Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

raportoi äskettäin, että koolontuumorisolut stimuloida makrofagien vapauttamaan IL-1β, joka puolestaan ​​inaktivoi GSK3 # ja lisää Wnt signalointi koolonkarsinoomasoluissa, tuottaa itse- monistetaan silmukka, joka edistää kasvainsolujen kasvua.

Principal Ensimmäisen

Tässä kuvataan, että makrofagit suojaavat HCT116 ja HKE-3 paksusuolen syövän soluja TRAIL-indusoitua apoptoosia. Inaktivointi IL-1β neutraloimalla IL-1β vasta-ainetta tai hiljentäminen IL-1β makrofageissa esti niiden kykyä torjua TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Näin ollen IL-1β oli riittävä inhiboimaan TRAIL-indusoitua apoptoosia. TRAIL aiheuttama romahduksen mitokondrion kalvon potentiaali (Δψ) ja kaspaasien aktivaatio estettiin antamalla makrofagien tai yhdistelmä-IL-1β. Farmakologinen esto IL-1β vapautuminen makrofagien D-vitamiinin

3, voimakas chemopreventive aine paksusuolisyövän, palautti TRAILin kyvyn indusoida kasvainsolujen viljeltyjen makrofageihin. Makrofagien ja IL-1β epäonnistui estämään TRAIL-indusoitua apoptoosia in HCT116 soluissa, jotka ilmentävät dnIκB, dnAKT tai dnTCF4 vahvistaa, että ne vastustavat TRAIL-indusoidun solukuoleman induktion kautta Wnt signaloinnin kasvainsoluissa. Osoitimme, että makrofagit ja IL-1β vakiintunut Snail tuumorisoluissa in NF-KB /Wnt riippuvaisella tavalla ja että Snail puutteellinen kasvainsoluja ei suojattu TRAIL: n indusoiman apoptoosin makrofagien tai IL-1β, mikä osoittaa keskeinen rooli Snail vastus syöpäsolujen trail.

merkitys

Olemme tunnistaneet positiivista takaisinkytkentäsilmukka välillä kasvaimen solut ja makrofagit, joka etenee kasvua ja edistää selviytymistä koolonkarsinoomasoluissa: tuumorisoluja stimuloida makrofageja erittämään IL-1β, mikä puolestaan ​​edistää Wnt signalointia ja stabiloi Snail kasvainsoluissa, resistenssin TRAIL. D-vitamiini

3 pysähdyksiä tämän vahvistava silmukka häiritsemällä vapauttaa IL-1β makrofageista. Siten D-vitamiinin

3 herkistää kasvainsolut Trail aiheuttamaa apoptoosia, mikä viittaa siihen, että terapeuttinen teho TRAIL voitaisiin täydennetty tämän helposti saatavilla chemopreventive agentti.

Citation: Kaler P, Galea V, Augenlicht L , Klampfer L (2010) Kasvaimen Associated Makrofageilla Suojaa koolonkarsinoomasoluissa peräisin TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta IL-1β- Dependent stabilointi Snail Kasvainsoluissa. PLoS ONE 5 (7): e11700. doi: 10,1371 /journal.pone.0011700

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 27 Kesäkuu 2010; Julkaistu: 22 heinäkuu 2010

Copyright: © 2010 Kaler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CA 111361 (LK), U54 CA 100926 (LA) ja P30-13330 National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tulehdus myötävaikuttaa taudin etenemiseen luomalla olosuhteet, jotka tukevat kasvaimen solujen kasvua ja selviytymistä sekä lisäämään metastasoituneeseen potentiaalia. Todellakin, krooninen tulehdus on osoitettu altistavan kehittämistä erilaisia ​​kasvaimia, silmiinpistävä esimerkki on tulehduksellinen suolistosairaus, joka liittyy kohonnut riski paksusuolen syövän [1]. Lisäksi vaikuttaa siltä, ​​että paksusuolen syöpiä, jotka eivät kehity komplikaationa tulehduksellinen suolistosairaus ohjaavat myös tulehdusta, koska on osoitettu, että säännöllinen käyttö tulehduskipulääkkeiden vähentää kuolleisuutta satunnaista paksusuolensyöpä ja tulokset regressioon adenoomia FAP potilailla , jotka perivät mutaatio APC-geenin [2]. Liukoinen tekijöitä, jotka etenevät tulehdusta voidaan tuottaa itse kasvainsoluihin, tai useammin, solujen rekrytoidaan kasvaimen mikroympäristössä, kuten kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM). Koordinoitu välinen signalointi kasvainsolujen ja ei-pahanlaatuisten solujen kasvaimen mikroympäristössä tarvitaan etenemistä kasvaimia, ja signalointireittejä, jotka säätelevät välinen ylikuuluminen koolontuumorisolut ja strooman, kuten NF-KB: n ja STAT3, ovat nousseet tärkeitä kohteita chemopreventive ja kemoterapeuttiset aineet [3], [4]. Samoin TNFa antagonistit ovat vaiheessa I /II kliinisessä tutkimuksessa ja niiden on osoitettu olevan hyvin siedetty potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia [5], [6].

Olemme hiljattain perustettu, että makrofagit edistävät Wnt signalointia paksusuolen syöpä solut ja parantaa niiden leviämiseen, ja osoitti, että makrofagit aikaansaavat protumorigenic toimintaa pääasiassa vapauttamaan IL-1β [7], [8]. Tässä osoitamme, että makrofagi johdettuja tekijöitä, lisäksi kasvun tukemiseen kasvainsolujen, myös edistää niiden selviytymistä käsiteltäessä TNF liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL), joka on voimakas aloitteentekijä ulkoinen tie apoptoosin.

TRAIL käynnistää apoptoosin sitoutumalla kaksi kuolemareseptorien, DR4 ja DR5, kun taas sitoutuminen syötti reseptoreihin, joista puuttuu kuolemandomeeniksi, kuten DCR1, DcR2 ja osteoprotegeriini, estää sen pro-apoptoottista aktiivisuutta [9]. Sitoutuminen TRAIL kuolemaan asiakkuutta reseptorit DR4 /DR5 johtaa rekrytointiin Fas -associated kuolindomeeni (FADD) reseptoreihin, joka käynnistää sitoutuminen prokaspaasi-8 ja prokaspaasi-9, ja muodostumista kuoleman asiakkuutta signalointikompleksiin (DISC) [9]. Tyypin I solut, kaspaasi-8 aktivaatio on riittävä aktivoimaan efektori kaspaasien 3, 6 ja 7, kun taas tyypin II solujen apoptoottisen kaskadin vaatii integroinnin mitokondrioiden reitin välittämä kaspaasi-8: lla indusoituvan lohkaisu Bid.

Kasvainsolut ovat merkittävästi herkempiä TRAIL-indusoitua apoptoosia kuin normaalit solut, perustamisesta TRAIL ja DR4 tai DR5 agonistinen vasta-aineiden houkutteleva syöpälääkkeet. Todellakin, jyrkässä ristiriidassa muiden jäsenten TNF-hiirten ja kädellisten yhdistelmä-TRAIL indusoi merkittävää taantumista kasvainten ilman systeemistä toksisuutta [10], [11]. Äskettäin yhdistelmä TRAIL kaikki trans-retinyyliasetaattia (RAC) on osoitettu indusoivan apoptoosin selektiivisesti adenomatoottisen polypoosin (APC) puutteellinen epiteelisolujen vahingoittamatta normaali cellsαα ja hoitoon APC

Min

hiiret TRAILin kanssa ja rAC indusoi apoptoosin suoliston polyyppien ja pitkäaikainen eläinten eloonjääminen [12].

on kuitenkin merkittäviä eroja TRAIL herkkyys joukossa ihmisen syöpäsoluja. Kestävyys TRAIL on osoitettu kehittyä solujen mutantti DR5 [13] tai yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä puutteellinen kasvaimia Bax mutaatioita [14]. Sen sijaan, c-Myc edistää reagointikykyä TRAIL inhiboimalla ilmentymistä FLIP, estäjä TRAIL signaloinnin [15], ja vastustamalla TRAIL-indusoidun ilmentymisen lisääntyminen MCL-1 ja cIAP2, kaksi proteiinia, joilla luontainen kyky estää apoptoosia [ ,,,0],16]. Lisäksi, strooman solujen ja liukoisia tekijöitä esiintyy kasvaimen mikroympäristössä on osoitettu olevan merkittävä vaikutus herkkyyttä kasvainsolujen terapeuttiset aineet [17], [18].

TRAIL hiirissä lisääntynyttä alttiutta että karsinogeeniksi aiheuttama kasvaimien syntyyn ja ovat lisänneet metastaattista potentiaalia [19], [20], mikä osoittaa, että TRAIL kiinnostavuus kasvaimia estävä aktiivisuus, ja ehdottaa tärkeä rooli endogeenisen TRAIL kasvaimen valvontaa. Itse asiassa, kirjoittajat osoittivat, että TRAIL on, ainakin osittain, joka vastaa NK-soluvälitteistä, IFNy riippuvainen, kasvainten poistamista.

Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että TRAIL: n indusoiman apoptoosin paksusuolen syövän solujen estyy makrofagi johdettu IL-1β, ja osoitti, että makrofagit ja rekombinantti IL-1β vastapainoksi TRAIL: n indusoiman apoptoosin aktivoimalla Wnt signalointia ja vakauttamiseen Snail kasvainsoluissa. Lopuksi esitämme tietojen mukaan ”normalisointi” kasvain microenvironment D-vitamiinin

3, joka on voimakas chemopreventive agentti, palauttaa herkkyys paksusuolensyöpä solujen TRAIL, mikä viittaa siihen, että terapeuttinen tehokkuus TRAIL voidaan huomattavasti parantaa agentit jotka estävät välinen ylikuuluminen kasvainsolujen ja kasvaimen microenvironment.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja yhdessä viljelemisen kokeita

HCT116 ja HKE-3 peräsuolen sinoomasolulinjoja , jotka eroavat toisistaan ​​vain läsnäolo mutantti k-Ras-alleeli [21], ja SW480-soluja viljeltiin MEM, kun taas 293T-soluja viljeltiin DMEM: ssä. Ihmisen monosyyttisen, THP1, viljeltiin RPMI. Normaali ihmisen monosyyteissä, 90% CD14 ja CD11 c positiivisia ja alle 1% anti T solureseptoripositiivisissa, ostettiin

Astarte Biologics

(Redmond, WA). Kasvainsolut ja monosyytit /makrofagit olivat yhdessä viljelty erotettu Transwell-irto-polykarbonaattimembraanille 0,4 uM huokoskoko, jotka estävät suoran solu-solu-kontakti, mutta voidaan vaihtaa liukoisen tekijät (Corning Incorporated, Lowell, MA).

klonogeenisten määritystä, HCT116 ja HKE-3-soluja siirrostettiin tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä yksinään tai yhdessä THP1 makrofagien tai periferaalisen veren monosyyttejä 7 päivää. Kasvainsoluja viljeltiin THP1 monosyyttien suoraan (1600 kuoppaa kohti 6 kuoppalevyllä), koska THP1 solut eivät kiinnitä ja muoto pesäkkeitä. Optimaalinen suhde kasvainsolujen ja makrofagien aiemmin vahvistettu [7], [8]. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 6% glutaraldehydiä ja 0,5% kristalliviolettia ja laskettiin käyttäen Yhteensä Lab 1.1 ohjelmisto (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, USA).

apoptoosimäärityksessä

Soluja käsiteltiin rekombinantti TRAIL (50 ng /ml, jota määritetään oli optimaalinen pitoisuus) yksinään tai läsnä makrofagien, IL-1β (5 ng /ml) tai TNFa (10 ng /ml) 7 tuntia. Solut suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin (0,1% Triton X-100, 0,1% natriumsitraatti) ja värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) 4 tunnin ajan 4 ° C: ssa, kuten on kuvattu [22]. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla, ja solusyklin jakautuminen ja laajuus apoptoosin (solujen kanssa subG1 DNA-pitoisuus) analysoitiin

Modfit

ohjelmisto. Mitokondrioiden kalvojännite määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä fluoresoivaa väriainetta JC-1 (

Invitrogen

). Solut värjättiin 1 uM JC1 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, pestiin PBS: llä ja analysoitiin fluoresenssilla FL2-kanavalla. Soluja käsiteltiin trail -7 tuntia ja kerättiin arviointia perustuu morfologisiin kriteereihin. Kuitenkin, kuten PI-värjäys voi aliarvioida määrää apoptoosin [23], olemme vahvistaneet apoptoottisten luonne solujen biokemiallisten analyysi solulysaateista. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen paritonta t-testiä, jossa arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Transient transfektion ja reportterigeenimäärityksessä

HCT116 ja HKE-3-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa ylhäältä FLASH tai TOP-FOP lusiferaasireportteri plasmideja käyttäen kalsiumfosfaatti menetelmällä. Transfektiotehokkuuden normalisoitiin kotransfektion pTK-Renilla ja lusiferaasiaktiivisuus määritetään myyjän protokollan (Dual Luciferase reportterimääritys, Promega, Madison, WI). Dominantti negatiivinen IκBα ilmennettiin koodaavan plasmidin IκBα kanssa seriinit 32 ja 36 on mutatoitu alaniiniksi, joka antaa resistenssin ärsyke indusoimaa hajoamista [24]. Ilmentävien plasmidien konstitutiivisesti aktiivinen AKT, (HA-mdelta (4-129) PH-AKT), ja hallitseva negatiivinen AKT (HA-AKT-K179M) toimitti Richard Roth [25], [26]. dnTCF4 on kuvattu aiemmin [27].

Makrofagit transfektoitiin 20 nM ja ei-spesifisen siRNA (NSP) tai siRNA: ita, jotka ovat spesifisiä VDR, IL-1β tai STAT1 (Dharmacon, Lafayette, CO) käyttäen Lipofec- tamin’ia LTX (Invitrogen , Carlsbad, CA). Tehokkuus hiljentäminen seurattiin immunoblottauksella (STAT1 ja VDR), tai ELISA (IL-1β), kuten on raportoitu [7], [8].

Immunofluoresenssikoe

subsellulaariseen havaitseminen β-kateniinin immunofluoresenssilla, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Soluja inkuboitiin anti-β-kateniinin-vasta-aine (1:100) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja johdetun anti-kani-vasta-aine konjugoitu FITC: llä 45 minuuttia 37 ° C: ssa. Kuvat otettiin kanssa SPOT CCD-kamera ja analysoitiin SPOT ohjelmisto.

Western Blot

Western blotit suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä. Membraanit blokattiin 5% maitoa TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä, ja niitä inkuboitiin vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä kaspaasin 8 (Abcam), kaspaasi 9, PARP, Snail (Cell Signaling Technology), pGSK3β (Millipore, Billerica, MA), yhteensä β kateniinin (BD Biosciences, San Jose, CA), ja β-aktiini (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin kemiluminesenssin (Amersham ECLTM western blotting detektioreagenssipakkaus, Piscataway, NJ).

Tulokset

makrofagit ja IL-1β suojata paksusuolen syövän soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin

Olemme osoittaneet, että makrofagit indusoivat useita prosurvival signalointireiteissä paksusuolen syöpäsoluissa, mukaan lukien NF-KB: n, AKT ja Wnt signalointia [7], [8], mikä viittaa siihen, että läsnä makrofaagien voivat vaikuttaa vaste kasvainsolujen terapeuttisia aineita. HCT116 paksusuolen syövän solut ovat erittäin herkkiä TRAIL-indusoidun apoptoosin [16]. Näin ollen, TRAIL estivät merkittävästi klonogeenisten kasvua HCT116 ja HKE-3-solut (Fig. 1A ja B), solulinjat, jotka eroavat toisistaan ​​vain läsnäolo KRAS [21]. Ei ollut toistettavissa eroa reagointikykyä HCT116-ja HKE-3 solujen TRAIL (Fig. 1 ja 2), jotka osoittavat, että läsnäolo KRAS ei säännellä reagointikykyä solujen TRAIL. Sen määrittämiseksi, onko makrofagit muuta herkkyyttä kasvainsolujen TRAIL, käsittelimme HCT116 ja HKE-3-solujen TRAIL puuttuessa tai läsnä ollessa THP1 makrofageissa. Huomattavaa on, läsnäolo THP1 makrofagien tai hoito IL-1β, sytokiini on tuotettu keraviljelmien kasvainsolujen ja makrofagit [7], palautti klonogeenisten kasvua TRAIL-käsiteltyjen koolonsyöpäsoluja (Fig. 1).

a ja B: HCT116 ja HKE-3-soluja siirrostettiin tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyllä puuttuessa tai läsnä makrofaagien (1600 /kuoppa) tai IL-1β, ja käsiteltiin TRAIL varten 4 tuntia. Tulokset on esitetty B edustavat keskiarvoa kaksi erillistä koetta, jokainen suoritettiin kahtena kappaleena.

makrofagit eivät ilmentymisen inhiboimiseksi DR4 tai DR5 tai moduloida tasot decoy-reseptorien DcR1 tai DcR2 in HCT116 /HKE-3-soluja (kuvio S1), mikä viittaa siihen, että ne eivät moduloida reagointikykyä Trail säätelyn kautta TRAIL-reseptorien.

Seuraavaksi osoitti, että makrofagit ja IL-1β inhiboi TRAIL-indusoitua apoptoosia HCT116 ja Hke- 3-solut (Fig. 2A). THP1 makrofagit ja IL-1β esty TRAIL-indusoitua romahtaminen mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) (Fig. 2B) ja esti TRAIL-indusoitua kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 (Fig. 2C). Ihmisen monosyyttisolulinjassa THP-1 oli peräisin perifeerisen veren potilaan akuutti monosyyttileukemia ja THP1-soluissa on ominaisuuksia, ihmisen monosyyteistä peräisin makrofagien [28]. Nämä solut on useita ominaisuuksia, kasvaimeen liittyvien makrofagien (TAM), mukaan lukien alentunut NF-KB: n, puuttuminen typpioksidin tuotantoa vasteena LPS /IFNy (ei esitetty) ja suuren konstitutiivinen STAT1 signalointi [7], [8]. Kuitenkin, jotta varmistetaan, että saadut tulokset käyttämällä THP1-solut ovat biologisesti merkityksellisiä, olemme osoittaneet, että normaali perifeerisen veren monosyyteistä, esiasteita kasvaimeen liittyvien makrofagien, suojattu paneeli paksusuolisyövän solulinjoja TRAIL-indusoitua apoptoosia (Fig. 2D). Kuten THP1 makrofagit, normaali perifeerisen veren monosyyteistä palautti MMP ja estää kaspaasi 8 ja pilkkominen PARP TRAIL-kasvaimen soluja (tietoja ei ole esitetty, kuviossa S2), joka on yhdenmukainen sen kanssa, että paksusuolen syövän soluja indusoivan IL- 1β vapautuminen ääreisverenkierron monosyyteistä [7].

V: HCT116 (keskiarvo 5 itsenäisestä kokeesta) ja HKE-3-soluissa (keskiarvo 4 itsenäistä koetta) käsiteltiin TRAIL puuttuessa tai läsnä makrofaagien tai IL-1β (5 ng /ml), kuten on osoitettu, ja missä määrin apoptoosi määritettiin 7 tunnin jälkeen. B: mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) määritettiin JC1 värjäys 5 tuntia käsittelyn jälkeen. C: kaspaasi 8 ja kaspaasi-9 määritettiin koolonkarsinoomasoluissa käsiteltiin TRAIL (50 ng /ml) mainituissa olosuhteissa. D: perävaunu herkkien syöpäsolujen solulinjoja käsiteltiin TRAIL puuttuessa tai läsnä ihmisen perifeerisen veren monosyyteistä (Mo) ja laajuus apoptoosi määritettiin 7 tuntia käsittelyn jälkeen. Esitetyt tulokset edustavat keskimäärin 2 tai 3 erillisen kokeen välillä.

Oheislaitteet verimonosyyteissä esti TRAIL: n indusoiman apoptoosin myös 293T-soluissa (kuvio. 2D), jotka osoittavat, että makrofagi johdetut tekijät ovat yleisiä ja voimakkaita estäjiä TRAIL-indusoidun solukuoleman.

Makrofagit suojata TRAIL-indusoitua apoptoosia IL-1β

osoitti, että IL-1β on riittävä inhiboimaan TRAIL-indusoitua apoptoosia (Fig. 2). Sen määrittämiseksi, onko IL-1β tarvitaan makrofagi-välitteisen suojelemiseksi kasvainsolujen TRAIL-indusoitua apoptoosia, ensin vaiennetaan IL-1β in THP1 makrofageissa. Nämä kokeet paljastivat, että IL-1β puutteellisia makrofagit eivät suojele kasvainsolujen TRAIL-indusoitua apoptoosia (Fig. 3A ja 3B). Yhdenmukaisesti näiden tietojen, neutralointi IL-1β IL-1β spesifistä vasta-ainetta, tai hiljentämisen STAT1, transkriptiotekijä, joka osoitimme tarvitaan vapauttamaan IL-1β makrofageista [7] esti myös anti-apoptoottisen aktiivisuuden makrofagit (Fig. 3A ja 3B). Kuten odotettua, neutraloivat IL-1β-vasta-aine inhiboi prosurvival IL-1β, mikä osoittaa spesifisyyden vasta-ainetta. Yhdessä nämä tiedot huomioon, että kasvaimeen liittyvät makrofagit suojaavat syöpäsolujen TRAIL-indusoitua apoptoosia in IL-1β riippuvaisella tavalla.

A ja B: HCT116-soluja viljeltiin THP1 makrofagien vaiennetaan IL-1β tai STAT1 ilmaisu ja käsiteltiin TRAILin esitetyllä. IL-1β neutraloitiin anti-IL-1β spesifistä vasta-ainetta. Kuvat on otettu (A) ja määrää apoptoosin (B) määritettiin 7 tunnin jälkeen. Data esitetään B edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen. C ja D: n tutkimukset Gyorffy

et al

([29], C) ja Khambata-Fordin

et al

([30], D) on kartoitettu Oncomine ja osoittavat, että solujen (C) ja ensisijainen paksusuolen syövät (D), jossa korkeampi IL-1βdisplay vastustuskykyä terapeuttisia aineita, kuten vinblastiini, doksorubisiini ja setuksimabi (CTX).

Voit selvittää, onko kyky IL -1β häiritä hoidon aiheuttamaa apoptoosia on rajoitettu TRAIL, me tutkituista Oncomine (www.oncomine.org), joka on kokoonpano, ihmisen kasvaimen microarray tutkimuksia. Analyysi 30-solulinjoissa Gyorffy

et al

[29] paljasti, että korkeat IL-1β kasvainsoluissa linjat vahvasti korreloi vastustuskykyä solujen vinblastiinin ja doksorubisiinin (Fig. 3C). Analyysi 70 metastasoituneen paksusuolen kasvaimissa [30] osoitti, että paksusuolen kasvaimia, jotka satama KRAS on korkeampi IL-1β kuin kasvaimista WT Kras (Fig. 3d, vasen paneeli). Olipa IL-1β tuotetaan stroomasolut tai tuumorisolut itse ei voida päätellä, mutta analyysi tämän tietokannan paljasti, että korkeampi IL-1β kasvaimissa korreloi vastustuskykyä setuksimabin [30] (Fig. 3d, oikea paneeli). Yhteenvetona, nämä tiedot huomioon, että tasot IL-1β ovat koholla osajoukko ihmisen paksusuolen kasvaimia, ja että IL-1β moduloi vaste kasvainsolujen erilaisia ​​terapeuttisia aineita sekä

in vitro

ja

in vivo

.

farmakologinen esto IL-1β stimulaation Vitamin D

3 estää prosurvival aktiivisuutta makrofagien

viime aikoina osoittaneet, että ylikuulumisen välillä kasvain solut ja makrofagit häiritsevät D-vitamiinin

3, tärkeä chemopreventive aine peräsuolen syövän. D-vitamiini

3 estivät kyvyn kasvainsolujen stimuloida IL-1β vapautumista makrofageista [7], ja sen jälkeen, D-vitamiini

3 käsiteltiin makrofaageissa ei onnistunut indusoimaan Wnt-signalointi kasvainsoluissa [7]. Nämä tiedot osoittivat, että D-vitamiinin

3 voidaan myös säädellä TRAIL indusoi apoptoosia. HCT116-soluja viljeltiin yksinään tai läsnä makrofagien, ja käsiteltiin TRAIL puuttuessa tai läsnä ollessa D-vitamiinin

3. D-vitamiini

3 ei vaikuttanut TRAIL-indusoitua apoptoosia HCT116 tai HKE-3-soluissa (tietoja ei ole esitetty), joka on sopusoinnussa reagoimattomuus näiden solujen D-vitamiinin

3 [31]. Olemme kuitenkin osoittaneet, että makrofaagien kykyä suojata paksusuolen syövän soluja TRAIL-indusoidun apoptoosin estää D-vitamiinin

3 (Fig. 4A). Lisäämättä eksogeenistä IL-1β esti kyky D-vitamiinin

3 säädellä TRAIL: n indusoiman apoptoosin, joka vahvistaa, että D-vitamiini

3 palauttaa herkkyyttä kasvainsolujen Trail inhiboimalla vapautuminen IL-1β makrofageista, eikä vaikuttamalla signalointia IL-1β. Hiljentäminen VDR mukaan VDR erityisiä siRNA makrofageissa ei vaikuttanut niiden kyvystä estää TRAILin aiheuttama apoptoosin kasvainsoluissa, mutta D-vitamiinin

3 eivät palauttaneet TRAIL indusoi apoptoosia syöpäsolujen viljellään kanssa VDR puutteellinen makrofagien (Fig. 4A) . Nämä tiedot osoittivat, että D-vitamiini

3 vaikuttaa crosstalk välillä kasvainsolujen ja makrofagien kohdentamalla makrofagien eikä kasvainsoluja, ja että näin ollen se vaatii ilmaus VDR makrofagien, vastaa meidän julkaistujen tietojen [7].

V: n määrä apoptoosi määritettiin HCT116-soluissa käsitelty TRAIL alla ilmoitettu olosuhteissa. Virhepalkit olivat peräisin 2 itsenäisestä kokeesta. B: vaikutus D-vitamiinin

3 TRAIL aiheuttama kaspaasien aktivaatio ja pilkkominen PARP ja β-kateniinin määritettiin immunoblottauksella.

biokemiallinen analyysi vahvisti, että vaikka makrofagit esti perävaunu indusoiman kaspaasi 8 ja kaspaasi-9 ja lohkaisu PARP ja β-kateniinin, D-vitamiinia

3 edistää TRAIL-välitteisen apoptoottisten kaskadin tuumorisoluissa, jotka kasvatettiin läsnä WT, mutta ei VDR puutteellinen makrofagit (Fig. 4B). D-vitamiinin

3 toimii estäjänä IL1-β julkaisu, sen aktiivisuus esti eksogeeniset IL1B ja riippui ilmaus VDR makrofagien (Fig. 4A, Fig. 4B) eikä kasvainsoluja (data ei ole esitetty).

D-vitamiini

3 palautti myös herkkyys TRAIL paksusuolen syövän soluja, jotka viljeltiin, kun läsnä oli perifeerisen veren monosyyteissä. Se parantaa kaspaasi 8 ja myöhemmin pilkkominen PARP ja β-kateniinin HCT116, että hankittu resistenssi TRAIL läsnäolon takia perifeerisen veren monosyyteistä (kuva S2).

Nämä tiedot viittaavat siihen, että terapeuttinen teho TRAIL voitaisiin suuresti parantaa D-vitamiinin

3 syöpiä, jotka ovat soluttautuneet makrofagit.

Wnt signalointia tarvitaan prosurvival aktiivisuuden makrofagien

Olemme hiljattain osoittaneet, että makrofagien ja IL-1β indusoivat Wnt-signalointi koolonkarsinoomasoluissa aktivoimalla NF-KB-riippuvaista AKT signalointi [8], polkuja, jotka on osoitettu suojaavan kasvainsolujen apoptoosin. Voit selvittää, makrofagit ja IL-1β estävät TRAIL: n indusoiman apoptoosin aktivoitumisen kautta näiden pro-selviytymisen signalointireittien, me ilmaistu HCT116-soluissa dnIκB (estäjä NF-KB signalointi), dnAKT (estäjä AKT signalointi) ja dnTCF4 ( estäjä Wnt signalointia). NF-KB: n tai AKT eivät vaikuta TRAIL-indusoitua apoptoosia. Kuitenkin solut, jotka on transfektoitu dnTCF4 toistettavasti osoitti lievästi alennettu määrä TRAIL: n indusoiman apoptoosin (erot eivät olleet tilastollinen merkitsevyys), joka voi olla sopusoinnussa vaatimus Wnt-reitin optimaalinen TRAIL-indusoidun apoptoosin [32] (Fig. 5A) . Kuitenkin kriittisen pisteen oli se, että toisin kuin transfektoitu tyhjällä plasmidilla, makrofagit ja IL-1β ei suojaavat soluja, joilla on heikentynyt NF-KB, AKT tai Wnt signalointia TRAIL: n indusoiman apoptoosin (Kuva. 5A). Olemme vahvisti, että makrofagit ja IL-1β ei torjua TRAIL-indusoitua kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 ja sen jälkeen lohkaisu PARP soluja, jotka ilmentävät joko dnIκB, dnAKT tai dnTCF4 (Fig. 5B). Erityisen kiinnostavia, makrofagit ja IL-1β esti TRAIL-indusoitua pilkkominen β-kateniinin, mutta vain solujen ehjät NF-KB /AKT /Wnt signalointia (Fig. 5B).

A ja B: HCT116 ilmentävät dnIκB, dnAKT tai dnTCF4 käsiteltiin TRAIL alla esitettyjen tilojen määrä ja apoptoosi määritettiin propidiumjodidivärjäys. V: Tiedot edustavat keskiarvoa 5 riippumattomassa kokeessa. B: laajuus: n vapautumisen ja pilkkominen PARP ja β-kateniinin määritettiin solulysaateista immunoblottauksella. C: paikallistaminen β-kateniinin määritettiin immunofluoresenssilla HCT116-soluissa käsitelty TRAIL puuttuessa tai läsnä ollessa IL-1β tai TNFa.

katkaisu β-kateniinin välitti kaspaaseja, voisimme estää sen käsittelyä ZVAD, yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä (kuva S3). Lohkaista β-kateniinin on osoitettu olevan alentunut transkriptionaalista aktiivisuutta [33]. Osoitimme, että TRAIL estää TCF4 /β-kateniinin transkriptionaalisen aktiivisuuden ja että makrofagit ja IL-1β voi osittain palauttaa β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta TRAIL-käsitellyissä soluissa (kuva S3).

Samanlaisia ​​julkaistujen raporttien [34] olemme havainneet, että huolimatta siitä, että HCT116-solut kantavat mutantti β-kateniinin alleelin, suurin osa β-kateniinin on lokalisoitu kalvot HCT116-soluissa. Yhdenmukainen pilkkominen β-kateniinin TRAIL, kalvo lokalisaatio β-kateniinin oli vähentynyt selkeästi vuonna TRAIL käsitellyissä soluissa (Kuva. 5C). Sekä IL-1β ja TNFa palauttaa kalvomainen lokalisaatio β-kateniinin HCT116-solujen TRAIL-käsitellyissä soluissa (Fig. 5c), mukaisesti prosurvival aktiivisuutta.

Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että kasvaimeen liittyvät makrofagit (TAM) suojaavat syöpäsolujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta niiden kyky vakauttaa β-kateniinin ja edistää Wnt signalointia koolonkarsinoomasoluissa.

makrofagit, TNFa ja IL-1β vakauttaa Snail in NF-KB ja AKT /WNT riippuvaisella tavalla

Vaikka makrofagien ja IL-1β suojattu kasvainsolujen TRAIL-indusoitua apoptoosia, ne eivät säännellä tasot bcl-2-perheen jäsenten tuumorisoluissa, kuten Bcl-x tai Mcl1 tai muuttaa ekspressio cIAPs, joiden on osoitettu moduloivan vastetta solujen TRAIL-indusoidun apoptoosin [16] (tuloksia ei ole esitetty). Olemme kuitenkin osoitti, että tasot Snail-proteiinin lisääntynyt HCT116 soluissa, joita käsiteltiin IL-1β tai HCT116-soluja viljeltiin makrofagien (Fig. 6A). TNFa, toinen makrofaagiperäinen johdettu tekijä, joka voi aiheuttaa Wnt signalointia kasvainsoluissa [7], [35], myös kohonnut tasot Snail kasvainsoluissa (Fig. 6A). Olemme osoittaneet, että makrofagien IL-1β ja TNFa kohonnut Snail kautta NF-KB, AKT ja Wnt signalointia, koska ne eivät olleet korottaa Snail soluissa, jotka ilmentävät dnIκB, dnAKT tai dnTCF4 (Fig. 6A). Tasot Snail-mRNA: n HCT116 tai HKE-3-soluja ei lisääntynyt makrofagien (ei esitetty), mikä viittaa siihen, että makrofagi-johdettuja tekijöitä vakauttamiseksi Snail-proteiinin kasvainsoluissa. Induktio c-jun IL-1β ja TNFa tarvitaan myös NF-KB: n, yhdenmukaisia ​​julkaistujen tietojen kanssa (Fig. 6A). Olemme osoittaneet, että TNFa ja IL-1β myös onnistunut indusoimaan c-jun soluissa, jotka ilmentävät dnTCF4, mikä vahvistaa, että on tärkeää Wnt signalointia biologista aktiivisuutta Näiden sytokiinien ja vuorovaikutusta tuumorisolujen makrofageihin.

: makrofagien IL-1β ja TNFa vakauttaa Snail on NF-KB /AKT /Wnt riippuvaisella tavalla. HCT116-solut transfektoitiin dnIκB, dnAKT tai dnTCF4 ja käsiteltiin IL-1β tai TNFa, tai viljeltiin THP1 makrofagien kuten on osoitettu. Tasot Snail ja c-jun määritettiin immunoblottauksella. B: tasot Snail ja pGSK3β määritettiin immunoblottauksella in HKE-3-soluja, joita oli käsitelty IL-1β, TNFa tai olivat viljeltiin yhdessä makrofagien poissa tai läsnä ollessa, LY 294002: ssa 24 tuntia. C: HCT116 ja HKE-3-soluja käsiteltiin TRAIL puuttuessa tai läsnä ollessa IL-1β ja LY294002, kuten on osoitettu. Koe suoritettiin kolme kertaa.

GSK3p on merkittävä kinaasi, joka fosforyloi Snail ja indusoi sen hajoamistuotteet [36], [37]. Koska me raportoitu, että makrofagit ja IL-1β inaktivoida GSK3p kasvainsoluissa [7], [8], me seuraavaksi tutkittava, onko makrofagit /IL-1β vakauttaa Snail estämällä GSK3p. HCT116 ja HKE-3-soluja käsiteltiin LY294002, PI3K-inhibiittori – ja siten aktivaattori GSK3p (phoshorylation GSK3p on seriini 9 inhiboi sen aktiivisuutta). Kuten on esitetty kuviossa. 6B, solujen käsittely LY294002 todellakin esti makrofagit /IL-1β /TNFa-välitteisen inaktivaation GSK3p, ja estää täysin stabilointi Snail makrofagien TNFa: n ja IL-1β. Tämä tulos osoittaa, että inhibitio GSK3p säätelee vakautta Snailin HCT116-solut ja vahvasti siihen, että makrofagit, TNFa ja IL-1β vakauttaa Snail kautta niiden kyky estää GSK3p. Todellakin, farmakologinen esto GSK3p mukaan LiCI: tai GSK3p spesifinen estäjä, AR-A014418, oli riittävä stabiloimaan Snail kasvainsoluissa (kuvio S4).

Lisäksi solujen käsittely LY29004 esti täysin kyky IL -1β suojella paksusuolensyöpä soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin (Fig. 6C), mikä tarkoittaa, että makrofagit ja IL-1β suojaamiseksi TRAIL indusoi apoptoosin kautta GSK3p riippuvainen vakauttamiseen Snail.

makrofagien ja IL-1β Herkkä TRAIL: n indusoiman apoptoosin kautta stabilointi Snail

Snail on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa β-kateniinin ja edistää ilmentymistä Wnt kohdegeenien [38]. Sopusoinnussa näiden tietojen, huomasimme, että yli-ilmentyminen Snail edistää TOP-FLASH-perustuvaa toimintaa sekä HCT116 ja HKE-3-solut (Fig. 7A). Sen määrittämiseksi, onko vakauttamiseen Snail makrofagien /IL-1β edistää niiden kyky ajaa Wnt signalointia, me vaiennettu Snail tuumorisoluissa (Fig. 7B), ja tutkitaan kyky makrofagien ja IL-1β aiheuttaa Wnt signalointia etana puutteellinen HCT116 ja HKE-3-soluissa.