Krooninen sairaus

tiivistelmä

vaiheen III tutkimuksissa anti-insuliinin kaltainen kasvutekijä -1-reseptori (IGF1 R) vasta figitumumab ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla on lopetettu puuttumisen takia eloonjäämishyötyä. Olemme tutkineet, onko eston erittäin homologisia insuliinin reseptorin (IR) lisäksi IGF1 R olisi tehokkaampi kuin inhibitio IGF1 R yksin leviämisen estämiseen NSCLC-solujen. Signalointi kautta IGF1 R ja IR NSCLC solulinjoissa A549 ja Hcc193 stimuloitiin yhdistelmällä IGF1, IGF2 ja insuliini. Se estää vasta-aineilla, jotka estävät ligandin sitoutumisen, αIR3 (IGF1 R) ja IR47-9 (IR), ja ATP-kilpailun pienimolekyylisten tyrosiinikinaasin estäjät AZ12253801 ja NVPAWD742, jotka estävät sekä IGF1 R ja IR-tyrosiinikinaaseihin. Inhibiittoreiden vaikutus määritettiin kiinnityskohdassa riippumatonta lisääntymisen määrityksessä ja analysoimalla Akt fosforylaation. Vuonna Hcc193 solujen väheneminen solujen lisääntymisen ja Akt: n fosforylaation, koska anti-IGF1 R-vasta-aine tehostaa vasta-aine-estoa IR, kun taas A549-soluja, joilla on suhteellisen alhainen IR: IGF1 R ilmentymisen suhteen, se ei ollut. Jokaisessa solulinjassa lisääntymistä ja Akt fosfory- oli tehokkaammin inhiboi AZ12253801 ja NVPAWD742 kuin yhdistetyn αIR3 ja IR47-9. Kun IGF1 R yksin estyy, esteetöntä signalointi kautta IR voi osaltaan jatkuvasti NSCLC-solujen lisääntymisen. Olemme päätellä, että pienmolekyylisalpaajien kohdistamaan sekä IR- ja IGF1 R vähentää tehokkaasti NSCLC soluproliferaatiota tavalla riippumaton IR: IGF1 R ilmaisun suhteen, joka tarjoaa terapeuttisen perustelut tämän taudin hoitamiseksi.

Citation: Vincent EE, vanhin DJE, Curwen J, Kilgour E, Hers I Tavare JM (2013) Targeting ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut Dual esto insuliinireseptorin ja insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1-reseptorin. PLoS ONE 8 (6): e66963. doi: 10,1371 /journal.pone.0066963

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2013; Hyväksytty: 14 toukokuu 2013; Julkaistu: 24 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Vincent et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ kuvattu rahoittivat avustusta Medical Research Council ja AstraZeneca JMT. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Jon Curwen ja Elaine Kilgour, ovat työntekijöitä AstraZeneca ja omien osakkeiden AstraZeneca. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti Non-Small-Cell Lung (NSCLC) osuus on noin 80% kaikista tapauksista. Yleinen viisi vuotta eloonjäämisaste on Euroopassa 8% [1] ja mediaanielossaolosta diagnoosin jälkeen on 4-5 kuukautta, jos ne jätetään hoitamatta [2]. Standard kemoterapiaa pitkälle NSCLC tarjoaa vain marginaalinen parannus kokonaiselinaika, mutta EGFR tyrosiinikinaasin estäjät parantaa selviytymistä potilailla kuljettavat aktivoivat mutaatiot EGFR-geenin [3]. Muita lupaavia terapeuttisia kohteita NSCLC kuuluu anaplastinen lymfooma kinaasi (ALK), histoni deasetylointi (HDAC) ja IGF (insuliinin kaltainen kasvutekijä) järjestelmä [4].

IGF-järjestelmä on keskeinen rooli sääntelyn energia-aineenvaihdunnan ja kasvun [5]. On kaksi vanhempien reseptorit IGF järjestelmässä, jotka ovat aktiivisia signalointia; IGF1 R ja insuliinin reseptorin (IR), jotka molemmat esiintyvät homodimeerejä, joka käsittää kaksi ”puoli-reseptoreihin. Suuren sekvenssihomologia ne ovat myös läsnä hybridi reseptoreita muodostuu insuliinin puoli reseptorin ja IGF1 puoli reseptoria ilmentävissä soluissa sekä reseptoria geenit [6], [7]. IR ja IGF1 R aktivoidaan insuliinin ja IGF-1 vastaavasti, mutta kolmasosa ligandi, IGF-2, sitoo sekä IGF1 R ja silmukointivarianttia IR kutsutaan IR-A [8]. Kolmas reseptori, IGF2R ei tiedetä signaalitransduktion ominaisuuksia ja toimii välys reseptorin IGF-2 [9]. IGF sitovia proteiineja (IGFBP 1-6) on myös tärkeä rooli säännellään vapaan ligandin konsentraatio ja altistuminen ligandin sen reseptori [10]. Seerumissa, että suurin osa verenkierrossa IGF-puoli on kompleksoitu IGFBP3. Tämä suojaa kasvutekijöiden hajoamista, mutta voivat myös estää niiden sitoutuminen reseptoreihin [11]. Kun aktivoidaan ligandin sitoutumisen reseptoreihin käynnistää signaalitransduktion kautta tyrösiinikinaasiaktiivisuuden loppupään kaskadeja kuten RAS /RAF /MAPK-reitin ja PI3K /Akt-reitin. Nämä reitit ovat vastuussa sääntelystä prosessorit kuten sikiön kehitykseen, kudoksen kasvua ja aineenvaihduntaa [12].

Koska keskeinen säätelijä kasvua ja selviytymistä, vapautuminen IGF järjestelmä on yleinen ihmisen syövässä (tarkistetaan [13 ]. Ylimääräinen autokriininen /parakriininen tuotannon IGF-1 ja IGF-2 ja /tai alhainen IGFBP3 arvot liittyvät lisääntyneeseen syöpäriskiin useita syöpiä, kuten rinta- [14], kohdun limakalvon [15] ja virtsarakon [16]. Tutkimukset tässä alue ovat ensisijaisesti tutkinut roolin IGF1 R. esto IGF1 R käyttäen estävää vasta johtaa huomattavaan vähenemiseen leviämisen kasvainsolulinjoissa [17] ja se on todettu olevan yliaktiivinen syövät kuten eturauhas- [18], rintojen [19 ], paksusuoli [20] ja sappirakon syöpä [21]. runko todisteiden on sellainen, että se on johtanut tutkinnan IGF1 R estäjien yli 70 onkologian tutkimuksissa [22]. Nämä inhibiittorit kuuluvat kahteen luokkaan, monoklonaalisia vasta-aineita kohdistaminen n solunulkoinen domeeni ja pienimolekyylisiä ATP-kilpailukykyinen tyrosiinikinaasin estäjät, joiden tarkoituksena on estää selektiivisesti IGF1 R yli IR, mutta jolla on aktiivisuutta sekä reseptoreihin.

Huoli siitä, että co-inhibition IR pienten molekyyli IGF1 R estäjät olisi toivottuja aineenvaihdunnan seuraukset ovat johtaneet IGF1 R-selektiivisiä monoklonaalisia vasta-aineita suositaan varten kehittämistä ja käyttöä kliinisissä kokeissa. Kuitenkin, on ollut tunnettua jonkin aikaa, että insuliinin voivat edistää kasvua ihmisen syöpäsolulinjojen [23] – [26] ja että 80% rintasyövistä yli-ilmentävät IR verrattuna normaaliin rintakudokseen [27]. Lisäksi, ekspressio sikiön isoformin IR, IR-A, on kohonnut useissa ihmisen maligniteettien ja, toisin kuin signaalit välittyvät IR-B, joka on pääasiassa metabolinen vaikutus, IR-A: lla on pääasiassa proliferatiivinen vaikutus [ ,,,0],28]. Zhang et al ovat osoittaneet, että downregulation IR inhiboi Rintasyövän metastaasin soluista kateenkorvattomissa hiirimallissa [29], ja viimeaikaiset tutkimukset ovat alkaneet arvioida hyväksi dual inhibition IGF1 R ja IR-malleissa osteosarkooman [30] ja haiman neuroendocrine karsinogeneesissä [31]. Kussakin tapauksessa IR osaltaan solujen eloonjäämistä vaikutus IGF-järjestelmän ja parannettu monivaiheinen syövän etenemisen haiman hermosto-. Nämä tutkimukset viittaavat rooli IR kasvainten synnyssä.

NSCLC osallistuminen IGF järjestelmää tukevat useissa tutkimuksissa. IGF1 R ilmennetään usein [32] – [34], ja korkea IGF-1 ja alhainen IGFBP3 arvot liittyvät suurempi riski ja lisääntynyt vakavuus keuhkosyöpään [35], [36]. IGF1- on mitogeenisiä vaikutuksia joissakin NSCLC solulinjoilla [37], [38], ja fibroblasti johdettu IGF2 edistää kasvua NSCLC-solujen in vivo [39]. Siksi in NSCLC se on perusteltu, että IGF1 R voi olla kannattava terapeuttinen kohde. Faasin II tutkimuksessa kehittyneiden NSCLC, ensilinjan hoito täysin humanisoitu monoklonaalinen IGF1 R vasta-aine figitumumab (CP-751871) lisäsi hoitovaste ja taudin etenemisvapaa aika hyödyksi paklitakselin ja karboplatiinin [40]. Kuitenkin viime aikoina NSCLC faasin tutkimuksessa testaus figitumumab joko kemoterapian tai EGFR estäjän erlotinibin keskeytettiin puutteen vuoksi eloonjäämishyötyä [41]. Koska kyse on kehittyvistä näyttöä rooli IR muissa elimissä, on mahdollista, että tämä puute kliinistä hyötyä figitumumab vuonna NSCLC johtui ainakin osittain luopua esteetöntä signalointi kautta IR.

Tässä tutkimuksessa olemme selvittäneet, onko signalointi kautta IR tukee NSCLC kasvainsoluproliferaation kun IGF1 R estyy. Hyödynsimme neutraloivia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka selektiivisesti sitovat IGF1 R tai IR lisäksi ATP-kilpailukykyinen pienmolekyylisalpaajien että samanaikaisesti estävät molempia reseptoreita. Tämä lähestymistapa mahdollisti myös vertailun tehokkuudet vasta-aineiden ja pienten molekyyli-inhibiittorien kohdistuvat IGF-signaloinnin akselin tuumorin solujen proliferaatiota.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

AZ12253801 (Astra Zeneca, Macclesfield, Cheshire, UK), NVP-ADW742 (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) ja Akti-puoli (Merck, Darmstadt, Saksa) tehtiin DMSO: ssa (lopullinen pitoisuus kokeissa oli 0,5% ( v /v)). αIR3 (Merck Chemicals Ltd., Nottingham) ja IR47-9 (ystävällisesti toimittanut Ken Siddle (University of Cambridge, UK)) valmistettiin PBS: ään. Insuliini (Sigma, Poole, UK), IGF1 (Gro-Pep, Adelaide, Australia) ja IGF2 (R Amersham Biosciences). Kaikki primaaristen vasta-aineiden käytetään tässä havaitsemaan yksi juova on ennustettu molekyylipaino proteiinin vasta-aine on nostatettu. Skannattuja kuvia Immunoblottien rajataan ominaisuus näkyvä bändi.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys määritettiin kaksisuuntaisella parittoman

t

testiä. p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

AZ12253801 Estää Loppupään merkinanto päässä IGF1 R ja IR tasa Potency taas inhiboiva Monoclonal Antibodies (αIR3 ja IR47-9) ovat erityisiä niiden Target Reseptori

tässä tutkimuksessa käytimme estävää monoklonaalista vasta-ainetta αIR3 ja IR47-9, suunnattu IGF1 R [46] ja IR [7] vastaavasti, ja ATP kilpailukykyinen pieni molekyyli estäjä AZ12253801, jolla on inhibitorista aktiivisuutta sekä reseptorien . Alustavat kokeet suoritettiin tehokkuuden arvioimiseksi ja spesifisyys αIR3, IR47-9 ja AZ12253801 että Hcc193 NSCLC solulinjassa. 24 h ymppäämisestä, soluja käsiteltiin αIR3, IR47-9 (0,5-10 ug /ml) tai AZ12253801 (2-100 nM) ja stimuloitiin sitten kasvutekijä. Alhainen pitoisuus (5 nM) kasvutekijä on käytetty, jotta tekijät aktivoituu vain niiden vastaavan reseptorin. Fosforylaatio loppupään seriini /treoniini-kinaasin, Akt: n, on seriini-473 (S473) käytettiin mittana insuliinia ja IGF1-indusoitu signaali aktiivisuutta.

stimulointi joko insuliinin tai IGF-1 aiheutti lisääntynyt fosforylaatio Akt on S473 (kuvio 1A). IGF1 R inhiboiva monoklonaalinen vasta-aine, αIR3, inhiboi IGF-1, mutta ei ole insuliini-välitteistä Akt-fosforylaation. Sitä vastoin IR-inhiboiva monoklonaalinen vasta-aine, IR47-9, inhiboi insuliinin, mutta ei IGF-1,-välitteinen Akt-fosforylaation (kuvio 1 B). Tämä vahvisti, että nämä vasta-aineet estävät vain niiden reseptoreita vasta-ainepitoisuuksia, joita käytetään tässä tutkimuksessa. Hoito αIR3 vähensi ilmentymistason IGF1 R (kuvio 1A, oikeanpuoleinen paneeli), joka on yhdenmukainen aiempien havaintojen MCF7 solulinjassa ([47]; DJEE, EK, JMT julkaisemattomia havaintoja).

Hcc193 soluja käsiteltiin joko αIR3 (A), IR47-9 (B) tai AZ12253801 (C) osoitetussa annoksina 2 tuntia ennen 10 min inkubaation joko 5 nM insuliinia tai 5 nM IGF-1. Fosforylaatio Akt on S473 ja ilmaus IGFRβ ja IRβ määritettiin western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Anti-α-tubuliinin vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Kaikki primaaristen vasta-aineiden käytetään tässä havaitsemaan yksi juova on ennustettu molekyylipaino proteiinin vasta-aine on nostatettu. Skannattuja kuvia Immunoblottien rajataan ominaisuus tämän näkyvästi bändi.

Pre-solujen käsittely AZ tukossa insuliinia ja IGF1 aiheuttama Akt fosfory- annoksesta riippuvaisella tavalla ja yhtä voimakkaasti (kuvio 1 C ). Toisin kuin esikäsittely estävä monoklonaalisia vasta-aineita, AZ12253801 (25 nM ja yli) esti Akt-fosforylaation alle tason, että käsittelemättömissä soluissa (kuvio 1C). Kumpikaan αIR3 tai IR47-9 saavuttanut tämän jopa korkein pitoisuus käytetään (10 ug /ml), tai kun esikäsittely ajan (2 ug /ml), jatkettiin 24 h (kuvio 1A, B ja tietoja ei ole esitetty). Toisin kuin αIR3, AZ12253801 ei vähennä ilmentymistason IGF1 R.

yhdistettyyn esto IGF1 R ja IR-Blocks Cell Growth voimakkaammin kuin inhibitio IGF1 R yksin Hcc193 Solut

tutkia mahdollista osuutta IR tukemisessa kasvainsolujen proliferaatiota, kun IGF1 R on estetty, Hcc193 NSCLC-soluja viljeltiin kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa, kun läsnä on IGF1, IGF2 (pitoisuuksina, jotka samanaikaisesti aktivoida sekä reseptorit) ja insuliinia (3GF, ks Materiaalit ja menetelmät). Vaikutukset leviämisen estäminen IGF1 R ja IR, yksin ja yhdessä, määritettiin. Maksimaalisesti tehokkaat konsentraatiot inhibiittoria valittiin tietojen perusteella kuviossa 1.

Kuvio 2A havainnollistaa leviämisen tietojen Hcc193 solujen kiinnittymisestä riippumaton kulttuuriin. 3GF voimisti leviämisen Hcc193 solujen 1,6-kertaiseksi verrattuna tilanteeseen, pelkällä vehikkelillä. Esto IGF1 R jonka αIR3 tai IR mukaan IR47-9 vähensi lisääntymistä havaittiin läsnäollessa 3GF (3GF lisääntymistä) 22% (

p

0,0001) ja 17% (

p

0,01) vastaavasti. Esto sekä IGF1 R ja IR αIR3 ja IR47-9 johti 48% vähennys 3GF leviämisen, huomattavasti suurempi vaikutus kuin saadaan saarto joko reseptorin yksinään (

p

1 x 10

-5 kussakin tapauksessa). Se havainto, että IR47-9 estänyt proliferaatiota indusoitu 3GF joko yksin tai yhdessä αIR3 viittaa siihen, että insuliinin reseptori on suoraan kykenee edistämään proliferaatiota Hcc193 soluja.

(A) Hcc193 soluja viljeltiin anchorage- riippumaton olosuhteissa 0,1% seerumia läsnä ollessa 3GF (1 nM insuliinia, 50 nM IGF-1, 50 nM IGF-2), yksin ja yhdessä αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml) , αIR3 (2 ug /ml) ja IR47-9 (2 ug /ml), ja AZ12253801 (50 nM), kuten on osoitettu. Sen jälkeen 5 päivää elävät solut arvioitiin fluoresenssi metabolisen vähentämistä tuote Alamar blue. Kukin pylväs esittää keskimääräistä fluoresenssi neljä rinnakkaisten kaivojen ± keskihajonta yhden kokeen. Esitetyt tulokset ovat edustavat 3 itsenäistä koetta. ***,

p

1 x 10

-5; **,

p

0,0001; *,

p

0,01 (voimassa kaikissa toistoja); kaksisuuntainen parittoman

t

testiä. (B) Hcc193 soluja käsiteltiin αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) ja IR47-9 (2 ug /ml), ja AZ12253801 (50 nM) kuten 2 tunnin ajan ennen 10 min inkubaation ajoneuvon tai 3GF. Fosforylaatio Akt on S473 ja ilmaus IGFRβ ja IRβ määritettiin western blottauksella. Anti-α-tubuliinin vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Kaikki primaaristen vasta-aineiden käytetään tässä havaitsemaan yksi juova on ennustettu molekyylipaino proteiinin vasta-aine on nostatettu. Skannattuja kuvia Immunoblottien rajataan ominaisuus tämän näkyvästi bändi.

Samanaikainen saartoon IGF1 R ja IR käyttäen AZ12253801 johti suurempaan lisäkasvun estäminen (75%) kuin saadaan αIR3 ja IR47-9 yhdistelmässä (

p

1 x 10

-5) (kuvio 2A). Tämä voidaan selittää lisääntynyt tehokkuus AZ12253801 estämisessä 3GF-indusoidun Akt-fosforylaation (kuvio 2B). Lisäksi yhdistetty vasta-aineet olivat tehokkaita inhiboimaan Akt-fosforylaation kuin on kunkin vasta-aineella (kuvio 2B). Siten inhibiittorien vaikutus on 3GF aiheuttama Akt-fosforylaation, kun lisätään yksinään tai yhdistelmänä, joka on samansuuntainen niiden vaikutus 3GF-indusoitua proliferaatiota.

Euroopan IGFR IR-Expression suhde voi Veikkaa Riippuvuus Solujen on IR Survival

vieressä tutki suhteellista ilmentymistä IGF1 R ja IR-reseptorien vaikuttanut kykyyn IR47-9 estää kasvainsolujen proliferaatiota tai suhteellisen tehon AZ12253801 ja yhdistetyn neutraloivat vasta-aineet. Tätä varten toisen NSCLC linja, A549 käytettiin, koska se ilmaisee suunnilleen yhtä suuret lukumäärät IR Hcc193 soluissa, mutta huomattavasti enemmän IGF1 R, määritettynä western-blottauksella yhtä suuret määrät lysaattia (kuvio 3A). Densitometri-analyysi osoitti, että Hcc193 solut ovat IR: IGF1 R ilmaus suhde -15-kertainen verrattuna A549-solut.

(A) vertailu ilmaisun IGF1Rβ ja IRβ vuonna Hcc193 ja A549 solulinjoissa määritettiin western-blottauksella käyttämällä 15 ug proteiinia uutetaan kustakin solulinjasta. (B) A549-soluja viljeltiin kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa 0,1% seerumia läsnä ollessa 3GF yksin ja yhdessä αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml ) ja IR47-9 (2 ug /ml), ja AZ12253801 (50 nM), kuten on osoitettu. Sen jälkeen 5 päivää elävät solut arvioitiin fluoresenssi metabolisen vähentämistä tuote Alamar blue. Kukin pylväs esittää keskimääräistä fluoresenssi neljä rinnakkaisten kaivojen ± keskihajonta yhden kokeen. Esitetyt tulokset ovat edustavat 3 itsenäistä koetta. ***,

p

1 x 10

-6; **,

p

0,0001; *,

p

0,05 (voimassa kaikissa toistoja); kaksisuuntainen parittoman

t

testiä. (C) A549-soluja käsiteltiin αIR3 (2 ug /ml), IR47-9 (2 ug /ml), αIR3 (2 ug /ml) ja IR47-9 (2 ug /ml), ja AZ12253801 (50 nM) kuten 2 tunnin ajan ennen 10 min inkubaation ajoneuvon tai 3GF. Fosforylaatio Akt on S473 ja ilmaus IGFRβ ja IRβ määritettiin western blottauksella. Anti-α-tubuliinin vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinimäärän. Skannattuja kuvia Immunoblottien rajataan ominaisuus näkyvä bändi.

A549-soluja viljeltiin olosuhteissa kuvattu Hcc193 (kuva 2). 3GF voimisti leviämisen A549-solut 2-kertaiseksi, joka havaittiin ajoneuvon ohjaus (kuvio 3B). Esto IGF1 R, jonka αIR3 vähentää 3GF-stimuloitu proliferaatio 40% (

p

1 x 10

-6) noin 2-kertainen väheneminen nähdään Hcc193 soluissa. Sen sijaan, esto IR jonka IR47-9 oli vähäinen vaikutus vähentää 3GF proliferaatiota 10% (

p

0,05) ja, toisin kuin Hcc193 solujen läsnäolo IR47-9 ei lisätä vaikutus αIR3 on 3GF lisääntymistä (kuvio 3B). Niinpä A549-soluja IR on paljon tehottomampi tukemaan kiinnittymisestä riippumaton lisääntymistä kuin havaitaan Hcc193 soluihin. Kuitenkin, kuten havaittiin kanssa Hcc193 solujen aste inhibitio A549-soluproliferaation AZ12253801 oli merkittävästi suurempi kuin havaittu, kun läsnä on vasta-aineen yhdistelmän (p 0,0001; kuvio 3B).

vaikutus inhibiittorien A549 kiinnittämisestä riippumaton määritys oli jälleen sopusoinnussa niiden vaikutusta Akt fosforylaation (kuvio 3C); αIR3 esti 3GF aiheuttama Akt-fosforylaation, ei ylimääräisiä vaikutus havaittiin, kun IR47-9 yhdistettiin αIR3, ja AZ12253801 oli tehokkaampi kuin αIR3 (tai yhdistetty αIR3 ja IR47-9). αIR3 alensi ilmaus IGF1Rβ mutta ei IRβ A549-soluja (kuvio 3C), kuten aiemmin on havaittu Hcc193 soluissa (kuvio 1 ja 2).

tehokas inhibitio Cell Proliferation by Small Molecule IR /IGF1 R Inhibitor Rakenteellisesti erilaisia ​​voidakseen AZ12253801

sekä Hcc193 ja A549-solulinjoja AZ12253801 on suurempi estävä vaikutus kiinnittymisestä riippumaton leviämisen kuin yhdistetyt αIR3 ja IR47-9. Sen tutkimiseksi, onko ATP-kompetitiivisia estäjiä IGF1 R /IR tarjota tehokkaampia tilassa inhiboimaan kasvutekijän aiheuttaman solujen lisääntymistä kuin neutraloivien vasta-aineiden vaikutus rakenteellisesti erillisen ATP-kilpailukykyinen pieni molekyyli, IGF1 R /IR-inhibiittori NVP-ADW742 kasvuun Hcc193 ja A549 arvioitiin myös. NVP-ADW742 vähensi annosriippuvaisesti 5 nM IGF-1 ja 5 nM insuliinin stimuloimaa Akt-fosforylaation Hcc193 ja A549-soluja, joilla on maksimaalinen tehokas konsentraatio saavutettiin 1 uM (kuvio 4A).

(A) Hcc193 ja A549-soluja käsiteltiin NVP-ADW742 (0,1-3 pM) 2 tunnin ajan ennen 10 min inkubaation 5 nM insuliinia tai 5 nM IGF-1. Fosforylaatio Akt on S473 määritettiin western blottauksella. Anti-α-tubuliinin vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinimäärän. (B) Hcc193 ja A549-soluja viljeltiin kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa 0,1% seerumia läsnä ollessa 3GF yksin ja yhdessä αIR3 (2 ug /ml) ja IR47-9 (2 ug /ml), AZ12253801 (50 nM ), NVP-ADW742 (1 uM), tai Akti-puoli (10 uM) kuten on osoitettu. Sen jälkeen 5 päivää elävät solut arvioitiin fluoresenssi metabolisen vähentämistä tuote Alamar blue. Kukin pylväs esittää keskimääräistä fluoresenssi neljä rinnakkaisten kaivojen ± keskihajonta yhden kokeen. Esitetyt tulokset ovat edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta. ***,

p

0,001; **, P 0,01 (voimassa kullekin kokeelle); kaksisuuntainen parittoman

t

testiä. (C) Hcc193 ja A549-soluja käsiteltiin αIR3 (2 ug /ml) ja IR47-9 (2 ug /ml) AZ12253801 (50 nM), NVP-ADW742 (1 uM) tai Akti (10 uM) kuten on osoitettu 2 h ennen 10 min inkubaation ajoneuvon tai 3GF. Fosforylaatio Akt on S473 ja ilmaus IGFRβ ja IRβ määritettiin western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Anti-α-tubuliinin vasta-ainetta käytettiin kontrollina proteiinimäärän.

Kuvio 4B havainnollistaa kiinnittymisestä riippumaton leviämisen Hcc193 ja A549-soluissa, kun läsnä on 3GF ja vaikutus αIR3 ja IR47-9, AZ12253801 ja NVP-ADW742 tälle. NVP-ADW742 inhiboi 3GF aiheuttama Hcc193 ja A549-soluproliferaatiota on asteeltaan samanlainen AZ12253801 ja suuremmassa määrin kuin mitä havaitaan yhdistelmä αIR3 ja IR47-9. Tämä näkyi enemmän inhibitioasteeseen Akt fosfory- ATP-kilpailevat inhibiittorit verrattuna αIR3 /IR47-9 (kuvio 4C).

läheinen korrelaatio vaikutuksen AZ12253801, NVP-ADW742, αIR3 ja IR47-9 soluproliferaatioon ja Akt-fosforylaation ehdotti, että Akt voisi vaikuttaa 3GF-stimuloi solujen proliferaatiota. Tutustua tarkemmin käytimme selektiivinen allosteerinen estäjä Akt, Akti-1/2 Hcc193 ja A549-soluja. Akti-puoli oli yhtä tehokas kuin AZ12253801 ja NVP-ADW742 inhiboimaan kiinnittymisestä riippumaton solujen lisääntymistä (kuvio 4B), ja yhtä tehokkaita inhiboimaan Akt-fosforylaation (kuvio 4C). Tämä tulos on yhdenmukainen Akt välittävä kiinnittymisestä riippumaton leviämisen näistä solulinjoista alavirtaan IGF1 R ja IR.

Keskustelu

IGF1-R on vakiintunut rooli kasvainten synnyssä, mutta viimeaikainen epäonnistuminen IGF1-R monoklonaalinen vasta figitumumab NSCLC tutkimuksissa on kyseenalaistanut kohdistaminen tämän reitin yksin johtaa terapeuttisen edun. Kehittyvät viittaavat siihen, että signalointi, jotka liittyvät IR tarjoaa mekanismin, jonka avulla kasvainsolujen vastustavat vaikutukset IGF1-R-inhibition ihmisen osteosarkooma ja rintasyöpä. Tämän mukaisesti, tietomme tukevat mahdollinen rooli IR nopeaan lisääntymiseen NSCLC solulinjojen suurella IR: IGF1 R-suhde. Lisäksi tarjoamme todisteita siitä, että dual saartoon IR ja IGF-1 R käyttäen ATP-kilpailukykyinen pieni molekyyli IR /IGF-1 R-estäjä on parantunut tehokkuus inhiboimaan NSCLC solun jakautumisessa verrattuna saadaan samanaikaisesti estämällä IR ja IGF1-R- valikoiva monoklonaalisia vasta-aineita.

yhdenmukainen vakiintunut asema IGF1- tukemisessa kasvainsoluproliferaation [17], [30], [31], [38], [48], neutraloivat vasta-aine-suunnattu saarto IGF1 R jokaisessa NSCLC testatuissa solulinjoissa johti osittaiseen proliferaation esto (kuviot 2-4). A549-solut olivat herkempiä kuin Hcc193 tässä suhteessa mahdollisesti heijastaa korkeampi ilmentyminen IGF1 R A549 ja tuloksena alhainen IR: IGF1 R lauseke suhde. Valikoivasta estosta IR käyttämällä erityistä vasta-ainetta myös vähensi lisääntymistä kussakin solulinjassa. Vuonna Hcc193 soluja, joilla on suhteellisen korkea IR: IGF1 R lauseke suhde, laajuus tähän vähentymiseen on samanlainen kuin aiheuttama IGF1 R eston, mutta A549-soluja väheneminen lisäkasvun saarto IR oli selvästi pienempi kuin nähnyt upon IGF1 R esto. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiemman raportin osoittaa, että rintasyöpä solulinjassa korkea IR: IGF1 R lauseke suhde (MDAMB231) oli herkempi IR saarto kuin solulinjan, jolla on alhainen IR: IGF1 R lauseke suhde (MCF7) [31]. Suppressio IR ilmentymisen RNA-interferenssi on myös osoitettu inhiboivan solujen lisääntymistä, missä määrin tämä tapahtuu vaihdellen solutyypin ja analyysin luonteesta [29], [30]. IR tukeekin kasvainsoluproliferaation useiden solutyyppien riippumatta IGF1 R, ja olemme täällä ulottaa nämä huomautukset NSCLC soluihin.

Yhdistetty esto IGF1 R ja IR monoklonaalisten vasta-aineiden Hcc193 solulinjassa vähennetään lisääntymistä suuremmassa määrin kuin eston joko reseptorin yksin. Tämä osoittaa, että NSCLC IR on potentiaalia edistää vastustuskykyä IGF1 R esto tukemalla solujen lisääntymisen. Tällainen rooli IR yhteydessä kohdennettujen IGF1 R on osoitettu siirtogeenisen hiiren mallia haiman neuroendocrine syövän synnyn ja ihmisen rintasyövän solujen [31] ja luusarkoomasolulinjoissa [30]. Molemmissa näistä tutkimuksista IGF2, pikemminkin kuin IGF1, määriteltiin kasvutekijän signalointi läpi IR aiheuttaa tämän protumorigenic vaikutus. Tämä voi myös olla kyse NSCLC jossa IGF2 on tunnetusti tukee kasvaimen kasvua [39], [49]. Lisäksi on mahdollista, että insuliini voi itse apua tässä suhteessa, koska se on vakiintunut mitogeeniset ominaisuudet [23] – [26], ja se on mukana, IGF1 ja IGF2, että kasvualustaa olevassa tutkimuksessa. Saarto IR ei voimistaa IGF1 R eston A549-soluja viittaa siihen, että NSCLC tapauksissa, joissa alhainen suhde IR: IGF1 R lauseke olemassa, ja kun nämä solut altistuvat IGF1- lisäksi IGF2 ja insuliini, co-kohdistaminen IR voi olla edullista.

Pieni molekyyli tyrosiinikinaasin inhibiittorit, kuten AZ12253801, NVP-ADW742 ja BMS754807 [50], [51] estävät sekä IGF1 R ja IR, ja siten, on potentiaalia olla tehokas syöpälääkkeiden kuin vasta-aineita IGF1 R. Itse asiassa nykyisessä tutkimuksessa vaikutusta AZ12253801 on Hcc193 soluissa oli yhteneväinen dual IGF1 R ja IR salpauksesta vasta-aineiden laajuudesta proliferaation inhibition oli suurempi kuin nähnyt kun saarto IGF1 R yksin.