Krooninen sairaus

tiivistelmä

Evasion apoptoosin on osallisena lähes kaikista syövän etenemisen, sekä hoito vastus. Tässä tutkimuksessa, resistenssin apoptoosia todettiin kasvaimia synnyttäviä keuhkojen epiteelin (A549) seurauksena vikoja mitokondrioiden ja autophagic toiminto. Mitokondrioiden toimintaan määräytyy osittain mitokondrion morfologia, prosessi säännellään mitokondrioiden dynamiikka, jolloin yhdistää kaksi mitokondrioita, fuusio, inhiboi apoptoosia samalla fissio, jako on mitokondrioissa, käynnistää apoptoosin. Mitokondrioiden morfologia A549-solut näkyvät pitkänomainen fenotyyppi muistuttavia soluja puutteellinen mitokondrion fissio proteiinia, Dynamin liittyvä proteiini 1 (Drp1). A549-soluja oli alentunut Drp1 mitokondrioiden rekrytointi ja laski Drp1 riippuvaa fissio. Sytokromi c vapautumista ja kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen oli heikentynyt sekä basaalisesti ja apoptoottisten ärsykkeitä A549-soluja. Lisääntynyt mitokondrioiden massa havaittiin A549-soluja, mikä viittaa puutteita mitophagy (mitokondrion valikoiva autophagy). A549-solut olivat laskeneet LC3-II lipidaatio ja lysosomaalisen esto viittaa puutteita autophagy esiintyä ylävirtaan lysosomaalisen hajoamisen. Immunovärjäys osoitti mitokondrioiden lokalisoitu LC3 punctae A549-solujen määrä nousi jälkeen mitokondrio irtoamisen tai yhdistelmällä mitokondrion Depolarisaatio ja kohdunulkoinen Drp1 ilme. Lisääntynyt apoptoosin inhibitio A549-soluissa korreloi estäneet mitokondrioiden fission ja mitophagy. Ehdotamme mitokondrioiden fissio vikoja edistää apoptoottista resistenssin A549-solut.

Citation: Thomas KJ, Jacobson MR (2012) Viat mitokondrioiden Fissio Protein Dynamin-Related Protein 1 liittyvät Apoptotic Resistance ja Autophagy on Lung Cancer Malli. PLoS ONE 7 (9): e45319. doi: 10,1371 /journal.pone.0045319

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 20 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Thomas, Jacobson. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: St. Maryn sairaalassa ja Regional Medical Center, St. Maryn sairaalassa Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on suuri kansanterveydellinen ongelma ympäri maailmaa. Nykyiset strategiat syövän hoidossa (kemo- ja sädehoidon) luottaa tuumorisolujen tappamisessa mekanismeja pitkälti välittämän apoptoosin aktivaatiosta. Apoptoosi on konservoitunut soluprosessin joka ohjaa normaalin kehityksen ja kudosten homeostaasin poistamalla vaurioituneita soluja. Apoptoosin inhibitio edistää kasvaimia muuntaminen normaalien solujen laajentamalla niiden elinkelpoisuus, suosimalla kertyminen muuttaa mutaatioiden [1]. Vastustuskyky apoptoosin liittyy lisääntynyt invasiivisia ja metastaattisen potentiaalin syöpäsoluissa [2].

Klassinen syöpä tunnusmerkki on apoptoottinen vastus [3]. Miten kasvainsolujen kiertää apoptoottista solukuolemaa ei tällä hetkellä tiedetä, mutta kasvava kasvain herkkyys apoptosis on terapeuttinen tavoite. Puuttuminen spontaani apoptoosin ja hoidon aiheuttaman apoptoosin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) esittää, että puutteet apoptoottinen prosessi voi olla vastuussa niiden vastustuskykyä syövän hoitoon [4]. Geenimutaatioita ja muuttunut ilmentyminen apoptoosisäätelijät havaitaan keuhkosyöpä. Erot herkkyydessä terapeuttisia indusoivat apoptoosin voivat liittyä ilmaisun apoptoosin sääntelyviranomaisten keuhkosyöpä. Anti-apoptoottisten muokkaava hoito on tutkittu laajasti [3].

Luonnostaan ​​apoptoosin on tunnusomaista permeabilisaation mitokondrioita, vapautumisen sytokromi c: n, ja aktivointi kaspaasin kaskadin [5]. Mitokondrioiden valvonta apoptoosin tapahtuu ylävirtaan kaspaasin aktivaatio ja välittyy Bcl-2-perheen proteiinien [5]. Bcl-2-proteiinien vaikuttavat myös mitokondrion dynamiikka, prosessi, joka tasapainottaa mitokondrioiden fissio ja fuusio tapahtumia säännellä muoto, rakenne ja toiminta mitokondrioissa [5]. Mitokondriot ovat dynaamisia organelles jolloin niiden muoto vastaa aineenvaihdunnan tila [6], terveyttä solun [7] ja tasapaino fuusio ja fissio tarvitaan homeostaasiin. Normaalisti mitokondrioiden fissio sovittelija Drp1 fragmentteja mitokondrioiden [5]. Drp1 on suuri GTPaasia, joka ohjaa kalvo tubulation ja fissiotuotteiden nisäkässoluissa [5]. Solut meneillään mitokondrioiden fissio on lyhyempi mitokondrioiden pituus verrattuna soluihin, joita ollaan mitokondrioiden fuusio [8]. Vaikka nämä tapahtumat ovat ohimeneviä, soluja puuttuu mitokondrio dynamiikka proteiinia tai alle ärsykkeet säilyttävät valtion riippuvainen mitokondrion morfologia [6]. Liiallinen mitokondrioiden fissio (pirstoutuminen) on välttämätön luontainen apoptoosin on välttämätöntä sytokromin c vapautumiseen ja myöhemmin kaspaasin aktivaatio [5].

esto Drp1 riippuvaisten mitokondrioiden fissio huonontaa ja osittain estää luontainen apoptoosin [7]. Samanaikainen kanssa mitokondrion kalvon läpäiseväksi apoptoosin aikana, Drp1 muodostaa oligomeerit ja rekrytoimista ulomman mitokondrion kalvon välittäjänä fissio on GTP-riippuvaisella tavalla [5]. Fissio tapahtumia välittävät apoptoosin luovuttamista koskevat proapoptoottisten tekijät sytosoliin. Esto Drp1 estää mitokondrion kalvon mahdollinen romahtaminen ja sytokromi c: vapauttaa, ja edistää pitkänomainen mitokondrioiden morfologiset fenotyypit [5]. Esto mitokondrioiden fissiotuotteiden kielletään sytokromi c translokaatio ja viiveet solukuoleman, mikä tarjoaa yhteyden mitokondrion dynamiikkaa ja apoptoosin induktio.

Mitokondrioiden dynamiikkaa ei vain vaikuta luontaisia ​​apoptoosin, mutta myös ohjata autophagic hajoamista. Laaja cross-talk välillä mitophagy ja apoptoosin [9]. Esto ydinfission välittäjäaineiden, kuten Dynamin liittyvä proteiini 1 (Drp1), joka heikentää luontainen apoptoosin [10], on osoitettu vähentävän mitophagy [11]. Downregulation autophagy aikana kasvaimen etenemistä on todettu monissa tutkimuksissa [12]. Lisääntynyt kasvaimen kasvu on osoitettu vähentävän proteiinien hajoaminen keuhkojen epiteelisoluissa [13]. Negatiivinen säätelijä autophagy, mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde), on usein käytössä [14] ja mTOR-inhibiittorit ovat osoittautuneet rajoittaa kasvaimen leviämisen NSCLC malleissa [15].

Resistance apoptoosiin liittyy mitokondriot ja proteiinit, jotka osallistuvat mitokondrioiden dynamiikkaa. On kuitenkin edelleen epäselvää, kasvainsolut saavat vastustuskykyä apoptoosin muuttamalla mitokondrioiden dynamiikkaa. Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu mitokondrion dynamiikkaa ja alavirran prosessi apoptoosin keuhkojen syöpäsoluja. Erot mitokondrioiden morfologiaan ja toimintaan havaittiin A549-soluja. Tarjoamme todisteet keuhkosyöpäsoluissa viittaa epätasapainoon mitokondrion dynamiikka olemassa, jolloin viat Drp1 riippuvaisten mitokondrioiden fissio estävät alavirtaan prosessi autophagy ja edistää apoptoottista vastarintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Plasmidit

Solulinjat hankittiin ATCC: ltä (taulukko I) viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [16]. Elävien solujen kuvantaminen suoritettiin fenolipunaista (PRF) OptiMEMiin (Invitrogen). Plasmidit [16] mitokondrioiden YFP (mito-YFP, Clontech), Drp1-YFP [17], Drp1-myc [18], Drp1 K38A-myc [18], ja Drp1 RNAi [19] oli lahja Dr. Richard Youle (NINDS, Bethesda, MD) ja transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti valmistaja. Päällystetty solut (10

4 solua /kuoppa) ympättiin ja niitä viljeltiin täydellisessä OptiMEM 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ennen hoitoa ja fluoresenssin voimakkuus käsittelyssä. Solujen käsittely olivat: inkubointi 1 uM staurosporiini (STS, Sigma) ja /tai 50 uM zVAD-FMK (Sigma) 3 tuntia PRF OptiMEM ilman seerumia apoptoottisen määrityksissä. Solut nälässä käyttäen EBSS (Invitrogen) ja /tai käsiteltiin 10 nM bafilomysiini A1 (Sigma) 24 tuntia autophagy määrityksissä.

Analyysi mitokondrio Morfologia ja Yhteydet

mitokondrioiden morfologia analysoitiin aikaisemmin kuvatulla [16] käyttämällä elävien solujen kuvantamisen käänteismerkkisinä -konfokaalimikroskoopilla (ve pyörivän kiekon, DMI 6000B, Leica) ja MetaMorph ohjelmistoja. Mitokondrioiden pituus analyysi tehtiin Kuvien ImageJ käsittelyn jälkeen löytää reunat. Keskimääräinen mitokondrioiden pituus määritettiin käytön jälkeen vapaalla kädellä linjan valinnan mittaamaan pituuden (mikrometriä) yksittäisten mitokondrioita saatu satunnaisesti valitun kentän 100 x 100 pikseliä ja 10-15 solua solulinjaa tutkittiin. Liittyvä metadata olivat esillä ja kuvan skaalaa (Välimatka in Pikselit: 1; Tunnetut Etäisyys: Value kohteesta Metadata; Pixel Aspect Ratio: 1, yksikkö Pituus: mikrometriä; Global: valittuna) asetettiin kuva-analyysiin johdonmukaisuuden. Ohimenevä solujen transfektio ja Drp1 RNAi knockdown-kokeet suoritettiin kuten on kuvattu [16]. Mitokondrioiden kuvantaminen 0,5 ug transfektoitujen mito-YFP tai mito-DsRED mitokondrioiden pituus arvioita ja mitokondrioiden FRAP määrityksiä on kuvattu [16], [20].

Cellular Imaging ja Fluorimetria

mitokondrioiden massa arvioitiin käyttäen fluoresoivaa levylukijaa jälkeen värjäämällä solut 200 nM Mitotracker Green 30 minuuttia 37 ° C: ssa, ja pesemällä kerran PRF-OptiMEM: [21]. Fluoresenssin intensiteetin mittaukset raportoitiin ovat tausta vähennetään (495/515 nm).

Mitokondrioiden kalvojännite arvioitiin 96-kuoppaisen levyn käyttäen fluoresoivaa (TECAN). Solut (10

4 kuoppaa kohden) ladattiin 10 nM TMRE 30 minuuttia 37 ° C: ssa normaali kasvu media. TMRE lastaus väliaine poistettiin ja viljelmät sijoitettiin fenolipunaista, seerumivapaassa ja inkuboidaan vielä 15 minuutin ajan, jotta varten TMRE fluoresoiva signaali saavuttaa vakaan tilan. Fluoresenssi-intensiteetti vangittiin sitten 1 /min 5 minuutin ajan perustason. 5 minuutin kuluttua 6 uM oligomysiini (Cell Signaling) lisättiin aiheuttavan hyperpolarisaatioon Δψ

m. Läsnä ollessa oligomysiini, 10 uM CCCP lisättiin 18 minuutin soluihin aiheuttaa depolarisaation ΔΨ

m. TMRE ilme on piirretty suhteellinen suhde AF /F

0 osoittaa keskiarvo ja SEM, jossa F osoittaa fluoresenssin intensiteetti ja F

0 ilmaisee lähtötasolle ennen stimulaatiota. Kaikki solulinjat analysoiduista näkyy oligomysiini aiheuttama hyperpolarisaatioon mitokondrion kalvon potentiaalia. Fluoresenssivoimakkuudet ovat tausta vähennetään (554/576 nm).

Mitophagy mitattiin konfokaalimikroskopia havaitsemiseksi rinnakkaispaikantumisen Mito-YFP transfektoitujen positiivisten solujen kanssa immuunivärjäysmenetelmällä vastaan ​​hiiren monoklonaalisella anti-LC3B (Novus Biologicals) kanssa AlexaFluor® 594 toissijainen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Invitrogen). Solut (5 x 10

4 kuoppaa kohti) transfektoitiin suspensiossa 0,5 ug: mito-YFP käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ja ympättiin LabTekII borosilikaattilasin kammiot (Nunc) 24 tuntia. Kiinnityksen jälkeen 4% paraformaldehydillä, solut immunovärjättiin kanin polyklonaalista anti-LC3B-vasta-ainetta (Novus Biologicals) ja visualisoitiin AlexaFluor® 594 vuohen anti-kani-IgG: tä (590/617 nm). Määrä erillisiä mitokondrioiden lokalisoitu LC3-positiivisten punctae solua kohden laskettiin. Autophagosome muodostuminen totesi LC3 punctae.

Kaikki Fluoresenssimittauksissa on suhteellinen fluoresenssi (RFU).

ELISA fosfoproteiinituote Puhdistus ja Western-blottaus

Yleiset menetelmät western blotting ja subsellulaarifraktiointikokeet on kuvattu [20]. Käytetyt vasta-aineet: Sigma (β-aktiini, GAPDH), Cell Signaling (kaspaasi-3, HSP60, HTRA2, PARP), BD Translabs (Drp1, p53, TIM23), Calbiochem (VDAC), Novus (LC3-II), Abcam ( vimentiinista, fibronektiini) ja MitoSciences (Mitobiogenesis Pitoisuus, kompleksi IV alayksikkö I, frataxin). Vasta-aine Drp1 pS637 oli antelias lahja tri Craig Blackstone (NINDS, Bethesda, MD). Fosfoproteiini puhdistus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16].

Tilastot

Testit määritysnäytteiden merkitty kuvioon legenda ja merkitys merkitään seuraavasti: ns, ei merkittävää

P

0,05; *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001.

Tulokset

Mitokondrioiden Pidennys A549 Cells

Mitokondriovauriot on havaittu monenlaisia ​​syöpäsolulinjojen [22]. Tärkeä tekijä mitokondrioiden toimintaan ei mitokondrioiden morfologia. Mitokondrioiden morfologia tutkittiin kussakin normaalin ja keuhkosyövän solulinjoja (taulukko I) käyttämällä mito-YFP fluoresoivasti merkitä mitokondrioiden matriisin solujen (kuvio 1A). Mitokondrioiden pituus määritettiin myös kullekin solulinja (kuvio 1 B). Selviä eroja morfologiassa, mukaan lukien pituus mitokondrioita, välillä ei havaittu keuhkon epiteelisolujen linjat, jotka vaihtelevat Tuumorigeenisuustutkimuksissa (taulukko I) ja suhteellinen Tuumorigeenisuustutkimuksissa kustakin solulinjasta oli validoitu suorittamisen jälkeen solujen vaeltamiseen kokeissa (kuvio S1) [23] . Ei- ja heikosti tuumorigeenisemmiksi NL20 ja NL20TA soluilla oli heterogeeninen fenotyypin kasvaimia Calu1 ja A549-soluja näkyy pääasiallisesti pitkänomainen muoto mitokondrioita. Suuntaus Todettiin, jolloin ei-tuumorigeenisiä soluja (NL20) oli lyhin keskimääräinen mitokondrioiden pituus (keskiarvo ± SEM; 5,2 ± 0,4 um) ja pisin keskimääräinen mitokondriaalisen pituus havaittiin A549-soluja (keskiarvo ± SEM; 8,0 ± 0,8 um) (kuvio 1).

(A) edustaja mito-YFP ilmentymistä soluissa. Numeroidut laatikot (1-4) ovat suurennoksilla (10 x) vastaavaa numeroitu boxed alueilla alkuperäisessä kuvia NL20, NL20TA, Calu1 ja A549. Mittakaava on 2 pm. (B) Keskimääräinen mitokondrion pituus (y-akseli, ± SEM) mittauksen (n = 35-50) kolmesta itsenäisestä kokeesta ja NL20, NL20TA, Calu1, ja A549-solut. 1-suuntainen ANOVA kanssa Tukey post-testit (

P

0,0001).

Lisääntynyt Mitokondrioiden Mass A549 Cells

Mitokondrioiden massa arvioitiin elävien soluihin käyttäen Mitotracker Green FM, joka kertyy mitokondrioita riippumatta mitokondrion kalvon potentiaalia [24]. Normalisoinnin jälkeen solun tilavuuden, havaittiin, että A549-solut olivat kasvaneet mitokondriaalisen massa verrattuna muihin keuhkojen epiteelin solulinjoissa (kuvio 2A). Edelleen vahvistaa tätä suhdetta, ilmaus mitokondrion koodatun proteiinin, mitokondrion kompleksin IV alayksikkö I (päätelaitteen entsyymi hengitysteiden ketju) verrattiin ydin- koodattu mitokondrion liittyvien proteiinien, TIM23 (translokaasia sisemmän mitokondrion kalvon 23) ja frataxin kaksi riippumatonta menetelmillä, immunoblottaus ja ELISA (kuvio 2B, D, vastaavasti). A549-solut olivat lisääntyneet tasot monimutkaisia ​​IV alayksikkö I-proteiinin verrattuna NL20 soluja (kuvio 2B-E). Selektiivinen kertyminen mitokondrioiden A549-solut ei jäljitellä muita organelleja, kun analyysi proteiinin ilmentymisen (ER, kalneksiini, Golgin, syntaksiini 6, sytosoliin, GAPDH) Western blot (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, mitokondrioiden biogeneesin markkereita TFAM (mitokondrion transkriptiotekijä A) ja PGC1α (peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori gamma koaktivaattorikompleksien-1-alfa) tutkittiin edelleen tutkia mitokondrioiden massa solulinjoissa. Tutkiminen nämä merkit on geeniekspression taso ei viittaa siihen, että nousu mitokondrioiden massa havaitut A549-soluja johtuvan lisääntyneestä mitokondrioiden biogeneesin. Geenien ilmentyminen kertaluokkamuutos erot eivät olleet merkittäviä sekä geenin arvioinneissa (

TFAM

,

P

0,142;

PGC1α

,

P

0,119 ) (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, A549-solut ovat kasvaneet mitokondrion massa.

(A) Mitotracker vihreän fluoresenssin suhteellinen fluoresenssin yksiköissä (y-akseli, RFU) edustaa mitokondrion massa (keskiarvo ja SEM); mittaukset (n = 8 kuoppaa) kolmesta itsenäisestä kokeesta. 1-suuntainen ANOVA kanssa Tukey post-testit (

P

0,0001). (B) edustaja immunoblotit osoittavat endogeenisen proteiinien monimutkaisia ​​IV alayksikkö I, TIM23, frataxin, ja VDAC in NL20 (kaista 1), NL20TA (kaista 2), Calu1 (kaista 3), ja A549 (kaista 4) soluja. β-aktiini näkyy lastaus. Merkkiaineiden kilodaltonia (kDa). (C) Immunoblotit kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta kvantitoitiin näyttää suhteelliset monimutkaisia ​​IV alayksikkö I-proteiinin ilmentymisen normalisoitu TIM23. Mean ja SEM on esitetty. 1-suuntainen ANOVA kanssa Tukey post-testit verrattuna NL20. (D) edustaja mitokondrioiden biogeneesin mittatikku ELISA-määrityksessä osoittaa frataxin ja monimutkainen IV ilmaisun. (E) Kolme riippumatonta mitokondrioiden biogeneesin ELISA määritykset määrällisesti näyttää suhteelliset mitokondrioiden-koodatun kompleksi IV-proteiinin ilmentymisen normalisoida ydin–koodatun frataxin proteiinia. Mean ja SEM on esitetty. 1-suuntainen ANOVA kanssa Tukey post-testit verrattuna NL20.

Vastustuskyky CCCP aiheuttamaa mitokondrioiden Depolarisaatiospektrit A549 Cells

Mitokondrioiden irtoamisen by CCCP (karbonyyli syanidi m-kloorifenyyli hydratsoni) häiritsee mitokondrion kalvon potentiaali (Δψ

m) ja mitokondrioiden pH-gradientin (ΔpH

m) [20]. TMRE ilmentyminen on piirretty suhteellinen suhde, AF /F

0, jossa F osoittaa fluoresenssin intensiteetti ja F

0 tarkoittaa perustason arvot ennen stimulaatiota. Kaikki solulinjat analysoiduista näkyy oligomysiini aiheuttama hyperpolarisaatioon mitokondrion kalvon potentiaalia. Läsnä ollessa oligomysiini, 10 uM CCCP lisättiin sitten soluihin aiheuttaa depolarisaation Δψ

m.

tiedot viittaavat siihen, että A549-solulinjat eivät depolarisoi tasolle muiden solulinjojen seuraavat CCCP hoitoon. Merkittäviä eroja (P 0,001; 2-tie ANOVA) in AF /F

0 havaitaan 23-30 minuuttia ( 4 min kuluttua CCCP lisäksi) välillä A549 ja muut solulinjat. Tämä viittaa siihen, että erittäin tuumorigeenisiä A549 näyttää vastustuskyky mitokondrion kalvon depolarisaation (kuvio 3).

TMRE värjäys kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta (n = 8). TMRE ilme on piirretty suhteellinen suhde AF /F

0 osoittaa keskiarvo ja SEM, jossa F osoittaa fluoresenssin intensiteetti ja F

0 ilmaisee lähtötasolle ennen stimulaatiota seuraavan tausta vähennyslasku. Solulinjoja NL20 (sininen), NL20 (oranssi), Calu1 (pink1) ja A549 (vihreä) käsiteltiin oligomysiini (6 uM, 0 minuuttia) ja CCCP (10 uM; 18 minuuttia), joilla hyperpolarisaatiolla ja depolarisaation, vastaavasti. 2-tie ANOVA analyysi Bonferronin post-testejä.

Kuten kasvainsolulinjoissa on aiemmin osoitettu olevan vaikutusta monilääkeresistenssiin kuljettajat (MDR), soluja esikäsiteltiin 50 uM verapamiilia lohkoon MDR toiminnan aikana TMRE lastaus onko MDR proteiinit solukalvon vaikutti TMRE virtaa. Seuraavat oligomysiini /CCCP hoitoon verapamiilin käsiteltyjä soluja, MDR ei vaikuttanut intrasellulaarista kertymistä TMRE verrattuna ei-verapamiilin käsitellyt solut (tuloksia ei ole esitetty); koska tämä loisteputki rodamiini alustaan ​​ei kerry lääkkeille vastustuskykyiset soluissa. Tässä tutkimuksessa A549-solut olivat vähemmän muutosta Δψ

m mitattuna TMRE fluoresenssi seuraavat CCCP hoidon ja MDR toiminta ei vaikuta tähän toimintaan. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​muiden raporttien, jotka viittaavat siihen syöpäsolujen ilmenee resistenssi mitokondrion kalvon depolaroinnin [25].

Vähentynyt Drp1 riippuvaa Fissio A549 Cells

Mitokondrioiden Depolarisaatio ja fissio ovat edellytys luontaisia apoptoosin [5]. Lisääntynyt mitokondrioiden pituus, me arveltu, että A549-soluja olisi laskenut mitokondrion fissio, mikä vähentäisi sekä apoptoottisten aloittamisen ja loppupään catabolic prosessin autophagy.

Drp1 ja sen mitokondrioiden fuusio antagonisteja OPA1 (Optiikka surkastuminen 1), Bax /Bak ja Mfn1 /2 (Mitofusin 1/2), osittain säännellä muoto, rakenne ja toiminta mitokondrioiden mitokondrioiden dynamiikka [8]. Tutkiminen mitokondrioiden morfologian (kuvio 1A, kuvio 4A, pohjapinta) esittää lähinnä pitkänomainen mitokondriot A549-soluja (kuvio 4A2: mitokondrion pituus, keskiarvo ± SEM; 8,3 ± 0,8 um). Tämä fenotyyppi viittaa vioista fissio tai säätelyä fuusio. Vakaa tila Drp1 proteiinin tasot analysoitiin immunoblottauksella (kuvio 4B, C). Kvantitatiivinen analyysi osoittaa, että pohjapinta Drp1 proteiinin ilmentymistä A549-solut oli korkeintaan 44%, joka havaittiin NL20 soluissa (kuvio 4D).

(A) Mitokondrioiden morfologia NL20 (vasemmalla) ja A549 (oikealla) soluissa mito -DsRED transfektiota. Kuvat ovat osoittaneet: pohjapinta (ylempi) ja seuraava Drp1 RNAi (keskellä) tai Drp1-YFP transfektio (alempi). Mittakaavapalkki osoittaa 2 um. Numeroidut laatikot (1-6) ovat suurennoksilla (10 x) vastaavaa numeroitu boxed alueiden alkuperäiset kuvat. (B) Immunoblot endogeenisen Drp1 ilmaisun ennen (kaistat 1,3) ja sen jälkeen (kaistat 2,4) Drp1 RNAi transfektion NL20 ja A549-soluja. (C) Immunoblot endogeenisten (kaistat 1,2, nuoli) ja kohdunulkoisen (kaistat 3,4, nuolenkärki) Drp1 ilmaisun ennen ja jälkeen Drp1-YFP transfektion NL20 ja A549-soluja. (B, C) β-aktiini seuloa toistamiseen näyttää lastaus; merkkiaineiden kDa. (D) Suhteellinen Drp1 proteiinin ilmentymisen normalisoida p-aktiini ennen ja jälkeen Drp1 RNAi transfektion NL20 (valkoinen palkki) ja A549 (musta palkki) soluja (kaksi itsenäistä koetta). 2-tie ANOVA analyysi Bonferronin post-testit. (E) edustaja kuvia FRAP analyysiin NL20 (vasemmalla) ja A549 (oikealla), jotka on transfektoitu mito-YFP. Solut kuvantaa perusolosuhteissa (ylhäällä), Drp1 K38A-myc downregulation Drp1 (keskellä) ja Drp1-myc yliekspressio (alhaalla) olosuhteissa. Numeroidut laatikot (1-6) ovat suurennoksilla (10 x) vastaavaa numeroitu boxed alueiden alkuperäiset kuvat. Mittakaava on 1 pm. (F-H) Mobile osa mito-YFP arvot ilmenevät yhden subsellulaariseen mielenkiintoisen alueen (n = 60 solua). Mean ja SEM esitetty kahdesta itsenäisestä kokeesta. 1-suuntainen ANOVA kanssa Tukey post-testit. Muita FRAP tilastot on esitetty kuvassa S2.

edelleen manipuloida mitokondrion morfologia, Drp1 pudotettiin käyttäen RNAi [16], [19] (kuvio 4A, B + Drp1 RNAi), jonka odotetaan venyttää mitokondrioita. Sen jälkeen Drp1 RNAi välittämää kaataa sisään NL20 ja A549-soluja, oli vahva lasku Drp1 proteiinin tasot (kuvio 4B, D). Mitokondrioiden pituus kasvoi, kuten odotettua, ja NL20-soluissa sen jälkeen, kun Drp1 RNAi hoidon (kuvio 4A: keskiarvo ± SEM, pohjapinta (A1), 4,9 ± 0,5 um, Drp1 RNAi (A3), 7,8 ± 0,6 um, 1-suuntainen ANOVA, Tukey-post -testi,

P

0,001). Mitokondrioiden fenotyyppi jälkeen Drp1 RNAi käsittely A549-soluja oli turvonnut ja mukulat (kuvio 4A4); morfologia aiheuttama hyperfuusiosta mitokondrioiden puutteen vuoksi tasapainon että tarjoavat yleensä fissio [26]. Sen määrittämiseksi, vähennetään Drp1 proteiinin ilmentyminen myötävaikuttaa pitkänomainen mitokondrioiden fenotyyppi normaalisti havaitaan A549-soluja, solulinjat transfektoitiin Drp1-YFP plasmidi ilmentää voimakkaasti Drp1-YFP fuusioproteiini, joka on toiminnallisesti kykenee indusoimaan fissio [16]. Kuten on esitetty kuviossa 4A (+ Drp1-YFP), Drp1 yliekspressio pelastaa mitokondrion fenotyyppi A549-soluja, vähentämällä mitokondriaalisen pituudet, jotka havaittiin pohjapinta NL20 soluissa (kuvio 4A: keskiarvo ± SEM; + Drp1-YFP (A6), 5,1 ± 0,7 m; 1-tie ANOVA, Tukey testin jälkeen,

P

0,05). Mitokondrioiden morfologia A549-solut seuraavista Drp1 yliekspressio samalla muistutti tyvi- NL20 soluja (kuvio 4A1). Mitokondrioiden pituus NL20 soluissa (Kuva 4A: keskiarvo ± SEM, pohjapinta (A1), 4,9 ± 0,5 um) laski myös jälkeen Drp1 yliekspressio (Kuva 4A: keskiarvo ± SEM; + Drp1-YFP (A5), 2,1 ± 0,3 m; 1 -way ANOVA, Tukey testin jälkeen,

P

0,001).

Nämä tiedot viittaavat siihen, että puute Drp1 proteiinin tasot osallistuvat laskivat mitokondrioiden fissio tapahtumia A549-soluja. FRAP (fluoresenssi toipuminen Valovalkaistuminen) käytettiin määrällisesti mitokondrion yhteyden, joka päättelee mitokondrion fissio tapahtumat [16], elävissä NL20 ja A549-soluja (kuvio 4E-H). FRAP käyrät tiivistää laskemalla liikkuva osa mitokondrioiden suunnatun keltainen fluoresoiva proteiini (mito-YFP), joka arvioi mitokondrion yhteydet [16]. FRAP kokeet vahvistavat, että A549-solut ovat vähentyneet mitokondrion fissio (kuvio 4F-H). Mobile murto arvot osoittavat, että mitokondriot NL20 solut ovat merkittävästi pienemmät toiminnalliset yhteydet (lisää fissio) verrattuna A549-soluja basaalisesti (kuvio 4F). Downregulation Drp1 yliekspressiolla vallitsevan negatiivisen versio Drp1 (Drp1 K38A), joka oli tasapainotettu mitokondrion yhteyden kahden solulinjojen (kuvio 4H). Sen jälkeen Drp1 yliekspressio (+ Drp1-myc), mitokondrioiden fissio paranee A549-soluja niin, että liikkuva osa-arvot ovat verrattavissa pohjapinta NL20 soluihin (kuvio S2). Nämä FRAP tulokset matkivat mitokondrion morfologinen huomautukset osoittavat laski Drp1 riippuvaa fissio A549-soluissa verrattuna NL20 soluihin ja että vaimentua fissio A549 solut voidaan pelastaa yliekspressio Drp1.

Drp1 lokalisointi A549 Cells

tarkastella edelleen vähentynyt Drp1 riippuvaa fissio A549-soluissa, me katsoimme Drp1 lokalisointi seuraavat subsellulaarifraktiointikokeet kautta immunoblottaus. Mitokondrioiden ja sytosolisia fraktioita tutkittiin endogeenisen Drp1 proteiinin tasot (kuvio 5A, B). Drp1 proteiinia ei havaittu mitokondriofraktiosta A549-solut viittaa siihen, että Drp1 ei aktiivisesti palvelukseen mitokondriot fissioon. Sen sijaan NL20 solut osoittivat rekrytointi Drp1 jotta mitokondriofraktiosta, joka päättelee mitokondrion fissio on ilmennyt NL20 soluissa ehdottivat mitokondrioiden morfologiset analyysit (kuvio 1A, 4A) ja vahvistettu FRAP data (kuva 4F-H). Nisäkässoluissa Drp1 rekrytoimista ulomman mitokondrion kalvon seuraavat apoptoottinen induktion [5]. Tutkia tämä kulkeutuminen, Drp1 lokalisointi tehtiin näkyväksi immunoblottauksella seuraavien solunosafraktio jälkeen staurosporiinille (STS) käsittely. STS on proteiinikinaasin estäjä, jonka tiedetään aiheuttavan apoptoosia [27]. Kun apoptoottinen induktion STS, Drp1 proteiini rekrytointi sytosolin ja mitokondriofraktiosta havaittiin sekä NL20 ja A549-solut (kuvio 5B). Tämän havainnon, me päätellä, että A549-solut ovat vähentyneet Drp1 mitokondrion rekrytointia, että voidaan parantaa apoptoottisia stimulaatiota. Tämä viittaa siihen, että Drp1 voidaan palvelukseen mitokondriot A549-soluja mutta prosessi mitokondrion fissio vaikeutuu tässä solulinjassa.

(A, B, E) edustaja immunobloteista kolmen erillisen kokeen (A) käsittelemätön (B) 1 uM STS hoito 3 h apoptoosin indusoimiseksi, ja (E) 1 uM STS hoito 3 h kuluttua Drp1-myc transfektion NL20 ja A549-soluja. Endogeeninen Drp1 ja sytokromi c proteiinin ilmentyminen arvioitiin yhteensä (kaistat 1,2), mitokondrioiden (kaistat 3,4) ja sytosolin (kaistat 5,6) jakeet. Mitokondrioiden (VDAC), sytosoliin (GAPDH) ja β-aktiini (yhteensä) sisältyvät fraktiointiprosessilla ja lastaus valvontaa. Myc ilmentymisen jälkeen Drp1-myc transfektio on esitetty (E). Merkkiaineiden kDa. (C, D, F) Sytokromi c-proteiinin ilmentymisen normalisoida p-aktiini in NL20 (valkoiset pylväät) ja A549 (mustat palkit) solun fraktioiden käsittelemätöntä olosuhteissa (C), 1 uM STS hoito 3 h (D) tai 1 uM STS hoito 3 h: n ektooppinen ekspressoituminen Drp1-myc (F). Mean ja SEM esitetty kahdesta itsenäisestä kokeesta. 2-tie ANOVA analyysi Bonferronin post-testit. Mitokondrioiden morfologia näissä olosuhteissa on esitetty kuvassa S3C ja S5.

Heikentynyt Sytokromi C Release A549 Cells

Inhiboivaa mitokondrioiden fissio viivästyttää vapautumista sytokromi c sytoplasmaan [28] ; Näin ollen tutkimme sytokromi c translokaatiota A549-soluja (kuvio 5, kuvio S3). Mitokondrioiden ja solulimafraktioita tutkittiin sytokromi c release NL20, NL20TA, Calu1 ja A549-soluja ja ilman CCCP aiheuttama irtoamisen (kuva S3A, B). Erityisesti A549, kaikkein tuumorigeenisiä solulinja tähän keskusyksikkö (Kuva S1), näkyy heikentynyt sytokromin c vapautumisen seuraavat CCCP hoidon (kuvio S3B, C). STS-käsiteltyjen A549-solut osoittivat samanlaista puute sytokromin c vapautumisen verrattuna NL20 soluihin (kuvio 5B, kuvio S3C). Immunoblotit kvantifioitiin osoittamaan sytokromi c: proteiini tasoilla fraktiointia kokeissa ilman ja STS-hoitoa (kuvio 5C, D). Perusolosuhteissa ja STS olosuhteissa, A549-solut olivat kasvaneet sytokromi c-proteiinia tasot mitokondriofraktiosta verrattuna NL20 soluihin. Nämä tiedot viittaavat siihen A549-solut ovat vähentyneet Drp1 riippuvia mitokondrioiden fissio ja alavirran prosessi sytokromin c vapautumisen on heikentynyt. Tukemiseksi edelleen tätä ajatusta, yliekspressio DRP1 A549-soluissa pelastettiin STS-hoidon aiheuttama vapautuminen sytokromi c tässä solulinjassa (kuvio 5E, F, kuvio S3C) osoittamaan, että alentunut sytokromi c release havaittu A549-solut johtuu puute Drp1 . Odotettu mitokondrioiden morfologiset fenotyypit havaittiin seuraavat STS-hoidon ja yhdessä Drp1-myc yliekspressio (kuva S5), joka tukee sytokromi c release immunoblottaustietojen vuonna NL20 ja A549-solut.

Apoptotic Resistance A549 Cells

Koska mitokondrioiden fissio vikoja viivyttää sytokromin c vapautumista [28] ja kaspaasin aktivaatio [5], tutkimme loppupään proapoptoottisten tapahtumien sytokromi c release. Lohkaisu kaspaasin 3, keskeinen välittäjäaine nisäkkään apoptoosin [29], havaittiin seuraavat STS-ja doksorubisiini-hoitoa (kuvio 6A, kuva S4A, C) NL20, NL20TA, ja Calu1 soluja. Sitä vastoin kaspaasi-3 lohkaisu oli poissa apoptoosin stimuloiduissa A549-soluja (kuvio 6A, kuvio S4A). PARP pilkkominen, alavirran osa apoptoosin, joka johtuu osittain kaspaasi-3 [30], tutkittiin myös seuraavat apoptoottinen induktion (kuvio 6B Kuva S4b, D). PARP pilkkominen havaittiin NL20 soluissa apoptoottisten ärsykkeille mutta se puuttui A549-soluja. Inhibitio STS aiheuttaman PARP lohkaisu NL20 soluissa havaittiin, kun samanaikainen hoito zVAD-FMK (kuvio 6C), joka on tunnettu kaspaasiestäjä, mikä osoittaa, että tämä on kaspaasi välittämä prosessi NL20 soluissa. Täydellinen PARP pilkkominen havaittiin STS-käsiteltyjen NL20 solut yli-ilmentävät Drp1 proteiinia (kuvio 6C). STS-hoidon aiheuttama PARP pilkkominen palautettiin A549-soluja yliekspressoivat Drp1 (kuvio 6C).