassa Pariisissa. Keuhkokuumeen potilasta rekrytoitiin Royal Free Hospital, Lontoo. Keuhkojen syöpäpotilailla ja 5 TB potilaiden Testi rekrytoitiin mukaan Lyon Collaborative Network, Ranska. Kaikki potilaat rekrytoitiin peräkkäin ajan kuluessa niin, että harjoitussetti rekrytoitiin ensin seurasi Testi, validointi Set ja lopuksi potilaiden näytteistä, joita käytettiin solussa puhdistukseen. Muita veren geenien ilmentyminen tiedot saatiin keuhko- ja piilevä TB potilasta rekrytoitiin ja analysoitu aiemmassa tutkimuksessa, jotka sitten analysoitiin uudelleen tässä tutkimuksessa verrattaessa vastauksia ennen ja jälkeen tuberkuloosin hoitoon [10].

kriteereillä olivat spesifisiä kullekin tautia. Keuhkojen TB potilaat: kulttuuri vahvistettu

Mycobacterium tuberculosis

joko ysköksen tai bronkoalveolaarinen huuhtelu; keuhkosarkoidoosi: diagnoosin tehnyt sarkoidoosi asiantuntijan, granulooma n on koepala, yhteensopiva kliiniset ja radiologiset löydökset (6 kuukauden kuluessa rekrytointi) mukaan WASOG suuntaviivat [11]; hankittu keuhkokuume potilaat: täyttänyt British Thoracic Societyn suuntaviivat diagnoosia [12]; keuhkosyöpäpotilaita: diagnoosi jonka keuhkosyöpä asiantuntija, histologisia ja radiologisia ominaisuuksia sopusoinnussa ensisijainen keuhkosyöpä; terveillä verrokeilla: sukupuolen, etnisen taustan ja ikä olivat samanlaisia ​​kuin potilailla, negatiivinen QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT) (Cellestis) testi. Poissulkukriteerit kaikille potilaille ja terveillä verrokeilla mukana muita huomattavia sairaushistoria (mukaan lukien immunosuppressio kuten HIV-infektio), alle 18-vuotiaille eikä raskaana oleville. Potilaat rekrytoitiin syyskuun 2009 maaliskuussa 2012. Potilaat rekrytoitiin ennen hoidon aloittamista, ellei toisin mainita.

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi Keski-Lontoon 3 Research eettisen komitean (09 /H0716 /41) ja CPP Sud-Est IV, Ranska, CCPPRB, Pitié-Salpêtrière, Pariisi. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

IFNy Release Assay Testing

QFT Assay (Cellestis) suoritettiin valmistajan ohjeiden.

geeniekspressioprofilointi

3 ml kokoverta kerättiin Tempus putkiin (Applied Biosystems /Ambion) tavanomaisilla flebotomiasta, sekoitetaan voimakkaasti heti keräämisen jälkeen, ja varastoidaan -20 ja -80 ° C: ssa ennen RNA. RNA eristettiin käyttäen 1,5 ml kokoverta ja MagMAX-96 Veri RNA: n eristäminen Kit (Applied Biosystems /Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 250 ug eristetty kokonais-RNA globiini vähentää käyttämällä GLOBINclear 96-kuoppaformaatissa Kit (Applied Biosystems /Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteensä ja globiini-vähennetty RNA eheyttä arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA tuotto arvioitiin käyttämällä NanoDrop8000 spektrofotometriä (NanoDrop Products, Thermo Fisher Scientific). Biotinyloitu, monistettu antisense komplementaarisen RNA: n (cRNA) tavoitteet valmistettiin sitten 200-250ng globiinin vähennetty RNA: sta käyttäen Illumina CustomPrep RNA-monistus Kit (Applied Biosystems /Ambion). 750 ng leimatun cRNA hybridisoitiin yön yli Illumina ihmisen HT-12 V4 BeadChip paneelit (Illumina), joka sisälsi yli 47000 antureista. Taulukot pestiin, tukossa, värjätään ja skannattu koskevasta Illumina Iscan, kuten valmistajan ohjeiden. GenomeStudio (Illumina) lisättiin sitten käyttää suorittamaan laadun valvontaa ja tuottaa signaalin voimakkuuden arvoja.

Cell puhdistus ja RNA Käsittely Microarray

Kokoveri kerättiin natriumhepariinia. Perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) erotettiin granulosyyttien /punasolujen käyttäen Lymphoprep-™ (Axis-Shield) tiheysgradientilla. Monosyyttien (CD14 +), CD4 + T-solujen (CD4 +) ja CD8 + T-solujen (CD8 +) eristettiin sekventiaalisesti PBMC: istä käyttäen magneettisia vasta-aine on kytketty (MACS) kokoveren helmiä (Miltenyi Biotec, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neutrofiilit eristettiin granulosyytti /erytrosyyttien kerros punasolujen hajoamista seurasi CD15 + MACS-helmiä (Miltenyi Biotec, Saksa). RNA uutettiin kokoverestä (5 ’Prime PerfectPure Kit) tai erottaa solupopulaatioiden (Qiagen RNeasy Mini Kit). Kokonais-RNA eheys ja saanto määritettiin kuten edellä on kuvattu. Biotinyloitu, monistettu antisense komplementaarisen RNA: n (cRNA) tavoitteet valmistettiin sitten 50 ng kokonais-RNA: sta käyttäen NuGEN WT-Ovation ™ RNA Monistaminen ja Encore BiotinIL Module (NuGEN Technologies, Inc). Monistettiin RNA puhdistettiin käyttämällä Qiagen MinElute PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, Saksa). cRNA käsitellään sitten edellä kuvatulla tavalla.

Raw Data Processing

Mittaustulosten käsiteltiin käyttäen GeneSpring GX versio 11.5 (Agilent Technologies) ja seuraava sovellettiin kaikkiin analyyseihin. Sen jälkeen kun tausta vähennyslasku kukin koetin johtui lippua ilmaisemaan sen signaalin intensiteettiä tunnistus

p

-arvo. Liput käytettiin suodattaa koetinsarjojen joka ei johda ”läsnä” soittamaan ainakin 10% näytteistä, jossa ”esillä” alempi katkaista = 0,99. Signaalin arvot sitten asetettu kynnysarvon 10, log2 muuttaneet, ja per-chip normalisoidaan käyttäen 75

persentiilin shift algoritmia. Seuraava per-geenin normalisoinnin levitettiin jakamalla jokainen lähetti-RNA-transkriptin, että mediaani-intensiteetin kaikkien näytteiden. Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin tämän vaiheen jälkeen. Raaka microarray data on talletettu GEO (Liittymisnumero GSE42834). Kaikki tiedot kerätään ja analysoidaan kokeissa kiinni Minimal tietoa Microarray Experiment (MIAME) ohjeita.

Data Analysis

GeneSpring 11,5 käytettiin valita selostukset joka näkyy ilmaisun vaihtelevuus mediaani kaikkien selostukset (ilman valvontaa analyysi). Suodatin asetettiin sisältämään vain selostukset joka oli ainakin kaksinkertainen muuttuu mediaani ja läsnä ≥10% näytteistä. Valvomatta analyysiä johtamiseen käytetty 3422-transkriptien. Soveltamalla parametriton tilastollinen suodatin (Kruskal Wallis testi FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01), kun ilman valvontaa analyysin tuotti 1446-otteen ja 1396-transkripti allekirjoituksia. Kaksi allekirjoitukset erosivat vain mitkä ryhmät tilastollinen suodatin soveltaa kaikkialla; 1446, viiteen ryhmään (TB, sarkoidoosi, keuhkokuume, keuhkosyöpä ja valvonta) ja 1396, kuusi ryhmää (TB, aktiivinen sarkoidoosi, ei-aktiivinen sarkoidoosi, keuhkokuume, keuhkosyöpä ja valvonta).

Differentially ilmaisi geenien kukin sairaus saatiin vertaamalla kunkin sairauden joukko valvonnan sovitettuina etnisyyden ja sukupuolen sisällä 10%: n ero. GeneSpring 11.5 käytettiin valita selostukset, jotka olivat ≥1.5 kertaiseksi erilainen ilmentyminen keskiarvosta valvonnan ja tilastollisesti merkitsevä (Mann Whitney pariton FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01). Vertailu kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) (kekseliäisyyttä Systems, Inc., Redwood, CA) käytettiin määrittämään merkittävin kanoninen reitit liittyvät differentiaalisesti ilmentyvien geenien kunkin taudin suhteen muita sairauksia (Fisherin tarkka FDR (Benjamini Hochberg) = 0,05). Pohja x-akseli ja baareissa kunkin vertailun IPA kuvaaja osoitti log (p-arvo) ja top x-akselin ja merkkiviivaa prosenttiosuus geenien läsnä reitin.

Molecular etäisyys terveydelle (MDTH ) määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13], ja sitten soveltaa eri transkription allekirjoituksia. Transkription modulaarinen analyysi on sovellettu, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Raaka ekspressiotasoja kaikista transkriptien merkitsevästi havaita taustan hybridisaatio verrattiin kunkin näytteen ja kaikki tarkastukset läsnä että aineisto. Prosenttiosuus merkittävästi ilmaistuna geenejä kussakin moduulissa edustivat värikylläisyyttä (Studentin t-testi,

p

0,05), punainen osoittaa yli-ilmentyminen ja sininen ilmaisee ali. Keskimääräinen prosenttiosuus merkittäviä geenien ja keskimääräiset kertainen muutos näiden geenien verrattuna kontrollia tässä moduulit myös esitetty graafisessa muodossa. MDTH ja modulaarinen analyysi laskettiin Microsoft Excel 2010 GraphPad Prism versio 5 Windows käytettiin tuottamaan kuvaajia.

Differentially ilmaisi geenien välillä harjoitussetti tuberkuloosipotilaille ja aktiivinen tilaiden johdettiin käyttämällä merkitys Analyysi mikrosirujen (SAM) (

q

0,05) ja ≥1.5 taita ilme muutos [15]. SAM käytettiin johtuu lisääntyneestä herkkyydestä tämän epäparametrinen testi verrattuna Mann-Whitney jotta useammat ilmentyvät eri selostukset voidaan tunnistaa välillä TB ja aktiivinen sarkoidoosi. Luokan ennustus harjoitettiin GeneSpring 11.5 käyttää konetta oppinut algoritmi tukivektorikoneet (SVM). Malli on rakennettu käyttäen näytettä luokittelijoiden ”TB” tai ”ei TB. SVM malli on rakennettava yhdessä tutkimuksessa kohortti ja ajaa riippumattomalla kohortin estämiseksi yli istuva ennakoivan allekirjoitus. Tämä oli mahdollista, kaikki ikäluokat meidän tutkimuksessa. Jos tutkimuksen kohorteissa käyttänyt erilaista mikrosirun alusta SVM mallia jouduttiin uudelleen rakennettu kyseisessä kohortissa. Vaikutusten vähentämiseksi yli istuva samalla SVM parametrejä käytettiin aina. Ytimen tyyppi käytettiin lineaarista, maksimi toistojen 100000, maksaa 100, suhde 1 ja validointi tyyppi N-kertainen missä N = 3 10 toistoa. Vastaanotin toiminta käyrä (ROC) ja käyrän alapuolinen alue (AUC) laskettiin käyttäen Microsoft Excel 2010

yhden ja usean regressioanalyysillä laskettiin STATA 9 (StataCorp 2005. Stata Statistical Software: Vapauta 9. College Station, TX, StataCorp LP). Monimuuttujakalibrointiin regressioanalyysillä, jossa oli puuttuva datapisteitä (seerumin ACE ja HRCT sairauden aktiivisuuden) estämiseksi list-viisasta poisto tekomuuttujana säätö käytettiin.

Tehonlaskennassa suoritettiin käyttäen Power Analysis ja Sample Size Software (PASS) 2008

tulokset

Veren Transkription Profiilit ovat samanlaisia ​​Hengitysliitto granulomatoottinen sairaudet, tuberkuloosi ja sarkoidoosi mutta kuitenkin erillinen keuhkokuume ja keuhkosyövän

kohortit TB ja sarkoidoosi , hankittu keuhkokuume ja keuhkosyöpäpotilaita, ja terveillä verrokeilla on esitetty taulukossa 1 ja kuvioissa S1-S3, ja tarkoituksenmukaisesti sovitettu demografisesti ja kliinisesti (taulukot S1-2). Tutkimus teho laskettiin koulutus- setti (keskihajonta = 0,4, 3000 koettimet todella ilmentyvät eri, taita muutos ≥1.5, kaksi otoksen t-testi FDR 0,05). Kahdeksan 40 potilasta per ryhmä antaa tehoa yli 0,85 kunkin koetin (lasketaan PASS 2008) minimaalisella hyöty kasvaa otoskokoa.

Puolueettomat analyysi osoitti, että TB ja sarkoidoosi veren transkription profiilit ryhmittyivät yhteen, mutta selvästi keuhkokuumeeseen ja syöpä, joka itse ryhmitelty yhteen (Training Set, 3422 selostukset, kuva S4A). Tilastollinen suodatus tuotettu 1446 ilmentyvät eri selostukset (Training Set, kuva S4b). Tämä ryhmittely malli tarkistettiin riippumattomalla kohortin (Testi, kuva 1), ja se ei vaikuttanut etnisen alkuperän tai sukupuolen (tuloksia ei esitetty). Pathway analyysi (IPA) paljasti, että TB ja sarkoidoosi näytteet liittyy yli-runsaasti interferoni (IFN) signalointia ja immuunivasteen reittiä (kuvio 2). Keuhkokuume ja keuhkosyövän näytteet liittyvät yli-runsaasti polkuja liittyy tulehdus. Kaikki sairaudet osoitti alle runsaasti T- ja B-solujen polkuja.

1446-transkriptit differentiaalisesti ilmaistut koko veressä harjoitussetti terveillä verrokeilla, keuhkojen TB potilaat, keuhkosarkoidoosipotilaista, keuhkokuume potilaat ja keuhkosyöpää potilailla. Klusterointi on 1446-transkriptien testattiin itsenäinen kohortin, josta ne ole peräisin, Test Set. Heatmap näyttää selostukset ja Testi potilaiden profiilit järjestämä puolueeton algoritmin valvomattoman hierarkkinen klusterointi. Pisteviiva lisätään heatmap auttaa visualisointi pääryhmään syntyy klusterointialgoritmi. Transcript intensiteetti arvot normalisoidaan mediaani kaikkien selostukset. Red selostukset ovat suhteellisen erittäin runsaan ja sininen selostukset alle runsas. Värillinen alareunassa on heatmap osoittaa, mihin ryhmään profiilin kuuluu.

Kukin kolmesta hallitseva klustereita selostukset liittyy eri tutkimus ryhmien Training Set. Top transkripti klusteri on erittäin runsaan että keuhkokuume ja syöpäpotilaiden ja merkittävästi liittyvät IPA polkuja liittyvien tulehdus (Fisherin tarkka kanssa Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Keskimmäinen transkripti klusteri on liian runsaasti TB ja tilaiden ja merkittävästi liittyvät IFN signalointi ja muut immuunivastetta IPA väyliä (Fisherin tarkka kanssa Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Pohja transkripti klusteri on alle runsaasti kaikki potilaat ja merkittävästi liittyvät T- ja B-solujen IPA väyliä (Fisherin tarkka Benjamini Hochberg FDR = 0,05).

heterogeenisyys Transkription Profiilit tilaiden korreloi kliininen fenotyyppi

Transcriptional profiilit tilaiden ryhmittyneet joko TB potilailla tai terveillä verrokeilla (1446 selostukset, kuva 1). Potilaat arvioidun sairauden aktiivisuuden (merkitty joko aktiivisia tai ei-aktiivisia) by ennalta määritellyn päätös puun komposiitti kliinisten parametrien heijastaa tilannekuvan profiilia taudin aktiivisuuden tuolloin pisteen (kuva S5; taulukko S3). 1396-transkriptit havaittiin ilmentyvät differentiaalisesti käyttämällä tätä sarkoidoosi luokittelua. Jälleen aktiiviset tilaiden ryhmittyneet kanssa tuberkuloosipotilaille, kun taas ei-aktiiviset tilaiden ryhmittyneet hallintalaitteisiin (1396 selostukset, kuvio 3A). Tämä validoitiin itsenäisessä kohortit Test ja Validation setit (kuva S6A B, taulukko S4A, S4b).

1396-transkriptien ilmentyvät eri koko veressä harjoitussetti levityksen jälkeen analyysin kuudella ryhmät kuuluvat kaksi fenotyypit tilaiden. (EN) 1396 selostukset ja harjoitussetti potilaiden profiilit järjestetään ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi. Pisteviiva lisätään heatmap selventää pääryhmään syntyy klusterointialgoritmi. Transcript intensiteetti arvot normalisoidaan mediaani kaikkien selostukset. (B) Molecular etäisyys terveydelle 1396 transkriptien Training ja Test sarjaa osoittaa määrällinen transkription muutos suhteessa kontrolleihin. Keskiarvo, SEM ja

p

arvot näytetään (ANOVA kanssa Tukeyn moninkertainen vertailutesti).

soveltaminen Molecular etäisyyden terveydelle (MDTH) algoritmi [13] kaikille taudin ryhmät osoittivat, että ei-aktiivinen sarkoidoosi MDTH pisteet ollut määrällisesti poikkeaa merkittävästi valvontaa, kun taas aktiivinen sarkoidoosi MDTH tilanne oli (kuvio 3B). TB tulokset olivat huomattavasti korkeampia kuin aktiivisen sarkoidoosi tulokset, ja keuhkokuume tulokset olivat huomattavasti korkeampia kuin keuhkosyöpä tulokset, keuhkokuumeen ja TB jolla on suurin MDTH tulokset. Yhdessä tämä viittaa määrällinen sekä laadullinen ero veren transkription allekirjoituksia.

kolme Data Mining Strategies Näytä, että TB ja Active Sarkoidoosi hallitsevat IFN-indusoituva Genes, katsoo keuhkokuume ja keuhkosyövän hallitsevat Inflammatorinen Genes

Tutkimme lisäksi biologisen reitit liittyvät kunkin tautiryhmän käyttäen modulaarista analyysi, [14], IPA, ja merkinnästä alkuun differentiaalisesti ilmentyvien geenien kullekin tautiryhmän. Modulaarinen, jossa otetaan huomioon kaikki geenit ilmentyvät differentiaalisesti vastaan ​​tarkastuksia, tarkistaa, että TB ja aktiivinen sarkoidoosi oli merkittävä yli-ilmentyminen IFN moduulien verrattuna muihin keuhkosairaus ryhmiä (kuvio 4A, harjoitussetti Kuvio S7, Testi), kun taas keuhkokuume ja syöpäpotilaiden oli merkittävä yliekspressio tulehduksen moduulit (kuvio 2). TB potilailla osoittivat merkittävää määrällinen lisääntyminen IFN-indusoituvia geenejä ja niiden verran ilmentymisen, verrattuna aktiiviseen tilaiden (kuviot 4B, 4C). Keuhkokuume ja keuhkosyövän kasvoi merkittävästi määrä geenejä läsnä tulehdus moduulien ja niiden aste ilmaisun, verrattuna TB ja aktiivinen sarkoidoosi (kuviot 4D, 4E). Keuhkokuume potilailla havaittiin suurentunut määrä geenejä läsnä neutrofiilien moduulin (Kuva S8), joka korreloi veren neutrofiilimäärä (Spearmanin korrelaatio, r = 0,42,

p

0,0001).

( A) geeniekspressiotasot kaikkien transkriptien, jotka olivat merkittävästi havaittu verrattuna taustan hybridisaatio (15212 selostukset,

p

0,01) verrattiin Training Set kunkin potilaan ryhmä: TB, aktiivinen sarkoidoosi, ei-aktiiviset sarkoidoosi, keuhkokuume, keuhkosyöpä, että terveillä verrokeilla. Kukin moduuli vastaa joukko co geenien, jotka oli osoitettu biologisia toimintoja puolueeton kirjallisuutta profilointia. Punainen piste osoittaa merkittävää yli-kopioiden esiintymistiheyttä ja sininen piste osoittaa merkittävää alle runsaus (p 0,05). Värin voimakkuus korreloi prosenttiosuus geeneistä kyseisessä laitteessa jotka ovat merkittävästi ilmentyvät eri. Modulaarinen analyysi voidaan esittää myös graafisessa muodossa, kuten on esitetty (B) – (E), sisältäen sekä koulutus ja Test Set näytteitä. Keskiarvo, SEM ja

p

arvot näytetään (ANOVA kanssa Tukeyn moninkertainen vertailutesti). (B) osuus geenien yliekspressoituvat merkittävästi 3 IFN moduulia kunkin taudin. (C) Kansi muutos geenien läsnä IFN moduulien verrattuna kontrolleihin. (D) prosenttiosuus geenien merkittävästi yli-ilmentyy 5 tulehdus moduulia jokaista sairautta. (E) Kansi muutos geenien läsnä tulehdus moduulien verrattuna kontrolleihin.

Comparison IPA käyttäen geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kunkin tautiryhmän ja sovitetun ohjausobjekteja , paljasti merkittävin reittejä verrattaessa poikki sairaudet (≥1.5 kertainen muutos valvonta, Mann Whitney Benjamini Hochberg

p

0,01; TB = 2524, aktiivinen sarkoidoosi = 1391, keuhkokuume = 2801 ja keuhkosyöpää = 1626 selostukset). Top neljä merkittävää väyliä liittyivät proteiinisynteesiä (EIF2 signalointi), immuunivasteen, IFN signalointi, hahmontunnistuksen tunnistavia reseptoreita bakteereja ja viruksia, ja antigeenin esittelyn (kuvio 5A ja taulukossa S11). Under-runsauden EIF2 signalointireitin vauhdittivat keuhkokuume potilaat. Muita liittyvistä geeneistä proteiinisynteesiä (ribosomaalisen proteiinien ja muiden eukaryootti- aloitustekijöitä) ja laskostumattoman proteiinivaste (stressivastetta liialliseen proteiinisynteesiä), olivat myös merkittävästi alle runsaampaa keuhkokuumepotilaasta esim PERK, CHOP, ABCE1 (tuloksia ei ole esitetty). Tilastollinen merkitsevyys (bottom x-akselin, pylväsdiagrammi, kuvio 5A) ja prosenttiosuus geeneistä (top x-akselin, viivakuvaaja, kuvio 5A) kolmesta immuunivasteen väyliä ajettiin pääasiassa TB ja aktiivinen tilaiden, osoittaa jälleen samankaltaisuus biologisten reittien taustalla näitä sairauksia. Kuitenkin IFN-signalointireitin oli merkitsevä (kuvio 5A), ja se sisältää suuremman määrän geenien TB kuin aktiivinen sarkoidoosi (kuvio 5B).

differentiaalisesti ilmentyvien geenien olivat peräisin Training Set vertaamalla kunkin sairauden terveillä verrokeilla sovitettuina etnisyys ja sukupuoli: TB = 2524, aktiivinen sarkoidoosi = 1391, keuhkokuume = 2801 ja keuhkosyövän = 1626 selostukset (≥1.5 kertainen muutos keskiarvosta valvonnan, Mann Whitney kanssa Benjamini Hochberg FDR = 0,01). (A) IPA kanoninen väyliä käytettiin määritettiin merkittävimmät reitit (i-iv), jotka liittyvät kuhunkin taudin suhteen muita sairauksia (Fisherin tarkka kanssa Benjamini Hochberg FDR = 0,05). Pohja x-akseli ja baareissa kunkin käyrä esittää log (p-arvo) ja top x-akseli ja viiva osoittaa prosenttiosuuden geenien läsnä kautta. Geenit on EIF2 signalointireitillä ovat pääasiassa alle runsas geenit mutta geenien muut kolme reitit ovat pääsääntöisesti erittäin runsaan kontrolleihin verrattuna. Väylät yläpuolella sininen katkoviiva ovat merkittäviä (p 0,05). (B) IFN signalointi IPA -systeemi päällekkäin päälle kunkin sairausryhmästä. Värilliset geenit ilmentyvät differentiaalisesti että tauti ryhmässä verrattuna niiden verrokeilla (Fisherin tarkka FDR = 0,05). Red geenit edustavat yli-runsautta ja vihreänä-runsautta. Koulutusjakson TB on esitetty suurennettuna niin yksityiskohdat geenejä voidaan nähdä, se on myös esitetty uudelleen paljon pienemmässä mittakaavassa lisäksi muita sairauksia, jotta visuaalinen vertailu voidaan helpommin tehdä.

top 50 erittäin runsaan ilmentyvät eri selostukset kunkin taudin korreloi havaintojen modulaarinen ja IPA mittaamiseen, kun TB ja aktiivinen sarkoidoosi hallitsi IFN-indusoituva geenejä esim IFITM3, IFIT3, GBP1, GBP6, CXCL10, OAS1, STAT1, IFI44L, FCGR1B (taulukko S5). Jälleen nämä olivat suuremmat numero TB kuin sarkoidoosi. Top 50 erittäin runsaan transkriptien keuhkokuume hallitsi mikrobilääkkeiden neutrofiilien liittyviä geenejä esim Elane, DEFA1B, MMP8, CAMP, DEFA3, DEFA4, MPO, LTF. Geenit FCGR1A, B ja C olivat erittäin runsaan 50 parhaan selostukset kaikkien neljän keuhkosairaudet. 4-set Venn kaavio differentiaalisesti ilmentyvien geenien osoitettiin ainutlaatuinen geenejä kullekin tautiryhmän (kuvio S9 ja taulukko S6), jossa on yli kolme kertaa enemmän ainutlaatuisia TB geeneistä kuin ainutlaatuinen aktiivinen sarkoidoosi geenejä. TB Ainutlaatuinen geenit koostuvat immuunivaste geenien merkittävästi liittyvät IFN-signalointireitin ja antigeenin esittelyä. Ainutlaatuinen keuhkokuume geenit liittyy alle runsaasti polkuja liittyvien proteiinisynteesiä. Ainutlaatuinen keuhkosyöpä geenit liittyivät yli-runsaasti tulehdusta liittyviä reittejä ja alle runsaasti T-solujen polkuja. Päällekkäiset geenit ovat yhteisiä kaikille neljälle tautiryhmistä liittyi merkittävästi alle runsaasti T- ja B-solujen polkuja.

TB ja keuhkokuume Potilaat jälkeen Hoito Osoitti pienentäminen Transkription Profiilit katsoo tilaiden vastaaminen Glukokortikoidit kasvoi huomattavasti vuonna transkriptionaalinen aktiivisuus

vieressä tutki transkription hoitovaste. Keuhkokuumepotilaasta, seurattu vähintään 6 viikon kuluttua kotiutukseen, oli hyvä kliininen vaste standardin antibioottihoito (taulukko S7A) ja diminishment niiden transkription profiileja tasolle valvonnan modulaarinen analyysi (kaikki havaittavissa selostukset) ja MDTH (1446-selostukset) (kuvio 6A 6B). MDTH on 1446-transkriptien peräisin olevassa tutkimuksessa eri keuhkosairaudet, oli myös vähentynyt veressä Etelä-Afrikkalainen tuberkuloosipotilaille päätyttyä hoidon palataan allekirjoitus piilevän TB valvonnan (kuvio 6C) ja tukevat edellisessä raportissa [10].

(A) Modulaarinen analyysi.