Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvutekijän kaltaisen domeenin sisältävä proteiini 7 (EGFL7) ylössäädellään ihmisen epiteelin kasvaimissa ja niin on potentiaalinen biomarkkereiden syövän hoitoon. Todellakin, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat EGFL7 ilmaisun edistää soluttautuminen ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpä. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) aloittaa metastaattista Cascade ja hankkii syöpäsolujen invasiivisia ja muuttavat kapasiteetti; kuitenkin, se ei tiedetä EGFL7 edistää etäpesäkkeiden laukaisemalla EMT. Huomasimme, että EGFL7 yliekspressoitui useassa ihmisen mahasyövän (GC) solulinjat, ja että yli-ilmentyminen edisti soluinvaasiota ja maahanmuuttoa paljastui tyhjästä haava ja siirtokuoppaan muuttoliike määrityksissä. Toisaalta shRNA välittämä EGFL7 pudotus vähensi hyökkäyksen ja muuttoliike. Lisäksi EGFL7-yli-ilmentävät solut kasvoivat suuremmiksi kasvaimia ja ne olivat todennäköisesti etäpesäkkeitä maksaan verrattuna underexpressing CG solujen ihonalaisen injektion jälkeen hiirissä. EGFL7 yliekspressio suojattu GC solulinjat vastaan ​​anoikis, joka tarjoaa järkeenkäypää mekanismia tämän tehostetun metastaattisen kapasiteetti. Vuonna poistetun ihmisen mahalaukun kasvaimet, ilmaus EGFL7 korreloi positiivisesti ilmentymisen tasojen mesenkymaalisten merkki vimentiinista ja EMT-liittyvä transkription -repressori- Snail, ja korreloi negatiivisesti ilmaus epiteelisolujen merkki E-kadheriinin. GC solulinjoissa, EGFL7 knockdown käänteinen morfologisia merkkejä EMT ja väheni sekä vimentiinista ja Snail ilme. Lisäksi, EGFL7 yli-ilmentyminen edistää EGF-reseptorin (EGFR) ja proteiinikinaasi B (AKT) fosfo-aktivointi, vaikutuksia merkittävästi tukahdutti EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori AG1478. Lisäksi AG1478 vähensi myös koholla invasiivisia ja muuttavien kapasiteetti GC solulinjojen yli-ilmentävät EGFL7. Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että EGFL7 edistää etäpesäke aktivoimalla EMT kautta EGFR-AKT-Snail signalointireitin. Häiriöt EGFL7-EGFR-AKT-Snail signalointi voi lupaava terapeuttinen strategia mahasyövän.

Citation: Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) kasvutekijän-Like Domain sisältävä proteiini 7 (EGFL7) Parantaa EGF Receptor-AKT Signaling, epiteeliä-mesenkymaalitransitioon, ja Metastasis mahasyövän Cells. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922

Editor: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2013; Hyväksytty: 19. toukokuuta 2014; Julkaistu: 19 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81001080) ja kärkiosa rahasto arvokas ja Tarkkuusinstrumentit Keski Etelä yliopisto (nro JJ3121). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin pahanlaatuinen kasvain ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1], [2]. Noin puolet kaikista GC tapauksista esiintyy Itä-Aasian maissa, joissa erityisen korkea ilmaantuvuus Japanissa, Koreassa ja Kiinassa [3], [4]. Edistyminen systeemiseen hoitoon GC on kasvanut huomattavasti lyhyen aikavälin elinkelpoisuuden; kuitenkin, viiden vuoden eloonjäämisaste GC potilaista jää alhaiseksi uusiutumisen ja etäpesäkkeiden [5]. Lisäksi useimmat vastadiagnosoidun GC potilaat osoittavat jo etäpesäkkeitä, mikä on olennainen terapeuttinen haaste onkologit [6].

kasvutekijän kaltaisen domeenin sisältävä proteiini 7 (EGFL7), joka tunnetaan myös verisuonten endoteelin statiini , on endoteelisolujen johdettu erittyy tekijä, joka säätelee verisuonten putken muodostumiseen. Parker et ai. [7] osoitettiin, että EGFL7 on ratkaiseva angiogeneesin aikana seeprabarbi alkionkehityksen [8]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet kohonnut ilmentyminen EGFL7 useita kasvaimia ja syövän solulinjat, mukaan lukien munuaisten kasvaimia, pahanlaatuista gliooma, maksasolukarsinoomat, ja paksusuolen syövissä [7] – [10]. Olemme aiemmin osoittaneet, että EGFL7 yli-ilmentyy myös mahakarsinoo- [11], ja ilmentyminen korreloi merkitsevästi pathologic ominaisuuksia, kliininen eteneminen, huono ennuste, ja etäpesäkkeiden [10], [12]. Näin ollen, EGFL7 on ehdokas ennustava tekijä syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kuitenkin taustalla olevat mekanismit kasvaimia vaikutukset EGFL7 ovat epäselviä.

etäpesäke on monivaiheinen prosessi, johon liittyy epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), jossa polarisoituneet epiteelisolujen muunnetaan mesenkyymisolujen [13], ilmiasuun suurempi invasiivisen ja muuttavien kapasiteettia [14]. EMT on myös palautuva prosessi, joka usein tapahtuu invasiivisia edessä monet metastasoituneen syöpien [15]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että EGF edistää syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota samanaikainen aktivointi EMT [16] – [18]. Merkittävää on, EGFL7 sisältää kaksi EGF-kaltaiset domeenit, mikä viittaa joitakin toiminnallisia homologiaa [9], [12]. Kuitenkin myös EGFL7 itse asiassa tekee parantaa EMT ja edistää mahasyövän etäpesäke on vielä määrittelemättä. Lisäksi molekyylitason mekanismeja, joilla EMT sääntelee GC edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Sinkkisormen transkription repressori Snail on kriittinen geenien ilmentymisen uudelleenohjelmoinnin aikana EMT, etenkin tukahduttamisen solu-solu Adhesion Protein endoteelisolujen (E) -cadherin, menetys, jota pidetään tärkeänä varhainen tapahtuma EMT ja tarpeen seuraavan etäpesäke [ ,,,0],19].

Tässä tutkimuksessa haluttiin selvittää, jos EGFL7 edistää etäpesäkkeiden laukaisemalla EMT. Huomasimme, että EGFL7 yli-ilmentyminen aktivoi EGFR-AKT-reitin, laukaisee EMT, ja edistää GC soluinvaasiota

in vitro

ja etäpesäkkeiden

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

potilaille ja Tissue Collection

mahakarsinoo- kudokset saatiin 79 GC potilaista (58 urosta ja 21 naarasta) hoitaa kirurginen resektio laitoksella Kirurgian Xiangya sairaala, Keski Etelä yliopisto (Kiina). Leikkauksia tehtiin Jan 2010 joulukuu 2012. Potilaat olivat 54,7 vuotta vanha keskimäärin (vaihteluväli: 28-82 vuotta) ja eivät saaneet solunsalpaajia eivätkä sädehoitoa ennen leikkausta.

Potilaille kerrottiin, että kirurgisista näytteistä olisi voidaan käyttää tavanomaisia ​​patologisia diagnoosin ja että jäljellä olevat kudokset voidaan käyttää tutkimuksessa. Ei henkilökohtaisia ​​potilastietoja vaadittiin tätä tutkimusta varten ja protokollat ​​toteutetaan ole vaaraa, joten vain suullinen suostumus vaadittiin potilailta. Protokolla hyväksyttiin eettisen komitean Xiangya sairaala, Keski Etelä yliopisto (Luvan numero: 201311389).

Tauti pysähdyspaikan määriteltiin kuudennen painoksen TNM lavastus järjestelmä American sekakomitean Cancer [ ,,,0],20], [21]. Kasvaimet olivat hyvin eriytetty mahalaukun adenokarsinoomaa 12 tapauksessa, kohtalaisen eriyttää 34 tapauksessa, ja huonosti eriytetty 33 tapauksessa. Kaikki näytteet heti kiinnitettiin 10% formaliinilla, kuivattu, ja parafinoidut. Tarkka kliininen tieto ja patologinen diagnoosi olivat käytettävissä kaikilla potilailla.

immunohistokemia

Immunohistokemiaa valmistaa näytteitä inkuboitiin 60 ° C: ssa 15 tuntia ja leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä, parafiini vuonna tärpätti, kuivattiin ja niihin lisätään vähenevän etanoli: tislattu vesi gradientilla. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus inaktivoitiin inkuboimalla 30 minuuttia 0,3% vetyperoksidia 0,01 M fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Viipaleita inkuboitiin sitten 15-20 min sitraattipuskurissa (pH 6,0) 95 ° C: ssa antigeenin haku, blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia 0,01 M PBS: ssä 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla oli laimennettu blokkausliuoksen yön yli 4 ° C: ssa kosteassa kammiossa. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: hiiren anti-EGFL7 monoklonaalinen vasta-aine (Abcam, USA, 1:400) ja kanin monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​E-kadheriinin (CST, USA, 1:1000), vimentiinistä (CST, USA, 1:1000 ), etana (Proteintech, USA, 1:1000), ja CD34 (Boster, Kiina, 1:500). Pesun jälkeen näytteet peräkkäin inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja streptavidiiniin piparjuuriperoksidaasi (HRP) avidiini käyttöliuos. Immunoleimaus visualisoitiin käyttäen DAB substraattipakkausta Zhongshan Golden Bridge Company (Kiina) mukaan valmistajan suositusten. Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä (Vector Laboratories, USA), kuivattu nousevassa etanoli: tislattu vesi kaltevuus, ja kiinnitetty dioja käyttäen Permount-peitinlaseilla kiinnitysväliaineet (Fisher Scientific, USA).

kvantifiointi immunohistokemiallinen Signals

Kaikki GC ja ympäröivän ei-neoplastisia mahalaukun kudokset vahvistettiin histopatologisesti kaksi riippumatonta patologia (K.-SW ja J.-HL) blind alkuperäiseen diagnoosin. Immunovärjäys luokiteltava semikvantitiivinen menetelmä, joka pidetään voimakkuutta ja jakelu värjäys [22]. Lyhyesti, viisi kenttää valittiin sattumanvaraisesti alhaisessa suurennus (100 x, Olympus BX51, Tokio, Japani), ja 200 kasvainsolut lasketaan kunkin kentän. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin seuraavasti: 0, ei värjäystä; 1, heikko keltainen värjäys; 2, keltainen värjäys; 3, ruskea värjäystä. Positiiviset solut ominaista selvä raja ja keltainen tai ruskea värjäys eroaa taustasta. Niiden positiivisten solujen (PP) pisteytettiin seuraavasti: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Molemmat tulokset yhdistettiin, jolloin saadaan seuraavat luokitus: negatiivinen värjäytyminen, näytteitä immunoreaktiivisia pisteet (IRS) on 0-2; heikosti positiivinen värjäytyminen, näytteitä IRS on 3-5; voimakkaasti positiivinen värjäytyminen, näytteitä IRS on 6 7. Näytteitä, jotka osoittivat heikosti ja vahvasti positiivista värjäytymistä sisällytettiin tilastolliseen analyysiin.

Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen GC solulinjat SGC7901 (kohtalaisen eriytetty adenokarsinooma), BGC823 (huonosti eriytetty adenokarsinooma), MKN28 (hyvin erilaistunut adenokarsinooma), ja MKN45 (huonosti eriytetty adenokarsinooma) sekä normaali mahan limakalvon epiteelin GES-1-solut hankittiin Type Culture Collection Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Kaikki solut viljeltiin ja ylläpidettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa (Gibco Biocult, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Short hiusneula-RNA (shRNA) ja Recombinant Expression Plasmidi PEX-2-EGFL7

tuottaa solulinjoja, jotka yliekspressoivat tai underexpressing EGFL7, natiivi solulinjat transfektoitiin stabiilisti ekspressiovektorilla, tai kohdennettuja shRNA. ShRNA sekvenssit ihmisen EGFL7 suunniteltiin mukaan ihmisen EGFL7 DNA-sekvenssi (GenBank NO. NM_016215.3) Designer 3.0 ohjelmisto (Genepharma, https://www.genepharma.com) ja BLAST haut (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Kohdesekvenssien verrattiin ihmisen genomin tietokannasta BLAST-varmistamaan mitään suurta homologiaa muihin koodaussekvenssit. Sekvenssit EGFL7-homo-333 ja EGFL7-homo-887 tunnistettiin kohdekohtia tietylle EGFL7 shRNA. Lisäksi yksi epäspesifinen sekvenssi (sekoituskoodin shRNA) suunniteltiin negatiivisena kontrollina, ja GAPDH-sekvenssi suunniteltiin sisäisenä kontrollina. ShRNA sekvenssit olivat seuraavat:

EGFL7-shRNA1 vastaan ​​EGFL7-homo-333: sense, 5′-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 ’; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 ’; EGFL7-shRNA2 vastaan ​​EGFL7-homo-887: sense, 5’-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 ’; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 ’; epäspesifinen siinä mielessä, 5’-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 ’; antisense, 5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 ’; GAPDH mielessä, 5’-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 ’; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 ’. PGPU6 /GFP /Neo (vihreää fluoresoivaa proteiinia, neomysiinille) vektori (Genepharma Company, Shanghai, Kiina) käytettiin plasmidin rakentamiseen. Nukleotidit juotettiin ja insertoitiin BamHI- ja Hindlll-kohtien ja transformoitiin DH5a-kompetentteihin E. coli. Dual kanamysiini /neomysiini-resistentit pesäkkeet valittiin ja vektori-sekvenssit vahvistettiin restriktiodigestiolla ja DNA-sekvensoinnilla.

EGFL7 koodaava cDNA 533-1353 aminohapposekvenssiä subkloonattiin pEX-2 plasmidivektori (Genepharma, Shanghai, Kiina) BglII /EcoRI kaksinkertainen ruoansulatusta ja nimetyt pEX–2-EGFL7. Rekombinantti plasmidi monistettiin DH5a-kompetentteja E. coli ja vektorin sekvenssi monistettiin PCR: llä. DNA-sekvensointi vahvisti, että yhdistelmä-DNA-plasmidi sisälsi EGFL7 geenifragmentin identtinen GenBankin (GenBank nro. NM_016215.3). Kanamysiini /neomysiini-resistentit pesäkkeet valittiin ja sekvenssi varmistettiin restriktiopilkkomisella ja DNA-sekvensoinnilla. Kaikki alukkeet suunniteltiin ja syntetisoitiin Genepharma (Shanghai, Kiina).

Vakaa Transfektio ja G418 Selection

Perustaa EGFL7-underexpressing klooni (ja asianmukainen ohjaus), BGC823 soluja ympättiin kuudella kuoppaiset soluviljelylevyille 1 x 10

6 /kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ssa kosteutetussa 5% CO

2 ilmakehässä pidettiin 37 ° C: ssa. Solut transfektoitiin 4 ug pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-epäspesifinen-shRNA tai pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin G418: aa (Sigma, USA, 600 ug /ml) ja alustavan valinnan, laimennettiin, alhaisella tiheydellä (~ 1 solu /kuoppa) ja pidettiin viljelyalustassa, jota oli täydennetty G418 puoleen alustavan valinnan pitoisuus vielä 3 viikkoa. Tuloksena stabiileja solulinjoja nimettiin BGC2-13 (solulinja johtuvat pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 vakaa transfektio) ja BGC-NC, ja laajennettu myöhemmin tutkimuksia. Ilmentymisen taso EGFL7 arvioitiin Western blot ja reaaliaikainen RT-PCR: llä. Perustaa yli-ilmentäviä line ja sovitettua kontrolli, MKN28 solut ympättiin, transfektoitiin 4 ug pEX-2-EGFL7 tai pEX-2 plasmidit, ja on valittu kuten on kuvattu BGC823 soluja, paitsi että 500 ug /ml G418: aa käytettiin alkuperäisessä valinnassa. Tuloksena stabiileja solulinjoja nimettiin MKN28-EGFL7 ja MKN28-NC. Ilmentymistasojen EGFL7 G418-resistentit kloonit arvioitiin Western blot ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR).

Western blot -analyysi

Kun solut saavuttivat 80% -95% yhtymäkohta, kokonaisproteiinin uutettiin käyttäen solulysaattina uuttopuskuria (Beyotime, Kiina), joka sisälsi proteaasinestäjä (1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia). Lysaattia kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa proteiinimääritys (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia (25 ug) kustakin hoitoryhmässä erotettiin kohti geelikaistan 8% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Millipore, Bedford, USA). Kalvot peräkkäin inkuboitiin estopuskurilla, joka koostuu Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten yön yli 4 ° C: ssa tässä samassa puskurissa, jossa jokin seuraavista primaaristen vasta-aineiden: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). anti-E-kadheriinin, anti-vimentiinin, anti-Snail (kaikki 1:1000, Cell Signaling Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-ERK, ja anti-fosfo-ERK (kaikki 1:800, Abou Biotech Co., Ltd., USA). Immunomerkatut Sitten kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., USA) 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen TBST: llä, proteiinijuovat visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Expression of GAPDH käytettiin latauskontrollina ja proteiinit kvantitoitiin käyttäen UTHSCSA Image Tool 3.0. Kohdeproteiinin ekspressio laskettiin kaistan intensiteetin suhde kohdeproteiinin GAPDH.

RNA uutto ja PCR-analyysi

Solut lyysattiin TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja kokonais-RNA valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäinen kanta cDNA syntetisoitiin PrimeScript RT reagenssin Kit gDNA Eraser (Takara, Otsu, Japani) ja monistettiin PCR: llä käyttäen seuraavia spesifisiä alukkeita: EGFL7 mielessä 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ’; antisense, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ’. CDNA GAPDH monistettiin kontrolloida määrän cDNA kunkin näytteen (sense 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ’; antisense 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’). PCR-monistus suoritettiin 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 s, 57 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 40 s. PCR-tuotteet erotettiin 1,0% agaroosigeeleillä ja kohdegeenin ilmentymisen määrä määritetään suhde kohdegeenin bändi intensiteetti kuin GAPDH Image Tool 3.0 (University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

reaaliaikainen PCR

Reaktioseosta reaaliaikaista PCR koostui 10 ui Esiseos Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 uM kutakin EGFL7 ja GAPDH aluketta (alla), 0,2 pmol /ml TaqMan-koettimet (EGFL7 tai GAPDH), ja 0,4 ui ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Viite Dye II (Takara Bio, Shiga, Japani). Seos yhdistettiin 2 ui cDNA: ta kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisen microamp levyn (Applied Biosystems, CA, USA) ja tislattua vettä käytettiin säätämään lopulliseen tilavuuteen 20 ui. Seuraavat alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Premier 6,0 ohjelmistopaketti (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: eteenpäin, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ’; käänteinen, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ’; GAPDH: eteenpäin, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ’; käänteinen, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ’. Kaikki reaktiot suoritettiin 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle olosuhteet olivat alkudenaturaatio 95,8 ° C: ssa 30 s, jota seuraa 40 sykliä monistusta on 95,8 ° C: ssa 6 s ja 60,8 ° C: ssa 30 s.

Samanlaisia ​​koeolosuhteet arviointiin käytettiin ilmaisua muiden geenien kanssa seuraavia alukkeita: E-kadheriinin: eteenpäin, 5′-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 ’; käänteinen, 5’-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 ’; vimentiinista: eteenpäin, 5’-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 ’; käänteinen, 5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 ’; Snail: eteenpäin, 5’-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 ’; käänteinen, 5’-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 ’; GAPDH: eteenpäin, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ’; käänteinen, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ’. Reaktioseoksen real-time PCR koostui 10 ui SYBR Esiseos Ex TaqTM II, 1,6 ui kutakin aluketta (0,4 uM), 0,4 ui ROX Reference Dye, 2 ui templaatti-cDNA, ja 6 ui dietyylipyrokarbonaatilla käsiteltyä vesi. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA), jolla on seuraavat thermocycle olosuhteissa: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 s, mitä seurasi 40 monistussykliä 95 ° C: ssa 5 s ja 60 ° C: ssa 34 s.

proliferaatiomääritystä

Soluproliferaatio arvioitiin 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5 difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) elävien solujen määrityksessä. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille 2000 /kuoppa ja viljeltiin 12, 24, 48, 72, ja 96 h. Sitten, 20 pl MTT: tä (Sigma) kantaliuos (5 mg /ml) lisättiin 200 ul: aan kunkin kaivon alusta, ja levyjä inkuboitiin vielä 4 h 37 ° C: ssa. Huolellisen imemällä viljelyalusta, 150 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet muodostettu MTT elinkykyisten solujen. Levyjä ravisteltiin pyörivässä alustan 10 minuutin ajan ja absorbanssi mitataan aallonpituudella 490 nm käyttäen mikrolevylukijaa.

Plate Colony muodostumisen määritys

Solut ympättiin 200 /kuoppa samalla kuuden kuoppalevyillä kuin käyttää muihin määrityksiin arvioida pesäkemuodostuksen alle solun tarttumista olosuhteissa. Jälkeen 10 päivää, solut värjättiin 1% Giemsa, ja näkyvissä olevien pesäkkeiden laskettiin. Suhteellinen klooni muodostumisen indeksi laskettiin keskiarvona pesäkkeiden lukumäärä /määrä kylvetään solujen x 100%.

Scratch haavan paranemista Analyysit

analyysillä solujen vaeltamiseen, 5 x 10

5 solua /kuoppa maljattiin kuuden kuopan levyille päällystettiin 10 ug /ml fibronektiiniä (FN) ja inkuboitiin 24 tuntia. Yksikerroksiset Sitten häiritsivät yhden tyhjästä käyttäen 200 ui pipetin kärki. Micrographs saatiin 0, 12, 24, 36, 48, ja 72 h jälkeinen tyhjästä kanssa faasikontrastimikroskoopissa (Olympus BX51, Japani). Lukumäärä solujen naarmuuntunut (karu) alue mikrokaivo laskettiin viidellä (Suurennus: x 200). Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena.

In vitro

invaasio ja migraatiokokeessa

Solun invaasio ja muuttoliike arvioitiin käyttämällä transwell kammiot (Corning, New York, USA). Invasion testit suoritettiin transwell erotettua kammiota polykarbonaattikalvosuodatinta insertit (8 um huokosia) 24-kuoppaisille levyille. Kukin kammio päällystettiin 100 pl 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) kylmään RPMI 1640: ssa yön yli 4 ° C: ssa. Sen jälkeen solut (5 x 10

4 /ml x 200 ui) siirrostettiin ylempään kammioon seerumia. Noin 800 ui väliainetta ilmastoitu 10 ug /ml fibronektiiniä pantiin alempaan osastoon transwell kammion kemoattraktantti. Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, jäljellä oleva kasvainsoluja yläpinnalle kammion poistettiin pyyhkimällä märällä vanupuikoilla. Tunkeutuvat soluihin alapinnalla kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin alle faasikontrastimikroskoopissa (Olympus, Japani) on x 200. Neljä itsenäistä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena kaikkien hoitoon olosuhteissa.

In vitro

muuttoliike testit suoritettiin samoissa olosuhteissa kuin hyökkäyksen määrityksiä, mutta päällystämättömän alakammioissa ja käyttäen 1 x 10

5 solua /ml (200 ui).

Anoikis pitoisuus

poly-hydroksietyylimetakrylaatin (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), joka estää solun tarttumista soluviljelylevyille ja muiden kasvua pinnat, liuotettiin uudelleen 95% etanolista, jolloin lopulliseksi pitoisuudeksi 12 mg /ml. Valmistamiseksi poly-HEMA-päällystetyille levyille, 2 ml tätä liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kuivua yön yli laminaarivirtausjärjestelmällä kudosviljelykaapissa. Sitten 5 x 10

4 solut maljattiin kolmena kussakin poly-HEMA-pinnoitettu hyvin säännöllisesti elatusaineet. 24 tunnin kuluttua GC-solut kerättiin, huuhdeltiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitovaa puskuria anneksiini V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Uudelleensuspendoituja soluja kustakin näytteestä jaettiin eriin (100 ui) neljään putkiin. Kolme putkea leimattiin joko anneksiini V-PE, 7-AAD, tai molempia, kun taas neljäs käytettiin leimaamaton kontrolli. Kukin erä analysoitiin sitten virtaussytometrialla Beckman Coulter FC 500 laskuri (Beckman Coulter, Inc.). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen peräisin summana Solufraktioiden näytetään alussa apoptoosin (anneksiini V-positiivisia) ja myöhäinen apoptoosin (7-AAD-positiivinen).

Vieraslajisiirteen Nude Mouse Model

ksenografti GC solulinjojen suoritettiin National suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals (julkaisu no. 86-23, tarkistettu 1985), hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitean kolmannen Xiangya sairaala, Keski Etelä yliopisto ( LLSC [LA] 2013-0010), ja sopeutui nykyinen Kiinan laki eläinten suojelusta (LLSC [LA] 2013-0010). Yritettiin minimoida käytettyjen hiirien ja niiden kärsimyksiä.

Kolmekymmentä Balb /c nude-hiirten ikää 4-6 viikkoa ostettiin SLAC Laboratory Animal Co Ltd (Shanghai, Kiina) ja sijoitettu yksittäin ilmanvaihto häkeissä. Hiiret jaettiin satunnaisesti BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, ja ohjata PBS ryhmät (n = 5 hiirtä /ryhmä). Viljellyt solut kerättiin ja suspendoitiin PBS: ään 1 x 10

8 solua /0,2 ml. Suspensio injektoitiin subkutaanisesti vasemman yläraajan kunkin paljaan hiiren lukuun ottamatta kontrolliryhmässä, joka injektoitiin 0,2 ml: lla PBS: ää. Kasvaimen kasvu arvioitiin 3 päivän välein mittaamalla kasvaimen halkaisijat Vernier jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin seuraavan kaavan mukaan: TV (mm

3) = d

2 x D /2, jossa d ja D ovat lyhin ja pisin halkaisija, vastaavasti. Hiiret tapettiin 4 viikkoa sen jälkeen, kun solun istutuksen, ja tuumorit uutettiin ja punnittiin. Kaikki maksat tutkittiin etäpesäkkeiden hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

EGFL7 Expression kohosi Human mahasyövän Solulinjat

Western blot ja RT- PCR suoritettiin vertaamaan EGFL7 ilmentymistä ihmisen GC solulinjoissa SGC7901, BGC823, MKN45 ja MKN28 kuin normaaleissa mahan limakalvoa epiteelin GES-1-soluissa. Kohonnut EGFL7 tasot havaittiin kaikissa neljässä GC solulinjat verrattuna GES-1, jossa BGC823 ja MKN28 näyttää korkeimman ja matalimman EGFL7 ilmaisu, vastaavasti, sekä proteiini- ja mRNA-tasot (kuviot 1A ja 1B). Siksi BGC823 ja MKN28 käytettiin seuraavissa kokeissa arvioida vaikutuksia EGFL7 ilmaisun proliferaatiota, migraatiota, ja metastaattisen potentiaalin. Meillä työskentelee vakaa shRNA transfektion tukahduttaa EGFL7 ilmentymistä BGC823 soluissa ja suunniteltu ihmisen EGFL7 korkea-ekspressioplasmidin (PEX-2-EGFL7) lisäämiseksi EGFL7 ilmentymistä MKN28 soluissa.

(A) Expression tasot EGFL7 proteiinin GC solulinjoissa SGC7901, BGC823, MKN45, ja MKN28, ja normaali mahan solulinjaa GES-1 arvioitiin Western blot. GC solulinjat osoittivat korkeampia EGFL7 proteiinin ekspressiotasot kuin GES-1-solut, joissa BGC823 solut, joilla on korkein EGFL7 proteiinin ekspressiotasoja. (B) qRT-PCR osoitti, että BGC823 oli korkein EGFL7 mRNA: n ilmentymisen. Western blot- ja PCR-kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) qRT-PCR osoitti, että shRNA1 sekvenssi johti 75%: n inhibitio EGFL7 mRNA ilmaisun, kun taas shRNA2 järjestyksessä aiheutti ainoastaan ​​30%: n inhibition. (D) BGC823 solulinjat transfektoitiin stabiilisti pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 tai pGPU6 /GFP /Neo-epäspesifinen-shRNA on nimetty BGC2-13 ja BGC-NC, vastaavasti. MKN28 solulinjat transfektoidaan pEX–2-EGFL7 tai pEX–2-epäspesifisiä nimetään MKN28-EGFL7 ja MKN28-NC, vastaavasti. Expression of EGFL7 proteiini oli selvästi pienempi BGC2-13 soluissa verrattuna BGC823 ja BGC-NC soluja, ja suhteellisen korkea MKN28-EGFL7 solujen verrattuna MKN28 ja MKN28-NC soluissa. (E) EGFL7 ekspressiotasoja analysoitiin myös qRT-PCR: llä, ja tulokset vahvistivat Western blot tietoja. GAPDH toimi sisäisen valvonnan sekä qRT-PCR ja Western blot. Virhepalkit edustavat SD rinnakkaisessa kokeessa (*

P

0,05).

rakennettiin kaksi shRNA plasmidivektoreita kohdistaminen EGFL7 mRNA ja suoritettiin qRT-PCR: llä tehokkuuden arvioimiseksi näiden ehdokas shRNA sekvenssit tukahduttaa EGFL7 verrattuna epäspesifisen sekvenssejä. ShRNA1 ja shRNA2 sekvenssit saavutti 75% ja 30%: n inhibition EGFL7, vastaavasti (kuvio 1 C), niin sitä tehokkaammin shRNA1 käytettiin kaikkiin seuraaviin kokeisiin. BGC823 linjat stabiilisti transfektoitu pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 tai pGPU6 /GFP /Neo-epäspesifinen-shRNA nimettiin BGC2-13 ja BGC-NC, vastaavasti. MKN28 linjat transfektoitu stabiilisti pEX–2-EGFL7 ja PEX-2-epäspesifinen nimettiin MKN28-EGFL7 ja MKN28-NC, vastaavasti. Ilmentymistasojen EGFL7 proteiinia ja mRNA: G418-resistentit kloonit arvioitiin myös Western blot (kuvio 1 D) ja reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 1 E). Tulokset osoittivat selvästi vähentynyt EGFL7 ilmentymistä BGC2-13 soluissa verrattuna BGC-NC-solujen ja merkittävästi kohonnut ilmentyminen MKN28-EGFL7 solujen verrattuna MKN28-NC-solut (kaikki

P

0,05). Ei ollut merkittäviä eroja mRNA ja proteiinin ilmentyminen välillä BGC-NC ja BGC solujen välillä tai MKN28-NC ja MKN28 soluja (kaikki

P

0,05).

EGFL7 mainosvideosuositukset GC Cell Invasion ja Migration, mutta ei vaikuttanut GC Cell Proliferation

roolin tutkimiseksi EGFL7 GC etenemiseen, me ensin tutki EGFL7 hiljentäminen tai yli-ilmentyminen muuttanut proliferatiivinen, invasiivisia, ja muuttavien valmiuksia GC soluja. Scratch haavan paranemista käytettiin mittaamaan migraation stabiilisti transfektoitujen solujen. Haava syntyi GC yksisoluiset kerrokset yhden tyhjästä ja solujen määrä tyhjästä vyöhykkeellä verrattuna 0 ja 48 tuntia. Sulkeminen haava oli huomattavasti hitaampi BGC2-13 kulttuureissa (underexpressing EGFL7) verrattuna natiivin BGC823 ja BGC-NC viljelmät (32%

vs.

100% ja 98%, sekä

P

0,05) (kuvio 2A). Sen sijaan sulkeminen oli merkittävästi nopeammin MKN28-EGFL7 viljelmät (yli-ilmentävät EGFL7) verrattuna MKN28 ja MKN28-NC viljelmät (99%

vs.

49% ja 50%, sekä

P

& lt 0,05) (kuvio 2B). Wu et ai.