Krooninen sairaus

tiivistelmä

aggressiivisuus haiman adenokarsinooma (PDA) on ominaista korkea metastaattinen potentiaali ja tehokkaiden hoitojen puute, joka johtuu puutteesta mekanismien ymmärtämistä mukana edistämässä PDA etäpesäkkeitä. Havaitsimme anneksiini A2 (ANXA2), jäsen Annexinia perheen kalsiumista riippuvan fosfolipidi sitovien proteiinien, uutena molekyyli, joka edistää PDA invaasio ja etäpesäkkeitä. Löysimme ANXA2 olevan PDA-liittyvä antigeeni tunnustettu jälkikäsittelyn potilaiden seerumeista, jotka osoittivat pitkäaikainen säilyminen hoidon jälkeen PDA-erityinen rokote. Solun pinta ANXA2 kasvaa PDA kehittymistä ja etenemistä. Knockdovvn ANXA2 ilmentymisen RNA-interferenssi tai estää anti-ANXA2 vasta inhiboi

in vitro

hyökkäystä PDA soluja. Lisäksi rokotuksen potilaiden seerumit inhiboi

in vitro

hyökkäystä PDA soluja, mikä viittaa siihen, että terapeuttinen anti-ANXA2 vasta-aineita rokotteen indusoimat. Lisäksi solun pinnalla lokalisoinnin ANXA2 on tyrosiini 23 fosforylaatiota riippuvaista; ja tyrosiini 23 fosforylaatiota tarvitaan PDA hyökkäystä. Olemme osoittaneet, että tyrosiini 23 fosforylaatio johtaa pinnan ilmentyminen ANXA2 vaaditaan TGF-indusoidun, Rho-välitteinen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka yhdistää solun toimintaa ANXA2, joka on aiemmin osoitettu liittyvän pieniä GTPaasi-säädellään solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä , että EMT prosessin PDA. Lopuksi, käyttäen hiiren PDA malleja, olemme osoittaneet, että shRNA knock-alas

ANXA2

, mutaatio tyrosiini 23, tai anti-ANXA2 vasta-aineet, estävät PDA etäpesäkkeitä ja pidentää hiiren eloonjäämisen. Siten ANXA2 on osa uutta rakenteisen taustalla PDA etäpesäkkeitä ja uuden tavoitteen kehittämiseen PDA terapeuttisten.

Citation: Zheng L, Foley K, Huang L, Leubner A, Mo G, Olino K, et al. (2011) Tyrosiini 23 fosforylaatio riippuva Cell-Surface Localization anneksiini A2 tarvitaan invaasio ja etäpesäkkeet Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10,1371 /journal.pone.0019390

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NCI SPORE gastrointestinaalisen Syövät P50 CA062924-14 (EMJ), Lustgarten Foundation (EMJ), Broad Foundation (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Virágh Foundation, NIH 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO Young tutkija Award (LZ), NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant (LZ), Sol Goldman Haimasyöpä Center (LZ). Dr. Jaffee on ensimmäinen vastaanottaja Dana ja Albert ”Cubby” Broccoli Endaumentin Professuuri. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Olen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Under välisen lisenssisopimuksen BioSante ja Johns Hopkins yliopiston, on oikeus etappimaksuja ja rojaltituloja myynnistä rokotteen kuvattu tuote käsikirjoitus. Meillä ei ole mitään muuta eturistiriidat luovuttaa. P. Illei on luennon sponsoroi Leica Microsystems. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDA) on edelleen tappava syöpä kokonaispituudeltaan 5 vuoden eloonjäämisaste 5% [1]. Kyvyttömyys diagnosoida varhain, korkea metastaattinen potentiaali, ja lääkeresistenssin huomioon sen alhainen eloonjäämisaste. Vaikka se on vakiintunut, että patogeneesin PDA seuraa portaittain vaiheita, näyttää yhä solujen atypia ja kerääntyä klonaalisia mutaatioita tai poikkeava ilmentyminen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille kuten

K-Ras

,

p16

,

p53

,

ja DPC4 /Smad4

[2], lääkkeet, jotka kohdistuvat nämä molekyyli poikkeavuuksien eivät ole vielä käännetty parantunut kliininen vaste [3]. Aggressiivinen luonne PDA on esillä sen yleisyydestä etäpesäkkeitä aikaan alustavan diagnoosin ja yleisyys varhaisen etäpesäkkeiden seuraavien poistettu kirurgisella. Kuitenkin tiedetään vähän molekyylitason mekanismit sen hyökkäys ja metastaattisen prosesseja. Parempi käsitys näistä mekanismeista on välttämätöntä kehittää innovatiivisia ja parannettuja hoitoja PDA.

Syöpä immunoterapia hoitomuodot ovat kehitteillä PDA. Kehitimme allogeenisen, granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF), jotka erittävät PDA rokote potilailla, joilla on PDA [4], [5], [6]. I ja II vaiheen kokeissa tätä rokotetta, jos potilaalla on resektoidun PDA osoitettu sekä kliinisiä ja immunologisia vasteita [4], [5]. Tämä immunoterapia lähestymistapa edellyttäen immunisoitiin lymfosyytti reagenssit identifioida uusia PDA antigeenejä, jotka testataan parhaillaan kohteina PDA hoitoa [7], [8]. Mahdollinen hoitotavoitteet tunnistettu tähän mennessä myös tärkeitä johtolankoja tutkimuksessa molekyylitason mekanismit PDA kehitystä ja etäpesäkkeitä. Me raportoimme tässä hyödyntäminen toiminnallisen proteomic lähestymistapa, joka tunnistaa anneksiini A2 (ANXA2) uutena ehdokkaana PDA kohde immuunivasteen. Lisäksi osoitamme, että tyrosiini 23 fosforylaatio riippuvaista solun pinnalla lokalisointi anneksiini A2 tarvitaan epiteelin ja mesenkymaalitransitioon, invaasio, ja metastaasit muodostuminen kämmenmikrot.

Tulokset

tunnistetiedot ANXA2 uutena ehdokkaana PDA kasvaimeen liittyvän antigeenin ja biologisten merkkiaineiden

Käytimme immunisoitiin seerumeista kahdella potilaalla, joilla osoittanut sekä näyttöä rokotuksen jälkeisen immuunivasteita ja pitkäaikainen tautivapaan elinajan (DFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) faasin II tutkimus GM-CSF erittävä kokosolu PDA rokote [4] seuloa kokosoluekstraktien päässä PDA rokote solulinjoja joka toimi proteomiin. Proteiini uutteet erotettiin kaksiulotteisella elektroforeesilla (2-DE); ja immunoblottaus analyysi suoritettiin vertaamaan antigeenitunnistuksessa ennen ja jälkeen rokotuksen seerumit. Proteiinit tunnustettu rokotuksen seerumit suhteessa ennen rokotusta seerumit tunnistettiin massaspektrometrillä. ANXA2 oli proteiini tunnistettiin rokotuksen seerumit immunobloteista sekä potilaiden arvioitiin. Arvioitava edelleen esiintyvyys rokotuksesta humoraalisia vasteita ANXA2, puhdistettua rekombinanttia ANXA2 käytettiin seulontaan ennen rokotusta ja rokotuksen seerumit 16 ylimääräistä hoidetuista potilaista tässä vaiheessa II tutkimuksessa sekä ELISA- ja Western blot (kuvio S1). Rokote indusoi anti-ANXA2 vasta, mitataan sandwich-ELISA, havaittiin 6 7 potilaalla osoittivat DFS yli 36 kuukautta [4], ja vain 1 muiden 9 potilasta ei osoittanut pitkäaikaista DFS ( Pöytä 1). Nämä tiedot ovat ensimmäisiä todisteita siitä, että ANXA2 on vasta-aine, kohteena immuunivasteita PDA.

ANXA2 on raportoitu yli-ilmentynyt useissa eri syövissä, mukaan lukien PDA verrattuna normaaleissa kudoksissa [9]. Kuitenkin ANXA2 on normaalisti soluliman ja luumenin asuvat proteiini haimakudoksessa, ja aiemmat tutkimukset [9] ei ole määrittää, onko solun pinnalla ANXA2 ilme on hallitseva malli PDA kudoksissa. Siksi olemme analysoineet sijainti ANXA2 ilmentymisen immunohistokemiallinen (IHC) in resektoitua kasvaimia 52 60 hoidetuista potilaista meidän faasin II tutkimuksessa, joille saatiin näyte värjäykseen. Huomasimme, että normaali haimatiehyen epiteelisolujen osoittavat heikkoja sytoplasmista ja luumenin värjäyksen IHC, kun taas solun pinnan lokalisoitu ANXA2 lisääntyy etenemistä Panin vaurioita invasiivisia PDA (kuva S2). Erityisesti, 39 (75%) 52 tuoreen haiman kasvainkudoksen testatussa on lisääntynyt ilmentyminen solun pinnalla ANXA2 (kuva S2). Nämä tiedot tukevat edelleen, että ANXA2 pintailmennys liittyy PDA kehitystä ja sellaisena voi toimia immunologista kohde.

esto ANXA2 estää

in vitro

hyökkäystä PDA solujen

tutkimme seuraavaksi solun pinnalla lokalisoinnin ANXA2 näyttelee biologinen rooli helpottaa PDA hyökkäystä. ANXA2 on raportoitu sitoutuvan kalvoon liittyvä fosfolipidien ja on monipuolinen solujen toimintoja, kuten plasminogeeniaktivaatioprosessille, fibrinolyysin, kalvo liikenne, solun tukirangan uudelleenjärjestely, angiogeneesi, soluadheesiota ja muuttoliike. ANXA2 toimii myös suuren affiniteetin reseptorin useita solunulkoisen ligandeja, jotka ovat sekaantuneet syövän kehitykseen, invaasio, ja etäpesäkkeitä [10], [11], [12], [13]. Suoraan testata, onko ANXA2 on mukana PDA invaasio, ANXA2 ilmentymistä pudotettiin PDA soluissa RNA-interferenssi (kuvio 1A). Knock-down on

ANXA2

tukahdutti

in vitro

hyökkäystä PDA solujen Boyden kammiossa määritys (kuvio 1 B ja kuviossa S3). Induktio vasta-aineiden ANXA2, joka on havaittu rokotetuilla potilailla, joilla on pitkäaikainen DFS (taulukko 1) viittaavat siihen, että anti-ANXA2 vasta-aineet voivat vaikuttaa suoraan tuumorin vastaista vaikutusta. Siksi testattiin sekä kaniinin polyklonaalista ja hiiren monoklonaalinen anti-ANXA2 vasta-aineita, ja havaitsi, että ne voivat spesifisesti inhiboida

in vitro

invaasion PDA-soluja (kuvio 1C, D). Lisäksi seerumit immunisoiduista potilaista, jotka osoittivat rokotuksen vaste ANXA2 samalla estyy

in vitro

invaasion PDA soluja (kuvio 1 E). Esitettyjen tietojen toistaiseksi linkki lisäämällä ilmentyminen solun pinnalla ANXA2 PDA hyökkäyksen valmiudet ja viittaa siihen, että rokote aiheuttama vasta-ainevasteet voivat estää tämän näkökohdan PDA etenemisen. Kuitenkin mekanismi, jolla ANXA2 välittämän PDA hyökkäys tapahtuu on vielä tutkittava. Mielenkiintoista, invasiivisen kapasiteetti PDA solujen ei korreloi niiden proliferatiivinen nopeus viittaa riippumattoman mekanismin (kuva S3). Paljastaa muita sääntelymekanismeja, joiden osuus hyökkäys kapasiteetin PDA-solujen, me tutki vielä solukomponenttien lokalisaatio ANXA2 erilaisissa PDA solulinjoissa fluoresenssivärjäys anti-ANXA2 vasta-aineita (kuvio S4). ANXA2 on pääasiassa lokalisoitu solukalvon kaikissa 8 PDA solulinjojen havaittiin suuren hyökkäyksen kapasiteetti, kun taas ANXA2 on läsnä pääasiassa sytoplasmassa solulinjojen alhainen invaasio kapasiteetti (kuva S4 ja taulukko S1). Nämä tiedot tukevat edelleen rooli ANXA2 translokaatio alkaen sytosoliin solun pintaan /kalvo parantamisessa PDA soluinvaasiota.

. Western blot-analyysi osoittaa, että

ANXA2

siRNA estää ilmentymistä ANXA2 PDA solulinjassa. Kokosolun otteita Panc10.05 hoidettu ohjaus siRNA ja

ANXA2

siRNA vastaavasti blotattiin kanin polyklonaalista anti-ANXA2 vasta-aineella (ylempi paneeli) ja kaniinin polyklonaalisella anti-GAPDH-vasta (alempi paneeli). B.

In vitro

invaasiomääritys osoittaa, että

ANXA2

siRNA estää hyökkäyksen kapasiteetti 10.05 PDA solulinjassa. Tunkeutuneet solut mitattiin MTT määrityksiä ja normalisoidaan koko solujen määrä. C. Polyklonaaliset anti-ANXA2 vasta estävät hyökkäyksen kapasiteettia Panc10.05 soluja. D. Hiiren anti-ANXA2 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) estävät hyökkäys kapasiteetti hiiren Panc02 ja ihmisen Panc10.5 soluja. C ja D, kanin anti-ANXA2-vasta-aine, kanin kontrolli-Ig:, hiiren anti-ANXA2 mAb (klooni: ZO14), tai hiiren isotyyppikontrollilla IgG1 lisättiin elatusaineeseen lopullisessa pitoisuudessa 25 ug /ml koko

in vitro

invaasio määrityksiä, vastaavasti. E. Vain rokotuksen potilaiden seerumi (3,009 ja 3,028), jotka osoittivat anti-ANXA2 vasta-ainevasteita, mutta ei potilailta (3.037 ja 3.039), jotka eivät osoittaneet anti-ANXA2 vasta-ainevasteita, estävät hyökkäystä Panc10.05 soluja. Pre- ja rokotuksesta seerumit lisättiin viljelyalustaan ​​suhteessa 01:50. Kolmena kappaleena kokeet tehtiin B-E.

fosforylaatio ANXA2 on Tyr23 edistää solun pinnalla paikantaminen ANXA2 ja hyökkäyksen kapasiteetin PDA-solujen

ANXA2 on substraatti Src kinaasi, joka fosforyloi ANXA2 at Tyr23 sekä

in vivo

ja

in vitro

[10], [11], [12], [13], ja Tyr23 fosforylaatio on ehdotettu olevan tärkeä normaalille solujen sironnan ja haarautuvia morfogeneesiin [14], [15]. ANXA2 on myös raportoitu olevan tyrosiinifosforyloitunut kun se paikantuu solun pinnalle stressiä [16]. Koska pahanlaatuiset solut usein matkivat normaaleja soluja, jotka on tehty erilaisia ​​stressin ärsykkeille, me olettaa, että ANXA2 kulkeutua solun pinnalle kuin tyrosiini-phophorylated proteiinin aikana tuumorigeneesin samoin. Tämän testaamiseksi me eluoitiin solun pinnan osa ANXA2 peräisin Panc10.05 PDA-solut, jotka ovat solun pinnalla lokalisointi ANXA2 (kuvio S4 ja taulukko S1), ja sen on todettu solun pinnan osa ANXA2 proteiini on itse asiassa tyrosine- fosforyloidun proteiinin (kuvio 2A). Sen sijaan, ANXA2 ei eluoida solupinnalla Panc 3,11 soluja, PDA solulinja, joka osoittaa, sytoplasmisen lokalisointi ANXA2 (kuva S4). Voit testata, onko fosforylaatiota ANXA2 at Tyr23 on tärkeä sen lokalisointi PDA solun pinnalla, me tuotti paneeli ilmentävien plasmidien joko villityypin ANXA2 (ANXA2

WT), The ANXA2 mutantti proteiini (ANXA2

Y23A) jossa Tyr23 muutettiin alaniinitähteellä tekemällä ei-fosforyloitavissa mutantti, tai ANXA2 mutantti proteiini (ANXA2

Y23E), jossa Tyr23 muutettiin glutamiinihappotähde jäljitteleviä konstitutiivinen fosforylaatio. Kun Panc10.05 solut transfektoitiin näillä plasmideilla ilmentävät ANXA2 merkitty GFP [17], ANXA2

WT-GFP: n ja ANXA2

Y23E-GFP lokalisoitu pääasiassa solun pintaan PDA soluja. Sen sijaan, ANXA2

Y23A-GFP paikantuvat sytoplasmaan (kuvio 2B). Nämä tulokset vahvistettiin edelleen käyttäen lentivirus konstitutiivisesti nimenomaista ANXA2

WT, ANXA2

Y23A, tai ANXA2

Y23E PDA soluissa (kuvio S4). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että fosforylaation Tyr23 tuloksia lokalisoinnin ANXA2 solun pinnalla.

. Panc10.05 ja Panc3.11 soluja joko inkuboitiin EGTA sisältävällä puskurilla tai EGTA-puskurissa. Kaksi eri eluoinnit kahdesta eri PDA solulinjoista, kuten, immunosaostettiin anti-ANXA2 vasta-aineita (kaistat 1-4) tai anti-fosfotyrosiini (anti-pTyr) vasta-aineita (kaistat 9-12). Eluoinnin jälkeen, kaksi PDA solulinjat lyysattiin ja lysaatit immunosaostettu anti-pTyr vasta-aineita (kaistat 5-8). B. GFP-merkittyä ANXA2 in Panc10.05 soluissa. Ylempi paneeli: GFP-signaaleja; alempi paneelit: päällekkäin kuvia GFP signaalit ja DAPI värjäytymistä ytimeksi. C. FLAG-merkitty ANXA2 ilmentymisen Panc10.05 transfektoitujen solujen pcDNA-pohjainen plasmidi, pelkällä vektorilla (kaistat 1,5,9,13), kantavan plasmidin ANXA2

WT-FLAG (kaistat 2,6,10, 14), kantavan plasmidin ANXA2

Y23A-FLAG (kaistat 3,7,11,15), tai plasmidi ANXA2

Y23E-FLAG (kaistat 4,8,12,16). Kokosoluekstraktien (WCE) (kaistat 1-4), solumembraanifraktioissa (kaistat 5-8, 13-16), tai soluliman jakeet (kaistat 9-12) eristettiin biokemialliset jakotislaamalla päässä Panc10.05 PDA soluja, tässä järjestyksessä ja immunosaostettiin käyttäen joko anti-FLAG M2-vasta-aineita (kaistat 1-12) tai anti-fosfotyrosiini-vasta-aineita (anti-pTyr) (kaistat 13-16). Immunopresipitaatit blotattiin anti-FLAG-M2-vasta-aineita. D.

In vitro

hyökkäystä Panc10.05 soluja. E.

In vitro

hyökkäystä Panc3.11 soluja. Sekä D ja E, solut transfektoitiin tyhjällä pcDNA-pohjainen plasmidivektori (kaistat 1,2), kantavan plasmidin ANXA2

WT-FLAG (kaista 3), kantavan plasmidin ANXA2

Y23A-FLAG ( kaista 4), tai plasmidi ANXA2

Y23E-FLAG (kaista 5). Kaista 1 oli myös keratransfektoidaan ryntäily siRNA ohjaus. Kaistat 2-5 Myös kotransfektoitiin

ANXA2

siRNA duplex. Tulokset kaksoiskokeista näkyvät.

onko muutos ANXA2 lokalisointi, joka tapahtuu seurauksena Tyr23 fosforylaation vaikuttaa hyökkäyksen kapasiteetin PDA solujen joukko plasmideja, jotka ilmentävät eksogeenisiä FLAG-merkittyä ANXA2 lukien ANXA2

WT-FLAG, ANXA2

Y23A-FLAG, ja ANXA2

Y23E-FLAG kehitettiin. Nämä vektorit ovat RNA-interferenssi resistenttejä koska hiljaiset mutaatiot sisällä siRNA kohdesivustoa. Panc10.05 PDA-solut, jotka on transfektoitu näillä plasmideilla fraktioitiin soluliman ja solumembraanifraktioissa (kuvio S4). Ensin vahvisti, että vain ANXA2

WT-FLAG ja ANXA2

Y23E-FLAG, mutta ei ANXA2

Y23A-FLAG, paikallistaa solukalvoon osa (kuvio 2C). Kuten odotettua, ANXA2

WT-FLAG-proteiinia tyrosiinifosforyloituu solukalvon osa. Seuraavaksi havaittiin, että kotransfektoimalla pcDNA ekspressoivan plasmidin ANXA2

WT-FLAG tai ANXA2

Y23E-FLAG, mutta ei ANXA2

Y23A-FLAG, jossa siRNA (estää endogeenisen ANXA2), käänteinen siRNA estoa invaasion Panc10.05 soluja (kuvio 2D). Kuitenkin soluissa, joilla on alhainen hyökkäys kapasiteetti ja vain sytoplasman lokalisointi ANXA2, kuten Panc3.11 (taulukko S1), kotransfektion ANXA2

Y23E-FLAG ohittaa fosforylaatiota sääntelymekanismiin matkimalla konstitutiiviset fosforylaation ja edistää hyökkäys Panc3.11 soluja (kuvio 2E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Tyr23 fosforyloitu ANXA2 annetaan PDA hyökkäystä kapasiteettia.

ANXA2 edistää epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon PDA solujen

Fosforyloitu ANXA2 on rooli solun sironnan normaaleissa morfogeneesiin prosesseissa [14] , [15]. Tuloksemme toistaiseksi tukevat rooli fosforyloidun ANXA2 PDA hyökkäystä. Epiteeli- ja mesenkymaalitransitioon (EMT) säätelee normaali morfogeeniseen prosessi alkionkehityksen aikana ja kudosten rakennemuutos, ja alkuvaiheet hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden ehdotetaan matkia EMT [18]. Siksi pyrimme onko ANXA2 tarvitaan EMT PDA soluissa. EMT on ominaista tukahduttaminen transkription epiteelisolujen markkereita, kuten E-kadheriinin ja induktio mesenkymaalisten markkereita, kuten etana ja vimentiinista. ANXA2 on raportoitu välittävän TGFli-aktivoitu EMT prosessin aikana sydänläpän kehityksen [19]. Lisäksi TGFli on raportoitu indusoivan EMT viljellyissä PDA soluissa [20], [21]. Tutkia ANXA2 on suora rooli EMT prosessissa tunkeutuvat PDA solujen lentivirusvektoria sisältävät

ANXA2

shRNA käytettiin saavuttaa pitkän aikavälin tukahduttaminen ANXA2 PDA soluissa (kuvio S3). Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että E-kadheriinin tukahdutettiin, kun taas etana ja vimentiinista indusoitiin aikana TGFli aiheuttama EMT in Panc10.05 solujen ohjaus shRNA, mutta ei niissä tartunnan

ANXA2

shRNA (kuvio 3A ). Lisäksi E-kadheriinin -proteiiniekspressio tukahdutettiin TGFli saaneilla solujen ohjaus shRNA, mutta pysyi ennallaan TGFli käsiteltyjä soluja, jotka ilmaisivat myös

ANXA2

shRNA (kuvio 3B, C). Kuten ennustettu, PDA-soluilla ilman

ANXA2

shRNA menettävät solu- soluadheesiota fenotyyppi ja hajottaa ympärille kulttuurin jättämän seuraavat TGFli hoitoon, muistuttaa EMT kuvio (kuvio 3B). Vaikka ANXA2 ei ole vielä osoitettu olevan osallisena Smad4 välittämän EMT, sen on osoitettu olevan osallisena Rho (pieni GTPaasit) -välitteisen solu- irtoamisesta piirre EMT [15]. Näin ollen olemme myös arvioida, onko Rho välittää ANXA2 liittyvän EMT PDA ja totesi, että Rho aktivointia ei havaita PDA solujen shRNA inhibitio ANXA2 seuraavista TGFp hoidon (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat, että menetys ANXA2 ilmaisun johtaa menetykseen TGFp-Rho-välitteisen EMT PDA-soluissa.

. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi E-kadheriinin, etana, ja vimentiinistä mRNA ilmaisun Panc10.05 PDA solujen ja ilman knockdovvn ANXA2 mukaan shRNA. Suhteelliset mRNA ilmaisun kanssa TGFp 1 kohtelu verrattuna ilman TGFp 1 hoitoa näkyvät. Aineisto normalisoidaan β-aktiinin ilme. B. Sama pari PDA solujen työskentelee paneelin hoidettiin TGFp 1 0, 36 tai 72 tuntia, vastaavasti, ja sitten korjataan immunovärjäys anti-E-kadheriinin vasta-aineita ja PE-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineilla. DAPI käytettiin värjäämään ytimet. C. Sama pari PDA solujen työskentelee paneeli A hoidettiin TGFp 1 0, 36 tai 72 tuntia, vastaavasti, ja sitten korjattu. Pieni osa solu-uutetta käytettiin western blot-analyysi, ja värjättiin anti-E-caherin, anti-RhoA, B, C, tai anti-β-aktiini-vasta-aineiden kuin sisäinen kontrolli, vastaavasti. Jäljellä oleva solu-uute tehtiin alasveto analyysissä affiniteettikolonniin, joka sitoo spesifisesti aktivoitu, GTP: hen sitoutuneen muotoja Rho. Tätä seurasi Western blot -analyysillä anti-Rho-vasta-aineita. Huomaa, että anti-Rho vasta-aineet tunnistavat Rho A, B ja C, joiden molekyylipainot ovat hieman erilaisia, tuloksena on kaksi bändejä geelillä. Ohjaus tarkoittaa solut ohjaus shRNA;

ANXA2

shRNA nimeää solut

ANXA2

shRNA. D. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi E-kadheriinin, kuonan ja vimentiinin mRNA: n ekspression pari Panc10.05 PDA solulinjojen infektoitu lentiviruksen ekspressoivat villityypin ANXA2 (ANXA2-WT) tai Y23A mutatoitu ANXA2 (ANXA2-Y23A ), vastaavasti. Suhteelliset mRNA ilmaisun kanssa TGFp 1 käsittely (merkitty +) vs. ilman TGFp 1 hoitoa (merkitty -) esitetään. Aineisto normalisoidaan β-aktiinin ilme.

seuraava tutkittava, onko Tyr23 fosforylaatio on tärkeä ANXA2 välittämää EMT PDA soluissa. Havaitsimme, että endogeeninen ANXA2 enää paikantuu solun pinnalla ekspressoivat solut tyrosiini sivuston menetys variantti ANXA2

Y23A (kuva S4). Lisäksi transfektio ANXA2

Y23A-FLAG estää hyökkäys Panc10.05 soluja (kuvio S4), mikä viittaa siihen, että ANXA2

Y23A on hallitseva negatiivinen vaikutus. Yhdenmukainen julkaistujen tietojen [22], huomasimme, että ANXA2

Y23A voivat silti sitoutua sen kumppani S100A10 /p11 [23] sytosoliin, mutta ei solukalvon (kuva S5). Näin ollen, yli-ilmennetään, sytoplasminen-lokalisoitu ANXA2

Y23A voi sitomaan kaikki S100A10 /p11 sytosoliin, jolloin annetaan dominantti negatiivinen vaikutus. Näin ollen hyödyntämällä hallitseva negatiivinen vaikutus ANXA2

Y23A, ja käyttämällä tämän ANXA2

Y23A-mutantti, olemme edelleen osoittaneet, että EMT indusoi TGF soluissa, jotka ilmentävät ANXA2

WT, mutta ei soluissa, jotka ilmentävät ANXA2

Y23A (kuvio 3D). Näin ollen nämä tiedot osoittavat lisäksi, että Tyr23 fosforylaatiota ANXA2 edistää EMT PDA-solujen ja on ajateltavissa mekanismi, jolla ANXA2 paikantuu PDA solukalvon ja antaa mahdollisuuksia PDA solujen hyökätä.

Expression ja tyrosiinifosforylaatiota ANXA2 tarvitaan PDA metastaasit muodostumista

in vivo

Paikalliset hyökkäyksen kasvainsoluja on tunnettu vaihe etäpesäkkeiden. Tuloksemme osoittavat, että ANXA2 helpottaa invaasio PDA solujen

in vitro

. Siksi palveluksessa transplantable hiiren haimasyöpä malli etäpesäkkeiden (kuva S6) arvioida roolia ANXA2 ilmaisun, fosforylaatio, ja solun pinnan lokalisointiin PDA etäpesäkkeitä prosessi

in vivo

. Tässä mallissa 100% hiiristä kuolla maksametastaaseihin noin 4-6 viikkoa (kuvio 4A) jälkeen pernan injektion 2 x 10

6 Panc02 hiiren PDA soluja. Panc02 infektoitujen solujen GFP-ilmentävien lentivirus kuljettaa shRNA spesifinen

ANXA2

pudotus tai valvontaa shRNA lajiteltiin GFP-positiivisten solujen FACS.