Krooninen sairaus

tiivistelmä

esto ubikitiinistä proteasomin järjestelmä (UPS) proteiinin hajoaminen on voimassa syöpälääkkeen strategia ja on johtanut hyväksymiseen bortetsomibi hoitoon useita myelooma. Kuitenkin vaihtoehtoista lähestymistapaa tehostaa hajoamista onkoproteiineja, jotka ovat usein yli-ilmennetään syövissä on vähemmän kehittynyt. Betuliinihappo (BA) on kasviperäinen pieni molekyyli, joka voi lisätä apoptoosia, erityisesti syövän, mutta ei normaaleissa soluissa, mikä tekee siitä houkuttelevan syöpälääkkeen. Tuloksemme eturauhassyövässä ehdotti, että BA esti useita deubiquitinases (Dubs), joka johti kertyminen poly-ubikitinoitu proteiineja, alentuneesta onkoproteiineja, ja lisääntynyt apoptoottista solukuolemaa. Normaalissa fibroblastit kuitenkaan BA ei estänyt DUB toimintaa eivätkä lisääntyi yhteensä poly-ubikitinoitu proteiineja, joka liittyi puute vaikutus solukuolemaan. Vuonna TRAMP siirtogeenisen hiiren mallia eturauhassyövän hoito BA (10 mg /kg) esti primaaristen kasvainten, lisääntynyt apoptoosi laski angiogeneesiä ja proliferaatiota, ja lasketaan androgeenireseptorin ja sykliini D1-proteiinia. BA hoito esti myös DUB toimintaa ja lisätä ubikitinoitu proteiinien TRAMP eturauhassyöpä mutta ei ollut vaikutusta apoptoosiin tai ubikinaa- normaaleissa hiiren kudoksissa. Kaiken tietomme viittaavat siihen, että BA-estoa DUBS ja induktio apoptoottisen solukuoleman, erityisesti eturauhassyövän, mutta ei normaaleissa soluissa ja kudoksissa voivat tarjota tehokkaan ei-toksisen ja kliinisesti valikoiva aine kemoterapiaan.

Johdanto-osan : Reiner T, Parrondo R, de las Pozas A, Palenzuela D, Perez-Stable C (2013) betuliinihappoa valikoivasti Lisäykset proteiinien hajoaminen ja Parantaa Eturauhassyöpä-Specific Apoptosis: mahdollisen tehtävän esto Deubiquitinase Activity. PLoS ONE 8 (2): e56234. doi: 10,1371 /journal.pone.0056234

Toimittaja: Paul J. Galardy, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 11 tammikuu 2013; Julkaistu: 12 helmikuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: Veterans Affairs Merit Review 6996,06 MR https://www.research.va.gov/programs/blrd/merit_review.cfm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nojalla niiden korkea proliferatiivinen kapasiteetti, syöpäsolut usein vastaamaan kertyminen laskostumattoman proteiineja tai proteotoxic stressiä parantamalla ubikitiinistä proteasomin järjestelmä (UPS), jotta se kestäisi apoptoottisen solukuoleman [1]. UPS on merkittävä solun polku, joka hajoaa unfolded proteiinit ja ohjaa ekspressiotasot tiettyjen proteiinien tärkeitä solukierron, lisääntymistä, ja apoptoosin [2]. Proteiinit suunnattu UPS-välitteisen hajoamista lisäämällä useiden ubikitiinipromoottori yksikköä (poly-Ub), mikä helpottaa tunnustamista ja hajoamista UPS monimutkainen. Esto UPS ja lisääntyminen myöhemmin useita proteiineja on kelvollinen syöpälääkkeen strategia, joka on johtanut kehitystä bortetsomibin, FDA: n hyväksymä lääke hoitoon useita myelooma [3]. Kliinisesti kuitenkin bortetsomibi yksin ei näytä merkittävää aktiivisuutta kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) ja siihen liittyy usein annosta rajoittavia sivuvaikutuksia, kuten neuropatia [4].

Vaihtoehtoinen mutta vähemmän kehittyneiden terapeuttinen strategia on hyödyntää UPS tehostamalla sen toimintaa ja spesifisyyden lisäämiseksi hajoamisen lisääntymistä ja pro-selviytymisen proteiineja, jotka ovat usein yli-ilmennetään syövissä eli onkoproteiineja. Toteuttamiskelpoinen ja kliinisesti merkittävä tapa on pyrkiä tunnistaa pieniä molekyylejä, jotka voivat aktivoida UPS välittämää hajoaminen proteiineja, kuten androgeenireseptoria (AR) eturauhassyövässä (PC). Betuliinihappo (BA) on kasviperäinen pieni molekyyli, joka voi lisätä apoptoosia syöpäsoluissa, mikä tekee siitä houkuttelevan syövän vastaisen aineen [5]. Tällä hetkellä BA on yksi vain kaksi pienten molekyylien ilmoitetaan suoraan aktivoida kymotrypsiinin kaltainen UPS aktiviteetti

in vitro

[6], [7]. Toinen raportti osoittaa, että BA estää niiden kasvun LNCaP PC solujen aktivoimiseksi selektiivisesti UPS-riippuvainen hajoamista AR sekä spesifisyys proteiini (Sp) transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät VEGF ilmaisun [8]. Kuitenkin mekanismeja, joilla BA spesifisesti aktivoi UPS-riippuvainen hajoamista AR ja muut tekijät ovat tuntemattomia.

stimuloinnin lisäksi UPS toimintaa, toinen mahdollinen tapa BA voi lisätä hajoamisen spesifisten proteiinien on estämällä deubiquitinases ( Dubs). Palautuva ubikinaa- on ratkaiseva mekanismi sääntelyn UPS ja ylläpitämässä useita solukierron ja pro-eloonjäämisen proteiinit [9] – [11]. Viimeaikaiset havainnot osoittavat, että Dubs pelata kriittinen sääntelytehtävässä useimmissa väyliä, joihin Ub [9] – [11]. Noin sata ihmisen Dubs jakaa viiteen luokkaan, paras tunnettu ollessa ubikitiinispesifinen proteaasit (USP) ja ubikitiinipromoottori C-terminaali hydrolaaseihin (UCH). DUB-välitteisen poisto poly-Ub keskeisistä proteiineista tekee niistä vähemmän alttiita hajoamiselle UPS ja lisää siten niiden tasoa. Itse asiassa, useita DUBS yliekspressoituvat syövän ja pidetään onkogeenien [9] – [11].

Koska DUBS on rooli syövän syntyyn, viimeaikainen huomio on keskittynyt tunnistaminen pienmolekyylisalpaajilla Dubs. Ajatuksena on, että estämällä Dubs nostavat poly-Ub on onkoproteiineja ja lisätä niiden tunnustamista ja hajoamista UPS polku, mikä lisää apoptosis ja parannetun lääkkeen tehokkuus [12]. Useita pienimolekyylisiä estäjiä DUB aktiivisuus on tunnistettu lisätä kertymistä poly-Ub-proteiineja ja lisätä apoptoosia syöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, että DUB-inhibiittorit ovat lupaavia syöpälääkkeet [13] – [18]. Tässä raportissa, osoitimme, että kyky BA lisätä hajoamista useita leviämisen ja pro-eloonjäämisen proteiinien PC soluissa korreloi eston Dubs. Toisin kuin PC-solujen, BA ei ollut vaikutusta DUB aktiivisuus ja proteiinin hajoamista, normaaleissa soluissa, mikä johtaa toksisuuteen. Tuloksemme ehdotti, että PC-erityinen vaikutus, jonka BA hoidon johtui sen kyky estää Dubs syövän, mutta ei ei-syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksyntää Institutional animal Care ja Käytä komitea (protokolla # 6996,06 MR) Miami Veterans Affairs Medical Center (Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory animal Care akkreditoitu) ja mukaisesti suoritettu jossa NIH ohjeet hoito- ja koe-eläinten käytön.

reagenssit

BA soluviljelmäkokeita ostettiin AG Scientific; digitoniinin ja polyvinyylipyrrolidoni (PVP) yhtiöltä Sigma-Aldrich; MG132, doksorubisiini ja Coomassie sininen EMD Biosciences; Netyylimaleimidin (NEM) Sigma; ja trypaanisininen (0,4%) Invitrogen.

hakurahtiliikennettä hiirten BA

TRAMP siirtogeenisiä hiiriä (Jackson Laboratories) tunnistettiin hännän koepala ja PCR käyttäen Wizard SV Genominen DNA puhdistus (Promega ) ja DNA-alukkeita PB-1 eteenpäin 5′-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 ’ja Tag käänteinen 5′- CTCCTTT CAAGACCTAGAAGGTCCA-3’. BA saatiin Ze-Qi Xu at Advanced Life Sciences ja valmistettu aikaisemmin kuvatulla [19]. Hiiret, joilla kouraantuntuva eturauhasen kasvaimia jaettiin satunnaisesti koe- ja kontrolliryhmissä ja injektoidaan i.p. 11 kertaa 14 päivää BA (5 [BA5] tai 10 [BA10] mg /kg kehon paino; n = 10 kukin annos) tai ajoneuvon ohjaus (n = 12). Päivänä 15, ensisijainen eturauhasen kasvaimet poistettiin ja niiden painot määritettiin. Ulompi osa ensisijainen eturauhasen kasvain fiksoitiin formaliiniin immunohistokemiaa. TRAMP males ilman palpoitavissa eturauhasen kasvaimia käsiteltiin samalla tavalla BA10 tai ajoneuvon ohjaus (n = 3, jokainen ryhmä), eturauhanen, perna, kateenkorva poistettu, ja analysoitiin immunohistokemiallisesti.

immunohistokemia

immuunivärjäytyminen apoptoottinen (pilkkoutuu kaspaasi-3, Cell Signaling Technology; ApopTag Peroksidaasisysteemit In situ Apoptosis Detection, Millipore) ja lisääntyvissä (Ki67, NCL-Ki67p, Leica Microsystems; PCNA [PC10], Santa Cruz Biotechnology) soluihin suoritettiin käyttämällä kanin polyklonaalista, hiiren monoklonaalisella ja biotinyloitu vuohen anti-kani /hiiri-vasta-aineita (Vector Laboratories), kuten aiemmin on kuvattu [20]. Verisuonitiheyttä määritettiin immunovärjäyksellä CD-31 käyttäen vuohen polyklonaalista vasta-ainetta (M20; Santa Cruz Biotechnology) ja biotinyloitu kaniinin anti-vuohi sekundaarinen vasta-aine tai CD-34 käyttämällä rotan polyklonaalista (RAM34, BD Biosciences) ja vuohen anti -rat sekundäärinen vasta-aine. Määrä katkaistun kaspaasi-3 tai Ki67-positiivisia soluja ja CD-31-positiiviset suonet määritettiin BA10 ja ajoneuvon hallintalaitteita (n = 5 kussakin ryhmässä), kuten aiemmin on kuvattu [20]. Vastaavasti, AR (N-20), sykliini D1 (DCS-6), ja ubikitiini (P4D1) Santa Cruz Biotechnology immunovärjättiin; määrä AR-positiivisten solujen määritettiin BA10 ja ajoneuvon hallinnan eturauhasen kasvaimia.

Solulinjat

Ihmisen PC-solulinjojen LNCaP, DU145, ja PC3 [21] saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja käytettiin 6 kuukauden kuluessa elvytys alkuperäisen kulttuureissa. Kaikki PC-soluja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jossa 5% naudan sikiön seerumia (Hyclone), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug /ml amfoterisiini (Invitrogen). PrEC normaalin ihmisen eturauhasen epiteelisolut saatiin Lonza ja ylläpidetään PrEGM media. RWPE-1 normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (saatu Dr. Bal Lokeshwar, University of Miami, ja alun perin ATCC) ylläpidettiin Keratinosyyttien-SFM media (Invitrogen). Ihmisen esinahan BJ fibroblastisoluja (passage 24) ja sikiön keuhkojen fibroblastit (IMR-90, MRC-5) saatiin tri Priyamvada Rai (University of Miami) ja alun perin saatu ATCC: ltä (CRL-2522, CCL-186, ja CCL -171). BJ, IMR-90, ja MRC-5-soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa (Invitrogen), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

BA-solujen lisääntymisen määrityksessä

CellTiter vesiliuosta solujen lisääntymisen kolorimetrisellä menetelmällä Promega käytettiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden PC-solujen elatusaineessa, joka sisälsi BA (2,5, 5, 7,5 ja 10 uM) tai kontrolli (0,5% DMSO). Solujen elinkelpoisuus normalisoitu vastaan ​​ajoneuvon ohjaus ja data ilmaistiin prosentteina kontrollista kolmesta itsenäisestä kokeesta tehdään kolmena kappaleena.

Drug hoitoja

PC-soluja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi BA (10 uM ), MG132 (1 uM), doketakseli (1 nM) tai DMSO ohjaus vaihtelevia aikoja (24-72 h). BJ, IMR-90, MRC-5, PrEC, ja RWPE-1-soluja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi BA, doksorubisiini (1 uM), tai DMSO-kontrollin vaihtelevia aikoja (24-72 h). Kaikissa kokeissa, kelluva ja trypsinisoitiin kiinnittyneet solut yhdistettiin lisäanalyysiä.

Western blot-analyysi

valmistaminen kokonaisproteiinia lysaatit ja western blot-analyysi tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: lohkaistiin PARP (9541), CoxIV (4844), AKT (9272), ja surviviini (71G4B7) Cell Signaling Technology; sytokromi c (7H8.2C12), Smac (612245), Bcl-x (610211) ja Rb (544144) BD Biosciences; AIF (E-1), aktiini (C-11), sykliini A (H432), sykliini B1 (GNS1), sykliini D1 (DCS-6), cdk1 (17), Cdk2 (D-12), Cdk4 (M2) , p21 (C-19), p27 (C-19), E2F1 (KH95), AR (N-20), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (N-19), HA (Y-11 ), Ub (P4D1), Rb (C-15), ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen Santa Cruz Biotechnology. Meidän parempana oli käyttää Coomassie sinivärjäyksen kokonaisproteiinia lastaussatamina valvontaa, koska lääkehoitojen usein vaikuttavat tasot tyypillinen taloudenhoito proteiineja, kuten aktiini tai tubuliinin.

trypaanisiniekskluusiolla määritys

Käsitellyt ja ohjaus PC, BJ, IRM-90, MRC-5, PrEC tai RWPE-1-solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, laimennettiin 1:01 0,4% trypaanisinistä, kuollut sininen ja elävät ei-sinisiä soluja välittömästi laskettiin käyttämällä hemasytometriä, ja% kuolleita sinisiä soluja määrittää ainakin kolmen erillisen kokeen kahtena kappaleena.

anneksiini FITC /propidiumjodidia (PI) virtaussytometria

Käsitellyt ja ohjaus-PC solut suspensoitiin uudelleen sitomispuskuriin minkä jälkeen lisättiin anneksiini V-FITC ja PI (anneksiini V Kit sc-4252 AK, Santa Cruz Biotechnology). 20 minuutin kuluttua., Solut analysoitiin virtaussytometrillä käyttämällä Coulter XL virtaussytometrillä ja prosenttiosuus anneksiini + solujen määritetään käyttäen WinMDI version 2.8 kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta tehdään kolmena kappaleena.

mitokondrio-proteiinin vapautumisen määrityksellä

Käsitellyt ja ohjaus-PC-solut suspendoitiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi 100-200 uM digitoniinia, 20 mM Hepes, pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCI, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 250 mM sakkaroosi, ja proteaasinestäjät (Roche) 50 ul /1 x 10

6 solua. 5 min kuluttua. jäällä, solut sentrifugoitiin 5 minuutin ajan ja supernatanttia käytettiin Western blot -analyysiä. Digitonin on pesuainetta, joka edullisesti permeabilizes solukalvon verrattuna mitokondrion kalvon [23].

Virtaussytometrinen solusyklin analyysi

propidium- /hypotoninen sitraattia menetelmää käytettiin tutkittaessa solusyklin jakautumisen BA käsitelty PC soluihin [24]. Kuusi 8 näytteet analysoitiin ainakin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta ja DNA jakelu histogrammeja tuotettu kuten aiemmin on kuvattu [22], [25].

Ohimenevä transfektio AR, sykliini D1 villityypin ja T286A mutantti

CMV /AR-ekspressioplasmidin transfektoitiin PC3-soluja 24 h käyttämällä FuGene-HD (Roche), jota seurasi BA (24, 48, 72 h) tai kontrolli (24 h) hoitoon ja AR-proteiini analysoitiin western-blotilla. Sykliini D1 ekspressioplasmidit pBabe /sykliini D1 villityypin (9050) ja pcDNA /sykliini D1 T286A mutantti (11182, ei voi hajota UPS, [26]) saatiin AddGene. Nämä plasmidit transfektoitiin LNCaP 24 h, mitä seurasi BA tai kontrollikäsittely 24 tuntia. Proteiini tasot transfektoitujen sykliini D1-proteiini määritettiin Western blot -analyysillä käyttäen anti-HA ja sykliini D1.

Proteasome määrityksessä

Proteasome-Glo Kymotrypsiinin kaltaiset Cell-Based määritys (Promega) oli käytetään määrittämään vaikutuksen BA proteasomiaktiivisuus PC soluissa. Soluja käsiteltiin BA, BA + MG132, tai ohjaus 8, 24, 48, ja 72 h, solujen määrä määritetään ja proteasomiaktiivisuus mitattiin luminometrillä (TD-20/20 Turner Designs). Valoyksikköä normalisoitiin solujen määrä (kontrollikäsittely = 1) ja 6-8 näytteet analysoitiin ainakin neljästä itsenäisestä kokeesta.

DUB määrityksessä

DUB-Glo proteaasimäärityksessä (Promega) käytettiin määrittämään vaikutuksen BA DUB toimintaa PC, BJ, IRM-90, ja RWPE-1-soluissa. Soluja käsiteltiin BA, 1 nM doketakselia tai valvonta 8, 24, 48, ja 72 h, hajotettiin DUB-puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% NP-40, 5 mM MgCl

2 , 250 mM sakkaroosia, 1 mM DTT, 1 mM PMSF), sentrifugoitiin 10 min., ja 10 ug proteiinia käytetään määrittämään DUB toimintaa. Ohjaus lysaatit esi-inkuboida 4 mM NEM, tunnettu DUB estäjä, 1 h ennen kuin lisättiin substraatti. Valoyksikköä (kontrollikäsittely = 1) 6-8 näytteistä määritettiin vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. DUB aktiivisuus mitattiin myös ajoneuvon ohjaus (n = 4) ja BA10 (n = 5) TRAMP eturauhasen kasvaimia.

DUB merkintöjä määrityksessä

Solulysaatit valmistettiin kuten edellä on kuvattu DUB määritystä , 20 ug proteiinia inkuboitiin 500 ng HA-Ub vinyylisulfoni (VS), joka on palautumaton spesifinen inhibiittori useimpien DUBS (Boston Biochem) 1,5 tuntia huoneenlämpötilassa, ja näytteet analysoitiin western blot käyttäen anti-HA-vasta-havaitsemaan DUB merkintöjä.

tilastollinen

Statistical eroja lääkkeellä käsiteltyihin ja valvonta määritettiin kaksisuuntaisella Studentin

t

-testi (varianssi on erisuuruinen), jossa

P

0,05 pidettiin merkittävinä.

tulokset

BA estää niiden kasvun TRAMP eturauhasen kasvaimia lisäämällä apoptoosin ja vähentämällä angiogeneesiä ja leviämisen

aiemmin käytetty BA (Fig. 1) kun aine, joka voi parantaa herkkyyttä PC solulinjojen solukuolemaan yhdistettynä antimitoottiset aineet lisäämällä NF-KB aktiivisuutta, mikä johtuu osittain tehostettua hajoaminen IκBα [27], [28]. Arvioidaan

in vivo

terapeuttinen teho BA, käytimme TRAMP siirtogeenisen hiirimallissa PC [29], [30]. TRAMP-hiiret sisältävät prostataspesifisen probasiinipromoottorin liittyy SV40 T-antigeenin onkogeeni, joka johtaa kehittämiseen aggressiivinen metastaattisen PC. Tuloksemme osoittivat, että BA (5 ja 10 mg /kg) vähensi merkittävästi lopulliset painot primaaristen eturauhas- kasvaimien verrattuna vehikkelikontrolliin kasvaimia (Fig. 2A). Ei ollut eroja lopullisessa painon BA käsiteltyjen ja kontrollihiirten (tuloksia ei ole esitetty). Immunohistokemia (IHC) katkaistun (aktiivinen) kaspaasi-3, markkeri apoptoottisten solujen, osoitti merkittävää kasvua BA10 verrattuna vehikkelikontrolliin kasvaimia (Fig. 2B ja täydentävä Fig. S1A). IHC of CD31, merkkiaine verisuonia, ja Ki67, markkeri lisääntyvien solujen, havaittiin merkittävä lasku BA10 verrattuna vehikkelikontrolliin kasvaimia. Lisävahvistusta käyttämällä TUNEL apoptoosin, CD34 ja angiogeneesin, ja PCNA lisääntymisen esitetään täydennyskuvio. S1B. Nämä tulokset osoittivat, että BA aiheuttaman apoptoosin ja estivät angiogeneesiä ja leviämisen TRAMP eturauhaskasvaimissa.

(A) painot ensisijainen eturauhasen kasvaimia olivat merkitsevästi vähemmän BA (5, 10 mg /kg) verrattuna ajoneuvoon ohjaus [C] käsiteltiin TRAMP hiirillä (*,

P

0,03; **,

P

0,002). (B) BA10-hoito lisäsi pilkottiin kaspaasi-3 + -solujen ja laski CD31 ja Ki67 + -solujen verrattuna kontrolliin eturauhasen kasvaimia. (C) edustaja immuunivärjäykseen sykliini D1 ja AR (x 200) osoittivat vähemmän proteiinia BA10 vertailuryhmän eturauhasen kasvaimia (PT). AR proteiinin pitoisuudet olivat samankaltainen normaaleilla prostates (Pr) hiirille on BA tai ohjaus (x 200). (D) laski merkittävästi lukumäärä AR + solujen BA10 vertailuryhmän eturauhasen kasvaimia (*,

P

4 x 10

-7).

BA pienenee tasot AR TRAMP eturauhasen kasvaimissa, mutta ei normaalissa eturauhasessa

sitten pyrittiin määrittämään, onko BA voi vähentää ekspressiotasot AR ja sykliini D1 proteiinien TRAMP eturauhasen kasvaimia. IHC ja laskenta AR + solut osoittivat merkittävää vähenemistä BA10 verrattuna vehikkelikontrolliin kasvaimia (kuviot. 2C, D). IHC sykliini D1 osoitti myös merkittävä lasku BA10 verrattuna vehikkelikontrolliin kasvaimia, korreloi lasku Ki67 ja PCNA leviämisen markkereita (kuviot. 2B, C). Me seuraavaksi pyrittiin määrittämään, jos BA-välitteinen väheneminen AR tapahtui myös ei-syöpä eturauhasen kudosta. Toisin kuin tulokset eturauhasen kasvaimia, tasot AR normaalissa eturauhasessa olivat samanlaisia ​​BA10 verrattuna vehikkelikontrolliin, mikä viittaa siihen, että BA-välitteinen hajoaminen AR tapahtui vain tuumorisoluissa (Fig. 2C).

BA estää proliferaatiota ja lisää apoptoosia PC solujen

Vastatakseen mekanismeihin BA ainoana lääkkeenä PC, käytimme androgeeniriippuvainen LNCaP ja kastraatio kestävä DU145 ja PC3-soluissa. Käyttäen kolmen päivän soluproleferaatiomäärityksessä, olemme huomanneet, että 10 uM BA inhiboivat kaikki PC-solujen, mukaan lukien enemmän kemoterapiaa kestäviä DU145 ja PC3-solut (Fig. 3A). Kaikki seuraavat kokeet tehtiin käyttäen 10 uM BA. BA anti-PC solujen vaikutus johtui lisääntyneestä apoptoottisen solukuoleman, määritettynä trypaanisiniekskluusiolla määritys, western blot-analyysi pilkkoa-PARP (substraatti aktivoitu caspases) ja anneksiini V-FITC /PI virtaussytometria (kuviot. 3B , C). BA on raportoitu kohdistaa mitokondriot aloittaa sisäisen reaktiotien apoptoosin lisäämällä vapautumista mitokondrioiden proteiineja, kuten sytokromi c, joka aktivoi kaspaasi kaskadin [5]. Tuloksemme PC3 solut osoittivat, että BA lisääntynyt vapautuminen sytokromi c, Smac (lohkot estäjä apoptoosin [IAP] perhe; [31]), ja apoptoosia indusoivan tekijän (AIF; translokoituu tumaan lisäämiseksi DNA pirstoutumista; [32] ) päässä mitokondrioissa (Fig. 3d). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin BA käsiteltiin LNCaP ja DU145-soluja (täydennyskuvio. S2). Siten BA-välitteisen vapautumisen pro-apoptoottisten proteiinien mitokondrion samaan aikaan havaitun apoptoosin lisääntymisen PC-soluissa.

(A) Soluproliferaatiomääritys osoittivat, että kasvavien pitoisuuksien BA (2,5-10 uM) esti LNCaP, DU145, ja PC3-soluissa. (B) trypaanisiniekskluusiolla testi osoitti, että 10 uM BA (B) määrä yhteensä solukuoleman LNCaP (48 h), DU145 (72 h), ja PC3 (72 h) verrattuna kontrolliin (C) solut. Western blot-analyysi osoitti, että BA lisääntynyt lohkaista (cl) -PARP tasoa PC-soluissa. Coomassie blue stain kokonaisproteiinia kuormituksen valvonta. (C) virtaussytometrinen analyysi osoitti korkeamman anneksiini-FITC värjätään BA verrattuna ohjata käsitelty PC-soluissa. (D) Mitokondrioiden proteiinin vapautumisen määrityksellä ja Western blot osoitti kohonneeseen sytokromi c, Smac, ja AIF PC3-soluissa käsitelty BA vertailuryhmän soluihin. Cox IV proteiini oli negatiivinen osoittaen ei mitokondrioiden saastuminen ja aktiini oli positiivinen kontrolli. + C oli lysaatin valmistetaan käyttäen standardimenetelmää täydellisen proteiineja.

BA kasvattaa G1 /S solusyklin pysähtymisen PC soluissa

Tutkiakseen solusyklin vaikutuksia BA PC-soluissa käytimme virtaussytometria-analyysi. Hoito PC solujen BA 24 tuntia johti huomattavasti G1 ja vähentynyt S-vaiheen solusyklin, mikä osoittaa suurta lohkon G1 /S (täydennyskuvio. S3A). Sen jälkeen enää aikoina BA hoidon, oli merkittävä kasvu Saharan G1 solukierron vaiheessa kaikissa PC soluja, jotka oli heijastaa suurempaa DNA hajoaminen, joka tapahtui apoptoottiset solut (täydennyskuvio. S3B). Vuonna DU145 ja PC3 mutta ei LNCaP oli merkittävä kasvu G2 /M 72 tunnin jälkeen BA hoitoa. Nämä tulokset osoittivat, että BA indusoi merkittäviä häiriöitä normaalin solusyklin PC soluja.

BA lisää hajoamista useiden solukierron ja pro-eloonjäämisen proteiinien PC soluissa

Koska BA on raportoitu lisätä hajoamista useita proteiineja, olemme tutkineet vaikutusta BA solusyklin ja pro-eloonjäämisen proteiinien PC-soluissa western blot -analyysillä. Tuloksemme osoittivat, että proteiini tasot useiden solukierron proteiinit, kuten sykliinit A, B1, D1; Cdks1, 2, 4; E2F1, ja Rb väheni jälkeen BA hoidon alkaen klo 24 h LNCaP ja PC3-solut (Fig. 4A). LNCaP-solut, CDK-inhibiittori p21 on laskenut sen jälkeen, kun BA hoitoa, mutta PC3, p21 proteiinin lisääntyminen 24 tunnin ja palasi perustasoille 48 ja 72 tuntia. Sen sijaan Cdk estäjä p27 kasvoi jälkeen BA hoidon, mikä viittaa rooli G1 /S solusyklin lohko. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin DU145-soluissa (täydennyskuvio. S4).

(A) Western blot -analyysi osoitti, että BA hoito alensi proteiinin tasot Sykliinien CDK: t, E2F1, ja Rb LNCaP ja PC3-soluja. Sen sijaan, BA hoito lisäsi proteiinin tasot Cdk estäjän p27. (B) BA käsittely laski pro-selviytymisen proteiineja AR, AKT surviviiniperäiset, ja Mcl-1, joka korreloi lisääntynyt cl-PARP LNCaP ja PC3. AR PC3 oli peräisin väliaikaisen transfektion.

BA hoito nostivat halkaistut-PARP ajan PC-soluissa, mikä osoittaa kohonneet aktivoitua caspases ja apoptoosin (Fig. 4B; täydennyskuvio. S4) . Mielenkiintoista, BA hoito dramaattisesti vähentynyt proteiini tasot AR LNCaP ja AR transfektoiduissa PC3 /DU145 soluja. Lisäksi BA hoito vähensi tasot pro-selviytymisen proteiineja AKT surviviiniperäiset, ja Mcl-1. Sen sijaan, BA hoito ei vähentämään anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-x L (Fig. 4B; Täydentävä kuvio. S4). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että BA lisäsi valikoivasti hajoamista useita leviämisen ja pro-eloonjäämisen proteiineja.

BA välittämä proteiinien hajoaminen riippuu UPS

Aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että BA-välitteinen lisäys UPS toiminta on syy parantaa proteiinien hajoaminen [6], [8]. Tuloksemme vahvistivat, että LNCaP-soluissa, UPS -estäjä MG132 esti BA välittämää väheneminen AR, AKT, ja Mcl-1-proteiineja. Lisäksi, MG132 antagonisoi BA-välitteisen kasvu apoptoottisen solukuoleman, määritettynä tryptan syrjäytyminen ja western blot-analyysi pilkkoa-PARP (Fig. 5A). Sykliini D1-mutantti, joka ei voi hajottaa UPS oli resistentti BA-välitteisen hajoamista edelleen viittaa siihen, rooli UPS (Fig. 5B). Kuitenkin meidän proteasomin määritys Tulokset osoittivat, että BA ei ollut suoraa vaikutusta UPS aktiivisuus LNCaP-soluissa (kuvio. 5C). Toisin kuin LNCaP, BA hoitoon DU145 ja PC3-soluissa johti huomattavasti UPS aktiivisuutta (täydennyskuvio. S5). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että BA vaihtelevasti tehostettu UPS aktiivisuutta joissakin (DU145 ja PC3), mutta eivät kaikki (LNCaP) PC-soluissa.

(A) trypaanisiniekskluusiolla testi osoitti, että 1 gM MG132 antagonized solukuoleman BA käsiteltyjen LNCaP-soluja (24 h *,

P

0,02). Western blot-analyysi osoitti, että MG132 esti BA välittämää lisäystä cl-PARP ja lasku AR, AKT, ja Mcl-1-proteiineja. (B) Western blot-analyysi osoitti, että transfektoidut sykliini D1 T286A mutantti mutta ei sykliini D1 villityyppistä proteiinia oli resistentti BA välittämää hajoamisen (24 h) LNCaP-soluissa. (C) Proteasome aktiivisuuden määritys osoitti, ei ole merkittävää vaikutusta LNCaP-soluissa, joita käsiteltiin BA 8, 24, ja 48 h. Lisäämällä MG132 (MG) BA johti aktiivisuuden vähenemistä.

BA estää useita Dubs mikä lisää koko poly-Ub proteiinien PC soluissa

LNCaP, mahdollinen tapa BA voi lisätä selektiivinen hajoaminen proteiinien ilman suoraan aktivoimalla UPS on estämällä Dubs. Tässä tapauksessa esto Dubs pitäisi johtaa kertymiseen koko poly-Ub proteiineja ja lisätä niiden hajoamista UPS. Meidän western blot tulokset osoittivat, että BA hoito LNCaP-solujen määrä nousi yhteensä poly-Ub proteiineja, samanlainen MG132 hoitoon (Fig. 6A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös DU145 ja PC3-soluja (ei esitetty). Kasvusta huolimatta poly-Ub, ei ole selvää, miksi BA hoito ei ole vaikutusta UPS aktiivisuus LNCaP-soluissa (kuvio. 5C). Vuonna TRAMP eturauhasen kasvaimia, BA hoito lisäsi myös Ub proteiineja määritettynä IHC ja laski DUB aktiivisuus (täydennyskuvio. S6). Meidän DUB määrityksen tulokset osoittivat, että BA hoito LNCaP pienentää DUB aktiivisuus alkaen 24 tuntia. Sen sijaan hoidossa LNCaP 1 nM doketakselin annos että lisääntynyt apoptoottista solukuolemaa [28], oli vähemmän vaikutusta DUB aktiivisuutta (Fig. 6B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin BA hoitoon DU145 ja PC3 soluja, lukuun ottamatta, että BA esti DUB toiminta alkaa myöhemmin (48 h) ja doketakselin oli voimakkaampi DUB estävä vaikutus verrattuna LNCaP (täydennyskuvio. S7). Kaiken kyky 10 uM BA estävän DUB aktiivisuutta korreloi soluproliferaation inhibointi (ei esitetty).

(A) Western blot-analyysi osoitti, että BA hoito LNCaP-soluja (24 h) lisäämällä yhteensä poly- ub proteiineja samanlainen MG132 käsiteltyjen solujen. (B) DUB määritys osoitti, että BA hoito LNCaP-solujen merkittävästi vähentynyt DUB aktiivisuus 24 ja 48 h suhteessa kontrolliin käsiteltyjen solujen (= 1) (*,

P

5 x 10

-5 ). Doketakseli (Doc, 1 nM) vähensi DUB aktiivisuus paljon vähemmän kuin verrattuna BA (*,

P

6 x 10

-5). Ohjaus lysaatit esikäsitelty 4 mM NEM 1 h johti vähentynyt DUB toimintaa. (C) DUB leimaamisen HA-UbVS ja western blot-analyysi anti-HA osoitti, että BA (10 uM), mutta ei Doc (1 nM) esti useiden Dubs LNCaP-soluissa 24 ja 48 tuntia. Proteiinivyöhykkeet 1-6 väheni toimintaa BA käsittely taas bändi 7 ei. Ohjaus lysaatit lisäämättä HA-UbVS tai pre-inkuboitiin NEM 1 h olivat valvontaa. Molekyylipainomarkkerit (kDa) on osoitettu vasemmalla. Coomassie blue tahra kokonaisproteiinia asettaisit valvontaa.

Edelleen onko BA voi estää Dubs LNCaP-soluissa, käytimme DUB merkintöjä määrityksessä HA-UbVS, joka on voimakas, peruuttamaton, ja spesifinen estäjä useimpien Dubs [33]. Koska HA-UbVS vain sitoutuu aktiiviseen Dubs, HA tag mahdollistaa merkintöjä aktiivisen Dubs läsnä LNCaP jälkeen BA käsittely ja analysointi Western blot. Tuloksemme osoittivat, että BA hoito LNCaP-solujen vähentynyt useita DUBS 24 ja 48 h kontrollisoluihin verrattuna (Kuva. 6C). Sen sijaan hoidossa LNCaP dosetakseliannoksella ollut vaikutusta DUB toimintaa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin DU145 ja PC3-solut (Täydentävä kuviot. S8A, B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että BA esti useita Dubs, mikä lisää poly-Ub proteiineja, jotka todennäköisesti nopeasti hajottaa UPS reitin.

BA ei ole vaikutusta DUB toimintaa ei-syöpäsoluja

BA on raportoitu olevan enemmän selektiivisen aineen syöpää vastaan ​​verrattuna normaaleihin soluihin, mutta mekanismit, miten tämä tapahtuu, ei ole määritelty [34], [35]. Koska meidän tulokset TRAMP hiirillä osoittivat, että BA lääke ei laskenut AR proteiinin pitoisuudet ei-syöpä eturauhasen, pyrimme määrittää vaikutus BA ei-syöpäsolujen hyödyntäen BJ ihmisen esinahan fibroblastisolujen. BJ solut käsiteltiin BA 72 h ei kasvanut solukuolemaa tai lohkaista-PARP verrattuna hallita käsiteltyjä soluja (Fig. 7A). Sen sijaan hoidossa BJ solujen 1 uM doksorubisiinia (DNA vahingoittamatta lääke) aiheutti huomattavia solukuolemaan ja halkaistut-PARP. Tuloksemme osoittivat lisäksi, että BA hoito ei tason alentamiseksi AR tai lisätä koko poly-Ub proteiinien BJ soluissa kuin LNCaP (kuviot. 7B, C). Lopuksi osoitimme, että BA ei ollut vaikutusta DUB toimintaa BJ soluissa, toisin kuin havaittiin PC-soluissa (kuvio. 7D ja täydennyskuvio. S8C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä ihmisen IMR-90 ja MRC-5 sikiön keuhkojen fibroblastisoluja (täydennyskuvio. S9).

(A) trypaanisiniekskluusiolla testi osoitti, että BA ei kasvanut solukuoleman BJ fibroblasteissa jälkeen 72 h. Sen sijaan hoidossa BJ solujen doksorubisiinin (Dox) lisääntynyt solukuolema. Western blot-analyysi osoitti, että Dox muttei BA lisääntynyt cl-PARP. (B) Western blot osoitti, että BA ei ollut vaikutusta AR proteiinin pitoisuudet BJ soluissa. Drs.